CN109810945A

CN109810945A - 一种自体γδ-Τ细胞制备方法及实施该方法的试剂盒

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Publication number: CN109810945A
Application number: CN201910099930.XA
Authority: CN
Inventors: 金浩范; 孔伟圣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-05-28

Abstract

本发明涉及免疫细胞体外培养技术领域，尤其涉及一种自体γδ‑Τ细胞制备方法及实施该方法的试剂盒。一种自体γδ‑Τ细胞制备方法主要包括单核细胞提取，采用细胞激活剂包被液包被细胞培养瓶，γδ‑Τ细胞诱导、活化、与增值，收取全部γδ‑Τ细胞，γδ‑Τ细胞杀瘤活性测定等。用于实施该自体γδ‑Τ细胞制备方法的试剂盒包括盒体、盒盖、基座、细胞激活剂包被液试剂管、γδ‑Τ细胞刺激液试剂管、γδ‑Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ‑Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管。本发明的自体γδ‑Τ细胞制备方法获得的γδ‑Τ细胞纯度、数量、杀瘤性和活性均能达到较优水平，且避免了其它外来细胞所产生的免疫排斥反应；本发明的用于制备自体γδ‑Τ细胞的试剂盒结构简单、使用方便。

Description

一种自体γδ-Τ细胞制备方法及实施该方法的试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫细胞体外培养技术领域，尤其涉及一种自体γδ-Τ细胞制备方法及实施该方法的试剂盒。

背景技术

γδ-Τ细胞是机体免疫系统的重要组成部分，通过多种方式参与机体抗肿瘤免疫反应。γδ-Τ细胞能以MHC限制性或非MHC限制性方式特异性识别靶细胞，并通过两条独立的途径直接溶解杀伤靶细胞：一方面，分泌穿孔素和颗粒酶以杀伤肿瘤细胞，穿孔素和颗粒酶以杀伤肿瘤细胞，穿孔素在Ca2+存在的条件下可以插入靶细胞膜，经多聚化形成管状结构，从而破坏细胞的细胞膜结构，杀伤靶细胞，颗粒酶是一类丝氨酸酯酶，进入胞浆后可以直接活化胞浆中的蛋白酶，促进细胞凋亡；另一方面，在γδ-Τ细胞识别肿瘤细胞后，细胞表面表达的高水平FasL与肿瘤细胞表面的Fas相互识别，通过Fas触发肿瘤细胞内部的程序性凋亡，达到肿瘤杀伤效果。除了直接裂解肿瘤细胞，γδ-Τ细胞还能分泌TNF-a抑制肿瘤血管形成，以达到抑制肿瘤生长的抗肿瘤作用。

目前，国内体外培养γδ-Τ细胞方法主要是，采用免疫磁珠对单个核细胞进行细胞分选后再扩增的方法，这种方法分离出的细胞虽然纯度较高，但大大增加了研究成本，而且因为缺乏成熟的分选后体外培养工艺，所以很难在体外扩增，无法满足临床回输所需的细胞数量。

因此，国内目前的γδ-Τ细胞培养试剂盒或γδ-Τ细胞培养方法在细胞数量、细胞纯度和杀瘤性上不能满足临床和科研需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞纯度、数量、杀瘤性和活性均能达到较优水平的一种自体γδ-Τ细胞制备方法。本发明的另一个目的在于提供一种用于实施该自体γδ-Τ细胞制备方法的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供了一种自体γδ-Τ细胞制备方法，包括以下步骤：

(1)单核细胞提取：从外周血或脐带血中提取单核细胞；

(2)采用细胞激活剂包被液包被细胞培养瓶；其中，细胞激活剂包被液为采用PBS稀释抗CD3抗体细胞激活剂至10ng/mL；

(3)将单核细胞用NK细胞扩增基础培养基调整细胞浓度为1×10⁶～2×10⁶/mL后接种于包被好的T75细胞培养瓶中，并加入20～30mLγδ-Τ细胞刺激液以及体积分数为5～8％的自体灭活血浆，开始刺激细胞，并记为D₀天；其中，γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及IL-18，γδ-Τ细胞刺激液含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及Zoledronate；

