JPH05504882A

JPH05504882A - ヒト末梢血液単核細胞のアミノ酸アミド処理によるｌａｋ細胞活性化増強

Info

Publication number: JPH05504882A
Application number: JP2510179A
Authority: JP
Inventors: イル，ジョゼフ．デイビッド; レウング，カム
Original assignee: テルモ株式会社
Priority date: 1989-07-21
Filing date: 1990-07-12
Publication date: 1993-07-29
Also published as: AU5957090A; WO1991002050A1; US5108760A; EP0483223A1; ATE123807T1; EP0483223B1; DE69020157T2; CA2063813A1; DE69020157D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト末梢血液単核細胞のアミノ酸アミド処理によるＬＡＮ細胞活性化増強発明の分野本発明は、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＮ）細胞活性を有する養子免疫療法に有用な増強された細胞の産生に関する。

発明の背景インターロイキン−２（ＩＬ−２）をヒト末梢血液単核細胞（ＰＢｉＩＣ）またはマウス牌細胞とインキュベーションすると非常に腫瘍破壊性の細胞集団が誘発される。この現象はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性と称されてきた。ＬＡＫエフェクター細胞の前駆体は不均賀であるが、その活性の大部分は明らかに、約５％の末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を含有し、そして天然キラー（ＮＫ）細胞活性を有する大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）に由来する。

ＩＬ−２を同時に投与し乍らＬＡＮ細胞を、腫瘍を有するマウスに移入させると、幾つかの動物モデルで腫瘍の苦しみの緩解がもたらされた。これらの結果から、臨床試験はＬＡＮ細胞単独、ＩＬ−２単独、そして最終的には進行した固体腫瘍の患者で側薬剤を使用する集中的治療プログラムを使用して展開された［１？ｏｓｅｎｂｅｒｇ等、（１９８７）Ｎ、　Ｅｎｇ特許４．６９０．９１５］。この組合せ処方の毒性は、ＲｏｓｅｎｂｅｒｇがＬＡＮ細胞およびＩＬ−２のネズミ有効投与量（重量に基づいて）と比較してヒトでは当量投与量の僅か１から１０％しか送達できなかったという事実にも拘わらず、相当なものであった。それにも拘わらず、かなりの数の部分応答が見られ、モしてＩＬ−２およびＬＡＮの組合せ物の試験が更に進行中である。

ヒトでのＬＡＮ細胞使用に関する問題の中心はそれらの産生（本明細書では誘発または活性化とも称する）の複雑さである：患者から採取された白血球分離生成物をフィコール−ハイバク（Ｆｉｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配によって分離し、そしてその後得られた単核細胞を１１１当たり１乃至３　Ｘ　１０’個の細胞の細胞密度でｒＬ−２の存在下で３乃至５日間培養する。かくして、回転瓶中の最終培養量は４０Ｌに達することが可能である。この方法の種々の変更および改良が行われてきた。例えば、１９８７年１２月　２日に公開されたヨーロッパ特許出願８７１０７７５５．８および１９８７年４月２０日に出願され、共同して譲渡され許可された米国特許出願０７１０３８３６１は、単核細胞をフェニルアラニンメチルエステル（ＰＩＩＥ）にさらして単球を枯渇させると、現在使用されているＬＡＮ細胞誘発濃度より約１０倍濃い細胞培養密度のＬＡＮ細胞誘発が可能になることを開示している。１９８８年８月３１日に公開されたヨーロッパ特許出願８８１０１１３８、１および１９８７年Ｉ月２９日に出願され、共同して譲渡された係属中の米国特許出願０７１００８２７３は、ＬＡＮ細胞誘発が有機ポリマーの酸素透過性膜でできている袋の中で行われ得ることを開示している。１９８８年１１月　９日に公開されたヨーロッパ特許出願８８１０６５６６、８および１９８９年２月２８日に付与され、共同して譲渡された米国特許４．８０８．１５１は、白血球分離生成物はその活性化方法で使用する前にフィコール−ハイバクで分離する必要がないことを開示している。

静脈穿刺または白血球除去（療）法によって末梢血液から集めたヒト白血球と種々のアミノ酸のエステルとの混合物をインキュベートすると、機能的天然キラー（ＮＫ）細胞の一時的または永久的損失がもたらされる［Ｔｈ１ｅｌｅ等（１９８５）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：　２４６８〜２４７２；ＬｆｐｓｋｙおよびＴＨｉｌｅに付与された米国特許４．７５２．６０２コ。

ロイシンのエチルエステル（ＬＭＥ）を用いると、ジペプチドロイシルロイシンメチルエステルがＬＩＥにさらされた細胞中で形成され、これはＮＫ細胞に毒性である［ＴＢｉｌｅ等（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ八へ２：　２４６ｇ　〜２４７２：米国特許４．７５２．６０２）。ＬＡＮ細胞を調製する方法で、ＰＭＥと、アラニン、アスパラギン酸、システィン、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン、トリプトファンおよびバリンまたはそれらの任意の混合物を含む他の低級アルキルアミノ酸エステルを使用することが１９８７年１２月　２日に公開されたヨーロッパ特許比１８８７１０７７５５、８および１９８７年４月２０日に出願され許可された米国特許出願０７１０３８３６１に開示されている。

ヒＩ−ＬＡＫ細抱免疫療法に必要な誘発または活性化系が複雑で大量であるために、当該技術分野で記載さている方法には問題が存在する。本願は高細胞密度でのＬＡＮ細胞活性化法を記載しており、ネズミと等しい投与量でのヒトにおけるＬＡＮ細胞療法を実現可能な代替法とするも本発明はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＮ）細胞の活性化増強に関し、更に詳細にはＬＡＮ細胞活性化法の改良に関するものである。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養して活発な腫瘍細胞に対して細胞毒性である細胞集団を産生させる方法において、改良は、上記細胞を培養する前に、ＰＢＭＣまたはそれから得られる末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびバリンまたはそれらの任意の混合物からなる群から選択されるし一アミノ酸のＬ−アミノ酸アミドと接触させ、そしてその後得られた細胞を培養することからなる。

