CN116966155A - 一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外泌体冻干粉的制备方法及应用，属于干细胞领域。本发明的冻干粉包括外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白，其中，外泌体的制备方法包括以下步骤：(1)细胞复苏；(2)扩增培养；(3)发酵罐培养；(4)收集上清液；(5)外泌体纯化。本发明的外泌体冻干粉具有更高的活性和稳定性，具有良好的促进损伤修复效果，有利于储存、运输和应用。
Description
技术领域
本发明属于干细胞领域，具体涉及一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、"运载物"和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。
外泌体富含胆固醇和鞘磷脂。一类外泌体中常见的细胞质蛋白是Rabs蛋白，是鸟苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一种。它可以调节外泌体膜与受体细胞的融合，有文献报道称RAB4，RAB5和RAB11主要出现在早期以及回收的核内体中，RAB7和RAB9主要出现在晚期的核内体。现有大量的研究发现外泌体中含有40种RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌体中富含具有外泌体膜交换以及融合作用的膜联蛋白(包括膜联蛋白1、2、4、5、6、7、11等)。外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族(CD63，CD81和CD9)、热休克蛋白家族(HSP60，HSP70，HSPA5，CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33(结肠上皮细胞来源)、MHC-Ⅱ(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素(不成熟的树突状细胞)。其它一些外泌体中的蛋白包括多种的代谢类的酶(GAPDH，烯醇化酶1，醛缩酶1，PKM2，PGK1，PDIA3，GSTP1，DPP4，AHCY，TPL1，抗氧化蛋白，P4HB，LDH，亲环素A，FASN，MDH1和CNP)、核糖体蛋白(RPS3)、信号转导因子(黑色素瘤分化相关因子，ARF1，CDC42，人类红细胞膜整合蛋白，SLC9A3R1)、粘附因子(MFGE8、整合素)、细胞骨架蛋白以及泛素等。
多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。但不同种类的细胞产生的外泌体具有不同的功能，如肿瘤细胞分泌的外泌体能够促进肿瘤的生长及转移，干细胞分泌的外泌体能够进行免疫调节，外泌体的功能主要由其母细胞决定。
干细胞作为万能细胞，其在延缓衰老、调节机体免疫、修复受损组织等方面展现出强大的能力，而这些功能的发挥主要是由干细胞分泌的外泌体(旁分泌)完成的，因此，干细胞外泌体具有巨大的应用空间。
虽然培养的细胞均能产生外泌体，但通过普通培养细胞的方式产生的外泌体数量有限，且不能使不同批次间的外泌体质量稳定可控，不利于开发为产品。此外，细胞在培养过程中把外泌体分泌到培养基上清液中，但上清液中除了外泌体，还有其他杂质。传统纯化方式是通过梯度离心或者PEG沉淀法来获得较纯的外泌体，但这些方法要么对纯化的体积有要求，要么会引入有害的杂质，均不利于外泌体产品的规模化开发。最后，由于外泌体是杯状囊泡结构，自身比较脆弱，需要冷冻保存，这使其在储存，运输及应用方面带来了许多不便。因此，需要研究一种能保证外泌体活性和稳定性的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用，提高外泌体在储存、运输过程中的活性和稳定性。
为实现上述发明目的，本发明技术方案如下：
一方面，本发明提供一种外泌体冻干粉，包括外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白。