(4)D₃天解除刺激，从T75细胞培养瓶中取出细胞悬液进行计数，余下细胞转移离心管离心，弃掉上清，将沉淀打散，用γδ-Τ细胞扩增培养基调整细胞浓度为0.5×10⁶～2.0×10⁶个/mL后接种于新的包被好的T75细胞培养瓶中，并加入γδ-Τ细胞扩增培养基和体积分数为8～10％的自体血浆，每隔3天计数并补液；其中，γδ-Τ细胞扩增培养基含有IL-2以及IL-18；

(5)D₅天补液，取出T75细胞培养瓶，然后用移液管混匀，取出细胞悬液进行台盼蓝染色计数，按照1.0×10⁵～1.0×10⁶个/mL补加γδ-Τ细胞扩增培养基和体积分数为5～8％的自体血浆，依据补液量更换包被好的175cm²细胞培养瓶或1000ml细胞培养袋；

(6)D₁₄～D₂₀收取细胞培养瓶或细胞培养液中的全部细胞。

进一步的，步骤(2)中包被细胞培养瓶的步骤为：取1-5ml细胞激活剂包被液于细胞培养瓶中，36℃过夜后，吸弃细胞培养瓶中PBS，再置于4℃冰箱中放置2.5～4个月。

进一步的，γδ-Τ细胞刺激液含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为10％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为5μΜ/mL的Zoledronate。

进一步的，γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为10％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为50U/mL的IL-18。

进一步的，γδ-Τ细胞扩增培养基含有终浓度为350～500U/mL的IL-2、以及终浓度为50U/mL的IL-18。

本发明的一种自体γδ-Τ细胞制备方法，具有以下有益效果：

1、本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法采用单纯因子体外诱导扩增γδ-Τ细胞，利用自体免疫细胞体外高效增殖成γδ-Τ细胞，其细胞纯度、数量、杀瘤性和活性均能达到较优水平，且避免了其它外来细胞所产生的免疫排斥反应。

2、本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法包括γδ-Τ细胞扩增基础培养基、γδ-Τ细胞刺激液、以及γδ-Τ细胞扩增培养基，从而实现了γδ-Τ细胞在不同时期的诱导、活化、与增值，根据不同时期的需求进行设计，从而提供了一种γδ-Τ细胞增值速度较快、活性较高的γδ-Τ细胞制备方法。

3、本发明不仅具有较好的安全性，而且加入的因子种类较少，操作更简单、质量更稳定、技术成本更低廉，适用于大规模培养和肿瘤临床治疗。

4、本发明包被的抗CD3抗体，可以直接快速有效的使γδ-Τ细胞受到信号刺激，活化γδ-Τ细胞，促进细胞因子的合成，显著提高γδ-Τ细胞的杀瘤性。

5、本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法在包被好的T75培养瓶中培养7天左右后，再将细胞转入大的细胞培养瓶或细胞培养袋中，这样既可以保证γδ-Τ细胞被充分激活，又避免了高浓度抗体对细胞的持续作用诱发的凋亡，并且同等条件下细胞培养袋的效果要优于细胞培养瓶。

6、本发明的自体细胞γδ-Τ制备方法经测定其细胞纯度高达85％～90％；杀瘤性高达75％～80％，增值率达到950倍；在其平行试验中，γδ-Τ细胞在细胞比例、杀瘤性、增值率指标上比较稳定，所以此发明方法不仅可以用在试剂盒研究而且能够满足临床需求，是目前为止γδ-Τ细胞体外培养最优方法。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种用于实施该自体γδ-Τ细胞制备方法的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，包括盒体、盒盖、基座、细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管，其中：盒体为顶面开口的不封闭盒体；盒盖可扣合在盒体上，用于封闭盒体；基座固定设置在盒体内；细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管可移除的插入在基座上。

进一步的，细胞激活剂包被液试剂管包括PBS试剂管以及抗CD3抗体细胞激活剂试剂管；γδ-Τ细胞刺激液试剂管包括细胞扩增添加剂试剂管、L-谷氨酰胺试剂管、Zoledronate试剂管；γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管包括细胞扩增添加剂试剂管、L-谷氨酰胺试剂管、IL-18试剂管；γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管包括IL-2试剂管以及IL-18试剂管。

