DK142343B - Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine ved dyrkning af mikroorganismer, navnlig virus, i eucaryotiske celler. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1^-23^-3 (w) \βη/ DANMARK (51) lnt C|3 A 61 K 39/12 // c 12 n 5/oo §(21) Ansøgning nr. 55I/75 (22) Indleveret den 14. feb. 1975 (24) Løbedag 25. apr. 1973 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 20 . okfc. 1930

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begseret fra den

26. apr. 1972, 19387/72, GB

(71) THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED, 183-193 Eufiton Road, London, N.W. 1, GB.

(72) Opfinder: Ronald Charles Telling, Furzsholme, Dawneys Hill, Pir bright,’

Woking, Surrey, GB: Roy John Passlngham, 31 Lea Wood Road, Fleet, Hants., GB: Brian Lewis Kitchener, l4T Beta Road, Cove, Farnborough, Hants., GB:

David George HopTclnson, 12 Windermere Close, Cove, Farnborough, Hants., GB. ~ (74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Internatlonalt Patent-Bureau.___., _ (54) Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine ved dyrkning af mlkroor** ganismer, navnlig virus, i eucaryotlske celler.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine ved dyrkning af mikroorganismer, navnlig virus, i eucaryotiske celler, hvorved forstås celler med en egentlig, af en membran omgivet kærne indeholdende kromosomer, der kan dele sig ved mitose eller meiose. Sådanne celler kan f.eks. være pattedyrceller eller humane celler.

Det er kendt, at mange forskellige cellekulturer, især af animalsk eller human oprindelse, kan opretholdes som monolag på den jævne overflade af et fast underlag, f.eks. Petri-skåle, glasflasker eller rør. Så snart sådanne kulturer bliver "sammenløbende", dvs. danner et samlet lag af ensartet tykkelse, kan et virus indføres i det flydende medium, der dækker cellerne, og kulturen kan anvendes til dyrkning af vira i monolagsystemet. Mange typer celler kan desuden med fordel dyrkes i suspension, dvs. væsentlig dispersion i næringsmediet, og samme teknik kan også anvendes til dyrkning af vira i suspenderede celler. Apparatur til formålet 142343 2 omfatter sædvanligvis en lukket beholder eller tank med passende midler til omrøring, kontrol af miljøfaktorer, f.eks. pH, pO^, tilførsel af næringsstoffer (jfr.britisk patentskrift nr. 1.090.758 ).

I det konventionelt anvendte system, f.eks.til dyrkning af cellelinier i suspensionskultur, holdes cellerne i en submers omrørt tilstand i mediet og sedimenteres på grund af tyngden, når topkoncentrationen er nået. Mediet decanteres så af, og cellerne resuspenderes i et friskt medium, som også kan indeholde viruspartikler. Efter et tidsrum med virusvækst, som bestemmes ved iagttagelse af den cytopatiske virkning af cellerne, ledes udbyttet sædvanligvis gennem et filter og derpå gennem en bakteriesteriliserende membran til opnåelse af en opløsning, der indeholder frie vira frigjort af de sønderbrudte celler,

En vanskelighed ved store suspenderede kulturer af pattedyrs celler er, at gennemstrømning af luft gennem mediet med høj hastighed kan skade cellerne, samtidig med at en vis mængde oxygentilførsel hele tiden er nødvendig til optimal vækst.

Andre vanskeligheder er, at sedimentationen af cellerne er en tidskrævende proces (ea. 24 timer), de sedimenterede celler kan udsættes for et ugunstigt mediemiljø med hensyn til pH og næringsmiddelfaktorer, og kun 95% af det anvendte medium kan drænes fra uden risiko for tab af en væsentlig mængde af cellerne. Under filtrering af virusudbyttet udøver de medfølgende cellerester desuden en stoppende virkning på filtermediet og forholdet mellem filtreret rumfang og filtreringsareal må være lille til opnåelse af steriliserende filtrering. Dette kan forårsage alvorlige tab (op til 50%) af viralt antigen på grund af adsorption af virus både på filtermediet, især hvis dette indeholder asbest, og på de tilbageværende cellerester. Desuden er én stor vertikal filterpresseplade nødvendig til tilvejebringelse af a-dekvat filtrering, hvilket sædvanligvis forårsager væsentligt volumentab og, da det ikke er et lukket system, følgelig udgør en alvorlig risiko for sygdomsfremkaldelse.