优选地，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.01-1：0.01-0.1：0.5-5：0.01-0.5：0.01-0.5(mL：g：g：g：g：g)。
进一步优选地，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.1-0.3：0.03-0.07：1-3：0.05-0.2：0.05-0.2(mL：g：g：g：g：g)。
最优选地，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.2：0.05：2：0.1：0.1(mL：g：g：g：g：g)。
优选地，所述外泌体为干细胞外泌体。
进一步优选地，所述外泌体为脐带间充质干细胞外泌体。
优选地，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)细胞复苏；
(2)扩增培养；
(3)发酵罐培养；
(4)收集上清液；
(5)外泌体纯化。
进一步优选地，步骤(1)中，所述细胞复苏的条件为37±2℃恒温复苏，复苏时间不超过3min。
进一步优选地，步骤(2)中，所述扩增培养的条件为温度37±1℃、CO2浓度5±0.5％。
进一步优选地，步骤(3)中，所述发酵培养的参数为pH：7.20±0.05，温度：37℃，DO(溶氧浓度)：40.0±20.0％，转速：40±2rpm。
进一步优选地，步骤(5)中，所述纯化为依次进行梯度过滤纯化、超滤浓缩、溶液置换和过滤除菌。
更进一步优选地，所述梯度过滤纯化用囊式滤器进行，优选为1.5+0.8μm囊式滤器。
更进一步优选地，所述超滤浓缩使用中空纤维超滤膜进行，更进一步地，所述中空纤维超滤膜为300kD，所述浓缩的倍数为5-20倍，进一步优选为10倍。
更进一步优选地，所述溶液置换使用PBS(磷酸缓冲盐溶液)进行。所述PBS添加体积为浓缩液的2-8倍，进一步优选为4倍。
所述溶液置换进行3-5次，进一步优选为4次。
进一步优选地，所述过滤除菌使用除菌滤器进行，优选为孔径为0.45+0.22μm除菌滤器。
作为本申请的一个具体实施方式，所述步骤(5)包括以下步骤：
(1)梯度过滤纯化
用1.5+0.8μm囊式滤器进行纯化：用PBS进行过滤器的润洗，后进行上清收获液的过滤，压力不超过0.1MPa。最后使用适量PBS冲洗过滤器并将冲洗液与干细胞上清收获液的滤后液一起混合收集。
(2)超滤浓缩
用300kD中空纤维超滤膜将过滤好的上清液进行超滤浓缩，浓缩8-12倍。
(3)溶液置换
添加PBS与浓缩液混合均匀，PBS添加体积为浓缩液的4倍，混合均匀后继续使用中空纤维超滤膜浓缩至浓缩液的体积，此过程重复进行4次。
(4)过滤除菌
使用0.45+0.22μm除菌滤器对外泌体进行过滤，滤液收集至无菌容器中，用NTA测定得到的外泌体浓度。根据测定结果，在生物安全柜内，用无菌PBS稀释至1.0×1010Particles/mL，并分装至无菌试剂管，放置-20℃以下储存备用。
作为本申请的一个具体实施方式，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)细胞复苏
将脐带间充质干细胞37±1℃恒温复苏，复苏时间不得超过3min。
(2)扩增培养
按照每个细胞培养器接种细胞数量为4.0～8.5×107个，体积为800～1000mL，将细胞接种至细胞培养器中，拧紧容器盖子后，颠倒摇晃培养器使细胞悬液分布均匀并铺满层底面，放入37±1℃、5±0.5％ CO2培养箱中培养。
(3)发酵罐培养
将扩增培养得到的细胞种子加入到罐子中，细胞总数在3～5×108个，按照pH：7.20±0.05，温度：37℃，DO：40.0±20.0％，转速(rpm)：40±2的培养参数进行发酵培养。
(4)收集外泌体
发酵罐停止搅拌，待载体静置沉底，将罐内的上清液排出并收集。
(5)外泌体纯化。
另一方面，本发明提供上述外泌体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
将配方用量的外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸、人血清白蛋白，和水混匀，后经过冷冻干燥制成冻干粉。
优选地，所述冷冻干燥的程序为：
进一步优选地，所述冷冻干燥的程序为：
