DK141911B - Celle-dyrkningssystem omfattende levende eucaryotiske celler. - Google Patents

Description

Mm vis/ (11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1^1911 C 12 il 3/00 DANMARK (·ΐ) [nt.ci.3 c 12 h b/oo «(21) Ansøgning nr. 2261/73 (22) Indlever« den 25· Θ·ΡΓ · ^973 (23) Le bedeg 25· apr. 1973 (44) Ansøgningen fremlagt og non fremleeggelseeskriftet offentliggjort den 1 4 . JUl · · you DIREKTORATET FOR __ . .

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begæret fra den

26. apr. 1972, 19387/72, GB

(71) THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED, 183-193 Eueton Road, London N.W.1, GB. “ (72) Opfinder: Ronald Charles Telling, Furzsholme, Dawneys Hili, Fir= bright, Woking, Surrey, GB: Roy John PassIngham, 31 Lea Wood Road,

Fleet, Hants, GB: Brian Lewis Kitchener, 144 Beta Road, Cove,

Farnborough, Hants, GB: David Tleorge Hopkinson, 12 Windermere Close,

Cove, Farnborough, Hants, GB, (74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Internationalt Patent-Bureau. ________ I II I I I ............—^T— " 1 —aw—^mmmmmmwmm (54) Celle-dyrkningssyBtem omfattende levende eucaryotiske celler.

Opfindelsen angår et celle-dyrkningssystem omfattende levende eucaryotiske celler, især sådanne af human eller animalsk oprindelse eller sådanne stammende fra mycophyta. Ved eucariotiske celler forstås celler med en egentlig, kromosomagtig kærne omgivet af en men-bran. Celle-dyrkningssystemet kan anvendes til dyrkning af mikroorganismer, såsom vira, i eksempelvis pattedyrcéller og humane celler.

Det er kendt, at mange forskellige cellekulturer, især af animalsk eller human oprindelse, kan opretholdes som monolag på den jævne overflade af et fast underlag, f. eks. Petri-skåle, glasflasker eller rør. Så snart som sådanne kulturer bliver"sammenstødende", dvs. danner et samlet lag af ensartet tykkelse, kan et virus indføres i det flydende medium, der dækker cellerne, og kulturen kan anvendes til dyrkning af vira i monolagsysternet. Mange typer celler kan des- 2 141911 uden med fordel dyrkes i suspension, dvs. væsentlig dispersion i næringsmediet, og samme teknik kan også anvendes til dyrkning af vira i suspenderede celler. Apparatur til formålet omfatter sædvanligvis en lukket beholder .eller tank med passende midler til omrøring, kontrol af miljøfaktorer, f. eks. pH, pC^/ tilførsel af næringsstoffer (cf. britisk patentskrift nr. 1.090.758).

I det konventionelt anvendte system, f. eks. til dyrkning af cellelinier i suspensionskultur, holdes cellerne i en submers omrørt tilstand i mediet og sedimenteres på grund af tyngden, når topkoncentrationen er nået. Mediet decanteres så af, og cellerne resuspendere-res i et friskt medium, som også kan indeholde viruspartikler. Efter et tidsrum med virusvækst, som bestemmes ved iagttagelse af den cy-topatiske virkning af cellerne, ledes udbyttet sædvanligvis gennem et filter og derpå gennem en bakteriesteriliserende membran til opnåelse af en opløsning, der indeholder frie vira frigjort af de sønderdelte celler.

En vanskelighed ved store suspenderede kulturer af pattedyrs celler er, at gennemstrømning af luft gennem mediet med høj hastighed kan skade cellerne, samtidig med at en vis mængde oxygentilførsel hele tiden er nødvendig til optimal vækst. Andre vanskeligheder er, at sedimentationen af cellerne er en tidskrævende proces (ca.

