CN110392733A

CN110392733A - 体细胞制造系统

Info

Publication number: CN110392733A
Application number: CN201780075265.XA
Authority: CN
Inventors: 田边刚士; 须藤健太; 平出亮二
Original assignee: Limited By Share Ltd Of World
Current assignee: Limited By Share Ltd Of World; I Peace Inc
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2017-02-27
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2037-02-27
Also published as: EP3530727A4; CA3053891C; JPWO2018154788A1; WO2018154788A1; CA3053891A1; US20190382706A1; EP3530727A1; US20230002717A1; JP6480093B2; CN110392733B

Abstract

一种体细胞制造系统，其具备：导入前细胞送液通路(20)，使包含导入前细胞的溶液通过；因子导入装置(30)，与导入前细胞送液通路(20)连接，于导入前细胞中导入体细胞诱导因子而制作诱导因子导入细胞；及细胞制作装置(40)，对诱导因子导入细胞进行培养而制作体细胞。

Description

体细胞制造系统

技术领域

本发明涉及一种体细胞诱导技术，特别涉及一种体细胞制造系统。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES细胞)是由人类或小鼠的早期胚胎而确立的干细胞。ES细胞具备可分化为生物体内所存在的所有细胞的多能性。现在，人类ES细胞可以在帕金森病、幼年型糖尿病、及白血病等众多疾病的细胞移植疗法中利用。然而，在ES细胞的移植中也存在障碍。特别是ES细胞的移植可能引起与不成功的器官移植后所产生的排斥反应同样的免疫排斥反应。而且，对于利用破坏人类胚胎而确立的ES细胞，来自伦理性观点的批判或反对意见较多。

在此种背景的状况下，京都大学的山中伸弥教授通过将4种基因：Oct3/4、Klf4、c-Myc、及Sox2导入至体细胞而成功地确立诱导多能干细胞(iPS细胞)。因此，山中教授获得了2012年的诺贝尔生理学或医学奖(例如参照专利文献1)。iPS细胞是并无排斥反应或伦理问题的理想的多能性细胞。因此，期待将iPS细胞应用于细胞移植疗法中。而且，近年来，还确立了通过将特定的基因导入到细胞中，可由特定的细胞制作其他细胞的技术。期待此种技术可与iPS细胞同样地应用于移植医疗或药物筛选中。

目前，有许多使iPS细胞变化为体细胞的方法。然而，为了将iPS细胞利用于移植治疗中，重要的是确立iPS细胞的效率良好的分化诱导方法。具体而言，需要确立在将iPS细胞分化诱导为体细胞时使用的技术，使分化诱导的效率及精度提高，从而使所制作的体细胞的功能性等能够耐受移植治疗。

由iPS细胞或胚胎干细胞(ES细胞)分化诱导为体细胞的方法以如下方式进行：通过将决定细胞性质的激素或生长因子、以及低分子化合物组合，且使它们的量比或浓度随时间改变，由此模仿产生过程。然而，难以在试管中完全模仿产生过程且效率差。而且，与小鼠的体细胞分化诱导相比而言，人类需要非常长的分化诱导期，例如为了制作成熟的神经而需要3个月以上。另外，存在分化诱导的效率根据ES/iPS细胞株而有较大的不同，所诱导的体细胞的性质不均一等问题。

具体而言，确认使用利用激素或化学物质的方法由人类ES/iPS细胞分化诱导的细胞在初期阶段为胎儿阶段的体细胞。人类成熟的体细胞的分化诱导极难，需要经过数个月的长期培养。然而，在以完成发育的个体为对象的药物研发或移植医疗中，制作与个体的成熟度一致的体细胞是非常重要的。

而且，在神经细胞中存在各种亚型细胞，但在利用激素或化学物质的方法中，无法由ES/iPS细胞均一地分化诱导这些亚型神经。因此，无法进行特定的神经亚型特异性药物研发筛选。因此，药物研发筛选的效率低。而且，在移植医疗中，也无法仅浓缩移植疾病的某种特定细胞。

对此，提出了如下的方法：使用病毒将规定特定体细胞性质的基因直接导入到ES/iPS细胞中，以制作目标体细胞。与利用激素或化学物质的方法相比而言，使用病毒的方法可以在例如2星期这样的非常短的时间内特异性地制作成熟的神经细胞。而且，如果通过导入特定基因来制作神经细胞，则可以仅均一地获得例如兴奋性神经。因此，可以进行特定的神经亚型特异性药物研发筛选，在移植医疗中，也可以仅浓缩移植疾病的某种特定细胞。

而且，在使iPS细胞分化为体细胞的情况下，存在如下的担忧：在分化的体细胞中残存未分化的iPS细胞。因此，还确立了并不经由iPS细胞，而是由体细胞分化为其他体细胞的方法。具体而言，开发了使纤维母细胞分化为心肌细胞或神经细胞的方法。这些方法被称为直接重新编程，由于并不经由iPS细胞等多能性干细胞，因此并没有在移植时残存未分化的多能性细胞的风险。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4183742号公报

发明内容

发明所欲解决的课题

体细胞可通过于细胞中导入基因等诱导因子而确立，从而进行扩增培养，视需要冻结保存。然而，例如在制作临床用体细胞(例如GLP、GMP级)、产业化中存在如下所述的问题点。