进一步的，细胞激活剂包被液试剂管盛放有细胞激活剂包被液，细胞激活剂包被液含有10ng/mL的抗CD3抗体细胞激活剂；γδ-Τ细胞刺激液试剂管盛放有γδ-Τ细胞刺激液，γδ-Τ细胞刺激液含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为5μΜ/mL的Zoledronate；γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管盛放有γδ-Τ细胞扩增基础培养基，γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为50U/mL的IL-18；γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管盛放有γδ-Τ细胞扩增培养基，γδ-Τ细胞扩增培养基含有终浓度为350～500U/mL的IL-2、以及终浓度为50U/mL的IL-18。

进一步的，盒体的两侧还设置有防滑纹或盒体的两侧还设置有便于盒体移动的把柄。

进一步的，基座上还设置有插孔，插孔的孔壁粘接有环状防滑橡胶套，细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管插入插孔内并与防滑橡胶套挤压接触。

本发明的一种用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，具有以下有益效果：

1、本发明的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒设置有细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管，可以满足临床级别用的自体γδ-Τ细胞制备的需要，功能针对性较强。

2、本发明的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒具有多个试剂管，可以盛放配备好的细胞激活剂包被液、γδ-Τ细胞刺激液、γδ-Τ细胞扩增基础培养基、γδ-Τ细胞扩增培养基，也可以根据需要盛放用于配备细胞激活剂包被液、γδ-Τ细胞刺激液、γδ-Τ细胞扩增基础培养基、γδ-Τ细胞扩增培养基的PBS、抗CD3抗体细胞激活剂、细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、Zoledronate、IL-2、IL-18等，且各个试剂管根据盛放试剂的不同可以分区设置。

3、本发明的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒两侧设置有防滑纹或盒体的两侧还设置有便于盒体移动的把柄，有效防止试剂盒移动过程中的滑动脱落。

4、本发明的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，插孔的孔壁粘接有环状防滑橡胶套，防滑橡胶套与各试剂管挤压接触，从而可以有效固定各试剂管，而且起到缓冲减震的作用。

5、本发明的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒结构简单、使用方便，在NK细胞制备领域可以广泛推广使用。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1为本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法的培养前外周血中γδ-Τ细胞比例图；

图2为本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法的培养后γδ-Τ细胞比例图；

图3为本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法的γδ-Τ细胞增殖图；

图4为本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法的γδ-Τ细胞数量图；

图5为本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法的γδ-Τ/CIK/NK细胞杀毒性对比图；

图6为本发明的自体γδ-Τ细胞制备流程图；

图7为进行细胞生物治疗的每种病与患者的百分比；

图8为本发明的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒的结构示意图；

图9为本发明的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒的基座结构示意图；

图中：1-盒体、2-盒盖、3-基座、4-防滑橡胶套。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。

本发明实施例的一种自体NK细胞制备方法，包括以下步骤：

(1)单核细胞提取：从外周血、淋巴结、胸腺、骨髓、肿瘤、胸水、腹水、或脐带血中提取单核细胞。优选的，采用密度梯度离心法分离提取出单核细胞。

(2)采用细胞激活剂包被液包被细胞培养瓶。优选的，细胞激活剂包被液为采用PBS稀释4-1BB抗体细胞激活剂至8～12ug/mL制得。此处的细胞激活剂包被液可以包被各型号细胞培养瓶或细胞培养袋，如T75细胞培养瓶、175cm²细胞培养瓶、1000ml细胞培养袋等。

(3)将单核细胞用γδ-Τ细胞扩增基础培养基调整细胞浓度为1×10⁶～2×10⁶/mL后接种于包被好的T75细胞培养瓶中，并加入30～40mLγδ-Τ细胞刺激液以及体积分数为5％的自体血浆，开始刺激细胞，并记为D₀天；其中，γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及IL-18，γδ-Τ细胞刺激液含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺。优选的，γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为80～120U/mL的IL-18；γδ-Τ细胞刺激液含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺

(4)D₃天解除刺激，从T75细胞培养瓶中取出细胞悬液进行计数，余下细胞转移离心管离心，弃掉上清，将沉淀打散，用NK细胞扩增培养基调整细胞浓度为0.5×10⁶～2.0×10⁶个/mL后接种于新的包被好的T75细胞培养瓶中，并加入γδ-Τ细胞扩增培养基和体积分数为5％的自体血浆，每隔一天计数并补液；其中，γδ-Τ细胞扩增培养基含有IL-2以及IL-15。优选的，γδ-Τ细胞扩增培养基为AIM-V培养基，并添加终浓度为750U/mL的IL-2、以及终浓度为20～30ng/mL的IL-15。

