CN111349600A - 一种pbmc体外培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人外周血单个核细胞(PBMC)培养基，所述培养基含有以下成分：1640干粉培养基10mg/L、体积分数为10％～20％的胎牛血清、NaHCO3。其制备方法包括以下步骤：步骤一、溶解培养基；步骤二、调节pH值；步骤三、过滤除菌；步骤四、加小牛血清；步骤五、检测。本发明配方简单、操作容易、成本可控，对人外周血单个核细胞培养能够达到较高的扩增倍数及细胞纯度，有利于大规模、标准化生产，未加入其他培养基包含的细胞因子和抗生素等，从而避免这些细胞因子和抗生素等对后续检测的干扰和影响。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种PBMC体外培养基及其制备方法。
背景技术
外周血单个核细胞(PBMC，peripheral blood mononuclear cell)，顾名思义，为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(T细胞和B细胞)，单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。
PBMC广泛应用于基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究，尤其是近年来在肿瘤学和免疫学领域的科研活动，如自体免疫性疾病、传染病、恶性血液病、疫苗开发、移植免疫学等。PBMC的体外培养是很多生物实验室的基本操作，各实验室基本摸索出适合各自研究目的的操作方法。但因为终末需求的不同，以及基础生物和/或医学研究需要的样本量相对较小，各实验室的操作方法各异，而且缺乏统一标准。而由于PBMC能充分反映人体细胞免疫和体液免疫的功能，对于PBMC的研究越来越深入，对PBMC的需求也日益增加。相关的工业化生产和临床应用从法规(如药监)和质量控制等角度，要求研发机构和/或生产厂家建立标准化、稳定、可溯源的PBMC体外培养基，从而满足大量的工业化和/或临床应用需求。
细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力，因此培养级是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基主要组成成分有：氨基酸、水、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。细胞培养的发展，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成分中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的，所以血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。但是细胞培养中使用血清也有很严重的缺点，例如血清成分复杂，虽然含许多对细胞有利成分，也含有对细胞有害的成分；另外，由于动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。同时血清取材过程中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。尤其是在生物制药领域，使用血清培养的工艺在生产过程后期的分离和纯化环节会延长整体生产时间和增加成本。
目前DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用广泛的培养基，很多制备细胞培养基的制备方案需要加入各种刺激因子，如细胞刺激因子(CSF)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF-a)，以及加入抗生素，如青霉素-链霉素等抑制细菌感染。加入过多的成份，不仅增加成本，而且导致制备过程过于繁琐和耗时，同时对后续的检测和分析带来不可预测的影响。而本发明者通过不断的试验摸索，优化了培养条件，既达到了无菌细胞培养的效果，又可以标准化、大规模生产。
发明内容
鉴于目前PBMC体外培养基缺乏统一标准，很多无血清培养基需要添加多种成份，成本较高、操作复杂，相关成份还会对后续的鉴定和检测会产生干扰等不良影响，本发明提供了一种PBMC体外培养基及其配制方法，具体技术方案如下：
一种PBMC体外培养基，所述培养基含有以下成分：1640干粉培养基10mg/L、胎牛血清10-20v/v％、NaHCO3。
