CN117771432A - 一种促血管化的双网络动态生物墨水 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促血管化的双网络动态生物墨水。由PBS缓冲液、非动态水凝胶组分及其交联剂、动态水凝胶组分及其交联剂、活细胞组成；其中，所述非动态水凝胶组分为甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶；其交联剂为苯基‑2,4,6‑三甲基苯甲酰基次膦酸锂；所述动态水凝胶组分为经过己二酸二酰肼修饰的明胶GelADH；其交联剂为经过偏高碘酸钠氧化从而形成醛基的葡聚糖分子。本发明通过优化非动态水凝胶组分和动态水凝胶组分的配比，及其对应的交联剂的添加量，构建了打印性能优良的双网络动态生物墨水，兼具稳定性和动态性，是一种既支持动态血管形态发生，同时兼具打印性的水凝胶材料设计新方案。
Description
技术领域
本发明属于血管化组织工程技术领域，具体涉及一种促血管化的双网络动态生物墨水。
背景技术
组织工程是以修复、重建以及再造具有一定生理功能的组织/器官为目标的一项生物技术，其重要挑战之一是实现构建组织的血管化。水凝胶是一类重要的组织工程常用材料，通过提供物理和生物化学因素以模拟支持血管形态发生所需要的组织微环境。常见的水凝胶生物材料是由天然、合成及其复合材料经过化学改性制备，通常由修饰于材料的官能团之间形成不可逆稳定交联实现从水溶液到凝胶的成形。其中改性明胶水凝胶(比如经过甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶GelMA)具有细胞粘附位点并可以被细胞降解而常作为血管内皮细胞的3D培养支架。其成形性也可作为工程学属性用于以生物3D打印等生物制造技术以构建具有特定形状尺寸的仿生血管化组织。
目前有两类水凝胶已经被用于血管内皮细胞的3D培养：
第一类是经过稳定共价交联的常规水凝胶具有优异的打印性、形状保真度和支持长期3D培养的结构稳定性。然而，细胞必须主动降解这种常规水凝胶才能达到铺展的细胞形态，进行迁移，并重塑水凝胶微环境，这会延迟并阻碍一系列重要的细胞行为。
第二类可逆交联的动态水凝胶可以通过增强基质与细胞的相互作用促进内皮细胞铺展，迁移并形成网络。尽管如此，动态水凝胶由于交联中逆向反应的存在导致容易降解，从而缺乏稳定性来支持长期3D培养。
如何优化设计水凝胶材料使其支持动态血管形态发生，同时使其具有较好的打印性等工程学属性，是其面向血管化组织工程应用的一个关键问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性-动态性互补的双网络水凝胶体系，是一种既支持动态血管形态发生，同时兼具打印性的水凝胶材料设计新方案。本发明采用双网络水凝胶设计策略，设计的水凝胶体系既含有支持较高程度血管形态发生的动态水凝胶网络，又含有常规可稳定交联的非动态水凝胶网络。该体系的两种水凝胶网络均基于对明胶分子的化学改性。
本发明所提供的双网络水凝胶体系，其原料包括非动态水凝胶组分和动态水凝胶组分，其中，非动态水凝胶组分和动态水凝胶组分的质量比可为2-5：2-5，优选4：2-5，更优选4：2-3；
所述非动态水凝胶组分为甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶(GelMA)(甲基丙烯酸酐化明胶)，改性率20％-80％；
所述动态水凝胶组分为经过己二酸二酰肼(ADH)修饰的明胶GelADH，改性率20％-80％；
制备所述双网络水凝胶体系的原料还包括用于交联所述甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶(GelMA)的交联剂和用于交联所述经过己二酸二酰肼(ADH)修饰的明胶GelADH的交联剂，
所述用于交联所述甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶(GelMA)的交联剂可为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)，通过蓝光引发苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)产生自由基交联所述甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶(GelMA)；
所述用于交联所述经过己二酸二酰肼(ADH)修饰的明胶GelADH的交联剂具体可为经过高碘酸钠氧化从而形成醛基的葡聚糖分子DexCHO，改性率为20％-80％；
所述双网络水凝胶体系中，经过己二酸二酰肼(ADH)修饰的明胶GelADH与用于其交联的交联剂的质量比可为10-20:1；
甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶(GelMA)与用于其交联的交联剂的质量比可为：2-5:0.125，具体可为4:0.125。