1)成本

临床用体细胞需要在保持得非常干净的洁净室中制作、保存。然而，维持所要求的水准的清洁度的成本非常高。因此，需要消耗成本来制作临床用体细胞，成为产业化的较大的障碍。

2)品质

从体细胞的确立到保存的一系列作业复杂，需要手工操作之处较多。而且，体细胞的制作有时依赖个人的技能。因此，可能由于制作者或实验批次而产生临床用体细胞的品质的偏差。

3)时间

为了防止在洁净室中与特定供体以外的其他人的细胞交叉污染，花费规定时间在洁净室内制作仅仅源自一个人的临床用体细胞。而且，临床用体细胞的确立、品质评价需要较长时间。然而，在洁净室内一次仅仅为一个人制作临床用体细胞，因此需要非常长的时间来制作众多需求者的临床用体细胞。

4)人材

如上所述，现状是临床用体细胞的制作需要手工作业之处较多。然而，具备能够制作临床用体细胞所需的技术的技术人员少。

对此，本发明的目的之一在于提供可制造体细胞的体细胞制造系统。另外，体细胞并不限定于临床用体细胞。

解决问题的手段

根据本发明的形态，提供一种体细胞制造系统，其具备：导入前细胞送液通路，使包含导入前细胞的溶液通过；因子导入装置，与导入前细胞送液通路连接，于导入前细胞中导入体细胞诱导因子而制作诱导因子导入细胞；及细胞制作装置，对诱导因子导入细胞进行培养而制作体细胞。

上述体细胞制造系统可以进一步具备壳体，容纳导入前细胞送液通路、因子导入装置、及细胞制作装置。

在上述体细胞制造系统中，导入体细胞诱导因子而制作的体细胞可以不包括多能性干细胞。导入体细胞诱导因子而制作的体细胞可以包括分化细胞。导入体细胞诱导因子而制作的体细胞可以包括成体性干细胞。成体性干细胞是指成体干细胞或组织干细胞。导入体细胞诱导因子而制作的体细胞可以包括神经系细胞。导入体细胞诱导因子而制作的体细胞可以包括纤维母细胞。导入体细胞诱导因子而制作的体细胞可以包括心肌细胞、角质形成细胞(keratinocyte)、或视网膜细胞。

在上述体细胞制造系统中，导入前细胞可以包括多能性干细胞。多能性干细胞可以包括ES细胞及iPS细胞。导入前细胞可以包括成体性干细胞。导入前细胞可以包括分化的体细胞。导入前细胞可以包括血液细胞。导入前细胞可以包括纤维母细胞。

在上述体细胞制造系统中，细胞制作装置可以具备：体细胞培养装置，对在因子导入装置中制作的诱导因子导入细胞进行培养；及扩增培养装置，对在体细胞培养装置中确立的体细胞进行扩增培养，体细胞培养装置具备对诱导因子导入细胞补给培养基的第1培养基补给装置，扩增培养装置具备对体细胞补给培养基的第2培养基补给装置。

在上述体细胞制造系统中，体细胞培养装置可以进一步具备药剂补给装置，其供给包含杀死未导入耐药因子的细胞的药剂的溶液。

在上述体细胞制造系统中，因子导入装置可以具备：因子导入部，与导入前细胞送液通路连接；因子保存部，保存体细胞诱导因子；因子送液通路，用以使体细胞诱导因子自因子保存部向导入前细胞送液通路或因子导入部流动；泵，用以使因子送液通路内的液体流动。

在上述体细胞制造系统中，体细胞诱导因子可以是DNA、RNA、或蛋白质。

在上述体细胞制造系统的因子导入部中，可以利用RNA脂质转染而于导入前细胞中导入体细胞诱导因子。

在上述体细胞制造系统中，体细胞诱导因子可以植入至载体中。载体可以是仙台病毒载体。

上述体细胞制造系统可以进一步具备封装装置，对在细胞制作装置中制作的体细胞进行封装，可以壳体容纳封装装置。

上述体细胞制造系统可以进一步具备溶液置换器，所述溶液置换器具备筒状构件、及配置于筒状构件内部的液体透过过滤器，在筒状构件上设有：体细胞导入孔，用以将在细胞制作装置中制作的包含体细胞的溶液导入至液体透过过滤器上；置换溶液导入孔，用以将置换溶液导入至液体透过过滤器上；体细胞流出孔，用以使包含体细胞的置换溶液流出至液体透过过滤器上；废液流出孔，使透过液体透过过滤器的溶液流出。

上述体细胞制造系统可以进一步具备与溶液置换器的废液流出孔连接的废液送液通路，在废弃包含体细胞的溶液的溶液时，容许废液送液通路中的溶液流动，在使体细胞分散于置换溶液中时，并不容许废液送液通路中的溶液流动。

在上述体细胞制造系统中，置换溶液可以是冻结保存液。

上述体细胞制造系统可以进一步具备自血液中分离导入前细胞的分离装置，包含在分离装置中分离的导入前细胞的溶液可以通过导入前细胞送液通路。

发明的效果

根据本发明，可提供能够制造体细胞的体细胞制造系统。

附图说明

图1是本发明的实施方式的体细胞制造系统的示意图。

图2是本发明的实施方式的体细胞制造系统的示意图。

图3是本发明的实施方式的体细胞制造系统的导入细胞送液通路的一例的示意性剖视图。

图4是本发明的实施方式的体细胞制造系统的导入细胞送液通路的一例的示意性剖视图。

图5是本发明的实施方式的体细胞制造系统中所使用的培养袋的示意图。

图6是本发明的实施方式的溶液置换器的示意图。

图7是本发明的实施方式的体细胞制造系统的示意图。

图8是实施例1的细胞的照片。

图9是实施例1的细胞的照片。

图10是表示实施例1的转染效率与生存率的比率的图表。

图11是实施例2的细胞的照片。

图12是表示实施例2的TUJ-1阳性细胞的比率的图表。

图13是表示实施例2的TUJ-1阳性细胞的比率的图表。

图14是实施例3的转染的方法的示意图。

图15是实施例3的细胞的照片。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式加以说明。在以下附图的记载中，以同一或类似符号表示同一或类似部分。但附图是示意性附图。因此，具体的尺寸等应对照以下的说明而判断。而且，在附图相互之间，当然包含相互的尺寸关系或比例不同的部分。

