CN106074602A - 混合细胞制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种混合细胞制剂及其制备方法与应用，其中，所述混合细胞制剂包括：间充质干细胞、调节性T细胞、以及溶液；在所述混合细胞制剂中，所述间充质干细胞的浓度为(1～10)×10⁵个/ml，所述调节性T细胞的浓度为(0.1～3)×10⁶个/ml。本发明混合细胞制剂可以促进胰岛β细胞再生和修复、以及抑制自身免疫反应对胰岛β细胞的损伤而治疗1型糖尿病，无需胰岛移植。

Description

混合细胞制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及免疫细胞技术领域，尤其涉及一种混合细胞制剂及其制备方法与应用。

背景技术

糖尿病是一类发病人数众多，危害大，进程缓慢的慢性疾病。其中，1型糖尿病(T1DM)是T细胞介导的自身免疫性疾病，在遗传易感因素与环境因素相互作用下，体内的免疫调节逐渐失衡，以胰岛β细胞损害导致严重胰岛素分泌障碍为特点，血糖持续升高为标志。

目前糖尿病的治疗主要依赖药物和胰岛素来控制血糖，不能治愈糖尿病，患者从发病开始就需使用药物治疗，需要终生服用降糖药物和/或注射胰岛素，费用高昂。虽然胰岛素治疗可有效缓解糖尿病症状，但是胰岛素治疗并不能彻底解决胰岛β细胞损伤的问题。

胰岛移植为治愈糖尿病提供了可能性，但由于胰岛来源受限，且配型困难，手术成功率低，治疗后需要长期服用抗免疫排斥药物，限制了此技术的广泛应用。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种混合细胞制剂，旨在通过促进胰岛β细胞再生和修复、以及抑制自身免疫反应对胰岛β细胞的损伤而治疗1型糖尿病，无需胰岛移植。

为实现上述目的，本发明提供一种混合细胞制剂，所述混合细胞制剂包括：间充质干细胞、调节性T细胞、以及溶液；在所述混合细胞制剂中，所述间充质干细胞的浓度为(1～10)×10⁵个/ml，所述调节性T细胞的浓度为(0.1～3)×10⁶个/ml。

优选地，所述间充质干细胞的浓度为(4～6)×10⁵个/ml。

优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

优选地，所述调节性T细胞的浓度为(0.5～1.5)×10⁶个/ml。

优选地，所述调节性T细胞为CD4⁺CD25⁺调节性T细胞。

优选地，所述溶液为注射液，所述注射液包括组分如下：

质量分数为1～8％的葡萄糖；质量分数为0.1～2％的NaCl；质量分数为0.1～2％的人血清白蛋白；质量分数为90～98％的水。

优选地，所述注射液包括组分如下：

质量分数为5％的葡萄糖；质量分数为0.45％的NaCl；质量分数为0.5％的人血清白蛋白；质量分数为94.05％的水。

本发明还提供一种如上所述的混合细胞制剂的制备方法，包括步骤如下：

获取所述间充质干细胞；

获取所述调节性T细胞；

提供所述溶液，并将所述间充质干细胞、所述调节性T细胞加入所述溶液中。

优选地，所述获取调节性T细胞的步骤，包括：

获取外周血单个核细胞；

从所述外周血单个核细胞中分选出CD4⁺T细胞；

从所述CD4⁺T细胞中分选出CD4⁺CD25⁺调节性T细胞。

本发明还提供一种如上所述的混合细胞制剂在治疗自身免疫性疾病的药物上的应用。

优选地，所述自身免疫性疾病为1型糖尿病。

本发明技术方案，通过将间充质干细胞、调节性T细胞与溶液混合，而制得混合细胞制剂，其中，该间充质干细胞可以促进胰岛β细胞再生和修复，上调调节性T细胞而起到免疫调节的作用；该调节性T细胞可以抑制T细胞介导的自身免疫性反应，避免T细胞攻击胰岛β细胞，因此，本发明混合细胞制剂可以有效调节免疫反应，减轻或消除自身免疫系统攻击胰岛β细胞，同时再生和修复受损胰岛β细胞，从而达到缓解或治疗1型糖尿病的效果，甚至可以达到接近治愈的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的内容获得其他的附图。