一种PBMC体外培养基的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、溶解培养基：将1640干粉培养基溶解在总量1/3-1/2的三蒸水中，得溶解液；再用余下的三蒸水洗涤包装袋内面两次，得洗涤液；之后将溶解液和洗涤液充分混合；
步骤二、调节pH值：加入适量NaHCO3调节pH值至7.2；
步骤三、过滤除菌：采用双层多孔滤膜过滤器过滤除菌；
步骤四、加胎牛血清：根据培养基配制的总量，加入培养基总体积10％～20％的胎牛血清，充分混匀；
步骤五、检测：培养基配制完成后，抽取少许放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48h，观察结果为阴性，培养基合格。
进一步地，步骤一中干粉培养基的溶解采用振荡或超声助溶。
进一步地，步骤二中所述双层多孔滤膜为0.45μm和0.22μm滤膜各一张，0.45μm滤膜在上层，0.22μm滤膜在下层。
RPMI-1640是由Moore等人在Roswell Park Memorial研究所开发，因此缩写为RPMI。RPMI-1640培养基已被用于培养人正常和肿瘤性白细胞。如果适当添加补充剂，RMPI-1640可广泛适用于多种细胞类型的培养，包括在72小时植物血凝素(PHA)刺激实验中培养新鲜的人类淋巴细胞。但是单纯RPMI-1640体外培养淋巴细胞效果不佳，使用胎牛血清则可以显著提高体外淋巴细胞培养效果。尤其是作为体外培养的淋巴细胞用于体外检验用途，因此与用于细胞治疗等目的细胞培养不同，不需要担心后续纯化的问题。
本发明提供的PBMC体外培养基是将1640培养基与胎牛血清混合，通过对二者配比、pH值进行优化得到的，组分简单，制备容易，pH稳定，对PBMC培养能够达到较高的扩增倍数及细胞纯度。
本发明提供的PBMC体外培养基及其制备方法，与现有技术相比具有以下有益效果：
1.本方法配方简单，因此操作容易，成本可控，对后续测试和检验影响小，有利于大规模、标准化生产；
2.本方法没有加入其他培养基包含的细胞因子和抗生素等，从而避免这些细胞因子和抗生素等对后续检测的干扰和影响。
附图说明
图1为实施例1～3及对比例1的PBMC细胞培养计数结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图及本发明的优选实施例进行详细描述。
实施例1
一种PBMC体外培养基，所述培养基含有以下成分：1640干粉培养基10mg/mL、胎牛血清15v/v％、NaHCO3 2mg/mL。
一种PBMC体外培养基的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、溶解培养基：取10g包装的1640干粉培养基一袋，将其溶解在的500mL三蒸水中，得溶解液；再用余下的350mL三蒸水洗涤包装袋内面两次，得洗涤液；之后将溶解液和洗涤液充分混合；
步骤二、调节pH值：加入2g NaHCO3调节pH值至7.2；
步骤三、过滤除菌：采用双层多孔滤膜过滤器过滤除菌；
步骤四、加胎牛血清：加入150mL的胎牛血清，充分混匀；
步骤五、检测：培养基配制完成后，抽取3mL放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48h，观察结果为阴性，培养基合格。
实施例2
一种PBMC体外培养基，所述培养基含有以下成分：1640干粉培养基10mg/mL、胎牛血清20v/v％、NaHCO3 2mg/mL。
一种PBMC体外培养基的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、溶解培养基：取10g包装的1640干粉培养基一袋，将其溶解在的500mL三蒸水中，得溶解液；再用300mL三蒸水洗涤包装袋内面两次，得洗涤液；之后将溶解液和洗涤液充分混合；
步骤二、调节pH值：加入2g NaHCO3调节pH值至7.2；
步骤三、过滤除菌：采用双层多孔滤膜过滤器过滤除菌；
步骤四、加胎牛血清：加入200mL的胎牛血清，充分混匀；
步骤五、检测：培养基配制完成后，抽取3mL放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48h，观察结果为阴性，培养基合格。
实施例3
一种PBMC体外培养基，所述培养基含有以下成分：1640干粉培养基10mg/mL、胎牛血清10v/v％、NaHCO3 2mg/mL。
一种PBMC体外培养基的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、溶解培养基：取10g包装的1640干粉培养基一袋，将其溶解在的500mL三蒸水中，得溶解液；再用400mL三蒸水洗涤包装袋内面两次，得洗涤液；之后将溶解液和洗涤液充分混合；
