CN107164322A - 一种用于人γδT细胞扩增的培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于人γδT细胞扩增的培养基及其制备方法，属于生物技术领域，所述培养基包含有标准配制的RPMI 1640培养基5毫升和Mtb‑Ag 0.025毫克、人AB型血浆0.025毫升、rIL‑2 250U。本发明还提供了一种用于人γδT细胞扩增的培养基的制备方法。本发明提高了所分离的人γδΤ细胞的数量和纯度，可为γδΤ细胞生物学特性的研究和临床的肿瘤过继性免疫治疗等提供细胞来源。

Description

一种用于人γδT细胞扩增的培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种细胞培养基和制备方法，具体的说，涉及一种用于人γδT细胞扩增的培养基及其制备方法。
背景技术
Τ细胞根据TCR类型不同分为αβΤ细胞和γδΤ细胞，γδΤ细胞是T淋巴细胞一个数量较少的亚群，约占成人外周血T淋巴细胞总数的0.5％～5％。T细胞对抗原物质的识别，抗原无需处理和呈递，也无MHC限制性，表现出与αβΤ细胞不同的特性。γδΤ细胞虽数量少，但在机体的抗感染、抗肿瘤及免疫调节等方面具有重要作用。过去用流式细胞仪等分离技术来分离γδΤ细胞，不仅需要大量的外周血，而且所需仪器设备昂贵，操作复杂，所得γδΤ细胞的比例仅占5％左右。笔者用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)刺激PBMC(外周血单个核细胞)培养10天后，γδΤ细胞的比例由培养前的4.9％上升为69.2％，再经免疫磁珠阳性分选后，γδΤ细胞的比例可高达99.3％，这可作为一种简单、快速的γδΤ细胞扩增获取方法。可为γδΤ细胞生物学特性的研究和临床的肿瘤过继性免疫治疗等提供细胞来源。
传统的RPMI 1640是一种常用的合成细胞培养液，主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质，能广泛适应许多种类的细胞的培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于人γδT细胞扩增的培养基及其制备方法，提高了所分离的人γδΤ细胞的数量和纯度，可为γδΤ细胞生物学特性的研究和临床的肿瘤过继性免疫治疗等提供细胞来源。
其具体技术方案为：
一种用于人γδT细胞扩增的培养基，包含有标准配制的RPMI 1640培养基5毫升和Mtb-Ag 0.025毫克、人AB型血浆0.025毫升、rIL-2 250U。
γδT细胞营养要求较高，在传统的RPMI 1640培养液中生长缓慢，由于Mtb-Ag可特异性通过TCR通路和MAPK/ERK通路诱导人γδΤ扩增，因此提高了所分离的人γδΤ细胞的数量和纯度。
进一步，所述RPMI 1640培养基包含有10％FCS，2mmol/L谷氨酰胺，50mol/L 2-巯基乙醇，1mmol/L丙酮酸钠，10mmol/L HEPES及青霉素、链霉素各0.5ml。
本发明一种用于人γδT细胞扩增的培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备工作
在试验前当天或前一天制备好三蒸水，所用容量瓶、滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都要清洗绝对干净并高压灭菌。
(2)基础液的配制
把L-精氨酸290mg、L-门冬酰胺50mg、L-门冬氨酸20mg、L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg、L-谷氨酸20mg、甘氨酸10mg、L-组氨酸15mg、L-羟脯氨酸20mg、L-异亮氨酸50mg、L-亮氨酸50mg、L-赖氨酸盐酸盐40mg、L-甲硫氨酸15mg、L-苯丙氨酸15mg、L-脯氨酸20mg、L-丝氨酸30mg、L-苏氨酸20mg、L-色氨酸5mg、L-酪氨酸23.19mg、L-缬氨酸20mg、对氨基苯甲酸1mg、硝酸钙100mg、无水硫酸镁48.84mg、无水磷酸二氢钠676.13mg、氯化钾400mg、氯化钠6000mg、葡萄糖2000mg、还原谷胱甘肽1mg、酚红5mg、L-谷氨酰胺300mg、生物素0.2mg、D-泛酸钙0.25mg、叶酸1mg、i-肌醇35mg、烟酰胺1mg、氯化胆碱3mg、盐酸吡哆醇1mg、核黄素0.2mg、盐酸硫胺素1mg、维生素B12 0.005mg、三蒸水900ml，碳酸氢钠2000mg，置于容量瓶中，振荡或超声助溶。