Disse ulemper kan i det væsentlige undgås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, at de eucaryotiske celler, der er fordelt i et bærerlegeme eller -leje af porøst eller partikelformet materiale, som tilvejebringer indre hulrum eller mellemrum, der er tilstrækkelige til at tilbageholde cellerne og muliggøre deres vådest og formering såvel som passage af flydende næringsmedium i kontakt med cellerne, inficeres med en mikroorganisme, som kan angribe cellerne, at de inficerede celler dyrkes i næringsmediet, indtil de brydes ved væksten af mikroorganismerne, at mikroorganismerne derefter adskilles fra celle-resterne, om nødvendigt under yderligere fjernelse af bakteriel forurening ved filtrering, og at mikroorganismerne derefter oparbejdes til en vaccine.

Bæreren kan passende tilvejebringes i form åf et filterleje, og kan bestå af naturlige eller syntetiske materialer, f.eks. silikater af diatoméjordtypen, såsom infusoriejord, eller glas eller polymerpartikler. F.eks. er forskellige former for 1423A3 3 filterhjælp af diatoméjord, specielt kiselgur eller partikelformet diatomit egnet til dette formål. Andre materialer, der kan anvendes, omfatter spundet glas, cellulosepuder, nylon- eller polystyrenperler. Alle disse materialer er praktisk talt uopløselige og biologisk i det væsentlige indifferente.

Størrelsen af porerne eller det for celleva&sten til rådighed værende rum i et leje af partikelformede materialer kan vælges på passende måde og indstilles efter kravene. Det er ofte nødvendigt at vælge, et "retentionsmål", der angiver filtreringsevnen af det materiale, der effektivt ville tilbageholde cellerne men tillade hurtig gennemstrømning af væskerne. Således kan.passende anvendes diatomé-jord med et retentionsmål på 0,1 ym til 2,00 ym, fortrinsvis mellem 0,2 ym og 1,2 ym, f.eks. ca. 0,4 ym til 0,6 ym. Materialerne forarbejdes passende ved fjernelse af forureninger og infektionskilder og renses og fraktioneres efter deres partikelstørrelse og andre krav.

Mere end én type bærermateriale kan anvendes til opbygning af en passende bærer for cellerne. Et sådant multilejesystem kan med fordel anvendes til forøgelse af retentionen og kan f.eks. omfatte på hinanden følgende lag af materiale med 0,5, 0,2, 0,5 og 1,2 turn's retentionsmål fra en basal perforeret understøttelsesplade eller et filter til toppen. Hvis der anvendes et enkelt lag, kan dette også skulle forsynes med et yderligere toplag med lavt retentionsmå 1^ f.eks. 0,2 tun, umiddelbart før den endelige filtrering til for øgelse af retentionen af mindre partikler.

Enhver type celle, der egner sig til vadest enten i monolag eller i suspension, kan inkorporeres i dyrkningssystemet. 1 denne sammenhæng omfatter celletyperne primære og sekundære cellekulturer og diploide og heteroploide cellelinier eller stammer af pattedyrisk eller human oprindelse. F.eks. er den velkendte IBRS2 grisenyreceIle linie eller babyhamstercelle linde klon 21 (BHK21) særligt egnet til dette formål. Forså vidt angår celler, der kun kan vokse og anvendes i monolag er dyrkaingssystemet yderst velegnet for alle væksttrin og også for på- . følgende dyrkning af mikroorganismer, såsom vira. Andre celler, der kan dyrkes effektivt i suspensionskulturer, kan først dyrkes på denne måde og derpå Inkorporeres i dyrkningssystemet til mikroorganismedyrkning og udvinding, idet man inficerer cellerne i dyrkningssysternet med mikroorganismer, såsom vira, for hvilke cellerne er modtagelige. Naturligvis kan andre typer af eucaryotider, f.eks. mycophytø, såsom gærarter, også anvendes på bæreren i et passende næringsmedium.

Fremgangsmåden er især egnet til dyrkning af vira i cellelinier og kan derfor anvendes med fordel til fremstilling af viral vaccine efter passende inaktive-: ring om nødvendigt. Med fordel er det virus, der anvendes i fremgangsmåden ifølge opfindelsen, et mund- og klovsygevirus (i det følgende kaldet FMD-virus).