图1A为本发明实施例1中原代脐带间充质干细胞培养3天后的细胞形态示意图；

图1B为本发明实施例1中原代脐带间充质干细胞培养7天后的细胞形态示意图；

图2为本发明实施例1中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的流式鉴定统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种混合细胞制剂，该混合细胞制剂包括原料如下：

间充质干细胞、调节性T细胞、以及溶液。而且，在该混合细胞制剂中，该间充质干细胞的浓度为(1～10)×10⁵个/ml，该调节性T细胞的浓度为(0.1～3)×10⁶个/ml。

本发明混合细胞制剂通过将间充质干细胞、调节性T细胞与溶液混合而成，其中，该间充质干细胞可以促进胰岛β细胞再生和修复，上调调节性T细胞而起到免疫调节的作用；该调节性T细胞可以抑制T细胞介导的自身免疫性反应，避免T细胞攻击胰岛β细胞，因此，本发明混合细胞制剂可以有效调节免疫反应，减轻或消除自身免疫系统攻击胰岛β细胞，同时再生和修复受损胰岛β细胞，从而达到缓解或治疗1型糖尿病的效果，甚至可以达到接近治愈的效果。

需要说明的是，该间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于脐带、骨髓等多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化成肝细胞、神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等，除此之外，间充质干细胞还具有低免疫原性和独特的免疫调节作用，能逃避免疫识别、抑制免疫应答；具体地，本发明间充质干细胞可以来源于脐带、骨髓、脐血、全身结缔组织或器官间质。该调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，Treg包括：天然型Treg(nature regulatory T cell，nTreg)即CD4⁺CD25⁺Treg、Tr1型CD4⁺Treg、Th3型CD4⁺Treg、以及CD8⁺Treg；其中，CD4⁺CD25⁺Treg是Treg亚群中的主要组成成分，主要在胸腺中发育并经自身抗原刺激后在胸腺内被阳性选择，在小鼠和正常人的外周血及脾脏组织中，CD4⁺CD25⁺Treg约占CD4⁺T细胞的5％～10％；此类细胞的功能特征是：本身缺乏增殖能力，但具有天然的免疫抑制作用，可抑制CD4⁺或CD8⁺T细胞活化、增殖，并能抑制初始T细胞和记忆性T细胞功能。该溶液只要满足提供间充干细胞和调剂性T细胞存活以及可用于人体注射的介质即可，具体可以是注射液、培养基或缓冲液等等，至于溶液的用量可根据实际需求进行调配，其为本领域技术人员的常规做法，在此不做赘述。

进一步地，该间充质干细胞的浓度为(4～6)×10⁵个/ml。

当浓度为(4～6)×10⁵个/ml时，可以为受损伤的胰岛β细胞提供充足的干细胞，进而对胰岛β细胞进行修复和再生，以及更好的免疫调节效果，其改善1型糖尿病的效果更加显著。

进一步地，该调节性T细胞的浓度为(0.5～1.5)×10⁶个/ml。

当浓度为(0.5～1.5)×10⁶个/ml时，该调节性T细胞抑制T细胞介导的自身免疫性反应的效果明显，更好地减轻或消除自身免疫系统攻击胰岛β细胞。

进一步地，该溶液为注射液，该注射液包括组分如下：

质量分数为1～8％的葡萄糖；质量分数为0.1～2％的NaCl；质量分数为0.1～2％的人血清白蛋白；质量分数为90～98％的水。

采用注射液作为间充质干细胞和调节性T细胞的载体，为细胞提供了良好的介质，保证了细胞的活性，同时便于采用注射的方式移植该混合细胞制剂，简化移植工序。

本发明还提供一种上述混合细胞制剂的制备方法，该制备方法包括步骤如下：

S1、获取上述间充质干细胞；

S2、获取上述调节性T细胞；

S3、提供上述溶液，并将间充质干细胞、调节性T细胞加入溶液中。

本发明混合细胞制剂的制备方法简单、高效，只需将间充质干细胞、调节性T细胞和适量的溶液共混即可完成调配。需要说明的是，该间充质干细胞可以通过离体组织培养得到，也可以通过购置商品化的间充质干细胞得到；该调节性T细胞可以通过外周血分离得到，也可以通过购置商品化的调节性T细胞得到。