(5)D₅天补液，取出T75细胞培养瓶，然后用移液管混匀，取出细胞悬液进行台盼蓝染色计数，按照1×10⁵～1.0×10⁶个/mL补加γδ-Τ细胞扩增培养基和体积分数为5％的自体血浆，依据补液量更换包被好的175cm²细胞培养瓶或1000ml细胞培养袋；D₇天细胞计数补液；D₉天细胞计数补液；D₁₁按着计数结果对其补液；D₁₃天抽取细胞悬液计数补液。

本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法采用单纯因子体外诱导扩增γδ-Τ细胞，利用自体免疫细胞体外高效增殖成γδ-Τ细胞，其细胞纯度、数量、杀瘤性和活性均能达到较优水平，且避免了其它外来细胞所产生的免疫排斥反应；另外γδ-Τ细胞扩增基础培养基、γδ-Τ细胞刺激液、以及γδ-Τ细胞扩增培养基的配置与添加，从而实现了γδ-Τ细胞在不同时期的诱导、活化、与增值，根据不同时期的需求进行设计，从而提供了一种γδ-Τ细胞增值速度较快、活性较高的γδ-Τ细胞制备方法。应该指出，本发明的各数据范围及数值只是一个优选范围或优选数值，本领域技术人员可根据实际情况进行调整。

进一步的，步骤(2)中包被细胞培养瓶的步骤为：取10ml细胞激活剂包被液于细胞培养瓶中，37℃过夜后，吸弃细胞培养瓶中PBS，再置于3～5℃冰箱中放置2.5～4个月。本发明包被的抗CD3抗体，可以直接快速有效的使γδ-Τ细胞受到信号刺激，活化γδ-Τ细胞，促进细胞因子的合成，显著提高γδ-Τ细胞的杀瘤性。

进一步的，T75细胞培养瓶、175cm²细胞培养瓶、或1000ml细胞培养袋置于37℃、5％CO₂培养箱中进行γδ-Τ细胞培养。

在本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法的一些实施例中，还包括步骤(7)：

(7)γδ-Τ细胞杀瘤活性测定：以K562细胞为靶细胞，按着不同效靶比将效应细胞和靶细胞混合培养，置于培养箱中培养10～14小时后,每孔加入8～12ul cellcountingkit8混匀，于培养箱中继续培养3～5小时后用酶标仪测定450nm波长处值。

本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法经测定其细胞纯度高达80％～85％；杀瘤性高达85％～90％，增值率达到1000倍；在其平行试验中，γδ-Τ细胞在细胞比例、杀瘤性、增值率指标上比较稳定，所以此发明方法不仅可以用在试剂盒研究而且能够满足临床需求，是目前为止γδ-Τ细胞体外培养最优方法。

进一步的，靶细胞浓度为1×10⁵～1×10⁶个/mL，效应细胞浓度为1×10⁵～1×10⁶个/mL。优选的，γδ-Τ细胞杀瘤活性测定的效靶比为1:1、5:1、10:1。

为了更清楚的描述本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法，现给出具体实施例，如图1至图6所示：

实施例采取周边多名健康人士血液，献血者经临床评估无血液系统疾病和严重自身免疫性疾病；外周血中单个核细胞提取后诱导增殖，实验中所有操作均在GMP实验室中完成。

每人采集60mL外周血样，分别做3个平行试验。室温下混匀，转移至50mL离心管中，留取2mL外周血做流式。3000rpm/10min，温度20℃，上下加速度调成5/5，离心结束后取出离心管，将血浆转移至另一个50ml离心管，余下血浆56℃灭活(30～40)min，灭活结束后，过70um膜，3000rpm/10min离心。用PBS将血液定容到30mL混匀，将血慢慢打到15ml淋巴细胞分离液中，温度室温，转速1600rpm，离心30min，上下加速度分别调为2。

离心结束后小心取出离心管，将离心管白细胞层上方约10cm处液体弃掉。将白细胞层细胞转移至新离心管，用PBS定容到45ml，温度20℃，转速1200rpm，离心5min，离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，再次用PBS定容到45ml，混匀，取出200ul进行计数。余下细胞悬液以1200rpm，温度20℃，离心5min，离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，γδ-Τ细胞扩增基础培养基调整细胞浓度至1.5×10⁶个/mL进行接种，加入40mLγδ-Τ细胞刺激液和5％自体血浆于包被好的T75细胞培养瓶中开始刺激细胞，记为D₀天。其中，γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有体积分数为20％的细胞扩增添加剂、体积分数为20％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为100U/mL的IL-18；γδ-Τ细胞刺激液含有体积分数为20％的细胞扩增添加剂、体积分数为20％的L-谷氨酰胺