142343 4

Standard .horisontale trykfiltre kan f.eks. anvendes til underlag for dyrknings-systemet, men det er passende at anvende et GalmiS »high duty” horisontal plade-trykfilter, såsom Galmic 45-S-9 E-type filter, der fremstilles af Cailmic Engineering

Ltd., Greve. Et sådant filter omfatter ni horisontale pladeenheder hver med diameter 2 45 cm og med et totalt filtreringsareal på 1,26 m . Hver pladeenhed omfatter en perforeret rustfri stålplade anbragt på en rustfri stålplade med fordybninger. Et underlag, f.eks. af papir eller rayon, kan anvendes på den perforerede plade til understøtning for filterlejet.

Ved freristilling af et dyrkningsleje- kan opslemninger af passende typer bærermateriale pumpes fra en passende beholder gennem pladefilteret, hvorved bæreren tilbageholdes på pladen. For hvert lag recirkuleres opslemningen flere gange, indtil filtratet er klart, hvorved man får den nødvendige tykkelse af bærerlejet på underlaget eller det tidligere lag, hvilket f.eks. kan være ca. 8 mm til 20 mm, fortrinsvis 10 mm til 14 mm og helst 12 mm.

Sædvanligvis består et enkelt lag af materiale med et relativt stort reténtionsmål·, f.eks. 0,75 til 2,0 ym, fortrinsvis 1,2 ym, og i tilfælde med et multilejesystem, påfølgende lag med relativt lille retentionsmål, f.eks. 0,1 til 0,75, passende 0,2 til 0,5 ym.

Dyrkningsbeholderen kan være af den sædvanlige type, forsynet med en omrører og midler til måling og kontrol af pH, temperatur og til indførsel af luft eller oxygen til gennemluftning af mediet. Den kan yderligere have en oxygenelektrode, der måler opløst oxygen i dyrkningsmediet og som følge deraf kan anvendes som beskrevet i det følgende til bestemmelse af varigheden af virusvækstperioden.

Vilkårlige dyrkningsmedier,som vides at være egnede til vækst af celler, og/eller mikroorganismer, f.eks. vira i forbindelse med celler, kan anvendes, f.eks. Eagles Basal Medium (Science, 122, 501 (1955)) eller modificeret Eagles Medium (Virology, 16, 147 (1962)). Mediet kan også indeholde f.eks. 10% v/v bovinserum for vækst af BHK21 suspension cellelinier og en formindsket mængde serum, f.eks. 1% serum for vækst af mund- og klovsyge virus på denne cellelinie.

Mund- og klovsyge forårsages af mange antigent forskellige virustyper, af hvilke flere er blevet fundet i særlige områder. F.eks. forekommer type 0, Δ og C i Europa og Sydamerika, type SAT1, SAT2 og SAT3 i Sydafrika og type 0, A og Asia I og SAT1 i det nære Østen. De stammer af FMD/virus, der indfri nu er fundet egnede til vækst ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er A Pando, 0 BFS 1860, SAT1 Kho-5/66, SAT2 Swz. 1/69 og SAT3 Bec 1/65.

Fremgangsmåden· kan udøves på to måder afhængigt af om cellesystemet normalt gror i suspensions- eller monolagskultur. I første tilfælde dyrkes cellerne i en submers kultur i en omrørt beholder på almindelig måde og filtreres igennem og tilbageholdes på lejet, når cellerne.har opnået deres maksimale koncentration.

5 142343

Celler, der kun egner sig til monolagsdyrkning, kan på den anden side dyrkes med fordel i dyrkningssystemer I sidstnævnte tilfælde kan det passende dyrkningsmedium i dyrkningsbeholderen således podes med levende celler og derpå øjeblikkelig cirkuleres gennem det forud fremstillede bærerleje, hvorpå cellerne indlejres og immobiliseres i lejet. Dyrkningsmediet cirkuleres så kontinuerligt gennem celledyrkningsperioden. 1 begge tilfælde kan medium, der egner sig til virusvækst, derpå sættes til dyrkningsbeholderen, og cellerne podes med viruset. Mediet cirkuleres igen kontinuerligt gennem lejet, således at denne virus kan formere sig i de i bærerlejet indlejrede celler. Når viruset ødelægger cellerne, forbliver de derved dannede rester i bærerlejet, og viruset frigøres i mediet.