步骤二、调节pH值：加入2g NaHCO3调节pH值至7.2；
步骤三、过滤除菌：采用双层多孔滤膜过滤器过滤除菌；
步骤四、加胎牛血清：加入100mL的胎牛血清，充分混匀；
步骤五、检测：培养基配制完成后，抽取3mL放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48h，观察结果为阴性，培养基合格。
对比例1
所用培养基为1640培养基。
PBMC细胞体外培养试验
采用本发明实施例1～3和对比例1提供的PBMC体外培养基对PBMC细胞进行培养，培养流程如下：
1.取血液5ml；
2.加Hanks液2ml适度稀释血液；
3.稀释血液：
3.1.取淋巴细胞分离液置于离心管内，在分离液上层1cm处缓慢加入稀释血液(稀释血液与分离液体积比例为2:1)；
4.离心：
4.1.离心条件：2500rpm，25min；
5.吸取白膜层；
6.洗涤白膜层：
6.1.将白膜层吸取到新的离心管中，加两倍PBS稀释后离心(1500rpm，5min)；
6.2.离心(1500rpm，5min)后，再次弃去上清液，加同等量PBS再次洗涤；
7.计数：
7.1.离心后，弃去上清液，加入1ml培养基吹打均匀；
7.2.将吹打均匀的细胞予以稀释(稀释比例为：10ul cell悬液+90ul培养基)；
7.3.计数得:细胞总数/4×10cells/ml；
8.细胞培养：
8.1.每一百万细胞加1ml培养液(根据实验调整密度，最大密度不超过200万/ml)，如：计数为一千三百万，即加培养液10.3ml；
8.2.阴性对照：从上步已配好的细胞培养液中抽取1ml，作为阴性对照；
8.3.其它含细胞的培养液作为试验细胞培养标本,加入PHA(3ul/ml)，混匀待用；
9.实验组铺孔：
9.1.在24孔培养板内每孔加入含细胞的培养液1ml,包括阴性对照和含PHA的实验样本；
9.2.将所有孔内液体混匀，放入二氧化碳培养箱(37℃，5％CO2)。
结果分析
细胞培养计数结果如图1所示。从图1可以看出：①含胎牛血清的培养基较单纯1640培养基效果好；②胎牛血清体积分数在10-20％范围内区别不大，但由于胎牛血清固有存在的批次间差异，需要实验室具体确定使用浓度；③由于外周血单个核细胞(PBMC，peripheral blood mononuclear cell)主要包括淋巴细胞(T细胞和B细胞)，单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型，其中淋巴细胞占很大一部分，因此在所有培养基条件下，总体细胞数量减少，主要是因为在此期间单核和巨噬细胞等逐渐凋亡，而淋巴细胞正处于增生前期。三天后即可观察到淋巴细胞显著增长；④本发明涉及的人外周血淋巴细胞培养的目的是作为体外诊断用途，所以细胞培养不超过5天。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种人外周血单个核细胞(PBMC)培养基，其特征在于，所述培养基含有以下成分：1640干粉培养基10mg/L、10-20v/v％的胎牛血清、NaHCO3。
2.一种权利要求1所述人外周血单个核细胞(PBMC)培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、溶解培养基：将1640干粉培养基溶解在总量1/3-1/2的三蒸水中，得溶解液；再用余下的三蒸水洗涤包装袋内面两次，得洗涤液；之后将溶解液和洗涤液充分混合；
步骤二、调节pH值：加入适量NaHCO3调节pH值至7.2；
步骤三、过滤除菌：采用双层多孔滤膜过滤器过滤除菌；
步骤四、加小牛血清：根据培养基配制的总量，加入培养基总体积10％～20％的小牛血清，充分混匀；
步骤五、检测：培养基配制完成后，抽取少许放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48h，观察结果为阴性，培养基合格。
3.根据权利要求2所述的人外周血单个核细胞(PBMC)培养基的制备方法，其特征在于，步骤一中1640干粉培养基的溶解可以采用振荡或超声助溶。
4.根据权利要求2所述的人外周血单个核细胞(PBMC)培养基的制备方法，其特征在于，步骤二中所述双层多孔滤膜为0.45μm和0.22μm滤膜各一张，0.45μm滤膜在上层，0.22μm滤膜在下层。
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