D₃天解除刺激，从T75细胞培养瓶中取出细胞悬液进行计数，余下细胞悬液转移至50ml离心管中。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，用γδ-Τ细胞扩增培养基调整细胞浓度至1.0×10⁶个/mL接种于新的包被好的T75细胞培养瓶中，并加入适当γδ-Τ细胞扩增培养基和10％自体血浆，转移至新75cm²细胞培养瓶。每隔一天计数补液。其中，γδ-Τ细胞扩增培养基为AIM-V培养基，并添加终浓度为700U/mL的IL-2、以及终浓度为25ng/mL的IL-15。

D₅天补液。从37℃、5％CO₂培养箱中取出培养瓶，然后用移液管混匀，从T75细胞培养瓶中取出细胞悬液进行台盼蓝染色计数，按着(0.5～1)×10⁶个/mL补加γδ-Τ细胞扩增培养基和5％自体血浆。依据补液量更换175cm²细胞培养瓶或1000ml细胞培养袋。

D₇天细胞计数补液。

D₉天细胞计数补液。

D₁₁按着计数结果对其补液。

D₁₃天抽取细胞悬液计数补液。

D₁₄～D₂₀收取细胞。将细胞悬液分别加入到4个250ml离心管，然后用移液器混匀细胞悬液，抽取2ml细胞悬液于冻存管中进行流式细胞仪检测和U266杀瘤性检测。再抽取细胞悬液进行计数。余下细胞悬液离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，次用PBS定容离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，再次用PBS定容(容量)离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，用生理盐水定容到100ml，离心。离心结束后取出离心管，弃掉上清，将沉淀打散，用生理盐水重悬细胞，过70um细胞筛，将细胞悬液打入到生理盐水中。

γδ-Τ细胞杀瘤活性测定(γδ-Τ细胞毒杀活性检测方法)：

收集对数生长期细胞,以U266细胞为靶细胞，靶细胞的浓度为1×10⁵个/mL，调整γδ-Τ细胞浓度为1×10⁵个/mL细胞为效应细胞,根据不同的效靶比分别调整细胞浓度为1.5×10⁵个/mL、1×10⁶个/mL。按不同效靶比(1:1、5:1、10:1)将效应细胞和靶细胞混合,同时设相应的靶细胞孔、效应细胞孔和培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔，置于37℃、饱和湿度培养箱中培养12小时后,每孔加入10ul cellcounting kit8,混匀,于37℃饱和湿度培养箱中继续培养4小时后用酶标仪测定450nm波长处值。细胞毒杀活性计算方法求出平行孔的平均值,按以下方法计算各组细胞毒杀活性,以杀伤率％表示：

细胞毒杀活性＝(1-靶细胞孔OD值一效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值×100％

本发明对3例健康者实施实验，实验测定结果如表1所示，由表1可以看出，应用本发明方法对体外单个核细胞进行扩增，其细胞纯度高达82.57％；杀瘤性高达87％，增值率达到1000倍。其平行试验中，γδ-Τ细胞在细胞比例、杀瘤性、增值率指标上比较稳定，所以本发明方法不仅可以用在试剂盒研究而且能够满足临床需求，是目前为止γδ-Τ细胞体外培养最优方法。

表1

如图7显示，本发明的自体γδ-Τ细胞制备方法对于临床上各种细胞生物治疗的疾病将会起到至关重要的作用，免疫治疗领域具有了广泛的应用价值。

本发明实施例的一种用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，用于实施上述自体γδ-Τ细胞制备方法，如图8、图9所示，包括盒体1、盒盖2、基座3、细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管，其中：盒体1为顶面开口的不封闭盒体1；盒盖2可扣合在盒体1上，用于封闭盒体1；基座3固定设置在盒体1内；细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管可移除的插入在基座3上。