Selvom cellevækst i bærerlejet ikke direkte kan observeres, så kan vaksten let måles ved glucoseudnyttelse. Tidsrummet for virusvæksten kan bestemmes indirekte ved aflæsning af oxygenelektroden, der giver koncentrationen af opløst oxygen (pOg) i dyrkningsmediet. 1 de tidligere trin af virusdyrkningen er oxygenoptagelsen af de metaboliserende celler større end oxygenopløsningshastigheden i dyrkningsmediet, og følgelig falder opløst pO^. Når cellerne dør som resultat af en virusinfektion er der et kontinuerligt faldende oxygenbehov til cellemetabolisme, hvilket behov eventuelt er mindre end oxygenopløsningshastigheden, således at opløst pO^ stiger. Denne forandring kan derfor anvendes til måling og kontrol af virusdyrk-ningstrinnet, og det har vist sig fordelagtigt at udvinde viruskulturen, når opløst pC>2 i dyrkningsmediet er ca. i ligevægt med pO^-værdien for betingelser med luftmætning .

Den almindelige operationsrækkefølge ved udførelse af fremgangsmåden f.eks. med celler, der kan dyrkes i suspensionskulturer, er som følger. Celledyrkningen påbegyndes i en omrørt beholder på almindelig måde, idet mediets pH er ca. 7,4 og temperaturen ca. 35°C i de fleste tilfælde. Et bærerleje frembringes så ved pumpning af en vandig opslemning af et passende beskaffent bærermateriale, f.eks. diatoméjord kontinuerligt gennem et passende filter, fortrinsvis under tryk, og systemet steriliseres og holdes i denne tilstand indtil anvendelse. Når cellerne har nået deres maksimale koncentration ledes cellekulturen gennem lejet med en hastighed på ca. 20 liter pr. minut, hvorved de fleste af cellerne immobiliseres i bærerlejet. Dyrkningsmediet og eventuelle ikke opfangede celler pumpes tilbage i dyrkningsbeholderen og recirkuleres gennem filteret, indtil det tidspunkt, hvor mindre end 10% af cellerne, fortrinsvis mindre end 5% viser sig at passere geniæra systemet. Dette kan bestemmes indirekte ved celletælling med mellemrum og når recirkulationstrinnet på prøver udtages fra filtrat umiddelbart efter filteret. Filtratet pumpes så til en spildvandsafdeling, efterladende cellerne dækket af det i filteret tilbageholdte medium, i det mindste indtil virusvæksttrinnet påbegyndes.

6 1423A3

Til virusvækst indføres sædvanligvis et nyt medium med en anden sammensætning og ledes gennem celle-dyrkningssystemet. En passende virus art, overfor hvilken cellerne er modtagelige, kan indføres til infektion af kulturen. Efter sønderdeling af cellerne ved virusfoimeringen, dvs. efter at den cytopatiske.i virkning har fundet sted, frigøres en stor mængde virus og føres bort med mediet.

Medium indeholdende viruspartikleme adskilt fra celleresterne på denne måde kan nu oplagres eller fortrinsvis filtreres, idet enhver bakteriel kontaminering fjernes fra mediet. Det virale antigen kan så iiaktiveres med et passende inaktiveringsmedium, såsom formaldehyd eller især acetylethylenimin, og forarbejdes til en.-vaccine, som fortrinsvis omfatter et tilsætningsstof, såsom aluminiumhydroxid, med fordel kombineret med saponin.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, undgås det tidskrævende sedimentationstrin, hvor cellerne ifølge den almindelige teknik ofte holdes i et uheldigt miljø i længere tidsrum. Fjernelse af anvendt céllemedium kan nu ske hurtigt og mere eller mindre fuldstændigt. Yderligere kan omskiftningen fra celledyrkningsmediet til virusvækstmediet ske let og hurtigt( og man undgården krydsforurening af de medier, som ofte forekommer i konventionelle systemer. Cellerne kan nemt vaskes mellem trinnene om nødvendigt.

Da celler og cellerester forbliver i bærerlejet, kan den pre-*filtrering, som er vigtig for at opnå høj gennemstrømning under det endelige bakteriologiske sterila-tionsfiltreringstrin,med fordel inkorporeres i virusvæksttrinnet, hvorved der kan Spares adskillige timer.