。
最后，本发明提供上述外泌体冻干粉在制备促进创伤修复药物中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明的外泌体制备方法在发酵罐中进行、纯化方法依次经过梯度过滤纯化、超滤浓缩、溶液置换和过滤除菌，以上方法均可规模化进行，且获得的冻干粉活性高、纯度高，不但解决了外泌体规模化生产、纯化问题，还提高外泌体在储存、运输过程中的活性和稳定性。
(2)具体来看，本发明的冻干粉配方针对所用的外泌体进行了改进，通过选择甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸、人血清白蛋白作为冻干辅助材料，可以显著提高冻干粉的储存稳定性和活性，以上组合材料中的任一成分均缺一不可。
(3)本发明进一步对冻干粉配方的组成比例进行了优化，最终得到外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.01-1：0.01-0.1：0.5-5：0.01-0.5：0.01-0.5(mL：g：g：g：g：g)这一配比下，尤其是外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.2：0.05：2：0.1：0.1(mL：g：g：g：g：g)这一配比下，可以获得更好的储存稳定性和活性。
(4)本发明的冻干粉配方需要配合一定的冻干程序，本发明采取梯度升温、降温、再升温的方法，利用二次降温过程中水分的形态变化，避免冻干粉结构坍缩，提高冻干粉稳定性和活性。进一步地，本发明进一步提出了该冻干过程中的最适宜温度和时间，该条件下获得的冻干粉具有更高的储存稳定性和活性。
附图说明
图1为本发明制备的外泌体检测电镜图。
图2为不同外泌体冻干配方生产的冻干粉中外泌体的含量对比图。
图3为实施例1外泌体冻干粉与新鲜外泌体含量对比图。
图4为不同外泌体冻干粉动物水平损伤修复对比图。
图5为不同外泌体促进细胞增殖对比图。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本发明要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本发明要求保护的范围之中。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。若无特殊说明，下文中所述含量均为质量含量。若无特殊说明，理解为在室温下进行。
下述实施例中，材料来源如下：
脐带间充质干细胞为原代分离培养
1.5+0.8μm囊式滤器购自cobetter，货号为L03HHPLELA1P；
PBS溶液制备方法为：PBS按照40mM 12H2O·Na2HPO4，1.37M NaCl，17.6mM KH2PO4，26.8mM KCl，pH7.4(室温)的配方进行配置。经过除菌过滤，并且通过无菌，支原体和内毒素3项内部检验。
300kD中空纤维超滤膜购自赛多利斯，货号为N04-E300-05-N；
0.45+0.22μm除菌滤器购自cobetter，型号/货号为L03HHSLESS1P；
NTA(粒径分析仪)购自马尔文帕纳科，型号为NS300；
发酵罐购自广州齐志生物工程设备有限公司，型号为BC-7L。
外泌体的制备：
(1)细胞复苏
将脐带间充质干细胞冻存管立即放入37±1℃恒温水浴锅中复苏，复苏时间不得超过3min。待管内溶液解冻后传入洁净工作台。
(2)扩增培养
按照每个细胞培养器接种细胞数量为4.0～8.5×107个，体积为800～1000mL，将细胞接种至细胞培养器中。拧紧容器盖子后，颠倒摇晃培养器使细胞悬液分布均匀并铺满层底面，放入37±1℃、5±0.5％ CO2培养箱中培养。
(3)发酵罐培养
发酵罐进行灭菌后，检查管道连接处是否脱落；先连接深层进气管，调节空气流量，使罐体保持正压；然后依次连接pH电极，DO电极，搅拌器和温度电极。连接收液口，将罐内PBS压出，保证压出完全；连接培养基液瓶及进液口，将培养基按需注入反应器中。将扩增培养得到的细胞种子加入到罐子中，细胞总数在3～5×108个。按照pH：7.20±0.05，温度：37℃，DO：40.0±20.0％，转速：40±2rpm的培养参数进行发酵培养。
(4)收集外泌体