本发明还提供一种改性明胶双网络动态生物墨水。
本发明所提供的改性明胶双网络动态生物墨水，由PBS缓冲液、非动态水凝胶组分及其交联剂、动态水凝胶组分及其交联剂、活细胞组成；
其中，所述非动态水凝胶组分为甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶(GelMA)(甲基丙烯酸酐化明胶)，改性率20％-80％；其交联剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)；
所述动态水凝胶组分为经过己二酸二酰肼(ADH)修饰的明胶GelADH，改性率20％-80％；其交联剂为经过偏高碘酸钠(NaIO4)氧化从而形成醛基的葡聚糖分子，改性率20％-80％；
所述改性明胶双网络动态生物墨水中，非动态水凝胶组分的浓度为1％-10％wt/v，优选2％-5％wt/v，更优选4％wt/v；
动态水凝胶组分的浓度为1％-10％wt/v，优选2％-5％wt/v，更优选2-3％wt/v；
动态水凝胶组分(经过己二酸二酰肼(ADH)修饰的明胶GelADH)与用于其交联的交联剂的质量比可为10-20:1；
用于交联非动态水凝胶组分的交联剂的浓度为0.1-1％wt/v，具体可为0.125％wt/v。
本发明还提供一种构建血管化组织的方法。
本发明所提供的生物3D打印构建血管化组织的方法，包括如下步骤：将所述非动态水凝胶组分和动态水凝胶组分加入相应的交联剂进行混合并在其中预先包埋活细胞，将所得水凝胶材料体系浇注进微模具或孔板，交联，3D培养，或将所述水凝胶体系作为生物墨水装载到挤出式生物3D打印机中，打印后进行3D培养，即得血管化组织。
由上述方法构建的血管化组织也属于本发明的保护范围。
本发明通过优化非动态水凝胶组分和动态水凝胶组分的配比及其对应的交联剂的添加量，构建了打印性能优良的双网络动态生物墨水，兼具稳定性和动态性，是一种既支持动态血管形态发生，同时兼具打印性的水凝胶材料设计新方案。
附图说明
图1为本发明载有血管内皮细胞的双网络明胶动态水凝胶体系作为生物墨水的3D打印流程。
图2表明不加入GelMA(a)成形性较差，加入GelMA(b)成形性较好。
图3为优化双网络动态水凝胶组分的浓度来优化打印性能。
图4为对比相同硬度的GelMA和双网络动态水凝胶的应力松弛特性，其中双网络动态水凝胶为将4％wt/v浓度的GelMA及其引发剂(LAP 0.125％wt/v)等体积加入到3％wt/vGelADH水凝胶(DexCHO 0.15％wt/v)(溶剂PBS)中，固化制得，其所具有的应力松弛特性比固定浓度4.7％wt/v GelMA具有更快的时间尺度。
图5为对比相同硬度的GelMA和双网络动态水凝胶对于血管内皮细胞形态发生所需要激活的生化信号通路程度，其中双网络动态水凝胶为将4％wt/v浓度的GelMA及其引发剂(LAP 0.125％wt/v)等体积加入到3％wt/v GelADH水凝胶(DexCHO
0.15％wt/v)(溶剂PBS)中，固化制得，其比4.7％wt/v GelMA更大程度地激活内皮细胞形态发生所需要的力学转导信号通路。
图6为对比纯GelMA水凝胶和双网络动态水凝胶在与人成纤维细胞共培养条件下对于血管内皮细胞形态发生的影响。
图7为将含有人内皮细胞与人肺成纤维细胞的双网络动态水凝胶体系在生物3D打印后进行培养，并进行免疫荧光染色观察到铺展连接的3D血管网络。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
将非动态水凝胶组分和动态水凝胶组分加入相应的交联剂进行混合并在其中预先装载活细胞(血管内皮细胞)，将所得水凝胶材料体系作为生物墨水装载到挤出式生物3D打印机中，打印，光固化，3D培养，得到血管化组织。
其中，所述非动态水凝胶组分为甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶(GelMA)，改性率20％-80％；其交联剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)；
所述动态水凝胶组分为经过己二酸二酰肼(ADH)修饰的明胶GelADH，改性率20％-80％；其交联剂为经过偏高碘酸钠(NaIO4)氧化从而形成醛基的葡聚糖分子，改性率20％-80％；
其流程如图1所示。
下述实施例中的GelMA，其改性率为53％，购自上普博源(北京)生物科技有限公司，商品名SUNP Gel G1；
下述实施例中的GelADH其改性率为29.6％，制备方法如下：
将1g明胶在50℃下以10％溶解在10mM pH 5.5PBS中，搅拌，将1.74g己二酰肼(ADH，阿拉丁)加入溶液中。然后，将0.77g 1-羟基苯并三唑(HOBt)和0.77g N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)分别溶解在10mL DMSO/水的混合物(1：1)中，并滴加到反应体系中。将pH调节至5.2后，将反应保持在50℃，搅拌12小时。将pH调节至7.4后，用三份去离子水稀释溶液，然后在40℃下用去离子水透析(MWCO 12kDa)3天，每天换水5次，然后冻干3天。