Det er vigtigt, at de ønskede næringsstoffer kan sættes til recirkuleringsmediet, når som helst det er påkrævet, og mediet også gennemstrømmes med luft med den maksimale nyttige hastighed uden risiko for fysisk skade på cellerne. Desuden kan fremgangsmåden udføres i et lukket system, der f.eks. kan steriliseres, eksempelvis ved hjælp af dampinjektion, og der optræder derfor ingen risiko for sygdomssmitte fra dråber og spildt materiale, således som ved den almindelige teknik.

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen, der skematisk viser forbindelsen mellem et trykfilter indeholdende et bærerleje og en dyrkningsbeholder med tilknyttet udstyr.

I figuren er en almindelig dyrkningsbeholder A forsynet med et elektrodesystem B, og. medium fra beholderen kan pumpes via en pumpe C ind i et trykfilter D, der understøtter et bærerleje E. Patronfiltre F og membranfiltre G tjener til filtrering af virusudbyttet før det ledes til en inaktiveringstank H.

7 142343

Eksempel 1

Fremstilling af diatoméjordfilterlejer.

Filterlejer anvendt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen var af tre slags a) Et enkelt leje blev fremstillet ved pumpning af en vandig opslenming af 3000 g'Dicalite'1 ® med refcentionsmål 1,2 ym gennem den centrale åbning i de horisontale plader i et Calmic 45-S-9 trykfilter og ned gennem hver enkel plade, hvorved der dannes et lag af'Dicalite"(§)på på hver plade. Filtersysternet blev så steriliseret ved dampinjektion. Umiddelbart før filtrering af virusudbyttet blev 1500 g steriliseret diatomé jord-filterhjælp med retentionsmål 0,2 ym sat til virusudbyttet.

b) Et enkelt leje blev fremstillet som under a) ved pumpning af 4000 g "Di-calite'© gennem trykfilteret. 500 g steriliseret diatoméjord-filterhjælp blev sat direkte til bærerlejet umiddelbart før steriliseringsfiltreringen.

c) Et multileje blev fremstillet ved pumpning af de følgende typer diatoméjord gennem trykfilteret i den angivne rækkefølge: 100 g af det under navnet "Hyflo Supercel" forhandlede produkt med retentionsmål 0,5 ym, 1000 g diatoméjord-filterhjælp, 2000 g "Hyflo Supercel" og 1000 g "Di-calite'©4200, hvilket system ikke behøver yderligere tilsætning af diatoméjord ved slutningen af virusdyrkningstrinet. Calmic-trykfilteret blev steriliseret ved dampinjektion ved 1,37 x 10 Newton/meter og holdt under positivt tryk med steril luft indtil anvendelsen. Under anvendelsen blev filterets temperatur reguleret ved cirkulation af vand gennem filterets kappe.

Eksempel 2

Fremstilling af FMD virus fra BHK21 suspensionsceller i bærerlejet.

En kultur på 650 liter medium indeholdende ca, 7 x 105 celler pr. ml af en klon af babyhamsternyreceller (BKH21) blev påbegyndt i en steril 700 liter lukket dyrkningsbeholder, som var passende udstyret til pH kontrol, til tilsætning af forskellige næringsstoffer under celledyrkningen og virusvæksten og med en oxygenelektrode til bestemmelse af koncentrationen af opløst oxygen (PO2).

Det anvendte dyrkningsmedium var modificeret Eagles Medium (Virology 16, 147 (1962)) tilsat 10% v/v bovinserum. Temperaturen under celledyrkningen blev holdt på 35 -i 0,25°G, og omrøringshastigheden med et frem- og tilbagegående blad bier indstillet til 36 slag/minut. En luftstrøm blev holdt på en hastighed af 5'liter/minut over toppen af mediet, og pH blev indstillet på 7,4 og automatisk holdt der indenfor området - 0,03 pH enheder med en strøm af carbondioxidgas på 10 liter/minut gennem mediet eller ved tilsætning af 4 molær natriurahydroxidopløsning. En yderligere 142343 8 strøm blev automatisk ledt gennem dyrkningsmediet med en hastighed på 15 liter/minutf når aflæsning af oxygenelektroden angav, at dette var nødvendigt. Den maksimale koncentration af celler, ca. 2,5 x 10^ celler/ml, blev opnået efter 50 timer, og cellekulturen blev så cirkuleret ved 20 liter/minut tre gange gennem multileje-filteret, fremstillet som angivet i eksempel 1 c). Celletællingsbestemmelser på prøver udtages fra mediet umiddelbart efter filteret med 15 minutters mellemrum angav* at på dette trin er ca. 96% af cellerne ved den maksimale koncentration blevet immobiliseret i bærerlejet. Det brugte, i hovedsagen cellefri medium blev så pumpøt .til en spildbeholder, hvorved man fik bærerlejet dækket af medium indtil virusdyrkningstrinnet.