发酵罐停止搅拌，待载体静置沉底，将罐内的上清液排出并收集，间充质干细胞外泌体就在发酵上清液中。
(5)梯度过滤纯化
在生物安全柜内，用1.5+0.8μm囊式滤器进行纯化。先用PBS进行过滤器的润洗，后进行上清液的过滤，压力不超过0.1MPa。最后使用适量PBS冲洗过滤器并将冲洗液与干细胞上清收获液的滤后液一起混合收集。
(6)超滤浓缩
在生物安全柜内，用300kD中空纤维超滤膜将过滤好的上清液进行超滤浓缩，浓缩10倍左右，过程最高浓缩倍数不大于20倍。
(7)溶液置换
添加PBS与浓缩液混合均匀，PBS添加体积为浓缩液的4倍。混合均匀后继续使用中空纤维超滤膜浓缩至浓缩液的体积。此过程重复进行4次。
(8)过滤除菌及冻存
使用0.45+0.22μm除菌滤器对外泌体进行过滤，滤液收集至无菌容器中，用NTA测定得到的外泌体浓度。根据测定结果，在生物安全柜内，用无菌PBS稀释至1.0×1010Particles/mL，并分装至无菌试剂管，放置-20℃以下储存备用。
外泌体冻干粉的制备：
实施例1
取2mL纯化获得的外泌体，加入0.2g甘露醇、0.05g谷氨酸钠、2g山梨醇、0.1g甘氨酸和0.1g人血清白蛋白，98mL纯净水，混匀后经过预冻、主干燥、二次升华等程序制成冻干粉，具体程序参数如下表。
| 序号 | 步骤 | 温度(℃) | 真空设定值(mbar) | 时间(分钟) |
| 1 | 预冻 | -45 | / | 1 |
| 2 | 保温 | -45 | / | 120 |
| 3 | 抽空 | -45 | 0.20 | 30 |
| 4 | 升温 | -18 | 0.20 | 30 |
| 5 | 干燥 | -18 | 0.20 | 60 |
| 6 | 升温 | -7 | 0.20 | 30 |
| 7 | 干燥 | -7 | 0.20 | 540 |
| 8 | 升温 | 0 | 0.20 | 30 |
| 9 | 干燥 | 0 | 0.20 | 120 |
| 10 | 升温 | 15 | 0.20 | 30 |
| 11 | 保温 | 15 | 0.20 | 60 |
| 12 | 降温 | -8 | 0.20 | 30 |
| 13 | 保温 | -8 | 0.20 | 60 |
| 14 | 升温 | 12 | 0.20 | 30 |
| 15 | 保温 | 12 | 0.20 | 50 |
| 16 | 升温 | 37 | 0.20 | 30 |
| 17 | 保温 | 37 | 0.20 | 100 |
| 18 | 解析干燥 | 37 | 极限真空 | 120 |
| 19 | 压塞 | / | / | 30 |
| 20 | 放气 | / | / | / |
| 21 | 出料 | 20 | / | / |
实施例2
取2mL纯化获得的外泌体，加入0.1g甘露醇、0.03g谷氨酸钠、3g山梨醇、0.05g甘氨酸和0.05g人血清白蛋白，98mL纯净水，混匀后经过预冻、主干燥、二次升华等程序制成冻干粉，具体程序参数同实施例1。
实施例3
取2mL纯化获得的外泌体，加入0.3g甘露醇、0.07g谷氨酸钠、1g山梨醇、0.2g甘氨酸和0.2g人血清白蛋白，98mL纯净水，混匀后经过预冻、主干燥、二次升华等程序制成冻干粉，具体程序参数同实施例1。
实施例4
取2mL纯化获得的外泌体，加入0.01g甘露醇、0.1g谷氨酸钠、0.5g山梨醇、0.5g甘氨酸和0.01g人血清白蛋白，98mL纯净水，混匀后经过预冻、主干燥、二次升华等程序制成冻干粉，具体程序参数同实施例1。
实施例5
取2mL纯化获得的外泌体，加入1g甘露醇、0.01g谷氨酸钠、5g山梨醇、0.01g甘氨酸和0.5g人血清白蛋白，98mL纯净水，混匀后经过预冻、主干燥、二次升华等程序制成冻干粉，具体程序参数同实施例1。
对比例1
取2mL纯化获得的外泌体，加入98mL纯净水，混匀后经过预冻、主干燥、二次升华等程序制成冻干粉，具体程序参数同实施例1。
对比例2
取2mL纯化获得的外泌体，加入0.2g甘露醇、5g海藻糖，98mL纯净水，混匀后经过预冻、主干燥、二次升华等程序制成冻干粉，具体程序参数同实施例1。
对比例3
取2mL纯化获得的外泌体，加入1g甘露醇、0.02g谷氨酸钠、5g山梨醇和0.5g人血清白蛋白，98mL纯净水，混匀后经过预冻、主干燥、二次升华等程序制成冻干粉，具体程序参数同实施例1。