进一步地，该步骤S2具体包括：

S20、获取外周血单个核细胞；

S21、从该外周血单个核细胞中分选出CD4⁺T细胞；

S22、从该CD4⁺T细胞中分选出CD4⁺CD25⁺Treg细胞。

该步骤S2从CD4⁺T细胞中分离出调节性T细胞，分离纯度高，分离容易。

本发明还提供一种上述混合细胞制剂在治疗自身免疫性疾病的药物上的应用。

自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，例如慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、1型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎、多发性硬化症、重症肌无力等。将本发明的混合细胞制剂应用于治疗自身免疫性疾病的药物时，间充质干细胞具有免疫无能性，可以修复和再生受损伤组织，且上调Treg而起免疫调节作用；Treg具有免疫抑制性，可以有效抑制T细胞对自身组织的免疫攻击。因此，该混合细胞制剂的药物可以有效地治疗自身免疫性疾病。

现通过实施例对本发明混合细胞制剂及其制备方法与应用做进一步解释，以详细说明其技术方案及带来的技术效果。

实施例1

一、获取人脐带间充质干细胞

(1)、原代脐带间充质干细胞的分离

人脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，并在4℃下保存；

在超净台内取出人脐带，用D-PBS缓冲液冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除洗净后的上述动、静脉血管，接着将人脐带剪成1mm³大小的组织块后，放入200ml蓝盖试剂瓶中；

向蓝盖试剂瓶中加入质量体积比为0.1％的Ⅱ型胶原酶30ml，将蓝盖试剂瓶置于恒温振荡仪内持续消化6h后，采用100目筛网过滤收集原代脐带间充质干细胞；

(2)、原代脐带间充质干细胞的培养

向步骤(1)收集的原代脐带间充质干细胞中加入D-Hank’s液冲洗3次，然后用含体积分数为10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，调整细胞密度为(4.8～10)×10³/cm²，并接种于25cm²培养瓶内，于37℃、体积分数为5％的CO₂孵箱内培养，24h后换培养液；

(3)、原代脐带间充质干细胞的传代

当步骤(2)中原代间充质干细胞贴壁生长至80％～90％汇合后，吸出培养液，用D-Hank’s液冲洗2次，加入胰蛋白酶/EDTA混合液进行消化；

接着，先将培养瓶置于37℃、5％CO₂饱和湿度的细胞培养箱中孵育2分钟，之后取出并轻轻叩击培养瓶侧壁以加速消化；

显微镜下观察分离出的细胞，待细胞浮起并由梭形变为圆形后，立即加入胎牛血清中止消化，收集所得细胞悬液，在室温下以1000转/min离心8分钟；弃上清，用DMEM.LG/F12培养基重悬细胞，按1：2比例传代，并收集传代后的人脐带间充质干细胞备用。

二、获取调节性T细胞(Treg细胞)