另外，本公开包含在美国临时提交申请(62/356,199)，并且已经签发了外国申请许可的发明。

本发明的实施方式的体细胞制造系统如图1所示那样具备：导入前细胞送液通路20，使包含导入前细胞的溶液通过；因子导入装置30，与导入前细胞送液通路20连接，于导入前细胞中导入体细胞诱导因子而制作诱导因子导入细胞；细胞制作装置40，对诱导因子导入细胞进行培养而制作体细胞；及壳体200，容纳导入前细胞送液通路20、因子导入装置30、及细胞制作装置40。

导入前细胞例如为多能性干细胞。多能性干细胞可使用ES细胞及iPS细胞。或者，导入前细胞例如为分化细胞。分化细胞可使用成体性干细胞、血液细胞、及纤维母细胞分化而成的体细胞等。成体性干细胞也称为成体干细胞或组织干细胞。

导入体细胞诱导因子而制作的体细胞不包括多能性干细胞。导入体细胞诱导因子而制作的体细胞是分化细胞。分化细胞可列举：成体性干细胞、神经系细胞、纤维母细胞、心肌细胞、肝细胞、视网膜细胞、角膜细胞、血液细胞、角质形成细胞(keratinocyte)及软骨细胞等。神经系细胞可以是神经细胞、神经干细胞及神经元前体细胞的任意一种。神经细胞可以是抑制性神经细胞、兴奋性神经细胞及多巴胺产生神经细胞的任意一种。或者，神经系细胞可以是运动神经细胞、少突胶质前体细胞、及少突胶质细胞等。神经系细胞可以是MAP2阳性，也可以是β-IIITubulin阳性。

体细胞制造系统还可以进一步具备：空气清洁装置，清洁壳体200内的气体；温度管理装置，管理壳体200内的气体温度；及二氧化碳浓度管理装置，管理壳体200内的气体的二氧化碳(CO₂)浓度。空气清洁装置还可以包含清洁度传感器，用于监视壳体200内的气体的清洁度。空气清洁装置例如使用HEPA(High Efficiency Particulate Air)过滤器及ULPA(Ultra Low Penetration Air)过滤器等对壳体200内的空气进行净化。空气清洁装置例如使壳体200内的空气的清洁度成为ISO基准14644-1中的ISO1至ISO6的等级。温度管理装置还可以包含温度传感器，用于监视壳体200内的气体温度。CO₂浓度管理装置还以包含CO₂浓度传感器，用于监视壳体200内的气体的CO₂浓度。

在壳体200上例如设有门等，在门关闭的状态下，内部完全封闭，可以将内部空气的清洁度、温度、及CO₂浓度保持为一定。壳体200优选为透明，从而可自外部观察内部装置的状态。而且，壳体200还可以是一体化地形成有橡胶手套等手套的手套箱(glove box)。

在壳体200上还可以设有与导入前细胞送液通路20连通的导入口。在该开口上也可以设置门等。或者，该导入口还可以用可装卸的密封材料进行密封。导入前细胞自该导入口进入至导入前细胞送液通路20。或者，在壳体200内，还可以配置有保存导入前细胞的导入前细胞保存容器，其与导入前细胞送液通路20连通。

再或者，体细胞制造系统还可以如图2所示那样进一步具备配置在壳体200内的，自血液中分离导入前细胞的分离装置10。在这种情况下，导入前细胞送液通路20与分离装置10连接。包含在分离装置10中分离的导入前细胞的溶液通过导入前细胞送液通路20。

壳体200内的分离装置10接收例如装有人类血液的小瓶。分离装置10包含抗凝聚剂罐，保存例如乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素、及生物学制剂基准血液保存液A液(ACD-A液、泰尔茂株式会社)等抗凝聚剂。分离装置10使用泵等，将抗凝聚剂自抗凝聚剂罐添加至人类血液中。

而且，分离装置10具备分离用试剂罐，保存例如Ficoll-Paque PREMIUM(注册商标、日本通用电气医疗株式会社)等单核细胞分离用试剂。分离装置10使用泵等，将单核细胞分离用试剂自分离用试剂罐每次5mL地分注于例如2根15mL的管中。另外，还可以使用树脂袋替代管。

另外，分离装置10具备缓冲液罐，保存磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate bufferedsaline，PBS)等缓冲液。分离装置10使用泵等，将5mL缓冲液自缓冲液罐加入至例如5mL人类血液中而进行稀释。而且，进一步地，分离装置10使用泵等，将所稀释的人类血液每次5mL地加入至管中的单核细胞分离用试剂上。

分离装置10进一步具备可设定温度的离心机。离心机设定为例如18℃。分离装置10使用移动装置等，将装有单核细胞分离用试剂及人类血液等的管放到离心机的固定器上。离心机以例如400×g对管中的溶液进行30分钟的离心。还可以使树脂袋替代管进行离心。