对比例4
取2mL纯化获得的外泌体，加入2g甘露醇、0.1g谷氨酸钠、2g山梨醇、0.1g甘氨酸和2g人血清白蛋白，98mL纯净水，混匀后经过预冻、主干燥、二次升华等程序制成冻干粉，具体程序参数同实施例1。
对比例5
取2mL纯化获得的外泌体，加入0.2g甘露醇、0.05g谷氨酸钠、2g山梨醇、0.1g甘氨酸和0.1g人血清白蛋白，98mL纯净水，混匀后经过预冻、主干燥、二次升华等程序制成冻干粉，具体程序参数如下表。
| 序号 | 步骤 | 温度(℃) | 真空设定值(mbar) | 时间(分钟) |
| 1 | 预冻 | -45 | / | 1 |
| 2 | 保温 | -45 | / | 120 |
| 3 | 抽空 | -45 | 0.20 | 30 |
| 4 | 升温 | -18 | 0.20 | 30 |
| 5 | 干燥 | -18 | 0.20 | 60 |
| 6 | 升温 | -7 | 0.20 | 30 |
| 7 | 干燥 | -7 | 0.20 | 540 |
| 8 | 升温 | 0 | 0.20 | 30 |
| 9 | 干燥 | 0 | 0.20 | 120 |
| 10 | 升温 | 15 | 0.20 | 30 |
| 11 | 保温 | 15 | 0.20 | 60 |
| 16 | 升温 | 37 | 0.20 | 30 |
| 17 | 保温 | 37 | 0.20 | 100 |
| 18 | 解析干燥 | 37 | 极限真空 | 120 |
| 19 | 压塞 | / | / | 30 |
| 20 | 放气 | / | / | / |
| 21 | 出料 | 20 | / | / |
结果检测
1、稳定性检测：
对实施例、对比例中的冻干粉进行检测，通过粒径分析(NTA)法对不同配方生产出来的冻干粉中外泌体的含量进行测定。具体过程为：取5mL PBS溶液，对冻干粉进行复溶，然后对冻干粉复溶液进行NTA测定。同时对纯化的外泌体溶液进行测定，作为对照组。具体检测结果见下表及附图2、3。
检测结果如下：
| 粒径(nm) | 浓度(Particles/mL) | |
| 对照组 | 111.7 | 2.07×107 |
| 实施例1 | 112.2 | 2.02×107 |
| 实施例2 | 118.0 | 1.91×107 |
| 实施例3 | 122.3 | 1.88×107 |
| 实施例4 | 124.0 | 1.75×107 |
| 实施例5 | 128.7 | 1.48×107 |
| 对比例1 | 127.2 | 1.25×107 |
| 对比例2 | 129.5 | 1.33×107 |
| 对比例3 | 116 | 1.58×107 |
| 对比例4 | 122.1 | 1.52×107 |
| 对比例5 | 111.0 | 1.90×107 |
结果表明，本发明制备的外泌体冻干粉复溶后检测到的浓度更高，实施例1-5明显优于对比例1、2，说明辅料的选择对复溶后效果具有重要的影响。
2、促细胞增殖结果检测：
通过划痕实验观察外泌体冻干粉对HaCat细胞(人永生化角质形成细胞)增殖的影响。
测试对象：实施例1、对比例4、对比例5制备的外泌体冻干粉。
实验方法：
(1)将5×105的HaCat细胞接种至6孔板中，待细胞重新贴壁生长后用100ul灭菌枪头依照划痕损伤，损伤之后PBS清洗去除损伤的细胞碎片。
(2)把细胞分为两组，一组添加100ul的PBS(对照组)，另一组添加100ul外泌体冻干粉溶液(实验组，冻干粉用PBS溶解)，每组两个平行。
(3)分别在处理后的0h、12h、18h、24h时，用倒置显微镜进行观察，并在低倍镜下拍照，电动倒置荧光显微镜软件测量划痕宽度，计算迁移率。迁移率＝(初始划痕宽度值一相应时间点划痕宽度值)/初始划痕宽度值×100％，数值越大，说明细胞迁移速度越快。HaCat细胞个数为12×5×105＝6×106即细胞计数板浓度为50，准备12mL。
迁移率结果如下：
| 迁移率(％) | |
| 对照组 | 73.39 |
| 实施例1 | 83.95 |
| 实施例2 | 80.96 |
| 实施例3 | 80.58 |
| 实施例4 | 79.47 |