(1)、外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分离

a、用抗凝管(内含抗凝液0.2ml)收集血液，摇匀，加入与血液等体积(1：1)的Hank’s液或PBS缓冲液稀释血液(或者，每1mL全血中加入0.1ml肝素溶液稀释血液，其中，肝素溶液：生理盐水将肝素配成125～250U/ml的无菌液，4℃保存)；

b、提供淋巴细胞分层液，并取2ml淋巴细胞分层液加入15ml的离心管中；

c、将离心管倾斜45°，用吸管吸取步骤a所得的稀释血液，在淋巴细胞分层液面上1cm处，沿离心管壁徐徐加入稀释血液，使稀释血液重叠于淋巴细胞分层液上，保持两者界面清晰(稀释血液与淋巴细胞分层液体积比例约为2：1)(或者，将吸管嘴插入离心管底部，将稀释血液缓慢加入淋巴细胞分层液的底部)；

d、在18～20℃下，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后，离心管中的内容物分为四层，上层为血浆(内含血小板)，中间层为淋巴细胞分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞；

e、用毛细血管(或1ml注射器)轻轻插入单个核细胞层，沿试管壁周缘吸取单个核细胞，移入另一离心管中；

f、加入5ml(不含Ca²⁺、Mg²⁺)的Hank's液或RPMI1640培养基洗涤2次，混匀，依次以1500r/min、1000r/min，各离心10min后吸弃上清；

g、末次离心且弃上清后，用2ml含10％(体积分数)小牛血清的RPMI1640培养基，重悬细胞形成PBMC悬液；

h、细胞计数：取20ul PBMC悬液加20ul 0.4％台盼兰染液，3～5分钟后取样进行计数；

(2)、Treg细胞的免疫磁珠法分选

首先，将上述制备的PBMC悬液采用间接法标记出带有磁性的非CD4⁺T细胞，同时标记PE^-CD25荧光抗体，将标记好的PBMC悬液放入磁珠自动分选仪的磁场，阴性选择出CD4⁺T细胞；

其次，将分选出的CD4⁺T细胞(其中的CD25⁺T细胞标记有PE)加入抗PE的磁珠，使CD4⁺T细胞中的CD25⁺T细胞都标记有磁珠，然后，经过磁珠自动分选仪的磁场阳性选择CD4⁺CD25⁺Treg细胞，阴性选择CD4⁺CD25^－T细胞；具体按CD4⁺CD25⁺Treg细胞的分选试剂盒说明书进行操作；

最后，收集上述流式分选的CD4⁺CD25⁺Treg细胞，并按1：1结合CD3/CD28磁珠微珠种在多孔板里，用添加10％热灭活血清的高糖培养基培养，第2天扩大培养体积并添加IL-2，第5、7、9、12天传代到新的细胞培养瓶并继续添加IL-2；密度达到(2～3)×10⁵个细胞/ml时即可收集，且收集的每袋CD4⁺CD25⁺Treg细胞的浓度为5×10⁵个/ml。

三、混合细胞制剂的制备

提供人脐带间充质干细胞1×10⁷个、CD4⁺CD25⁺Treg细胞2×10⁷个、以及溶液20ml，其中，该溶液包括质量分数为5％的葡萄糖、质量分数为0.45％的NaCl、质量分数为0.5％的人血清白蛋白以及质量分数为94.05％的水；将人脐带间充质干细胞、CD4⁺CD25⁺Treg细胞和溶液混合，制备成新鲜的非冷藏保存的细胞悬浮液。在该混合细胞制剂中，人脐带间充质干细胞浓度为5×10⁵个/ml，CD4⁺CD25⁺Treg细胞的浓度为1×10⁶个/ml。

实施例2

一、获取人脐带间充质干细胞

请参见实施例1，与实施例1相同。

二、获取调节性T细胞

请参见实施例1，与实施例1相同。

三、混合细胞制剂的制备

提供人脐带间充质干细胞8×10⁶个、CD4⁺CD25⁺Treg细胞1×10⁷个、以及溶液20ml，其中，该溶液包括质量分数为5％的葡萄糖、质量分数为0.45％的NaCl、质量分数为0.5％的人血清白蛋白以及质量分数为94.05％的水；将人脐带间充质干细胞、CD4⁺CD25⁺Treg细胞和溶液混合，制备成新鲜的非冷藏保存的细胞悬浮液。在该混合细胞制剂中，人脐带间充质干细胞浓度为4×10⁵个/ml，CD4⁺CD25⁺Treg细胞的浓度为0.5×10⁶个/ml。