具体的，盒体1的形状可以为长方形、正方形、正多边形、或者圆形，具有完全敞开的顶面，盒体1可以采用硬质塑料制作；盒盖2与盒体1相匹配，盒盖2可以完全扣合在盒体1上，封闭盒体1，保证盒体1的完全密封，防尘、防水，盒体1与盒盖2扣合接触的位置还可以设置各种卡扣结构，或者盒体1与盒盖2旋转连接，从而避免盒体1移动过程中盒盖2的脱落，盒盖2优选的与盒体1采用相同的材质制作，本发明不做具体限定；基座3可以可拆卸的卡设固定在盒体1内，便于清洗，也可以与盒体1一体成型，免除后续的安装固定程序，本领域技术人员可根据实际需要进行选择；细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管均采用玻璃材质制作，各试剂管还可以包括用于封闭试剂管的封盖，封盖可以采用塑料、橡胶、植物纤维等材料制作。

进一步的，细胞激活剂包被液试剂管包括PBS试剂管以及4-1BB抗体细胞激活剂试剂管；γδ-Τ细胞刺激液试剂管包括细胞扩增添加剂试剂管、L-谷氨酰胺试剂管；γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管包括细胞扩增添加剂试剂管、L-谷氨酰胺试剂管、IL-18试剂管；γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管包括IL-2试剂管以及IL-15试剂管，各试剂管的型号本发明不做具体限定，本领域技术人员可根据实际需要选择。

进一步的，细胞激活剂包被液试剂管盛放有细胞激活剂包被液，细胞激活剂包被液含有8～12ug/mL的抗CD3抗体细胞激活剂；γδ-Τ细胞刺激液试剂管盛放有γδ-Τ细胞刺激液，γδ-Τ细胞刺激液含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺；γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管盛放有γδ-Τ细胞扩增基础培养基，γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为80～100U/mL的IL-18；NK细胞扩增培养基试剂管盛放有NK细胞扩增培养基，NK细胞扩增培养基含有终浓度为750U/mL的IL-2、以及终浓度为20～30ng/mL的IL-15，本领域技术人员也可以根据实际的需要调整各成分的含量，以上数据范围只是一个优选数值范围。

本发明的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒可以盛放配备好的细胞激活剂包被液、γδ-Τ细胞刺激液、γδ-Τ细胞扩增基础培养基、γδ-Τ细胞扩增培养基，也可以根据需要盛放用于配备细胞激活剂包被液、γδ-Τ细胞刺激液、γδ-Τ细胞扩增基础培养基、γδ-Τ细胞扩增培养基的PBS、抗CD3抗体细胞激活剂试、细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、IL-12、IL-15等，且各个试剂管根据盛放试剂的不同可以分区设置，使用更为便捷。

进一步的，盒体1的两侧还设置有防滑纹、或盒体1的两侧还设置有便于盒体1移动的把柄/凹槽、或盒体1的两侧还粘贴有防滑橡胶片；盒体1的底部与承载物接触的部位还可以设置防滑垫，防止承载物(如实验桌等)晃动时盒体1跌落。

进一步的，基座3上还设置有插孔，插孔的孔壁粘接有环状防滑橡胶套4，细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管插入插孔内并与防滑橡胶套4挤压接触。具体的，插孔为通孔，插孔的深度决定于基座3的厚度，即插孔的深度等于基座3的厚度；插孔的个数及孔径应根据各试剂管直径等确定，应保证试剂管插入孔径后，试剂管的垂直度，以及试剂管与盒体1底面的不接触，基座3的设置高度及厚度本领域技术人员可根据实际情况进行确定，本发明不做具体限定；防滑橡胶套4可以通过粘接剂等直接粘接于插孔的侧壁上，当各试剂管插入时与试剂管管壁挤压接触，从而可以很好的固定各试剂管又可以起到缓冲减震的作用。

综上所述为本发明的具体实施方式,本发明可以用于试剂盒上进行γδ-Τ细胞大量增殖。应用本发明方法但本发明保护范围并不仅仅局限于此,任何熟悉本技术操作人员在本发明涵盖技术范围内,可以改变或替换内容,都应包括在本发明保护范围之内。

Claims

1.一种自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)单核细胞提取：从外周血或脐带血中提取单核细胞；

(2)采用细胞激活剂包被液包被细胞培养瓶；其中，所述细胞激活剂包被液为采用PBS稀释抗CD3抗体细胞激活剂至10ng/mL；

(3)将单核细胞用γδ-Τ细胞扩增基础培养基调整细胞浓度为1×10⁶～2×10⁶/mL后接种于包被好的T75细胞培养瓶中，并加入20-30mlγδ-Τ细胞刺激液以及体积分数为5～8％的自体血浆，开始刺激细胞，并记为D₀天；其中，所述γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及IL-12，所述γδ-Τ细胞刺激液含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及Zoledronate；