下述实施例中的经过高碘酸钠(NaIO4)氧化从而形成醛基的葡聚糖分子DexCHO，改性率为19.4％，制备方法如下：
1克葡聚糖(Mn＝110,000)溶解在蒸馏水中的1％，然后将1克高碘酸钠加入到溶液中。然后将溶液在避光条件下搅拌0.5小时，然后加入1.0mL乙二醇以终止氧化反应并再搅拌0.5小时。然后将溶液(MWCO 3500)透析3天，每天换水5次，然后冻干3天。
实施例1、双网络动态水凝胶体系的两种组分在单独或共混条件下交联过程的流变学表征
将4％wt/v浓度的GelMA及其引发剂(LAP 0.125％wt/v)等体积加入到3％wt/vGelADH水凝胶(DexCHO 0.15％wt/v)(溶剂PBS)中，固化，通过水凝胶成形测试证明该共混方法有利于提高动态水凝胶GelADH的稳定性，如图2所示。图2表明不加入GelMA(a)成形性较差，加入GelMA(b)成形性较好。
实施例2、水凝胶体系打印性能的优化
对于含有两种组分的双网络动态水凝胶体系进行打印性表征，调整两种组分及其交联剂的浓度，并优化打印参数进行打印性测试以筛选出最利于生物3D打印的双网络动态水凝胶体系浓度，结果如图3所示。采用PBS体系，其中LAP的浓度为0.125％wt/v，GelMA的浓度为4％wt/v,GelADH的浓度分别为2％wt/v、3％wt/v、4％wt/v、5％wt/v，GelADH与其对应的交联剂(DexCHO)的质量比分别为10:1、15:1、20:1，
从图3可以看出，GelMA的浓度为4％wt/v,GelADH的浓度分别为2％wt/v、3％wt/v，GelADH与其对应的交联剂(DexCHO)的质量比分别为10:1、15:1、20:1的条件下实现等同优异的打印性。判断打印是否优异的方法参考Ouyang等人已发表的打印性测试(Ouyang,Liliang et al.“Effect of bioink properties on printability and cellviabilityfor 3Dbioplotting of embryonic stem cells.”Biofabrication vol.8,3035020.16Sep.2016,doi:10.1088/1758-5090/8/3/035020)：
其中C是打印后水凝胶丝围成正方形孔隙的圆度，Pr值为打印性评分，Pr越接近1代表打印性越优异。
实施例3、对于共混组分的双网络动态水凝胶体系和纯GelMA进行应力松弛测试
双网络动态水凝胶的组分为浓度4％wt/v GelMA及其引发剂(LAP0.125％wt/v)，3％wt/v GelADH水凝胶(含经过高碘酸钠(NaIO4)氧化从而形成醛基的葡聚糖分子0.15％wt/v)(溶剂PBS)，纯GelMA水凝胶浓度为4.7％wt/v及其引发剂(LAP
0.125％wt/v)。考察所得双网络动态水凝胶体系的应力松弛特性，结果如图4所示。由图4可知，基于固定浓度的GelMA和GelADH、DexCHO，应力松弛特性比同等硬度下的纯GelMA水凝胶更快。
实施例4、检测共混组分的双网络动态水凝胶体系和纯GelMA对于内皮细胞的力学转导信号通路的激活程度。
双网络动态水凝胶的组分为浓度4％wt/v GelMA及其引发剂(LAP0.125％wt/v)，3％wt/v GelADH水凝胶(含经过高碘酸钠(NaIO4)氧化从而形成醛基的葡聚糖分子0.15％wt/v)(溶剂PBS)，纯GelMA水凝胶浓度为4.7％wt/v及其引发剂(LAP
0.125％wt/v)。在此浓度下以4000，000细胞/mL的密度进行内皮细胞的包埋，在第三天进行力学信号转导的关键特征蛋白，如integrinβ1，MMP14，p-FAK等进行荧光定量表征，结果证明共混组分的双网络动态水凝胶体系更大程度地激活内皮细胞的力学信号转导，有利于内皮细胞的形态发生(图5所示)。
实施例5、检测共混组分的双网络动态水凝胶体系和纯GelMA水凝胶在与人成纤维细胞共培养条件下对于内皮细胞形态发生的影响。
双网络动态水凝胶的组分为浓度4％wt/v GelMA及其引发剂(LAP0.125％wt/v)，3％wt/v GelADH水凝胶(含经过高碘酸钠(NaIO4)氧化从而形成醛基的葡聚糖分子0.15％wt/v)(溶剂PBS)，纯GelMA水凝胶浓度分别为4.7％wt/v和其引发剂(LAP 0.125％wt/v)，以及4％wt/v和其引发剂(LAP 0.125％wt/v)。在此浓度下以4000，000内皮细胞/mL和2000，000人肺成纤维细胞/mL的密度进行细胞包埋，在第三天对包埋细胞进行免疫荧光形态学表征，结果证明共混组分的双网络动态水凝胶体系更大程度地使内皮细胞与成纤维细胞伸展形成网络，有利于内皮细胞的形态发生(图6所示)。