(3)溶解抗生素：将市售青霉素为80万U/瓶，溶于4ml三蒸水中。将市售链霉素为100万U/瓶，溶于5ml三蒸水中。
(4)培养基的配制：
将配制好的青霉素、链霉素各0.5ml加入基础液中。加Mtb-Ag 0.25mg、rIL-2250U。振荡助溶、混匀。
(5)调pH值：加三蒸水到1000ml，然后用5％碳酸氢钠调节pH到7.2。
(6)过滤除菌：用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。注意滤膜正面(光面)朝上。过滤后分装于50ml小瓶中。
(7)保存：－20℃冷冻保存。
(8)加人AB血浆：临用前加入人AB血浆0.25ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提高了所分离的人γδΤ细胞的数量和纯度，可为γδΤ细胞生物学特性的研究和临床的肿瘤过继性免疫治疗等提供细胞来源。
附图说明
图1A：PBMCγδΤ细胞的比例；
图1B：Mtb-AT分选前γδΤ细胞的比例；
图1C：Mtb-AT分选后γδΤ细胞的比例。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要仪器①流式细胞仪(Coulter EPICSR XL-MCL,美国Beckman-counter公司)；②倒置显微镜(XDS-1，重庆光电仪器厂)；③CO2孵箱(MCO0175，日本三洋)；④细胞培养板(24孔，Falcon公司)；⑤全自动酶标仪(SLT-Ⅱ，奥地利)；⑥磁性细胞分选器(MiltenyiBiotec，Midi-MACS，德国)。
1.1.2主要试剂①牛结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag，本室自制)；②淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液学研究所，批号：20000408)；③人重组白细胞介素2(rIL-2,PTK公司)；④培养基的配制：将配制好的青霉素、链霉素各0.5ml加入基础液中；加Mtb-Ag0.25mg、rIL-2 250U；振荡助溶、混匀；调pH值：加三蒸水到1000ml，然后用5％碳酸氢钠调节pH到7.2；过滤除菌：用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果；注意滤膜正面朝上；过滤后分装于50ml小瓶中；保存：－20℃冷冻保存；加人AB血浆：临用前加入人AB血浆0.25ml。⑤四甲基偶氮唑蓝(MTT，FLUKA公司)；⑥鼠抗人荧光单抗TCRγδ-PE(Becton Dickinson公司)；⑦人红白血病细胞株K562；⑧TCRγδ磁珠试剂盒(Miltenyi Biotec)。
1.2方法
1.2.1淋巴细胞的诱导扩增抽取健康志愿者静脉血5～10ml，肝素抗凝，按常规分离获取PBMC，用培养液将PBMC细胞浓度调整至1×106/ml，加入24孔培养板中，每孔1ml，放置37℃，5％CO2条件下培养，每隔3天加rIL-2 50U/ml扩增，同时计数以观察细胞增殖情况，约10天收获细胞，之后再经免疫磁珠(严格按试剂盒说明书操作)阳性分选。
1.2.2淋巴细胞中γδT细胞所占比例的检测采用常规的荧光单抗染色法及流式细胞仪检测。取5×105个淋巴细胞，用冰冷的PBS洗涤3次，再用含1％付甲醛的PBS固定，最后上机检测。
1.2.3细胞毒活性测定对肿瘤细胞的杀伤活性采用MTT法检测，以K562作为靶细胞,效靶比设置为10:1,用酶标仪测定570nm和630nm的吸光度值，计算出绝对吸光度值(A＝A570-A630),按下式计算杀伤活性(以杀伤百分比表示)：
杀伤活性(％)＝[(靶细胞A值+效应细胞A值-效靶混合细胞A值)/靶细胞A值]×100％
2结果
2.1Mtb-Ag诱导的淋巴细胞的扩增
用活性定量法观察淋巴细胞的增殖情况。PBMC经Mtb-Ag刺激后，再加rIL-2培养，最初几天细胞增殖缓慢，约4天后增殖加速，至12天时达高峰，细胞数增加近40倍。
2.2淋巴细胞中γδT细胞所占比例
用流式细胞仪检测新鲜分离的PBMC和经Mtb-Ag刺激后培养10天的PBMC，结果新鲜分离的PBMC中γδT细胞仅占4.9％，见图1A。而经Mtb-Ag刺激培养10天后,γδT细胞的所占比例可高达69.2％，见图1B。由此可以看出，Mtb-Ag对γδT细胞的刺激具有特异性、高效性，可优先诱导γδT细胞大量扩增。若再经免疫磁珠阳性分选，γδT细胞的比例可高达99.3％，见图1C。
2.3Mtb-Ag诱导的淋巴细胞的细胞毒活性