在离心后，分离装置10用泵等回收管中的溶液的单核细胞的白色浑浊的中间层。分离装置10使用泵等，将所回收的单核细胞的悬浮液送出至导入前细胞送液通路20。或者，进一步地，分离装置10对2mL的所回收的单核细胞溶液加入例如12mL的PBS，将管放到离心机的固定器上。离心机以例如200×g对管中的溶液进行10分钟的离心。

在离心后，分离装置10使用泵等，将管中的溶液的上清液吸引除去，将X-VIVO 10(注册商标、Lonza Japan株式会社)等单核细胞培养基3mL加入至管中的单核细胞溶液中而使其悬浮。血液细胞还可以使用Matrigel(Corning)、CELLstart(注册商标、赛默飞世尔(ThermoFisher))、或Laminin511(nippi)等基底膜基质，进行无饲养层培养。分离装置10使用泵等，将作为导入前细胞的单核细胞的悬浮液送出至导入前细胞送液通路20。另外，分离装置10还可以使用透析膜，自血液中分离单核细胞。而且，在使用预先准备的导入前细胞的情况下，也可以不使用分离装置10。

分离装置10还可以利用离心分离以外的方法而分离适合诱导的细胞。例如，如果需分离的细胞是T细胞，则可利用淘选(panning)而分离CD3、CD4、CD8的任意之一为阳性的细胞。如果需分离的细胞是血管内皮前体细胞，则可利用淘选而分离CD34为阳性的细胞。如果需分离的细胞是B细胞，则可利用淘选而分离CD10、CD19、CD20的任意之一为阳性的细胞。而且，并不限定于淘选，还可以利用磁性细胞分离方法(MACS)或流式细胞仪等进行分离。

还可以在导入前细胞送液通路20的内壁涂层导入前细胞不会附着的poly-HEMA(poly 2-hydroxyethyl methacrylate，聚甲基丙烯酸-2-羟基乙酯)，使其成为细胞非附着性。或者，导入前细胞送液通路20的材料还可以使用导入前细胞难以附着的材料。而且，导入前细胞送液通路20的材料使用例如导热率良好、CO₂透过性的材料，由此使导入前细胞送液通路20内的条件变得与壳体200内所管理的温度及CO₂浓度同等。进一步自防止污染的观点考虑，还可以在导入前细胞送液通路20设有逆流防止阀。

壳体200内的诱导因子送液机构21具备例如保存诱导因子导入试剂溶液等的诱导因子导入试剂罐。诱导因子送液机构21使用微泵等，以使导入前细胞悬浮于诱导因子导入试剂溶液中的方式，将诱导因子导入试剂溶液送出至壳体200内的导入前细胞送液通路20或因子导入装置30。

基因导入试剂溶液等诱导因子导入试剂溶液例如包含体细胞诱导因子RNA、RNA转染溶液、及RNA转染用培养基的套装。RNA转染包括RNA脂质转染。体细胞诱导因子RNA的套装例如包含ASCL1的mRNA、Myt1L的mRNA、neurogenin2(Ngn2)的mRNA各100ng。Ngn2(neurogenin2)是神经系细胞分化所需的开关蛋白质。

体细胞诱导因子RNA还可以包含与耐药性基因对应的mRNA。所谓药剂，例如是嘌呤霉素、新霉素、杀稻瘟菌素、G418、潮霉素、及博莱霉素等抗生素。导入了与耐药性基因对应的mRNA的细胞显示耐药性。体细胞诱导因子RNA包含例如Ngn2-T2A-Puro mRNA(Trilink)。用Ngn2-T2A-Puro mRNA(Trilink)转染的细胞产生neurogenin2(Ngn2)，且显示嘌呤霉素抗性。

mRNA还可以用Anti-Reverse Cap Analog(ARCA)封端，进行多聚腺苷酸化，用5-甲基胞苷及假尿苷进行置换。5-甲基胞苷及假尿苷使抗体对mRNA的识别能力降低。

RNA转染溶液包含例如小分子干扰RNA(siRNA)或脂质转染试剂。RNA的脂质转染试剂可使用siRNA的脂质转染试剂及mRNA的脂质转染试剂。更具体而言，RNA的脂质转染试剂可使用Lipofectamine(注册商标)RNAiMAX(赛默飞世尔科技，Thermo FisherScientific)、Lipofectamine(注册商标)MessengerMAX(赛默飞世尔科技)、Lipofectamin(注册商标)2000、Lipofectamin(注册商标)3000、NeonTransfection System(赛默飞世尔科技)、Stemfect RNA转染试剂(Stemfect)、NextFect(注册商标)RNA转染试剂(BiooSientific)、Amaxa(注册商品)Human T cellNucleofector(注册商品)试剂盒(Lonza公司、VAPA-1002)、Amaxa(注册商品)Human CD34cellNucleofector(注册商品)试剂盒(Lonza公司、VAPA-1003)、及ReproRNA(注册商标)转染试剂(STEMCELL Technologies)、mRNA-in(注册商标)(赛默飞世尔科技公司)等。

例如，因子导入装置30在将体细胞诱导因子导入至细胞之后，还可以使细胞悬浮于培养液中。因子导入装置30可以实施多次体细胞诱导因子的转染。例如，可以在将体细胞诱导因子导入至细胞之后的24小时等规定的时间后，更换培养基，再次对细胞进行体细胞诱导因子的转染。另外，将体细胞诱导因子转染至细胞中、及规定时间的细胞培养的工序可以反复进行多次，例如2次至4次。