24 timer), de sedimenterede celler kan udsættes for et ugunstigt mediemiljø med hensyn til pH og næringsmiddelfaktorer, og kun 95% af det anvendte medium kan drænes fra uden risiko for tab af en væsentlig mængde af cellerne. Under filtrering af virusudbyttet udøver de medfølgende cellerester desuden en stoppende virkning på filtermediet og forholdet mellem filtreret rumfang og filtreringsareal må være lille til opnåelse af steriliserende filtrering. Dette kan forårsage alvorlige tab (op til 50%) af viralt antigen på grund af adsorption af virus både på filtermediet, især hvis dette indeholder asbest, og på de tilbageværende cellerester. Desuden er en stor vertikal filterpresseplade nødvendig til tilvejebringelse af adekvat filtrering, hvilket sædvanligvis forårsager væsentlige volumentab og, da det ikke er et lukket system, udgør den deraf følgende dryppen en alvorlig risiko for sygdomsfremkaldelse.

Med den foreliggende opfindelse tilsigtes derfor tilvejebragt et system, hvor disse nævnte ulemper i det væsentlige kan undgås. Fortrinsvis bør systemet kunne anvendes til celler både af monolags · og suspensionstypen og til dyrkning af vira til kommerciel frembringelse af vacciner.

3 141911

Det har vist sig, at dette kan opnås med celle-dyrkningssystemet ifølge opfindelsen, som er ejendommeligt ved, at cellerne er fordelt i et porøst bærerlegeme eller -leje, bestående af partikelformet materiale, som tilvejebringer indre hulrum eller mellemrum, der er tilstrækkelige til at tilbageholde cellerne og muliggøre deres vækst og formering i bærerlegemet eller -lejet, såvel som passage af flydende substrat i kontakt med cellerne.

Bæreren kan passende tilvejebringes i form af et filterleje, og kan bestå af naturlige eller syntetiske materialer, f. eks. sili-.cater af diatoméjordtypen, glas eller polymerpartikler. SåledeB har især forskellige former for filterhjælp af diatoméjord, og specielt kiselgur eller diatomit vist sig velegnet til dette formål. En anden anvendelig diatoméjord-type er infusoriejord. Andre materialer, der kan anvendes, omfatter spundet glas, cellulosepuder, nylon- eller polystyrenperler. Alle disse materialer er praktisk talt uopløselige og biologisk i det væsentlige indifferente.

Størrelsen af porerne eller det for cellevæksten til rådighed værende rum i et leje af partikelformede materialer kan vælges på passende måde og indstilles efter kravene. Det er ofte nødvendigt at vælge et "retentionsmål", der angiver filtreringsevnen af det materiale, der effektivt ville tilbageholde cellerne, men tillade hurtig gennemstrømning af væskerne. Således kan ifølge opfindelsen bæreren passende have et retentionsmål på 0,1 ym til 2,00 ym, fortrinsvis mellem 0,2 ym og 1,2 ym, f. eks. ca. 0,4 ym til 0,6 ym. Materialerne forarbejdes passende ved fjernelse af forureninger og infektionskilder og renses og fraktioneres efter deres partikelstørrelse og andre krav.

Bæreren kan omfatte et enkelt lag, og dette kan passende have retentionsmål på 0,75 ym til'2,0 ym, .fortrinar vis på 1,2 ym. Imidlertid kan ifølge opfindelsen bæreren omfatte mere end et lag af porøst partikelformet materiale.Et sådant multile jesys tem kan med fordel anvendes til forøgelse af retentionen.Fortrinsvis formindskes retentionsmålet i lagene af bærer i det store og hele fra indgangsfladelaget til fladelaget nærmest udgangsfladelaget, og bæreren kan f. eks. omfatte på hinanden følgende lag af materiale med o,5, 0,2, 0,5 og 1,2 ym's retentionsmål fra en basal perforeret understøttelsesplade eller et filter til toppen. Retentionsmå- 4 141911 let i lagene varierer hensigtsmæssigt fra 0/1 til 0,75 μιη, fortrinsvis fra 0,2 til 0,5 μια, og udgangsfladelaget har fortrinsvis større retentionsmål end nabolaget dertil, f. eks. passende ca. 0,5 μια.

Hvis der anvendes et enkelt lag, kan dette også skulle forsynes med et yderligere toplag med lavt retentionsmål, f. eks. 0,2 μιη, umiddelbart før den endelige filtrering, til forøgelse af retentionen af mindre partikler.

Tykkelsen af et lag i bæreren andrager hensigtsmæssigt fra ca. 8 mm til ca. 20 mm.