本発明では上記方法で調製し単離したＬＡＮ細胞を含有する改良された組成物も提供され、その際上記細胞は製薬的に受容可能な担体中に分散されそして腫瘍に苦しんでいるヒトにインターロイキン−２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である。

更に、哺乳動物にインターロイキン−２（ＩＬ−２）および腫瘍阻害量の本発明改良組成物を投与することからなる哺乳動物の癌治療方法も提供される。

更に、本発明は改良された方法、組成物および上記使用方法に関するものであり、その際し一アミノ酸アミドはＬ−アミノ酸低級アルキルエステルと組合せて使用される。

本発明では、高細胞密度培養物中でＬＡＮ細胞を産生させるために、リンパ球をＩＬ−２と共にインキュベーションする前に単球を除去するためにＬ−アミノ酸（ａａ）アミド、好ましくはＬ−フェニルアラニンアミド（Ｐ＾＾）を使用することを記載する。本願明細書で使用する「高細胞密度」は、より低い細胞密度の培養物中で得られるＬＡＮ細胞産生に関して、ＬＡＮ細胞産生阻害がある場合の細胞密度を意味する。即ち、「高細胞密度」は約３　Ｘ　１０’個／１１の細胞から約Ｉ　Ｘ　１０’個／ｍｌの細胞、好ましくは、工Ｘ１０７個／■１の細胞より高い細胞密度を意味する。成る種のドナーから得られるＰＢＭＣでは、ＦＡＡは、ヒト細胞の同じバッチのＬ−フェニルアラニンメチルエステル（ＰＭＥ）による処理で得られる活性化と比較して、高細胞密度でＬＡＮ細胞活性化の程麿を増強するように思われる。

したがって、本発明者はヒトＬＡＮ細胞療法に利用可能なＬＡＮ細胞数を増加させ、そして同時に誘発系の複雑さと量を減少させる実用的な方法を開発し、それによってＬＡＮ細胞療法のネズミと同等の投与量が今やヒトで実現可能である。

高細胞密度でのＬＡＮ細胞産生に与えるａａアミドの効果は、対応するａａアルキルエステルの効果とは相互関係がない。例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸およびチロシンのＬ−アミノ酸低級アルキルエステルは高細胞密度でＬＡＮ細胞の産生を高め（１９８７年１２月　２日に公開されたヨーロッパ特許出願８７１０７７５５．８および１９８７年４月２０日に出願され許可された米国特許出願０７１０３８３６１）、一方これらアミノ酸の対応するａａアミドはＬＡＮ細胞産生を高めるようには機能しなかった（実施例５、表８）。更に、ロイシンおよびイソロイシンメチルエステルを含む幾つかのａａアルキルエステルは、高細胞密度では［、ＡＫ細細度産生高めず（１９８７年１２月２日に公開されたヨーロッパ特許出願８７１０７７５５．８および１９８７年４月２０日に出願され許可された米国特許出願０７１０３８３６１．）、一方これらアミノ酸の対応するａａアミドは、細胞を高細胞密度で培養するときＬＡＮ細胞産生を高めることが見いだされた（実施例５、表８）。

２０種の可能なアミノ酸アミドの全てについては試験しなかったけれども、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびバリンに加えて上記のａａアミドのうちの幾つかは、細胞を高細胞密度で培養するときＬＡＮ細胞の産生を高めるのに有用であると思われる。

発明の詳細な説明細胞濃度が３　Ｘ　１０’／　ｍｌに限定される場合、多数の赤血球（１？Ｂｃ）が存在したとしても、１９８９年２月２８日に付与され共同して譲渡された米国特許４、ｇＯＬ　１５１でデュン（Ｄｕｎｎ）、ハルベーン（Ｈａｌｐｅｒｎ）およびイル（Ｉｒｒ）が開示したように、末梢血液から得られるリンパ球をＩＬ−２または組換え体ＩＬ　−２（ｒＩＬ　−２）と共に培養することによってＬ八に細胞の活性化を達成することができる。ＰＭＥ処理または表面への付着のような化学的または物理的手段によって上記のような単核細胞の調製物から単球を除去しそしてＲＢＣを勾配分離によって除去するときには、残っているリンパ球は少なくともＩ　Ｘ　１０７／　ｍｌの密度で培養することができる（　１９８７年１２月　２日に公開されたヨーロッパ特許出願８７１０７７５５．８および１９８７年４月２０日に出願され許可された米国出Ｍ　０７１０３８３６１）。

本発明の方法において、ＰＢＭＣを、０．５％のヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎａｒ−２５、イリノイ州カンカキ−のＡｒｍｏｕｒＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ、）を含有するりん酸緩衝生理食塩溶液、ｐｔ１７．０　（ＰＢＳ）中で約４０分間概ね室温でＬ−アミノ酸アミドの塩に暴露する。細胞を処理する最適の処理期間および温度は変えることができ、そして例えば使用するａａアミドの濃度に依存する。細胞の生存性に適合可能な他の緩衝溶液を使用することもできる。この処理によってＰＢＭＣ混合物中に存在する単球の破壊が生じる。処理したＰＢＭＣの残存リンパ球はフィコール−ハイバク密度勾配分離によって単離される。単離された細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで＾ｒトｖにューヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏ、　Ｉｎｃ、から入手可能）のような適当な細胞培養培地中に再懸濁する。他の適当な培地は周知であって＾■トｖの代わりに使用することができ、そしてそれに続（ＬＡＮ細胞活性化のためにヒトまたはウシ胎児血清を任意に補充する。

本発明の好ましい実施態様は、０．５％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、　ｐＥＩ７．０中で約４０分間室温でＬ−フェニルアラニンアミド（Ｐ＾＾）の塩酸塩にＰＢＩＩＣをさらすことを提供する。ＦＡＡは約１から１０ｄの濃度で存在することができ、好ましくは約ＩＱｍＭの濃度で存在する。