在进行体细胞诱导因子RNA的脂质转染时，例如在利用12微量滴定板的情况下，每1孔的细胞数为1×10⁴个至1×10⁸个、5×10⁴个至1×10⁶个、或1×10⁵个至5×10⁵个。另外，1孔的底面积为4cm²。体细胞诱导因子RNA的脂质转染时的体细胞诱导因子RNA的量是每1次为200ng至5000ng、400ng至2000ng、或500ng至1000ng。体细胞诱导因子RNA的脂质转染时的脂质转染试剂量是0.1μL至100μL、1μL至50μL、或1.5μL至10μL。

体细胞诱导因子RNA的脂质转染时所使用的培养基例如为Opti-MEM(注册商标、Gibco)等低血清培养基。在体细胞诱导因子RNA的脂质转染时及其前后所使用的培养基可包含B18R蛋白质。B18R蛋白质缓和细胞的先天性抗病毒反应。B18R蛋白质可用于抑制伴随着将RNA插入至细胞中时的免疫反应的细胞死亡。但是，在短时间内使细胞分化为体细胞的情况下，培养基可以不含B18R蛋白质，或者可以以0.01％至1％的较低浓度包含B18R蛋白质。

在体细胞诱导因子RNA的脂质转染后10天以内、9天以内、8天以内、或7天以内，动物细胞分化为体细胞。在所制作的体细胞为神经系细胞的情况下，是否分化为神经系细胞可通过β-IIITubulin、MAP2、或PsA-NCAM是否为阳性来确认。β-IIITubulin、MAP2、PsA-NCAM、及vGlu是标识神经细胞的标记物，是神经细胞突起中的微管的结构蛋白质。

或者，基因导入试剂溶液等诱导因子导入试剂溶液可包含例如仙台病毒载体溶液。源自仙台病毒的RNA并未整合到宿主DNA中，但可以在宿主中导入目标基因。仙台病毒载体套装例如以MOI(multiplicity of infection，感染复数)成为0.01至1000、0.1至1、或1至10的方式包含ASCL1的mRNA、Myt1L的mRNA、Ngn2的mRNA。诱导因子仙台病毒载体可包含与耐药性基因对应的mRNA。仙台病毒载体中所含的诱导因子RNA例如包含Ngn2-T2A-PuromRNA(Trilink)。另外，向细胞中导入仙台病毒可以是1次。

因子导入装置30使用泵等，将包含导入了诱导因子的细胞(诱导因子导入细胞)的溶液送出至导入细胞送液通路31。

也可以在壳体200内的导入细胞送液通路31的内壁涂层诱导因子导入细胞不会附着的poly-HEMA而使其成为非附着性。或者，导入细胞送液通路31的材料还可以使用诱导因子导入细胞难以附着的材料。而且，例如导入细胞送液通路31的材料使用导热率良好、CO₂透过性的材料，由此使导入细胞送液通路31内的条件变得与壳体200内所管理的温度及CO₂浓度同等。进一步自防止污染的观点考虑，还可以在导入细胞送液通路31设有逆流防止阀。而且，还可以如图3所示那样，在导入细胞送液通路31内部设置使内径断续地变化的一个或多个皱襞。再或者，还可以如图4所示那样，使导入细胞送液通路31的内径断续地变化。

如图1及图2所示，与导入细胞送液通路31连接的细胞制作装置40具备：体细胞培养装置50，对在因子导入装置30中制作的诱导因子导入细胞进行培养；第1分割机构60，将由体细胞培养装置50中确立的体细胞构成的细胞团(细胞集落)分割为多个细胞团；扩增培养装置70，对体细胞进行扩增培养；第2分割机构80，将由扩增培养装置70中扩增培养的体细胞构成的细胞团分割为多个细胞团；体细胞搬送机构90，将体细胞依序送至封装装置100。然而，在例如并未形成细胞团的情况下、或无需对细胞团进行分割的情况下，也可以省略第1分割机构60及第2分割机构80。

体细胞培养装置50可以在内部具备微量滴定板、袋、及管等培养容器。而且，体细胞培养装置50还可以具备移液机。体细胞培养装置50自导入细胞送液通路31接收包含体细胞诱导因子导入细胞的溶液，用移液机将溶液分配至培养容器。

在使细胞分化为神经系细胞的情况下，体细胞培养装置50在将诱导因子导入细胞放入至培养容器中后，在例如第1天至第7天，将作为神经分化培养基的N3培养基(DMEM/F12、25μg/mL胰岛素、50μg/mL人转铁蛋白、30nmol/L亚硒酸钠、20nmol/L孕酮、100nmol/L腐胺)加入至培养容器中。还可以在培养基中以10μmol/L的浓度添加ROCK抑制剂(Selleck)数日。

体细胞培养装置50在将诱导因子导入细胞分配至培养容器中后，例如在第9天进行培养基更换，之后进行培养基更换直至观察到神经系细胞等目标细胞。另外，所谓培养基更换还包含置换一部分培养基或者补给培养基。

在体细胞培养装置50中，还可以选择使未导入耐药因子的细胞死亡的药剂。在体细胞诱导因子RNA包含与耐药性基因对应的mRNA的情况下，通过将包含药剂的溶液供给至培养容器，可选择性地使显示耐药性的诱导因子导入细胞继续生存。例如，在体细胞诱导因子RNA包含与嘌呤霉素耐性基因对应的mRNA的情况下，可通过将脂质转染后的细胞暴露于嘌呤霉素中，使导入了体细胞诱导因子RNA的细胞以外的细胞死亡，从而筛选导入了体细胞诱导因子RNA的细胞。药剂还可以包含于培养基中。药剂的浓度例如为2mg/L。