| 实施例5 | 76.94 |
| 对比例1 | 74.40 |
| 对比例2 | 74.98 |
| 对比例3 | 77.75 |
| 对比例4 | 76.94 |
| 对比例5 | 81.45 |
实验结果：相对于对比例4、5，实施,1的外泌体冻干粉能够明显促进细胞增殖，结果如附图4所示，证明组分配比及冻干条件影响外泌体冻干粉的修复能力。
3、促进伤口愈合测试结果
通过机械性皮肤损伤动物模型验证外泌体对伤口愈合的影响。
测试对象：实施例1、对比例4、对比例5制备的外泌体冻干粉。
实验方法：
(1)机械性皮肤损伤动物模型制作
动物称重后，小鼠乙醚麻醉。在麻醉状态下剃除小鼠背部的毛发，然后在剃光的皮肤上用铳子打2个圆孔(直径8mm)，对小鼠全层皮肤进行机械性切除损伤。在背部中线处打孔。
(2)动物分组
将小鼠随机分为5组(n＝5/组)：、PBS空白对照组(阴性对照，200μL)、表皮生长因子EGF(阳性对照，5μg/mL)、外泌体组(治疗组，200μL)。
(3)给药
每隔两天将200μL的药水涂抹到小鼠损伤部位，每隔3-4天对小鼠皮肤损伤部位进行拍照并量取皮肤损伤的面积。
实验结果：相对于对比例4、5，实施例1制备的外泌体冻干粉能够更加明显的促进伤口愈合，结果如附图5所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种外泌体冻干粉，其特征在于，包括外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.01-1：0.01-0.1：0.5-5：0.01-0.5：0.01-0.5(mL：g：g：g：g：g)。
3.根据权利要求2所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.1-0.3：0.03-0.07：1-3：0.05-0.2：0.05-0.2(mL：g：g：g：g：g)。
4.根据权利要求3所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸和人血清白蛋白的体积质量比为2：0.2：0.05：2：0.1：0.1(mL：g：g：g：g：g)。
5.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体为脐带间充质干细胞外泌体。
6.根据权利要求1所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)细胞复苏；
(2)扩增培养；
(3)发酵罐培养；
(4)收集上清液；
(5)外泌体纯化。
7.根据权利要求6所述的外泌体冻干粉，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞复苏的条件为37±2℃恒温复苏，复苏时间不超过3min；
步骤(2)中，所述扩增培养的条件为温度37±1℃、CO2浓度5±0.5％；
步骤(3)中，所述发酵培养的参数为pH：7.20±0.05，温度：37℃，DO(溶解氧浓度)：40.0±20.0％，转速：40±2rpm；
步骤(5)中，所述纯化为依次进行梯度过滤纯化、超滤浓缩、溶液置换和过滤除菌。
8.权利要求1-7任一项所述外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将配方用量的外泌体、甘露醇、谷氨酸钠、山梨醇、甘氨酸、人血清白蛋白，和水混匀，后经过冷冻干燥制成冻干粉。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的程序为：
。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的程序为：
11.权利要求1-7任一项所述外泌体冻干粉在制备促进创伤修复药物中的应用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310788487.3A CN116966155A (zh) | 2023-06-29 | 2023-06-29 | 一种外泌体冻干粉及其制备方法、应用 |
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