(4)D₃天解除刺激，从T75细胞培养瓶中取出细胞悬液进行计数，余下细胞转移离心管离心，弃掉上清，将沉淀打散，用γδ-Τ细胞扩增培养基调整细胞浓度为0.5×10⁶～2.0×10⁶个/mL后接种于新的T75细胞培养瓶中，并加入γδ-Τ细胞扩增培养基和体积分数为8～10％的自体血浆，每隔3天计数并补液；其中，所述γδ-Τ细胞扩增培养基含有IL-2以及IL-18；

(5)D₅天补液，取出T75细胞培养瓶，然后用移液管混匀，取出细胞悬液进行台盼蓝染色计数，按照1×10⁵～1.0×10⁶个/mL补加γδ-Τ细胞扩增培养基和体积分数为5～8％的自体血浆，依据补液量更换175cm²细胞培养瓶或1000ml细胞培养袋；

2.根据权利要求1所述的自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，步骤(2)中包被细胞培养瓶的步骤为：取1-5ml细胞激活剂包被液于细胞培养瓶中，36℃过夜后，吸弃细胞培养瓶中PBS，再置于4℃冰箱中放置2.5～4个月。

3.根据权利要求1所述的自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，所述γδ-Τ细胞刺激液含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为10％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为5μΜ/mL的Zoledronate。

4.根据权利要求1所述的自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，所述γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为50U/mL的IL-18。

5.根据权利要求1所述的自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，所述NK细胞扩增培养基含有终浓度为350-500U/mL的IL-2。

6.一种用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，其用于实施权利要求1-5中任一项所述的自体γδ-Τ细胞制备方法，其特征在于，包括盒体、盒盖、基座、细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管，其中：

所述盒体为顶面开口的不封闭盒体；

所述盒盖可扣合在所述盒体上，用于封闭所述盒体；

所述基座固定设置在所述盒体内；

所述细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管可移除的插入在所述基座上。

7.根据权利要求6所述的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，其特征在于，

所述细胞激活剂包被液试剂管包括PBS试剂管以及抗CD3抗体细胞激活剂试剂管；

所述γδ-Τ细胞刺激液试剂管包括细胞扩增添加剂试剂管、L-谷氨酰胺试剂管、Zoledronate试剂管；

所述Zoledronate；细胞扩增基础培养基试剂管包括细胞扩增添加剂试剂管、L-谷氨酰胺试剂管、IL-18试剂管；

所述γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管包括IL-2试剂管以及IL-18试剂管。

8.根据权利要求6所述的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，其特征在于，

所述细胞激活剂包被液试剂管盛放有细胞激活剂包被液，所述细胞激活剂包被液含有10ng/mL的抗CD3抗体细胞激活剂；

所述γδ-Τ细胞刺激液试剂管盛放有γδ-Τ细胞刺激液，所述γδ-Τ细胞刺激液含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为5μΜ/ml的Zoledronate；

所述细胞扩增基础培养基试剂管盛放有γδ-Τ细胞扩增基础培养基，所述γδ-Τ细胞扩增基础培养基含有体积分数为20～30％的细胞扩增添加剂、体积分数为15～25％的L-谷氨酰胺、以及终浓度为350-500U/mL的IL-12；

所述γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管盛放有γδ-Τ细胞扩增培养基，所述γδ-Τ细胞扩增培养基含有终浓度为350～500U/mL的IL-2、以及终浓度为50U/mL的IL-18。

9.根据权利要求6所述的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，其特征在于，所述盒体的两侧还设置有防滑纹或所述盒体的两侧还设置有便于所述盒体移动的把柄。

10.根据权利要求6所述的用于制备自体γδ-Τ细胞的试剂盒，其特征在于，所述基座上还设置有插孔，所述插孔的孔壁粘接有环状防滑橡胶套，所述细胞激活剂包被液试剂管、γδ-Τ细胞刺激液试剂管、γδ-Τ细胞扩增基础培养基试剂管、γδ-Τ细胞扩增培养基试剂管、以及自体血浆试剂管插入所述插孔内并与所述防滑橡胶套挤压接触。