在体细胞培养装置50中，还可以在规定的时间内使用培养基来培养诱导因子导入细胞，该培养基包含使未导入耐药因子的细胞死亡的药剂，其后使用不含药剂的培养基来培养诱导因子导入细胞。

如果形成目标体细胞，则体细胞培养装置50利用移液机回收体细胞。进一步地，体细胞培养装置50将装有所回收的体细胞的容器放到培养箱中，在37℃、CO₂为5％下使体细胞与胰蛋白酶替代重组酶反应10分钟。另外，在使细胞团物理性破碎的情况下，也可以并不使用胰蛋白酶替代重组酶。例如，体细胞培养装置50通过利用移液机的移液而使体细胞的细胞团破碎。再或者，体细胞培养装置50还可以使细胞团通过设有过滤器的导管，或与如图3或图4所示的导入细胞送液通路31同样地使内径断续地变化的导管，从而使细胞团破碎。

在例如诱导神经的情况下，其后，体细胞培养装置50在装有破碎的体细胞的细胞团的溶液中加入如上所述的神经分化培养基。

另外，体细胞培养装置50中的培养还可以并不在微量滴定板中进行，而是在袋中进行。袋可以是CO₂透过性。而且，培养可以是附着培养，还可以是悬浮培养。在悬浮培养的情况下，还可以进行搅拌培养。进一步地，体细胞培养装置50中的培养还可以是悬滴培养。

体细胞培养装置50还可以具备第1培养基补给装置，将包含培养液的培养基补给至微量滴定板、袋及管等培养容器。第1培养基补给装置还可以回收培养容器内的培养液，使用过滤器或透析膜对培养液进行过滤，再利用所净化的培养液。而且，此时还可以在再利用的培养液中添加生长因子等。而且，体细胞培养装置50还可以具备药剂补给装置，将包含使未导入耐药因子的细胞死亡的药剂的溶液供给至培养容器。进一步地，体细胞培养装置50还可以进一步具备管理培养基的温度的温度管理装置、管理培养基的pH的pH管理装置、及管理培养基附近的湿度的湿度管理装置等。

在体细胞培养装置50中，例如还可以将细胞放入至如图5所示的透析膜等培养液透过性袋301中，将培养液透过性袋301放入至培养液非透过性袋302中，在袋301、302中放入培养液。袋302可以是CO₂透过性，也可以不是CO₂透过性。体细胞培养装置50还可以预先准备多个装有新鲜培养液的袋302，每隔规定的时间将放着装有细胞的袋301的外侧的袋302，更换为装有新鲜培养液的袋302。

在图1及图2所示的体细胞培养装置50上连接着第1体细胞送液通路51。体细胞培养装置50使用泵等将包含体细胞的溶液送出至第1体细胞送液通路51。而且，第1体细胞送液通路51与分支流路连接，该分支流路具有仅仅使小于规定大小的被诱导的细胞通过的内径，将规定大小以上的未被诱导的细胞除去。

还可以在第1体细胞送液通路51的内壁涂层体细胞不会附着的poly-HEMA而使其成为细胞非附着性。或者，第1体细胞送液通路51的材料还可以使用体细胞难以附着的材料。而且，第1体细胞送液通路51的材料使用导热率良好、CO₂透过性的材料，由此使第1体细胞送液通路51内的条件变得与壳体200内所管理的温度及CO₂浓度同等。进一步自防止污染的观点考虑，还可以在第1体细胞送液通路51设有逆流防止阀。

第1体细胞送液通路51与第1分割机构60连接。第1分割机构60例如具备网格。溶液中所含的细胞团由于水压而通过网格时，被分割为网格的各孔大小的多个细胞团。例如，如果网格的各孔大小均一，则分割后的多个细胞团的大小也变得基本均一。或者，第1分割机构60还可以具备管嘴。例如，通过将略圆锥状的管嘴的内部微细加工为阶梯状，在溶液中所含的细胞团通过管嘴时，被分割为多个细胞团。

在第1分割机构60上连接着扩增培养装置70。包含在第1分割机构60中分割的体细胞的细胞团的溶液被送至扩增培养装置70。另外，在并未形成细胞团的情况下，还可以省略第1分割机构60。在这种情况下，第1体细胞送液通路51与扩增培养装置70连接。

扩增培养装置70例如可以在内部容纳微量滴定板。而且，扩增培养装置70具备移液机。扩增培养装置70自第1分割机构60或第1体细胞送液通路51接收包含体细胞的溶液，利用移液机将溶液分配至孔中。扩增培养装置70在将体细胞分配至孔中后，在37℃、CO₂为5％的情况下对体细胞进行例如8天左右的培养。而且，扩增培养装置70适宜地进行培养基更换。

在形成细胞团的情况下，扩增培养装置70对细胞团添加TrypLE Select(注册商标、生命技术公司)等胰蛋白酶替代重组酶。进一步地，扩增培养装置70使装有细胞团的容器的温度升高，在37℃、CO₂为5％的情况下使细胞团与胰蛋白酶替代重组酶反应1分钟。另外，在使细胞团物理性破碎的情况下，也可以并不使用胰蛋白酶替代重组酶。例如，扩增培养装置70利用移液机的移液而使细胞团破碎。再或者，扩增培养装置70还可以使细胞团通过设有过滤器的导管，或与图3或图4所示的导入细胞送液通路31同样地使内径断续地变化的导管，从而使细胞团破碎。其后，图1及图2所示的扩增培养装置70在装有细胞团的溶液中加入维持培养用的培养基等培养基。进一步地，扩增培养装置70在附着培养的情况下，用自动细胞刮刀等而自容器剥下细胞团，将包含细胞团的溶液经由扩增培养送液通路71送至第1分割机构60。