650 liter virusdyrkningsmedium omfattende modificeret Eagles Medium indeholdende 1% v/v bovinserum blev sat til dyrkningsbeholderen og indstillet på 35°C. Celle-dyrkningsmediet i filteret blev drænet, og cirkulation af virusmedium gennem filteret blev påbegyndt. Mediet i dyrkningsbeholderen blev så podet med 200 ml suspension af af en stamme af FMD virus kaldt type A Pando, som var blevet tilpasset til vækst i BHK21 celler. Det podede medium blev recirkuleret gennem filteret i ca. 48 timer med en strømningshastighed på 20 liter/minut, idet antallet af medieskift i filteret var ca. 20/time og i det totale dyrkningsrumfang ca. 2/time. Den hastighed, med hvilken mediet strømmede gennem bærerlejet, var ca. 1,8 cm/minut.

Mediets pH, blev reguleret på en pH-værdi på 7,4 Ved"automatisk-injektion af luft og carbondioxidgas gennem mediet.

Viruset formerede sig i de i bærerlejet immobiliserede celler til en titer på 107>5 plaque-dannende enheder (pfu)/ml dyrkningsvæske, idet prøver til plaque-afprøvning blev udtaget fra dyrkningsvæsken med regelmæssige mellemrum i løbet af dagen. Den maksimale titer i en komplement-fikseringstest var 1/12.

Afslutningen af virusdyrkningsperioden blev bestemt ved måling af p0^ i dyrkningsmediet, og kulturen blev høstet, når p02~værdien var vokset til en værdi svarende til værdien ved luftmætning. Mediet i filteret blev så sendt tilbage til dyrkningsbeholderen ved hjælp af lufttryk, og filteret isoleret fra systemet. Virusudbyttet i mediet blev udpumpet gennem et totrinsbakterielt, steriliserende filtreringssystem, som forud var blevet steriliseret ved dampinjektion.

Ved første trin blev virusdyrkningsmediet indstillet på en pH-værdi på 7,6 med 2 molæt glycinpuffer og derpå filtreret ved stuetemperatur og med en gennemstrømningshastighed på 6,8 1/minut to "Balston cartridge depth filtre"(47,5 cm x 3 cm) bundne glasfibre. Filterpatronerne med et retentionsmål på 0,35^m blev anbragt parallelt til tilvejebringelse et filtreringsområde på 2 1500 cm . I det andet trin blev medium fra patronfiltrene pumpet i samme mængde 4 2 ved en tryk på 4,8 til 6,2 x 10 N/m gennem 20 Schleicher og SchUll membranfiltre ( 20 cm x 20 cm), retentionsmål 0,22 jim. Disse giver et effektivt 2 2 filtreringsområde på 6500 cm eller ca. 100 ml filtrat/ cm filtreringsområde.

9 142343

Det herved opnåede antigen blev inaktiveret i den præsteriliseret inaktiveringsbeholder ved behandling med acetylethylenimin (AEI) og forarbejdet til en vaccine indeholdende 2 ml inaktiveret virusfiltrat, 25 rumfangsprocent 2% w/v aluminiumhydoxid og 5 mg saponin pr. kvægvaccinedosis. Vaccinen blev prøvet på kvæg ved indpodning af levende virus 21 dage efter vaccinationen og fandtes at have en PD^q på 29,7 (PD^q er den beskyttelsesdosis, ved hvilken 50% af kvæget overlever inficeringen med levende virus). Dette viser vaccinens relative styrke.

Eksempel 3

Fremstilling af FMD virus fra BHK21 suspensionsceller i bærerlejet.