本発明の他の態様は、Ｌ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸低級アルキルエステルの組合せにＰＢＭＣをさらすことを提供する。好ましくは、使用される組合せ物は約１から１０ｍＭの濃度で存在するＰ＾＾および約１から５１１Ｍの濃度で存在するＰＭＥである。

単離された白血球を標準的な実験室方法、例えば血球針および顕微鏡を使用して計数したならば、＾ＩＭ−Ｖ培地で所望の濃度に希釈しそして適当な細胞培養容器に入れて高密度で培養する。好ましい容器はステリセル（ＳｔｅｒｉＣｅｌｌ）　（登録商標）容器、［プラウエア州つイルミントンのイー、アイ、デュポン　ドウ　ヌムールアンドカンバニイ（Ｅ、　Ｉ、　ｄｕ　Ｐａｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　＆　Ｃｏ、）から市販で人手できる気体透過性のプラスチックバッグ］である。しかし乍ら、当該技術分野で既知の他の気体透過性バッグを使用することができる。ＬＡＮ細胞活性化を達成するために、細胞を３７℃、５％ＣＯ２および９５％の相対湿度で３日間ｒＩＬ−２と共にインキュベートする。３日間のインキュベーションに続いて、細胞の１部を細胞障害性アッセイで試験してＬＡＫ細胞活性を評価することができる。

細胞障害性アッセイ以下の実施例で、ＬＡＮ細胞調製物の細胞障害性活性を測定するために４時間の５１Ｃｒ放出アツセイを使用した。

使用した標的（ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ細胞株）は、ＮＫ細胞介在細胞障害性には比較的非感受性であるがＬＡＮ介在細胞障害性には感受性であることが周知であるヒト腫瘍細胞株である。ｌ１１１当たり約２　Ｘ　１０’からＩ　Ｘ　１０７の濃度の腫瘍標的細胞を、トリス−りん酸緩衝生理食塩液中１００μＣｉのＮａ２”ＣｒＯ４と共に３７℃で１時間インキュベートする。細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＩＩＩ−１６４０細胞培養培地（メリーランド州ウォーカースピルのＷｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で３回洗浄し、そしてＲＰＭＩ−１０％ＦＣ３中でｌｓｌ当たり１０８個の細胞になるよう再懸濁した。

エフェクター細胞（ＬＡＮ細胞）を［ｌｐＨＩ−１０％ＦＣ３中に種々の濃度で再懸濁し、そしてＱ、　１ｍ１部分を、微量滴定プレートの丸底ウェル中に入れた。ｆｉｌＣｒ−標識腫瘍標的細胞（０，１■ｌ）を全ウェルに加えた。３７℃ で４時間インキュベーションした後、プレートを遠心し、そして得られた０、１ｍｌの上清液を各ウェルから除き、モしてガンマカウンターで計数した。結果は１分当たりのカウント（ＣＰＩ）で表わす。ＬＡＮ細胞の各試料を３回試験し、そして得られたデータを細胞障害性％として表わす。

細胞破壊パーセントを次式から計算する：この細胞障害性試験は広範に使用されており、更に詳細にはセレクテッドメソッズインセルラーイムノロジー（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ＩＩｌｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ミッシヱル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびンーギ（Ｓｈｉｉｇｉ）　、編、１２４〜１３７．１．Ｈフリーマンアンドカンバニイ（Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄＣｏ、　）、カリフォルニア州フランシスコ（１９８０）に記載されている。幾つかの実験で、アッセイの結果を溶解ユニット（ＬＵまたはＬＵ３０）として示す。１溶解ユニツトは標的細胞の３０％を溶解するのに要するエフェクター細胞数で割ったものの１０６として定義される。この値は、細胞溶解％がエフエクター二標的の比の対数関数であるモデルに合わせて計算される。この計算はブロス（Ｐｒｏｓｓ）等によって、Ｊ、　ｏｆ　Ｉａｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　６８　：　３５〜２４９（１９８４）に記載された方法に基づいている。

細胞・　ヒト末梢血液細胞を、米国特許４．４６４．１６７および４、４１６．６５４に記載されている標準的な細胞除去面輸血プロトコールによって、健康なドナーからヘモネメチックス（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）　Ｖ５０インストルメントに採集した。ラジ（Ｒａｊｉ）およびダウン（Ｄａｕｄｉ）細胞株を、標準的な実験室方法によって連続培養で維持し、これらの細胞株を５ＩＣｒ放出アツセイの腫瘍標的として使用した。

材料・Ａ、培地：　ＬＡＮ細胞活性化に使用した培地は、Ｌ−グルタミン、硫酸ストレプトマイノンおよび硫酸ゲンタマイシンを含有する＾ＩＭ−Ｖ（登録商標）血清不含培地（Ｇｉｂｃｏ）からなる。細胞株の培養および５１　（ｒ放出ア・ソセイＩこ使用した培地は、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および１０％の加熱不活性化ウシ胎児血清並びに０．０５ｍｃｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０であった。

Ｃａ−、Ｍｇ“またはフェノールレ・ソドを有さな（Ａダルベツコのりん酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）　（Ｇｉｂｃｏ）　４：：、Ｌ−ａａアミドおよび／またはＬ−ａａ低級アルキルエステルＢ．　５０ｍＭ　ＰＭＩＪＣ薬：　１グラムのし一フェニルアラニンメチルエステル、ＨＣＬ　（Ｄｕ　Ｐａｎｔ）を１００ｍｌのＰＢＳおよび２Ｉ１１のヒトアルブミン（　Ａｌｂｕｖｉｎａｒ　（登録商標）−２５米国薬局方２５％）に加えた。ｐＨは０．　ＩＮ　ＮａＯＨ　（ＳｉｇｌＩａ）を用し１て７、０に調整した。

Ｃ．　５０ｆｆｉＭ　ＰＡＡ試薬：　１グラムのし一フェニルアラニンアミド、ＨＣＬ　（Ｓｆｇｍａ）を１００ｖｌのＰＢＳおよび２鍾１のアルブミナールー２５　［Ａｌｂｕｍｉｎａｒ　（登録商標）−２５コ米国薬局方２５％に加えた。ｐＨｌは０．ＩＮ　ＮａＯｔｌを用０て７．０１こ調整した。