另外，扩增培养装置70中的培养还可以并不在微量滴定板中进行，而是在袋或管中进行。袋或管可以是CO₂透过性。而且，培养可以是附着培养，也可以是悬浮培养，还可以是悬滴培养。在悬浮培养的情况下，还可以进行搅拌培养。

扩增培养装置70还可以具备第2培养基补给装置，将培养液补给至微量滴定板、袋及管等培养容器。第2培养基补给装置还可以回收培养容器内的培养液，使用过滤器或透析膜而对培养液进行过滤，对所净化的培养液进行再利用。而且，此时还可以在再利用的培养液中添加生长因子等。而且，扩增培养装置70还可以进一步具备管理培养基的温度的温度管理装置、及管理培养基附近的湿度的湿度管理装置等。

在扩增培养装置70中，例如还可以将细胞放入至如图5中所示的透析膜等培养液透过性袋301中，将培养液透过性袋301放入至培养液非透过性袋302中，在袋301、302中放入培养液。袋302还可以是CO₂透过性。扩增培养装置70还可以预先准备多个装有新鲜培养液的袋302，每隔规定的时间将放入装有细胞的袋301的外侧的袋302，更换为装有新鲜培养液的袋302。

图1及图2中所示的体细胞制造系统可以进一步具备对体细胞培养装置50及扩增培养装置70中的培养进行摄影的扩增培养摄影装置。此处，如果在体细胞培养装置50及扩增培养装置70中所使用的培养基中使用无色的培养基，则变得可抑制在使用有色培养基的情况下所可能产生的漫反射或自体荧光。但是，为了确认培养基的pH，还可以包含酚红等pH指示剂。而且，在被诱导的细胞与未被诱导的细胞中，细胞的形状及大小等不同，因此体细胞制造系统还可以进一步具备诱导状态监视装置，通过对体细胞培养装置50及扩增培养装置70中的细胞进行摄影，算出被诱导的细胞的比例。或者，诱导状态监视装置还可以利用抗体免疫染色法或RNA抽出法而确定被诱导的细胞的比率。进一步地，体细胞制造系统还可以具备未诱导细胞除去装置，利用磁性细胞分离方法或流式细胞仪等而将未被诱导的细胞除去。

将图1及图2中所示的第1分割机构60所分割的细胞团再次于扩增培养装置70内进行培养。反复进行第1分割机构60中的细胞团的分割与在扩增培养装置70内的体细胞的培养直至获得所需的细胞量。另外，如上所述，在未形成细胞团的情况下，还可以省略第1分割机构60。

在扩增培养装置70上连接着第2体细胞送液通路72。扩增培养装置70使用泵等将包含扩增培养的体细胞的溶液，送出至第2体细胞送液通路72。其中，在悬浮培养的情况下无需剥离。第2体细胞送液通路72可与分支流路连接，该分支流路具备仅仅使小于规定大小的被诱导的细胞通过的内径，将规定大小以上的未被诱导的细胞除去。

还可以在第2体细胞送液通路72的内壁涂层体细胞不会附着的poly-HEMA而使其成为细胞非附着性。或者，第2体细胞送液通路72的材料可以使用体细胞难以附着的材料。而且，第2体细胞送液通路72的材料使用导热率良好、CO₂透过性的材料，由此使第2体细胞送液通路72内的条件变得与壳体200内所管理的温度及CO₂浓度同等。进一步自防止污染的观点考虑，还可以在第2体细胞送液通路72设有逆流防止阀。

第2体细胞送液通路72与第2分割机构80连接。第2分割机构80例如具备网格。溶液中所含的细胞团由于水压而通过网格时，被分割为网格的各孔大小的多个细胞团。例如，如果网格的各孔大小均一，则分割后的多个细胞团的大小也变得基本均一。或者，第2分割机构80还可以具备管嘴。例如，通过将略圆锥状的管嘴的内部微细加工为阶梯状，在溶液中所含的细胞团通过管嘴时，被分割为多个细胞团。

在图2所示的第2分割机构80上连接着体细胞搬送机构90，将体细胞依序送至封装装置100。另外，在未形成细胞团的情况下，也可以省略第2分割机构80。在这种情况下，第2体细胞送液通路72与体细胞搬送机构90连接。

在壳体200内的体细胞搬送机构90与封装装置100之间连接着封装前细胞流路91。体细胞搬送机构90使用泵等，将体细胞经由封装前细胞流路91而依序送至封装装置100。

还可以在封装前细胞流路91上涂层体细胞不会附着的poly-HEMA。或者，封装前细胞流路91的材料还可以使用体细胞难以附着的材料。而且，封装前细胞流路91的材料使用导热率良好、CO₂透过性的材料，由此使封装前细胞流路91内的条件变得与壳体200内所管理的温度及CO₂浓度同等。自防止污染的观点考虑，还可以在封装前细胞流路91设有逆流防止阀。

在封装前细胞流路91上连接着冻结保存液送液机构110。冻结保存液送液机构110将细胞冻结保存液送入至封装前细胞流路91。因此，在封装前细胞流路91内，体细胞悬浮于细胞冻结保存液中。

封装装置100依序对经由封装前细胞流路91而送达的体细胞进行冻结。例如，封装装置100在接收体细胞时将体细胞放入至低温保存管等冻结保存容器中，将包含体细胞的溶液瞬间冻结至例如-80℃以下。如果使用单位体积的表面积小的冻结保存容器，则存在冻结花费时间的倾向，因此优选使用单位体积的表面积大的冻结保存容器。通过使用单位体积的表面积大的冻结保存容器，变得可提高解冻后的细胞的生存率。冻结保存容器的形状可列举毛细管状及球状，但并不限定于这些形状。而且，根据所需的解冻后的细胞的生存率，也可以不必瞬间冻结。