以K562作为靶细胞,用MTT法测定,结果显示,Mtb-Ag诱导活化培养后的细胞(主要为γδT细胞)及免疫磁珠阳性分选后的细胞对K562均具有较高的杀伤活性,杀伤率分别为62.3％和79.6％。
3讨论
γδT细胞是1986年被确认的一类T细胞的亚群，在成年人外周血中仅占3～10％，主要分布于粘膜和皮下组织，如在人小肠上皮淋巴细胞(intra-epithelial lymphocyte，IEL)中占10～18％，人大肠IEL中占25～37％，小鼠IEL中占50％。粘膜和上皮组织是抵抗病原体入侵的第一道防线，也是肿瘤常发生部位，γδT细胞在粘膜及上皮组织中的高比例分布，提示γδT细胞在抗微生物和寄生虫、抗肿瘤及免疫调节等方面具有重要作用。当然，近年来的研究也证实了这一结论，并引起了广泛关注；另外，由于γδT细胞对抗原的识别无MHC限制性，也不需抗原呈递细胞对抗原的处理和呈递，因而γδT细胞发挥作用要比γβT细胞更加快捷，发挥作用也更具广泛性，现在，γδT细胞日益受到人们的重视。
以往的研究表明，Mtb-Ag可刺激Vγ9+/Vδ2+的γδT细胞增殖，而这类γδT细胞亚群占总γδT细胞的80％以上，本文用Mtb-Ag刺激外周血淋巴细胞，仅需外周血5～10ml，γδT细胞增殖速度快，短期内可获得大量的γδT细胞，所占比例由刺激前的4.9％上升到69.2％，这和其他研究者的实验结果相同，说明Mtb-Ag具有优先激活和扩增γδT细胞的特性，且具有较高的杀瘤活性。总之，该方法具有用血量少、特异性高、周期短、无需特殊设备等优点，可为γδT细胞生物学特性的研究和临床的肿瘤过继性免疫治疗提供细胞来源。
仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种用于人γδT细胞扩增的培养基，其特征在于，包含有标准配制的RPMI 1640培养基5毫升和Mtb-Ag 0.025毫克、人AB型血浆0.025毫升、rIL-2 250U。
2.根据权利要求1所述的用于人γδT细胞扩增的培养基，其特征在于，所述RPMI 1640培养基包含有10％FCS，2mmol/L谷氨酰胺，50mol/L 2-巯基乙醇，1mmol/L丙酮酸钠，10mmol/L HEPES及青霉素、链霉素各0.5ml。
3.一种权利要求1所述的用于人γδT细胞扩增的培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)准备工作
在试验前当天或前一天制备好三蒸水，所用容量瓶、滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶、存放和转移培养基液体的器具都要清洗绝对干净并高压灭菌；
(2)基础液的配制
把L-精氨酸290mg、L-门冬酰胺50mg、L-门冬氨酸20mg、L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg、L-谷氨酸20mg、甘氨酸10mg、L-组氨酸15mg、L-羟脯氨酸20mg、L-异亮氨酸50mg、L-亮氨酸50mg、L-赖氨酸盐酸盐40mg、L-甲硫氨酸15mg、L-苯丙氨酸15mg、L-脯氨酸20mg、L-丝氨酸30mg、L-苏氨酸20mg、L-色氨酸5mg、L-酪氨酸23.19mg、L-缬氨酸20mg、对氨基苯甲酸1mg、硝酸钙100mg、无水硫酸镁48.84mg、无水磷酸二氢钠676.13mg、氯化钾400mg、氯化钠6000mg、葡萄糖2000mg、还原谷胱甘肽1mg、酚红5mg、L-谷氨酰胺300mg、生物素0.2mg、D-泛酸钙0.25mg、叶酸1mg、i-肌醇35mg、烟酰胺1mg、氯化胆碱3mg、盐酸吡哆醇1mg、核黄素0.2mg、盐酸硫胺素1mg、维生素B12 0.005mg、三蒸水900ml，碳酸氢钠2000mg，置于容量瓶中，振荡或超声助溶；
(3)溶解抗生素：将市售青霉素为80万U/瓶，溶于4ml三蒸水中；将市售链霉素为100万U/瓶，溶于5ml三蒸水中；
(4)培养基的配制：
将配制好的青霉素、链霉素各0.5ml加入基础液中；加Mtb-Ag 0.25mg、rIL-2 250U；振荡助溶、混匀；
(5)调pH值：加三蒸水到1000ml，然后用5％碳酸氢钠调节pH到7.2；
(6)过滤除菌：用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果；注意滤膜正面朝上；过滤后分装于50ml小瓶中；
(7)保存：－20℃冷冻保存；
(8)加人AB血浆：临用前加入人AB血浆0.25ml。
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