Enhver type celle, der egner sig til vadest enten i monolag eller i suspension, kan inkorporeres i dyrkningssystemet ifølge opfindelsen. I denne sammenhæng omfatter celletyperne primære og sekundære cellekulturer og diploide og heteroploide cellelinier eller stammer af pattedyrisk eller human oprindelse. F. eks. er den velkendte IBRS2 grisenyrecellelinie eller babyhamstercelleli-nie klon 21 (BHK 21) særligt egnet til dette formål. For så vidt angår celler, der kun kan vokse og anvendes i monolag, er dyrkningssystemet yderst velegnet for alle væksttrin og også for påfølgende dyrkning af mikroorganismer, såsom vira. Andre celler, der kan dyrkes effektivt i suspensionskulturer, kan først dyrkes på denne måde og derpå inkorporeres i dyrkningssysternet ifølge opfindelsen til virusdyrkning og udvinding. Dyrkningssysternet omfatter altså også som et særligt træk celler inficeret med mikroorganismer, såsom vira, for hvilke cellerne er modtagelige. Naturligvis kan andre typer af euca-ryotider, f. eks. mycophyta, såsom gærarter, også påføres den ifølge opfindelsen anvendte bærer i et passende næringsmedium.

Standard horisontale trykfiltre kan f. eks. anvendes til underlag for dyrkningssystemet, men det er passende at anvende et cal-mic "high duty" horisontal pladetrykfilter, såsom Calmic 45-S-9 E-ty-pe filter, der fremstilles af Calmic Engineering Ltd., Grewe. Et sådant filter omfatter ni horisontale pladeenheder hver med diameter 45 cm og med et totalt filtreringsareal på 1,26 m . Hver pladeenhed omfatter en perforeret rustfri stålplade anbragt på en rustfri stålplade med fordybninger. Et underlag, f. eks. af papir eller rayon, kan anvendes på den perforerede plade til understøtning for filter-lejet.

Fremstilling af det omhandlede celle-dyrkningssystem sker ved følgende trin: a) man fremstiller et bærerleje udfra en opslemning af porøst 5 141911 eller partikelformet materiale, b) tilfører en flydende suspension af eucaryotiske celler til lejet, og c) lader cellerne i lejet etablere sig.

Ved fremstilling af dyrkningslejet kan opslemninger af passende typer bærermateriale pumpes fra en passende beholder gennem pladefilteret, hvorved bæreren tilbageholdes på pladen. For hvert lag recirkuleres opslemningen flere gange, indtil filtratet er klart, hvorved man får den nødvendige tykkelse af bærerlejet på underlaget eller det tidligere lag, hvilket som før nævnt f. eks. kan være ca. 8 mm til 20 mm, fortrinsvis 10 mm til 14 mm og helst 12 mm.

Dyrkningsbeholderen kan være af deri sædvanlige type, forsynet med en omrører og midler til måling og kontrol af pH, temperatur og til indførsel af luft eller oxygen til gennemluftning af mediet. Den kan yderligere have en oxygenelektrode, der måler opløst oxygen i dyrkningsmediet og som følge deraf kan anvendes som beskrevet i det følgende til bestemmelse af varigheden af virusvækstperioden.

Vilkårlige dyrkningsmedier, som vides at være egnede til vækst af celler, og/eller mikroorganismer, f. eks. vira i forbindelse med celler, kan anvendes, f. eks. Eagles Basal Medium (Science, 122, 501 (1955)) eller modificeret Eagles Medium (Virology, 16, 147 (1962)). Mediet kan også indeholde f. eks. 10% v/v bovinserum for vækst af BHK21 suspension cellelinier og en formindsket mængde serum, f. eks.

1% serum for vækst af mund- og klovsyge virus på denne cellelinie.

Mund- og klovsyge (i det følgende kaldt FMD) forårsages af mange antigent forskellige virustyper, af hvilke flere er blevet fundet i særlige områder. F. eks. forekommer type O, A og C i Europa og Sydamerika, type SAT1, SAT2 og SAT3 i Sydafrika og type O, A og Asia I og SAT1 i det nære Østen. De følgende stammer af FMD/virus er indtil nu fundet egnede til vakst i celledyrkningssystemet ifølge opfindelsen, nemlig A Pando, O BFS 1860, SÅH Pho-5/66, SKU2 Swz. 1/69 og SAT3 Bec 1/65.