使用した他の材料は、共同して譲渡された米国特許４、　８０８．　１５１に記載されたものと同一である。

方法：Ａ．ドナー細胞を、共同して譲渡された米国特許４，８０８、　１５１に記載されたのと同一の方法を使用して、白血球除去面輸血によって採集した。

Ｂ　更に処理する前に、白血球分離生成物の試料を分析用に取り出した。残りを遠心器に入れ、血漿および血漿板を分離して除去するために４６８ｘ　ｇで１０分間回転させた。細胞フラクションを白血球（ＷＢＣ）用に計数し、そして０．５％のヒト血清アルブミンを補充したＰＢＳを用いて密度をＩ　Ｘ　１０’／　＋ｓｌに調整した。細胞懸濁液の各部分を約１からＩＯＩＩＭの種々の濃度のＦＡＡまたは５ｍＭのＰＭＥを用いて４０分間室温で処理し、次いでリンパ球分離法で分画した。

Ｃ，リンパ球分離：４０■１の血球懸濁液の下に１０ｍ１のリンパ球分離液（ＦｉｃｏＬｌ−ＰａｑｕｅＳＰｈａｒＩＩａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌｓまたはＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、　Ｎｙｃｏｓｅｄ）を置いた。次いで、コノ混合物を８００Ｘ　ｇで１５分間遠心した。遠心後、得られた単核細胞の界面層を集めそしてＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＡＩトＶ培地で３回洗浄し、そしてＷＢＣを計数した。

Ｄ　デュポンのステリセル（登録商標）容器中での細胞培養。細胞を＾ｌ１ｌ− ４培地中Ｉ　Ｘ　１０７／　ＩＩｌの密度に希釈した。デュポンのｒＩＬ　−２、■００ユニット／Ｉｌｌを加え、そして培養物をステリセル（登録商標）容器中に移した。これらの細胞バッグを５％のＣＯ２および９５％の相対湿麿で３または４日間３７℃のインキュベーターに入れた。

Ｅ、インビトロ細胞障害性アッセイ標的細胞調製。アッセイの前日に、指数増殖標的細胞を１０１１のアッセイ培地中Ｉ　Ｘ　１０５／　ａ＋１に希釈した。

アッセイ当日に、４　Ｘ　１０’個の細胞を洗浄し、そして０．１ｍＭの２ＸＴＤｌｌｆｆｉ液および１００マイクロＣ１の”ＣｒＯ２に再懸濁した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、２回洗浄し、計数し、そしてアッセイ培地中Ｉ　Ｘ　１０’／■１に希釈した。

エフェクター細胞調製。約ＩＱｍｌのエフェクター細胞培養物をアッセイ培地で２回洗浄し、計数しそして生存性を試験した。細胞をアッセイ培地中４　Ｘ　１０’／　ｍｌに希釈した。エフェクターと標的は９６ウエルの微量滴定プレート中で４０：１．２０：１．１０：１．５：１および２．５：１の比率で混合し、混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、ガンマカウンターで上溝フラクションの５ＩＣ，含量を分析した。

高細胞密度培養物におけるヒト単球枯渇およびＬＡＮ細胞活性化に対するし一フェニルアラニンアミド、ＥＩＣＬ（ＦＡＡ）の有効性を試験した。ＰＡＡおよび他のａａアミドをミズーリー州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した。比較の目的で、新たに提供されたヒト細胞の各調製物から得た細胞分別物を用いてＬ−フェニルアラニンメチルエステル、肛１　（ＰＭＥ）処理も行った。

２つの調製物における単球枯渇と高密度ＬＡＮ細胞活性化を比較するのに十分な細胞を１人のドナー（ドナー１と称する）から得て、調製物の１つを５ｍ１ＰＡＡで、そしてもう１つを５ｍＭｐＨＥで処理した。単球枯渇を標準血液学的分染（表１人）および蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）分析（表１８）で試験した。塗抹標本またはサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）を、それらを光学顕微鏡で評価する前にギームザ染色にさらした。蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）およびヒト細胞表面マーカーに特異的な抱合抗体のパネルを種々の細胞タイプを定量するために使用した；上記抗体、Ｌｅｕ４、Ｌｅｕ１２、ＬｅｕＭ３およびＬｅｕ１９をカリフォルニア州マウンテンビュウのベクトン　デイキンソン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）から入手した。示されるとおり、５ｍＭＰＡ＾および５３ＭＰ１１Ｅで処理した試料は、存在する単球を失い、そしてそれ故リンパ球に富んでいた。

表ＩＡ非処理　６７　３２　１５ｍ１ｌＰ＾＾処理　９９１０５ｄＰＭＥ処理　９１９０表ＩＢ試　料　ＬｅｕＡ本　Ｌｅｕ１２＊　ＬｅｕＭ３宰　Ｌｅｕ１９零非処理　６１　１０　２７　１１５ｍＭＰＡＡ処理　８１　７　１　９５Ｉｌ１ＭＰＭＥ処理　８０　１３　５　９ＬｅｕＡ本　二Ｔリンパ球ＬｅｕｌＺ本＝Ｂリンパ球ＬｅｕＭ３本＝単球Ｌｅｕ１９本＝　ＮＫ細胞ＰＡＡ−およびＰＭＥ−処理細胞を、ステリセル（登録商標）容器内でｒＩＬ− ２補充ＡＩトＶ培地４０ｏ＋１中で３日間培養した後、２つの腫瘍細胞標的、ラジおよびダウンに対するＬＡＮ細胞活性についてアッセイした（表ＩＣ）。画処理による全体の細胞収量は、培養物からの１００％より大きかった。これらの細胞溶解活性は、この特別のドナー細胞調製物に関して５．ＱｍＭ　ＦＡＡにさらした細胞では５、ＯｍＭ　ＰＭＥで処理した細胞より大きいＬＡＮ細胞活性化が得られたことを示す。