I overensstemmelse med den i eksempel 2 angivne fremgangsmåde blev SÅT.2 Swz. 1/69 stamme af FMD dyrket, filtreret, inaktiveret og forarbejdet til en vaccine. Afprøvet i kvæg havde vaccinen en virkningsværdi på 29,3 PD^q beregnet udfra titerniveauet af cirkulerende antistof i kvæget 21 dage efter vaccinationen.

Eksempel 4 Vækst af virus ved de beskrevne fremgangsmåder ved anvendelse både af enkelt- og multileje-teknik blev undersøgt ved anvendelse af flere forskellige FMD-stammer. Den følgende tabel viser eksempler på infektivitet og maksimal komplement— fikseringsværdi opnået ved de forskellige anvendte stammer:

Skala Diatomit- Virus-stamme Infektivitet Komplement— (liter) leje (log. pfu/ml) fiksering (cfu/ml) 30 Enkelt SAT.l-Rho 5/66 6,7 1/16 " " 0-BFS 1860 6,8 1/16 " " " 6,4 Vl2 660 " A Pando 6,3 V24 " » » 6,8 Vl2 " Multi " 7,5 Vl2 » » » 7,3 Ve " » SAT.l-Rho 5/66 6,4 */6 " » » 7,0 Ve " " SAT.2-SWZ. 1/69 7,1 */6 » " " 6,1 Ve " '» SAT.3-BEC. 1/65 7,2 L/5 " π " 6,8 V6

Claims (1)

142343 ίο Eksempel 5 Fremstilling af FMD virus ud fra IBRS 2 svinenyrecellelinie i bærerleje. Fremgangsmåden ifølge eksempel 2 og 3 blev gentaget ved anvendelse af IBRS 2-celler med en passende FMD virus. En vaccine med en tilfredsstillende virkningsværdi blev opnået og afprøvet på kvæg med levende virus 21 dage efter vaccinationen. Eksempel 6 Vadest af BHK21-celler i bærerleje i filtret. 500. celle-dyrkningsmedium omfattende modificeret Eagles Medium indeholdende 10 % v/v bovinserum blev sat til en 700 1 dyrkningsbeholder, og mediet bragt på en temperatur på 35°C og derefter podet med levende celler til dannelse af en begyndelseskoncentration på ca. 7 x 10^ celler pr. ml af en klon af babyham-stemyrer monolag celler (BHK21). Den podede kultur blev sammen med 2000 g "Dicali-te" @4200 med retentionsmål på 1,2 ym øjeblikkelig pumpet gennem et steriliseret filterleje fremstillet ifølge eksempel la) en hastighed på 20 1/min, således at praktisk talt alle celler blev aflejret i filterlejet, idet de blev indlejret i lag af diatoméjord. Celle-dyrkningsmediet blev recirkuleret continu-erligt i 48 timer, og cellerne blev dyrket i bærerlejet, under hvilket tidsrum mængden af dissimileret glukose var 2g/l. Mediet blev så pumpet til en spildbeholder, og frisk virusmedium og podestof af 0-BFS 1860 stammen af FMD virus blev tilsat som i eksempel 1. Det frembragte virus blev filtreret fra, inaktiveret og forarbejdet som bestanddel af en trivalent FMD-vaccine, der indeholdt ækvivalenten af 2 ml af hver af de inaktiverede virusantigener, 25 rumfangsprocent 2 % w/v aluminiumhydroxid og 5 mg saponin pr. kvægdosis. Den trivalente vaccine blev prøvet i kvæg med levende virus 21 dage efter vaccination, og virkningen af 0-BFS 1860 stammen, frembragt som beskrevet i dette eksempel, var 15,3 PD^q.. Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine ved dyrkning af mikroorganismer, navnlig virus, i eucaryotiske celler, kendetegnet ved, at de euca-ryotiske celler, der er fordelt i et bærerlegeme eller -leje af porøst eller partikelformet materiale, som tilvejebringer indre hulrum eller mellemrum, der er tilstrækkelige til at tilbageholde cellerne og muliggøre deres vækst og formering såvel som passage af flydende næringsmedium i kontakt med cellerne, inficeres med en mikroorganisme, som kan angribe cellerne, at de inficerede celler dyrkes i næringsmediet, indtil de brydes Ved væksten af mikroorganismerne, at mikroorganismerne derefter adskilles fra celleresterne, om nødvendigt under yderligere