Fremgangsmåden kan udøves på to måder afhængigt af om cellesystemet normalt gror i suspensions- eller monolagskultur. I første tilfælde dyrkes cellerne i en submers kultur i en omrørt beholder på almindelig måde og filtreres igennem og tilbageholdes på lejet, når cellerne har opnået deres maksimale koncentration. Celler, der kun egner sig til monolagsdyrkning, kan på den anden side dyrkes med fordel i dyrkningssystemet. I sidstnævnte tilfælde kan det passende dyrkningsmedium i dyrkningsbeholderen således podes med levende celler 6 141911 og derpå øjeblikkelig cirkuleres gennem det forud fremstillede bærerleje, hvorpå cellerne indlejres og immobiliseres i lejet. Dyrkningsmediet cirkuleres så kontinuerligt gennem celle-dyrkningsperioden.

I begge tilfælde kan medium, der egner sig til virusvækst, derpå sættes til dyrkningsbeholderen, og cellerne podes med viruset. Mediet cirkuleres igen kontinuerligt gennem lejet, således at dette virus kan formere sig i de i bærerlejet indlejrede celler. Når viruset ødelægger cellerne, forbliver de derved dannede rester i bærerlejet, og viruset frigøres i mediet.

Selvom cellevækst i bærerlejet ikke direkte kan observeres, så kan væksten let måles ved glucoseudnyttelse. Tidsrummet for virusvæksten kan bestemmes indirekte ved aflæsning af oxygenelektroden, der giver koncentrationen af opløst oxygen (p02) i dyrkningsmediet. I de tidligere trin af virusdyrkningen er oxygenoptagelsen af de metaboliserende celler større end oxygenopløsningshastigheden i dyrkningsmediet, og følgelig falder opløst p02· Når cellerne dør som resultat af en virusinfektion, er der et kontinuerligt faldende oxygenbehov til cellemetabolisme, hvilket behov eventuelt er mindre end oxygenopløsningshastigheden, således at opløst pC>2 stiger. Denne forandring kan derfor anvendes til måling og kontrol af virusdyrkningstrinnet, og det har vist sig fordelagtigt at udvinde viruskulturen, når opløst p02 i dyrkningsmediet er ca. i ligevægt med p02~ værdien for betingelser med luftmætning.

Den almindelige operationsrækkefølge ved fremstilling af celle -dyrkningssystemet ifølge opfindelsen f.eks. med celler, der kan dyrkes i suspensionskulturer, er son følger. Ctelledyrkningen påbegyndes i en anrørt beholder på almindelig måde, idet mediets pH er ca. 7,4 og temperaturen ca. 35°C i de fleste tilfælde. Et bærerleje frembringes så ved pumpning af en vandig opslemning af et passende beskaffent bærermateriale, f.eks. diatoméjord, kontinuerligt gennem et passende filter, fortrinsvis under tryk, og systemet steriliseres og holdes i denne tilstand indtil anvendelse. Når cellerne har nået deres maksimale koncentration, ledes cellekulturen gennem lejet med en hastighed på ca. 20 liter pr. minut, hvorved de fleste af cellerne immobiliseres i bærerlejet. Dyrkningsmediet og eventuelle ikke opfangede celler pumpes tilbage i dyrkningsbeholderen og recirkuleres gennem filteret, indtil det tidspunkt, hvor mindre end 10% af cellerne, fortrinsvis mindre end 5% viser sig at passere gennem systemet. Dette kan bestemmes indirekte ved celletælling med mellemrum og når recirkulationstrinnet på 141911 7 prøver udtages fra filtrat umiddelbart efter filteret. Filtratet pumpes så til en spildvandsafdeling, efterladende cellerne dækket af det i filteret tilbageholdte medium, indtil virus vasks ttrinnet påbegyndes .

Til virusvækst indføres sædvanligvis et nyt medium med en anden sammensætning og ledes gennem celle-dyrkningssystemet. En passende virusart, overfor hvilken cellerne er modtagelige, kan indføres til infektion af kulturen. Efter sønderdeling af cellerne ved virusformeringen, dvs. efter at den cytopatiske virkning har fundet sted, frigøres en stor mængde virus og føres bort med mediet.