表ＩＣ１０：　１．　３２，８　３４．５５：Ｉ　２６．９　２８．２２、５　：　１　１３．１　１４．４１０　：　１　３４．１　２８．３５：１　２２．３　１９．７２．５：１　９，４　１３．９高密度培養物におけるヒトＬＡＮ細胞の活性化に与える種々の濃度のＦＡＡの効果を試験した。更に、細胞分別物の５ｍＭＰＭＥ処理も試験の内部対照として含めた。

ドナー２から白血球除去面輸血採集で得た細胞（ドナー２細胞と称する）を、種々の濃度でのＦＡＡによる処理用、５ｉ１１ＰＭＥ対照用および非処理対照用に６つの部分に分けた。分集およびＦＡＣ３分析を処理後の標本で実施し、そして残りの細胞をドナー１細胞（実施例１）と同様に、ＬＡＮ細胞活性化のために培養した。ドナー２を使用して得られた結果を表２＾、２Ｂおよび２Ｃに示す。単球枯渇の程度は化学的に処理した全試料で類似していた。ＬＡＮ細胞活性化の程度は使用したＰ＾＾の濃度に関係があった。

表２０に示されるとおり、ＬＡＮ産生に最適のＰ＾＾濃度は、１０■麗であり、そしてドナー２から得られた細胞に関しては、Ｐ＾＾はＬＡＫ細胞産生に５■Ｍ　ＰＩＩＥより幾らか有効であるように思われた。５１１ＭはＰＩＨに対する既知の最適濃度である（例えば、表６参照）。

１０ｍｌ１ｌ　ＰＡＡ処理　９０６４１５■Ｍ　ＰＡＡ処理　９１５４２ｈＭ　ＰＡＡ処理　８７８７５ｄＰＭＥ処理　９５４１１５ｍｌｌ　ＰＡＡ処理　７７　８　５　５ＬｅｕｌＺ本二　Ｂリンパ球ＬｅｕＭ３本＝単球ＬｅｕｌＱ本＝　ＮＫ細胞表２０２０・１２．８　０７非処理　１０：１　１１．３　７．９　０　０５：１　５．０　６．７２．５：１　２．８　５．１４０：　１　４３．１　３８．１２０　：　１　３６．６　２８．５５ｍ１ｌＰ＾＾　１０゜　１　８．１　４．９　５．２　３．４５：１　７．０４．０２．５：１　９．０　５．７４０・１　５７，９　４４．４２０＋　１　４３．９　３９．２１０ｍＭＰＡＡ　ＩＯ：１　３９．３　３０，４　１１．５　７．６５：１　２２．５　１３．３２．５：１　０　０４０：１　１９．１　８．８２０：１　１６．９　９．４１５ｉＭＰＡＡ　１０：１　１０．２　４．５　０．５　０５：１　７．０　５．２２．５：１　２．８　４．２４０　：　１　３１．７　２１．８２０：　１　１４．６　７．４２ｈＭＰＡＡ　１０：１　１ｇ、６　１２．６　１．６　０．２５：１　１０．６　６．９２．５：１　８．９　４．４４０：　１　４８．０　５２．６２０：　１　４０．６　３７．９５＠ＭＰＭＥ　１０：１　７．４　７．１　６．１　６．３他の２人のドナー（ドナー３および４と称す）から得た細胞を、ＬＡＮ細胞活性化に与える種々の濃度のＰ＾＾の効果を更に試験するために使用した。ドナー３および４細胞を使用して得られた結果を、表３＾、３Ｂ、３Ｃ１４＾、４Ｂおよび４Ｃに示す。これらの細胞では、より低い濃度のＰ＾＾を高密度活性化工程前に試験した。両事例共、ＬＡＮ細胞活性化応答に対する濃度依存性の効果があった。有効なＬＡＮ細胞活性化に対する上記Ｐへ＾依存性は、非処理細胞がＬＡＮ活性を生じさせなかったため、上記試料で特に注目に値するものであった。ドナー４から得たＰＩＩＥ−処理細胞はＬＡＮ細胞アッセイでは活性でなく、一方ＰＡ＾はドナー４細胞でＬＡＮ活性を増強した（表４Ｃ）。この結果は、成る種のドナーではＰＭＥを使用して得られるより大きいレベルのＬＡＮ活性がＰへ＾を使用して得ることができることを示している。