实施例3

一、获取人脐带间充质干细胞

请参见实施例1，与实施例1相同。

二、获取调节性T细胞

请参见实施例1，与实施例1相同。

三、混合细胞制剂的制备

提供人脐带间充质干细胞1.2×10⁷个、CD4⁺CD25⁺Treg细胞3×10⁷个、以及溶液20ml，其中，该溶液包括质量分数为5％的葡萄糖、质量分数为0.45％的NaCl、质量分数为0.5％的人血清白蛋白以及质量分数为94.05％的水；将人脐带间充质干细胞、CD4⁺CD25⁺Treg细胞和溶液混合，制备成新鲜的非冷藏保存的细胞悬浮液。在该混合细胞制剂中，人脐带间充质干细胞浓度为6×10⁵个/ml，CD4⁺CD25⁺Treg细胞的浓度为1.5×10⁶个/ml。

验证方法及验证结果

一、脐带间充质干细胞的形态观察

在实施例1的原代脐带间充质干细胞的培养过程中，采用显微镜进行观察，培养3天后的细胞形态如图1A所示，培养7天后的细胞形态如图1B所示。新分离的脐带间充质干细胞呈纺锤形，原代培养6h后有大量细胞贴壁，贴壁细胞呈梭形、多角形。根据图1A和图1B可知，培养3天后细胞呈长梭形，细胞平行或漩涡状排列；培养7天后细胞可达80％融合；且继续观察可得，传代后的细胞形态无明显改变，排列更加整齐。

因此，本实施例1中原代培养的细胞具备间充质干细胞的细胞形态，进而实施例1采用人脐带组织培养的细胞为人脐带间充质干细胞。

二、CD4⁺CD25⁺Treg细胞的流式鉴定

1、在每个流式上样管中加入100ul实施例1制备的CD4⁺CD25⁺Treg细胞悬液，CD4⁺CD25⁺Treg细胞数约为1x10⁶个；

2、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原(如CD4、CD8、CD25等)；

3、标记表面抗原后的细胞用预冷的Flow Cytometry Staining Buffer或预冷的PBS洗涤；

4、旋涡、震荡、重悬洗涤后的细胞，然后加入1ml的固定/破膜(Fixation/Permeabilization Buffer)工作液，并再次旋涡混匀；

5、避光，4℃孵育30～60分钟；

6、加入2ml Permeabilization Buffer工作液离心洗涤，孵育后的细胞并弃去上清液；

7、重复步骤5-6洗涤细胞；

8、(可选)加入稀释好的2％(2ul)的正常大鼠血清(用Permeabilization Buffer工作液进行稀释)100ul，在避光4℃孵育15分钟；

9、提供封闭液，并直接加入稀释好的荧光标记FOXP3抗体(用PermeabilizationBuffer工作液进行稀释)20ul，避光4℃孵育至少30分钟；

10、加入2ml Permeabilization Buffer工作液离心洗涤细胞并弃去上清液；

11、重复步骤10洗涤细胞；

12、用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析，检测分析结果如图2所示。

根据图2可知，经流式细胞检测，经过分选的CD4⁺CD25⁺Treg细胞阳性率达到94.3％，因此，实施例1中外周血单个核细胞经免疫磁珠法分选后得到的细胞为CD4⁺CD25⁺Treg细胞。

动物实验

SD大鼠由四川大学实验动物中心提供。一次性腹腔注射60mg/kg链脲唑菌素(Streptozotocin，STZ)3d后，连续3d尾静脉检测血糖，血糖均>16.7mmol/l，则糖尿病成模。糖尿病成模后，大鼠随机分为糖尿病对照组(n＝12)和混合细胞制剂移植组(n＝12)；另设正常对照组(n＝6)。糖尿病大鼠表现为消瘦，精神萎靡，反应迟钝，动作迟缓，毛发黄干欠光泽，饮水量、尿量、血糖高，体重减轻。