Medium indeholdende viruspartiklerne adskilt fra celleresterne på denne måde kan nu oplagres eller fortrinsvis filtreres, idet enhver bakteriel kontaminering fjernes fra mediet. Det virale antigen kan så inaktiveres med et passende inaktiveringsmedium, såsom formaldehyd eller især acetylethylenimin, og forarbejdes til en vaccine, som fortrinsvis omfatter et tilsætningsstof, såsom aluminiumhydroxid, med fordel kombineret med saponin.

Fremgangsmåden er især egnet til vækst af vira i cellelinier og kan derfor anvendes med fordel til fremstilling af viral vaccine efter passende inaktivering om nødvendigt.

Anvendelse af celle-dyrkningssystemet ifølge den foreliggende opfindelse, bevirker undgåelse af det tidskrævende sedimentationstrin, hvor cellerne ifølge den almindelige teknik ofte holdes i et uheldigt miljø i længere tidsrum. Fjernelse af anvendt cellemedium kan nu ske hurtigt og mere eller mindre fuldstændigt. Yderligere kan omskiftningen fra celle-dyrkningsmediet til virusvækstmediet ske let og hurtigt, og man undgår den krydsforurening af de medier, som ofte forekommer i konventionelle systemer. Cellerne kan nemt vaskes mellem trinene om nødvendigt. Da celler og cellerester forbliver i bærerlejet, kan den pre-filtrering, som er vigtig for at opnå høj gennemstrømning under det endelige bakteriologiske sterilationsfil-treringstrin med fordel inkorporeres i virusvæksttrinnet, hvorved der kan spares adskillige timer.

Det er vigtigt, at de ønskede næringsstoffer kan sættes til recirkuleringsmediet, når som helst det er påkrævet, og mediet også gennemstrømmes med luft med den maksimale nyttige hastighed uden risiko for fysisk skade på cellerne. Desuden kan fremgangsmåden udføres i et lukket system, der f. eks. kan steriliseres, eksempelvis ved hjælp af dampinjektion, og der optræder derfor ingen risiko for sygdomssmitte fra dråber og spildt materiale, således som ved den 8 141911 almindelige teknik.

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen, der skematisk viser forbindelsen mellem et trykfilter indeholdende et bærerleje og en dyrkningsbeholder med tilknyttet udstyr.

I figuren er en almindelig dyrkningsbeholder A forsynet med et elektrodesystem B, og medium fra beholderen kan pumpes via en pumpe C ind i et trykfilter D, der understøtter et bærerleje E. Patronfiltre. F og membranfiltre G tjener til filtrering af virusudbyttet før det ledes til en inaktiveringstank H.

Eksempel 1

Fremstilling af diatoméjordfilterlejer.

Filterlejer anvendt i celle-dyrkningssystemet ifølge opfindelsen var af tre slags a) Et enkelt leje blev fremstillet ved pumpning af en vandig opslemning af 3000 g "Dicalite" ® 4200 med retentionsmål 1,2 ym gennem den centrale åbning i de horisontale plader i et Calmic 45-S-9 trykfilter og ned gennem hver enkel plade, (S) hvorved der dannes et lag af "Dicalite"^ på hver plade. Filtersystemet blev så steriliseret ved dampinjektion. Umiddelbart før filtrering af virusudbyttet blev 1500 g steriliseret diatoméjord-filterhjælp med retentionsmål 0,2ym sat til virusudbyttet.

b) Et enkelt leje blev fremstillet som under a) ved pumpning af 4000 g "Dicalite"® gennem trykfilteret. 500 g steriliseret diatoméjord-filterhjælp blev sat direkte til bærerlejet umiddelbart før steriliseringsfiltreringen.

c) Et multileje blev fremstillet ved pumpning af de følgende typer diatoméjord gennem trykfilteret i den angivne rækkefølge: 100 g af det under navnet "Hyflo Supercel" forhandlede produkt med retentionsmål 0,5 ym, lOOOg diatoméjord-filterhjælp, 2000 g "Hyflo Supercel" og 1000 g "Dicalite"'^ 4200, hvilket system ikke behøver yderligere tilsætning af diatoméjord ved slutningen af virusdyrkningstrinnet. Calmic-trykfilteret blev 5 2 steriliseret ved dampinjektion ved 1,37 x 10 Newton/meter og holdt under positivt tryk med steril luft indtil anvendelsen. Under anvendelsen blev filterets temperatur reguleret ved cirkulation af vand gennem filterets kappe.