表３＾非処理　７１　２８　１Ｑ、５ｍＭＰ＾＾処理　７４　２６　０２．５ｍ１ｌＰ＾＾処理　８６　１４　０５　ａｌｌ　ＰＡＡ処理　９２７１１０箇ＭＰ＾＾処理　９５５０５■ＭＰ旺処理　９３４３表３Ｂ非処理　７５　１３　１８　１２０．５ｍＭＰ＾＾処理　８０　１４　１９　７２、５　ｒｘＭ　ＰＡＡ処理　８１　１２　１０　７５　ｍＭ　ＰＡ＾処理　８３　１５　６　１６ＩＱ　ｓＭＰ＾＾処理　７９　１３　７　１３５　ｍｌｌ　Ｐ肛処理　７０　１２　６　１０Ｌｅｕ４＊　＝　Ｔリンパ球Ｌｅｕ１２本＝Ｂリンパ球Ｌｅｕ３＊　＝単球Ｌｅｕ１９＊　＝　ＮＫ細胞表３Ｃ４０：１　１５．６　９．６２０：１　０　１．３非処理　１０・１　ｇ、６　４．６　０　０５：１　０　２．６２．５・１　０　３．３４０：１　７．４　９．７２０：１　４．５　４．３０．５ｍＭＰ＾＾　１０：１　０　０　Ｑ　Ｑ４０：１　２３．１　１３．９２０：１　１８．３　１０．０２．５　ｌｌ１ｌ　ＰＡＡ　１０：　１　１１．６　９．２　０．９　０．１４０：１　３１．０　３０．５２０：　１　２７．０　２４．２５　園１１ＰＡＡ　１０：１　１６．７　１５．８　１．９　２．４５：１　６．６　１０．２２．５＋１　３．５　７．１４０：　１　３８．８　４４．１２０：　１　２３．６　２４．２１０ｍＭＰＡＡ　１０：１　１９．９　２０．２　２．６　５．１５　：　１　１４．４　１２．８２．５：１　５．５　７．３４０・１　４４．４　４４．８２０：１　３０．９　３９．３５ｍＭＰＭ　１０：１　７．２　１１．４　３．３　６．０５：１　３．５　８．２２．５：１　３．９　６．３表４＾非処理　５４　４３　３０．５　ｄ　ＰＡ＾処理　５６　４２　２２．５ｍＭＰ＾＾処理　７３　２５　２５　ａ＋Ｍ　ＰＡＡ処理　８５　１４　１１０　ｉＭ　Ｐ＾＾処理　８３　１４　３５　ｆｆ１Ｍ　ＰＭＥ処理　９３６１表４Ｂ非処理　ｎｔ　ｎｔ　ｎｔ　ｎｔＯ，５ｄ　ＰＡＡ　処理　ｎｔ　ｎｔ　ｎｔ　ｎｔ２．５ｌＭ　ＰＡＡ処理　６３　７　１８　７５　ｗＭ　ＰＡ＾処理　６２　８　１１　１２１０　ｍＭ　Ｐ＾＾処理　７１　７　５　１０５　ｌｌ１ｌ　ＰＭＥ処理　６５　９　８　７Ｌｅｕ４零　＝Ｔリンパ球　ｎｔ＝試験しなかったＬｅｕ１２本二Ｂリンパ球ＬｅｕＭ３寧＝単球Ｌｅｕ１９＊　＝　ＮＫ細胞表４Ｃ４０：１　４．２　８．３４０：　１　１７．４　２１．９４０：１　３４．８　４２．２実施例　３高細胞密度でのＬＡＮ細胞活性化に関して、白血球除去（療）法によって集めた、単球数が異常に高いヒトＰＢＭＣ調製物を処理するために使用されるＦＡＡの濃度への依存性を評価した。ときには健康なドナーの白血球除去（療）法によって採集したものは高い単球数になる場合がある。平均して、その数は単核細胞の１５から２５％である。

本発明者は更に処理する前に幾つかのドナーの調製物を点検した。１つの調製物（ドナー５と称する）は通常の単球数のほぼ２倍であった。次いで、この調製物を２つに分け、そして０．５．１０．１５または２０１１Ｍ　ＰＡＡにさらした後、ＬＡＮ細胞活性化を試験した。５ｍＭＰＭＨの対照も実施した（表５Ａ）。

ＦＡＣ３分析はこれらの試料では使用できなかった。前記実験で見られるとおり、単球数は素晴らしく減少した。ｒｌＬ−２補充ＡＩＩＩ−Ｖ細胞培養培地中の５０ｍ１の細胞培養物は接種した細胞数の１００％より多く生じた。

ＬＡＮ細胞活性化はまた使用したＦＡＡの濃度に関係のある応答も示した。最適のＬＡＮ活性が１０５Ｍ　ＰＡＡで処理した試料で得られた（表５Ｂ）。

表５＾非処理　５６　４３　１５　ａｉｌ　ＰＡ＾処理　９１７２ＩＱ　ｍＭ　ＰＡＡ処理　９３３４１５　ｍＭ　ＰＡＡ処理　９３５２２０　ｍＭ　ＰＡＡ処理　９３４３５層Ｍ　ＰＭＥ処理　９５５０表５Ｂラジ細胞の細胞溶解％２０：１　１０．５　４２．３　７０．８　５４．４　２４．９　４２．９１０：１　４６．３　２３．０　３３．４　４１．４　３３．１　２４．７５＋１　４５．３　２２．６　１６．３　２０，５　３０，８　２３．７２．５：１　１２．９　１９．２　４．７　８，４　２４．７　４２．３表５０４０：１　２８．１　４７，９　７１．９　３６，３　２２．４　５９．８２０：１　１９．５　３４．４　５２．６　３１．７　１２．１　４０．７１０：１　２９．４　１５．９　１８，７　２１．８　１９，５　２３．２５：１　１９．２　１６Ｊ　２７．６　１２．９　１３．７　２１．８２．５：１　１４．４　１５．５　３．８　３．０　１０．７　２１．ＯＰＢＭＣをバイオロジカルスペシャルティー（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｐｅｃｉａｌｔｙ）　（ペンシルベニア州うンズデール）から入手し、そしてフィコール−バク（Ｐａｑｕｅ）　にュージャージー州ビス力タウェイのＰｈａｒｉａｃｉａ）密度勾配沈降によって分離した。フィコール分離の後にＲＰＩＩＩ−１６４０中のＰＢＭＣ（Ｉ　Ｘ　１０’個の細胞／■１）を新たに調製したＰＭＥ、　ＰＡＡまたはそれらの組合せ物と共に室温で４０分間インキュベートした。ストック溶液をＰＢＭＣに加える前にｐＨ７，４に調整した。細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。ＰＢＭＣからの単球枯渇をギームザ染色で評価した。

細胞を１０％のラン胎児血清および４００　Ｕ／ｓｌのｒＩＬ−２（ＢＲＭＰユニット）を補充した培地を有するポリプロピレン管内でＩ　Ｘ　１０’個の細胞／腫１の細胞密度で３７℃で４日間培養した。培養期間後、得られた細胞を５１Ｃｒ−標識ラジ（ＬＡＮ活性の測定）およびに５６２（ＮＫ活性の測定）標的細胞に対する細胞障害性をアッセイするために収集した。