上述混合细胞制剂移植组共有三组，分别采用实施例1、实施例2和实施例3制备的混合细胞制剂进行治疗，具体治疗过程如下：

1、麻醉：以l％戊巴比妥钠，40mg/Kg，取腹腔内注射给药；

2、切口：仰卧位固定后，术区皮肤以碘酒常规消毒后，选取正中小切口，暴露门静脉，以8-0血管缝合线先预作一荷包，再在荷包处穿刺，以22G套管针穿刺门静脉主干；

3、输注：以混合细胞制剂作移植，门静脉内移植输注容积为1.5ml；退出套管针，结扎穿刺点，检查无活动性出血点后，逐层缝合关闭切口；

4、复温：术毕以红外线灯照射复温，约30分钟；

5、检测：第1、2、3、6周分别于每周一注射一次混合细胞制剂，注射后测量大鼠体重，断尾约1cm取血测血糖(罗氏罗康全活力型血糖仪)，检测完后放单只代谢笼。

请参照如下表1和表2，表1为混合细胞制剂移植组、糖尿病对照组和正常对照组的大鼠血糖变化，表2为混合细胞制剂移植组、糖尿病对照组和正常对照组的大鼠体重变化。

表1

表2

由表1和表2可知，本发明实施例1至3中，随着治疗时间的增加，大鼠血糖不断降低，大鼠体重不断增加；且相较于糖尿病对照组，大鼠血糖显著降低，大鼠体重显著增加，因此，实施例1至3制备的混合细胞制剂可以有效地治疗1型糖尿病；进一步地，本发明实施例1中，治疗6周后，大鼠血糖降低至6.4+0.3mmol/L，接近正常对照组的大鼠血糖，大鼠增加至406.8±22.5g，接近正常对照组的大鼠体重，因此，本发明实施例1制备的混合细胞制剂可以达到接近治愈1型糖尿病的效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种混合细胞制剂，其特征在于，所述混合细胞制剂包括：

间充质干细胞、调节性T细胞、以及溶液；

在所述混合细胞制剂中，所述间充质干细胞的浓度为(1～10)×10⁵个/ml，所述调节性T细胞的浓度为(0.1～3)×10⁶个/ml。

2.如权利要求1所述的混合细胞制剂，其特征在于，所述间充质干细胞的浓度为(4～6)×10⁵个/ml。

3.如权利要求1或2所述的混合细胞制剂，其特征在于，所述调节性T细胞的浓度为(0.5～1.5)×10⁶个/ml。

4.如权利要求3所述的混合细胞制剂，其特征在于，所述调节性T细胞为CD4⁺CD25⁺调节性T细胞。

5.如权利要求1所述的混合细胞制剂，其特征在于，所述溶液为注射液，所述注射液包括组分如下：

质量分数为1～8％的葡萄糖；

质量分数为0.1～2％的NaCl；

质量分数为0.1～2％的人血清白蛋白；

质量分数为90～98％的水。

6.如权利要求5所述的混合细胞制剂，其特征在于，所述注射液包括组分如下：

质量分数为5％的葡萄糖；

质量分数为0.45％的NaCl；

质量分数为0.5％的人血清白蛋白；

质量分数为94.05％的水。

7.一种权利要求1至6任意一项所述的混合细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

获取所述间充质干细胞；

获取所述调节性T细胞；

提供所述溶液，并将所述间充质干细胞、所述调节性T细胞加入所述溶液中。

8.如权利要求7所述的混合细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述获取调节性T细胞的步骤，包括：

获取外周血单个核细胞；

从所述外周血单个核细胞中分选出CD4⁺T细胞；

从所述CD4⁺T细胞中分选出CD4⁺CD25⁺调节性T细胞。

9.一种权利要求1至6任意一项所述的混合细胞制剂在治疗自身免疫性疾病的药物上的应用。

10.如权利要求9所述的混合细胞制剂在治疗自身免疫性疾病的药物上的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为1型糖尿病。