161911 9

Eksempel 2

Fremstilling af FMD virus fra BHK21 suspensionBceller i bærerlejet.

En kultur på 650 liter medium indeholdende ca. 7 x 105 celler pr. ml af en klon af babyhamsternyreceller (BKH21) blev påbegyndt i en steril 700 liter lukket dyrkningsbeholder, som var passende udstyret til pH kontrol, til forskellige næringsstoffer under celle-dyrkningen og virusvæksten og med en oxygenelektrpde til bestemmelse af koncentrationen af opløst oxygen (pQ^)·

Det anvendte dyrkningsmedium var modificeret Eagles Medium (virology 16, 147 (1962)) tilsat 10% v/v bovinserum. Temperaturen under celledyrkningen blev holdt på 35 - 0,25°C, pg omrøringsbastig-heden med et frem- og tilbagegående blad blev indstillet til· 36 slag/ minut. En luftstrøm blev holdt på en hastighed af 5 liter/minut over toppen af mediet, og pH blev indstillet på 7,4 og automatisk holdt dér inden for området - 0,03 pH enheder med en strøm af carbondioxid-gas på 10 liter/minut gennem mediet eller ved tilsætning af 4 molær natriumhydroxidopløsning. En yderligere strøm blev automatisk ledet gennem dyrkningsmediet med en hastighed på 15 liter/minut, når afløsning af oxygenelektroden angav, at dette var nødvendigt. Den mak- g simale koncentration af celler, ca. 2,5 x 10 celler/*11!' blev opnået efter 50 timer, og cellekulturen blev så cirkuleret ved 20 liter/mi-nut tre gange gennem multilejefilteret, fremstillet som angivet i eksempel‘1 c), Celletællingsbestemraelser på prøver udtaget fra mediet umiddelbart efter filteret med 15 minutters mellemrum angav, at på dette trin er ca. 96% af cellerne ved den maksimale koncentration blevet immobiliseret i hæterlejet· Det brugte, i hovedsagen cellefri medium blev så pumpet til en spildbeholder, hvorved man fik bærerlejet dækket af medium indtil virusdyrkningstrinnet.

650 liter virusdyrkningsmedium omfattende modificeret Eagles Medium indeholdende 1% v/v bovinserum blev sat til dyrkningsbeholderen og indstillet på 35°C. Celle-dyrkningsmediet i filteret blev drænet, og cirkulation af virusmedium gennem filteret blev påbegyndt. Mediet i dyrkningsbeholderen blev så podet med 200 ml suspension af en stamme af FMD virus kaldt type A Pando, som var blevet tilpasset til vækst i BHK21 celler. Det podede medium blev recirkuleret gennem filteret i ca. 48 timer med en strømningshastighed på 20 liter/minut, idet antallet af medieskift i filtøret var ca. 20/tixne og i det totale dyrkningsrumfang ca. 2/time. Den hastighed, med hvilken mediet strømmede gennem bærerlejet, var ca. 1,8 cm/minut. Mediets U1911 ίο pH blev reguleret på en pH-værdi på 7,4, ved automatisk injektion af luft og carbondioxidgas gennem mediet.

Viruset formerede sig i de i bærerlejet immobiliserede celler 7 5 til en titer på 10 ' plaque-dannende enheder (pfu)/ml dyrkningsvæske, idet prøver til plaque-afprøvning blev udtaget fra dyrkningsvæsken med regelmæssige mellemrum i løbet af dagen. Den maksimale titer i en komplement-fikseringstest var 1/12.