アッセイは全て総量０．２ｉ１の丸底微量滴定プレート中で３回ずつ行った。Ｏ，１ｗＭの標識標的細胞（Ｉ　Ｘ　１０’ｌｉｉの細胞）を種々の濃度のエフェクター細胞Ｑ、　ｌ諺１に加えてエフェクター細胞：標的細胞の適当な最終比（Ｅ　：　Ｔ）を得た。微量滴定プレートを８０％ｇで３分間遠心し、次いで２時間（ＮＫアッセイ）または４時間（ＬＡＮアッセイ）インキュベートした。３つのＥ：Ｔ比をアッセイした。示したデータは、２０：１のＥＡＴ比を用いた、Ｋ５６２については２時間アッセイモしてラジについては４時間アッセイである。

ＩＬ−２による単球枯渇、［活性およびＬＡＮ活性化に対する効果を評価するために、ＦＡＡはＰＢＭＣに与える効果についてＰＭＥと比較した。ＦＡＡは投与量依存性態様でＰＢＭＣから単球を枯渇させた。ＦＡＡ処理またはＰＭＥ処理細胞のＮＫ活性も培養前（０日）に阻害された。ＩＬ−２によるＬＡＮ活性の活性化もＰＡＡまたはＰＭＥによって枯渇された単球の量に依存した。試験したドナーの大部分で、ＰＡＡおよびＰＩＩＩＥは、最適濃度で使用したとき、ＬＡＮ細胞産生の増強で同等に有効であった（表６）。

試験した３人のドナーのうち２人では、使用した条件下で、ＰＭＥとＦＡＡとの組合せ物は、良好な単球枯渇およびＬＡＮ活性化を示したけれども、５ｗＭのＰＭＨの単独使用を超える実賀的な改良は何も示さなかった（表７）。しかし乍ら、１人のドナー（実験２、表７）では、ＰＡＡとＰＭＥの組合せ物は相加的であるように思われた。この結果は、少なくとも投入かのドナーでＰＡＡとＰＭＥの組合せ物によってそのどちらかを単独で使用して得られるより大きいし八に活性値が得られることを示している。

表６および７の各実験は、ドナー細胞の別個の組を示す。

上記実施例の結果は、ＰＡＡおよび／またはＰＭＥでＰＢＩＩＣを前処理することに基づいた単球枯渇およびそれに続くＬＡＮ細胞活性化がドナーに依存性であることを示し、そしてＰＡＡおよび／またはＰＭＥはそれ自体実現可能な処理代替法である。例えば、ドナーのＰＢＭＣを処理するためにＰＭＥが最初に使用され、そして相当する不十分なＬＡＮ細胞活性化と共に不十分な単球枯渇である場合には、臨床医はここで、十分な単球枯渇を生じさせることができるＰＡＡまたはＰＡＡとＰＭＥの組合せ物に戻ることができる。

、　表６ＰＭＥおよびＦＡＡの効果表７実施例　５ＰＢＭＣをＰＭＥまたは種々のアミノ酸アミドを用いて室温で４０分間処理した。単球含量を、単球の表面マーカーであるＬｅｕＭ３抗体を使用するＦＡＣ３分析で測定した。ＮＫ活性（Ｅ：Ｔ比、２５：１）はに５６２細胞に対して測定した。ＬＡＮ活性化を、標的としてラジ細胞を使用し、ｌＸｌ０’個の細胞／！＋１で３乃至４日間、４％ヒト血清および４００　Ｕ／ｍｌのｒＩＬ　−２（ＢＲＭＰユニット）を含有するＲＰｌｉＴ−１６４０で細胞をインキュベートした後測定した。結果（表８）は、ロイシン、イソロイシン、バリン並びにフェニルアラニンのアミノ酸アミドがアミノ酸アミドで処理しないで得られた結果に比べてＬＡＫ活性値の増強に有効であることを示す。表８の各実験はドナー細胞の別々の組を示す。