实施例6、基于载细胞的水凝胶体系构建血管化组织的3D网络结构
将4％wt/v浓度的GelMA及其引发剂(LAP0.125％wt/v)等体积加入到3％wt/vGelADH水凝胶(含经过高碘酸钠氧化从而形成醛基的葡聚糖分子0.15％wt/v)(溶剂PBS)中，装载进3D生物打印机的针筒中，设定底板打印温度为12摄氏度，按照打印机自带的程序打印网格状结构，打印后使用紫外光固化。加入培养基在37摄氏度及5％二氧化碳的培养箱中持续培养7天。
将含有人内皮细胞与人肺成纤维细胞的双网络动态水凝胶体系在生物3D打印后进行7d培养，并进行免疫荧光染色观察到铺展连接的3D血管网络，结果如图7所示。由图7可知，将载细胞的水凝胶体系经过7d的3D培养得到具有血管内皮细胞铺展并相互连接的3D网络结构。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (7)
1.一种双网络水凝胶体系，其原料包括非动态水凝胶组分和动态水凝胶组分，其中，非动态水凝胶组分和动态水凝胶组分的质量比为2-5：2-5；
所述非动态水凝胶组分为甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶GelMA，改性率20％-80％；
所述动态水凝胶组分为经过己二酸二酰肼修饰的明胶GelADH，改性率20％-80％。
2.根据权利要求1所述的双网络水凝胶体系，其特征在于：制备所述双网络水凝胶体系的原料还包括用于交联所述甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶GelMA的交联剂和用于交联所述经过己二酸二酰肼修饰的明胶GelADH的交联剂，
所述用于交联所述甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶GelMA的交联剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂；
所述用于交联所述经过己二酸二酰肼修饰的明胶GelADH的交联剂为经过高碘酸钠氧化从而形成醛基的葡聚糖分子，改性率为20％-80％。
3.根据权利要求1或2所述的双网络水凝胶体系，其特征在于：所述双网络水凝胶体系中，经过己二酸二酰肼修饰的明胶GelADH与用于其交联的交联剂的质量比为10-20:1；
甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶GelMA与用于其交联的交联剂的质量比为：2-5:0.125。
4.一种改性明胶双网络动态生物墨水，由PBS缓冲液、非动态水凝胶组分及其交联剂、动态水凝胶组分及其交联剂、活细胞组成；
其中，所述非动态水凝胶组分为甲基丙烯酸酐化学修饰的明胶GelMA，改性率20％-80％；其交联剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂；
所述动态水凝胶组分为经过己二酸二酰肼修饰的明胶GelADH，改性率20％-80％；其交联剂为经过偏高碘酸钠氧化从而形成醛基的葡聚糖分子，改性率20％-80％。
5.根据权利要求4所述的改性明胶双网络动态生物墨水，其特征在于：所述改性明胶双网络动态生物墨水中，非动态水凝胶组分的浓度为1％-10％wt/v；
动态水凝胶组分的浓度为1％-10％wt/v；
动态水凝胶组分与用于其交联的交联剂的质量比为10-20:1；
用于交联非动态水凝胶组分的交联剂的浓度为0.1-1％wt/v。
6.一种构建血管化组织的方法，包括如下步骤：向权利要求1-3中任一项所述的双网络水凝胶体系中预先包埋活细胞，将所得水凝胶材料体系浇注进微模具或孔板，交联，3D培养，或将所述水凝胶体系作为生物墨水装载到挤出式生物3D打印机中，打印后进行3D培养，即得血管化组织。
7.由权利要求6所述方法构建的血管化组织。
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| CN202311770474.XA CN117771432A (zh) | 2023-12-21 | 2023-12-21 | 一种促血管化的双网络动态生物墨水 |
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Publications (1)
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ID=90384773
Family Applications (1)
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2023
- 2023-12-21 CN CN202311770474.XA patent/CN117771432A/zh active Pending
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