Afslutningen af virusdyrkningsperioden blev bestemt ved måling af pC>2 i dyrkningsmediet, og kulturen blev høstet, når pC^-vær-dien var vokset til en værdi svarende til værdien ved luftmætning. Mediet i filteret blev så sendt tilbage til dyrkningsbeholderen ved hjælp af lufttryk, og filteret isoleret fra systemet. Virusudbyttet i mediet blev udpumpet gennem et totrinsbakterielt, steriliserende filtreringssystem, som forud var blevet steriliseret ved dampinjektion .

Ved første trin blev virusdyrkningsmediet indstillet på en pH-værdi på 7,6 med 2 molær glycinpuffer og derpå filtreret ved stuétemperatur og med en gennemstrømningshastighed på 6,8 1/minut gennem to "Balston cartridge depth"filtre (47,5 cm x 3 cm) af bundne glasfibre . Filterpatronerne med et retentionsmål på 0,35 Mm blev anbragt parallelt til tilvejebringelse af et filtreringsareal på 1500 cm .

I det andet trin blev medium fra patronfiltrene pumpet i samme mængde ved et tryk på 4,8 til 6,2 x 10^ N/m2 gennem 20 Schleicher og

Schiill membranfiltre (20 cm x 20 cm), retentionsmål 0,22 ym. Disse 2 giver et effektivt filtreringsareal på 6500 cm eller ca. 100 ml 2 filtrat/cm filtreringsareal.

Det herved opnåede antigen blev inaktiveret i den præsteriliserede inaktiveringsbeholder ved behandling med acetylethylenimin (AEI) og forarbejdet til en vaccine indeholdende 2 ml inaktiveret virusfiltrat, 25 rumfangsprocent 2% w/v aluminiumhydroxid og 5 mg saponin pr. kvægvaccinedosis. Vaccinen blev prøvet på kvæg ved indpodning af levende virus 21 dage efter vaccinationen og fandtes at have en PD^q på 29,7 (PD^q er den beskyttelsesdosis, ved hvilken 50% af kvæget overlever inficeringen med levende virus). Dette viser den relative styrke af vaccinen.

Eksempel 3

Fremstilling af FMD virus fra BHK21 suspensionsceller i bærerlejet.

I overensstemmelse med den i eksempel 2 angivne fremgangsmåde blev SAT.2 Swz. 1/69 stamme af FMD dyrket, filtreret, inaktive- 11 141911 ret og forarbejdet til en vaccine. Afprøvet i kvæg havde vaccinen en virkningsværdi på 29,3 PD50/dosis beregnet ud fra titerniveauet af cirkulerende antistof i kvæget 21 dage efter vaccinationen. Eksempel 4 Vækst af virus ved de beskrevne fremgangsmåder ved anvendelse både af enkelt- og multileje-teknik blev undersøgt ved anvendelse af flere forskellige FMD-stammer. Den følgende tabel viser eksempler på infektivitet og maksimal komplement-fikseringsværdi opnået ved de forskellige anvendte stammer:

Skala Diatomit- Virus-stamme Infektivitet Komplement- (liter) leje (log.npfu/ml) fiksering (cfu/ml) 30 Enkelt SAT.l-Rho 5/66 6,7 1/16 " " O-BFS 1860 6,8 1/16 " " " 6,4 Vl2 650 " A Pando 6,3 /24 " " " 6,8 1/12 " Multi " 7,5 l/12 " " " 7,3 1/8 " " SAT.l-Rho 5/66 6,4 1/6 " " " 7,0 Ve " " SAT.2-SWZ. 1/69 7,1 1/6 " " " 6,1 1/8 " " SAT.3-BEC. 1/65 7,2 λ/5 " " " 6,8 Ve.

Eksempel 5

Fremstilling af FMD virus ud fra IBRS 2 svinenyrecellelinie i bærerleje.

Fremgangsmåde ifølge eksempel 2 og 3 blev gentaget ved anvendelse af IBRS 2-celler med en passende FMD virus. En vaccine med en tilfredsstillende virkningsværdi blev opnået og afprøvet på kvæg med levende virus 21 dage efter vaccinationen.

Eksempel 6 Vækst af BHK21-celler i bærerleje i filtret.

500 1 celle-dyrkningsmedium omfattende modificeret Eagles Medium indeholdende 10% v/v bovinserum blev sat til en 700 1 dyrkningsbeholder, og mediet bragt på en temperatur på 35°C og derefter podet