表８ＮＫ　ＬＡＫＰＭＥ、　５ｄ　０　５　６４　５６ＴｙｒＮＨ２，５ａＭ　２５　５４　１８　５１０■Ｍ　３２　７０　９　２ＬｅｕＮＨ２，５ｄ　１　５０　５４　２８１ｈＭ　０　４７　６４　４８ＰＭＥ、　５ａＭ　２　１５　６１　３２ＰｈｅＮＨ２，５ａ＋ｌＩ　２　３４　６２　３５Ｌ旺、　５ｉ１１　１　０　４　５ＬｅｕＮＨ２，５ａＭ　０　３５　５９　２７ＶａｌＮＨ２，５ｍＭ　１６　４８　３０　１０Ｇ１ｕＮＲ２，５ｍ１ｌ　２４　６０　１９　３ＡｓｐＮＦＩ２．５ｍＭ　２６　６１　２０　５１１ｅＮＨ２，５ｍＭ　６　５１　５５　１７ＰＭＥ、　５＋ａＭ　３　４２　６７　２２国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１）末梢血液単核細胞を培養して天然キラー細胞に耐性の腫瘍細胞に細胞障害性である細胞集団を産生させるリンホカイン活性化キラー細胞の調製方法において、上記末梢血液単核細胞またはそれから得られる末梢血液リンパ球を、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびバリンまたはそれらの任意の混合物からなる群から選択されるＬ−アミノ酸のＬ−アミノ酸アミドと接触させそしてその後得られた細胞を培養することからなる改良方法。２）上記末梢血液単核細胞がヒト細胞である請求項１の方法。３）上記接触を約４０分間行う請求項２の方法。４）上記アミノ酸がフェニルアラニンである請求項３の方法。５）フェニルアラニンアミドが約１から１０ｍＭの濃度で存在する請求項４の方法。６）フェニルアラニンアミドが約１０ｍＭの濃度で存在する請求項５の方法。７）ヒト末梢血液単核細胞またはそれから得られる末梢血液リンパ球をインターロイキン−２の存在下で培養する請求項３の方法。８）ヒト末梢血液単核細胞またはそれから得られる末梢血液リンパ球をインターロイキン−２の存在下で培養する請求項５の方法。９）上記アミノ酸アミドとの接触によって得られたヒト末梢血液リンパ球を洗浄しそして再懸濁する請求項７の方法。１０）上記フェニルアラニンアミドとの接触によって得られたヒト末梢血液リンパ球を洗浄しそして再懸濁する請求項８の方法。１１）上記再懸濁ヒト末梢血液リンパ球を組換え体インターロイキン−２の存在下で２から４日間培養する請求項９の方法。１２）上記再懸濁ヒト末梢血液リンパ球を組換え体インターロイキン−２の存在下で２から４日間培養する請求項１０の方法。１３）ヒト末梢血液リンパ球の濃度が約３×１０６個／ｍｌから約１×１０８個／ｍｌまでである請求項１１の方法。１４）ヒト末梢血液リンパ球の濃度が約３×１０６個／ｍｌから約１×１０６個／ｍｌまでである請求項１２の方法。１５）末梢血液単核細胞を培養して天然キラー細胞に耐性の腫瘍細胞に細胞障害性である細胞集団を産生させるリンホカイン活性化キラー細胞の調製方法において、上記末梢血液単核細胞またはそれから得られる末梢血液リンパ球を、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群から選択されるＬ −アミノ酸のアミドと、アラニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン、トリブトファンおよびバリンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルとの組合せ物と接触させ、そしてその後得られた細胞を培養することからなる改良方法。１６）上記末梢血液単核細胞がヒト細胞である請求項１５の方法。１７）上記接触を約２０から４０分間行う請求項１６の方法。１８）上記Ｌ−アミノ酸がフェニルアラニンである請求項１７の方法。１９）上記エステルがＬ−フェニルアラニンメチルエステルでありそして上記アミドがフェニルアラニンアミドである請求項１８の方法。２０）上記エステルが約１〜５ｍＭの濃度で存在し、そして上記アミドが約１〜１０ｍＭの濃度で存在する請求項１９の方法。２１）上記エステルおよびアミドの塩酸塩が存在する請求項２０の方法。２２）ヒト末梢血液単核細胞または末梢血液リンパ球をインターロイキン−２の存在下で培養する請求項１９の方法。２３）ヒト末梢血液単核細胞または末梢血液リンパ球をインターロイキン−２の存在下で培養する請求項２０の方法。２４）上記エステルおよびアミドとの接触によって得られた末梢血液リンパ球を洗浄し、そして再懸濁する請求項２２の方法。２５）上記エステルおよびアミドを接触させることによって得られた末梢血液リンパ球を洗浄し、そして再懸濁する請求項２３の方法。２６）上記再懸濁末梢血液リンパ球を組換え体インターロイキン−２の存在下で２〜４日間培養する請求項２４の方法。２７）上記再懸濁末梢血液リンパ球を組換え体インターロイキン−２の存在下で２〜４日間培養する請求項２５の方法。２８）末梢血液リンパ球の濃度が約３×１０６個／ｍｌから約１×１０８個／ｍｌまでである請求項２６の方法。２９）末梢血液リンパ球の濃度が約３×１０６個／ｍｌから約１×１０６個／ｍｌまでである請求項２７の方法。３０）請求項３に記載の方法によって調製され単離されたリンホカイン活性化キラー細胞からなる組成物であって、その際該細胞は製薬的に受容可能な担体中にあり、そして腫瘍に苦しんでいるヒトにインターロイキン−２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。３１）請求項５に記載の方法によって調製され単離されたリンホカイン活性化キラー細胞からなる組成物であって、その際該細胞は製薬的に受容可能な担体中にあり、そして腫瘍に苦しんでいるヒトにインターロイキン−２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。３２）請求項１２に記載の方法によって調製され単離されたリンホカイン活性化キラー細胞からなる組成物であって、その際該細胞は製薬的に受容可能な担体中にあり、そして腫瘍に苦しんでいるヒトにインタへーロイキン−２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。３３）請求項１４に記載の方法によって調製され単離されたリンホカイン活性化キラー細胞からなる組成物であって、その際該細胞は製薬的に受容可能な担体中にあり、そして腫瘍に苦しんでいるヒトにインターロイキン−２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。３４）請求項１９に記載の方法によって調製され単離されたリンホカイン活性化キラー細胞からなる組成物であって、その際該細胞は製薬的に受容可能な担体中にあり、そして腫瘍に苦しんでいるヒトにインターロイキン−２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。３５）請求項２０に記載の方法によって調製され単離されたリンホカイン活性化キラー細胞からなる組成物であって、その際該細胞は製薬的に受容可能な担体中にあり、そして腫瘍に苦しんでいるヒトにインターロイキン−２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。３６）請求項２２に記載の方法によって調製され単離されたリンホカイン活性化キラー細胞からなる組成物であって、その際該細胞は製薬的に受容可能な担体中にあり、そして腫瘍に苦しんでいるヒトにインターロイキン−２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。３７）請求項２３に記載の方法によって調製され単離されたリンホカイン活性化キラー細胞からなる組成物であって、その際該細胞は製薬的に受容可能な担体中にあり、そして腫瘍に苦しんでいるヒトにインターロイキン−２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。３８）請求項２７に記載の方法によって調製され単離されたリンホカイン活性化キラー細胞からなる組成物であって、その際該細胞は製薬的に受容可能な担体中にあり、そして腫瘍に苦しんでいるヒトにインターロイキン−２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。３９）インターロイキン−２および請求項３０に記載の腫瘍阻害量の組成物を哺乳動物に投与することからなる該哺乳動物の腫瘍の治療方法。４０）インターロイキン−２および請求項３１に記載の腫瘍阻害量の組成物を哺乳動物に投与することからなる該哺乳動物の腫瘍の治療方法。４１）インターロイキン−２および請求項３３に記載の腫瘍阻害量の組成物を哺乳動物に投与することからなる該哺乳動物の腫瘍の治療方法。４２）インターロイキン−２および請求項３５に記載の腫瘍阻害量の組成物を哺乳動物に投与することからなる該哺乳動物の腫瘍の治療方法。４３）インターロイキン−２および請求項３８に記載の腫瘍阻害量の組成物を哺乳動物に投与することからなる該哺乳動物の腫瘍の治療方法。