冻结例如使用玻璃化(Vitrification)法。在这种情况下，细胞冻结保存液可使用DAP213(COSMO BIO株式会社)及Freezing Medium(ReproCELL株式会社)。冻结可以利用玻璃化法以外的通常方法而进行。在这种情况下，细胞冻结保存液可使用CryoDefend-StemCell(R&D Systems公司)、或STEM-CELLBANKER(注册商标、日本全药工业株式会社)等。冻结可以利用液氮而进行，也可以利用帕尔贴元件而进行。如果使用帕尔贴元件，则变得可控制温度变化、抑制温度不均。封装装置100将冻结保存容器搬出至壳体200外。在冻结细胞为临床用途的情况下，冻结保存容器优选为全封闭系统。但是，封装装置100也可以并不对体细胞进行冻结而将其封装于保存容器内。

或者，可以于封装装置100中，使用图6所示的溶液置换器101，将包含体细胞的溶液的溶剂自培养基置换为冻结保存液。在溶液置换器101的内部设有过滤器102，所述过滤器102在底面上设有体细胞并不透过的细孔。而且，在溶液置换器101上设有：体细胞导入孔，在内部的过滤器102上连接对包含体细胞的培养基进行送液的第1送液流路103；置换溶液导入孔，在内部的过滤器102上连接对不含体细胞的冻结液进行送液的第2送液流路104；体细胞流出孔，连接着将包含体细胞的冻结液自内部的过滤器102上排出的第1排出流路105。进一步在溶液置换器101上设有废液流出孔，连接着将透过过滤器102的溶液排出的第2排出流路106。第1送液流路103、第2送液流路104、第1排出流路105、及第2排出流路106的各个可使用管等。

首先，如图6的(a)及图6的(b)所示那样，在使第2排出流路106中的溶液流动停止的状态下，将包含体细胞的培养基自第1送液流路103放入至溶液置换器101内部。其次，如图6的(c)所示那样，设为容许第2排出流路106中的溶液流动的状态，将培养基自溶液置换器101排出。此时，如图6的(d)所示那样，体细胞残留于过滤器102上。进一步如图6的(e)及图6的(f)所示那样，在使第2排出流路106中的溶液流动停止的状态下，将冻结保存液自第2送液流路104放入至溶液置换器101内部，使体细胞分散于冻结保存液中。其后，如图6的(g)所示那样，将包含体细胞的冻结保存液自第1排出流路105排出。将包含体细胞的冻结保存液经由第1排出流路105送至冻结保存容器等中。

图1及图2所示的体细胞制造系统还可以进一步具备对壳体200内进行杀菌的杀菌装置。杀菌装置可以是干热杀菌装置。在这种情况下，分离装置10、导入前细胞送液通路20、诱导因子送液机构21、因子导入装置30、细胞制作装置40、及封装装置100等使用电的装置的配线优选为具有耐热性的配线。或者，杀菌装置还可以将臭氧气体、过氧化氢气体、或福尔马林气体等杀菌气体放出至壳体200内，对壳体200内进行杀菌。

体细胞制造系统还可以通过有线或无线将分离装置10、导入前细胞送液通路20、诱导因子送液机构21、因子导入装置30、细胞制作装置40、及封装装置100等的运作记录、以及摄影装置所摄影的图像发送至外部服务器。进一步地，外部服务器还可以基于标准作业程序(SOP)而控制体细胞制造系统的分离装置10、诱导因子送液机构21、因子导入装置30、细胞制作装置40、及封装装置100等，基于SOP监视各装置是否运转，自动生成各装置的运转记录。

根据以上说明的体细胞制造系统，可自动地诱导体细胞。

另外，实施方式的体细胞制造系统并不限定于图1及图2所示的构造。例如，在图7所示的实施方式的体细胞制造系统中，经由血液送液通路202将血液自血液保存部201向单核细胞分离部203送液。血液保存部201及单核细胞分离部203例如可使用管。血液送液通路202例如是树脂管或硅管等。后述的其他送液通路也同样。还可以在血液保存部201上附上条形码等标识符，管理血液的信息。在送液中使用泵204。泵204可使用容积式泵。作为容积式泵的例子，可列举：包含活塞泵、柱塞泵、及隔膜泵的往复泵，或包含齿轮泵、叶片泵、及螺杆泵的旋转泵。作为隔膜泵的例子，可列举管式泵及压电(piezo)泵。作为管式泵的例子，可列举蠕动泵(注册商标、ATTO株式会社)、以及RP-Q1及RP-TX(高砂电气工业株式会社)。作为压电泵的例子，可列举SDMP304、SDP306、SDM320、及APP-20KG(高砂电气工业株式会社)。而且，还可以使用组合有各种泵的微流体芯片模块(高砂电气工业株式会社)。如果使用蠕动泵(注册商标)、管式泵、及隔膜泵等密闭型泵，则可使泵并不直接接触血液送液通路202内部的血液地进行送液。在后述的其他泵中也同样。或者，泵204、以及后述的泵207、泵216、泵222、泵225、泵234、泵242、及泵252还可以使用注射泵。即使是密闭型泵以外的泵，也可以通过加热杀菌处理等而再利用。

将红血球凝聚剂自分离剂保存部205，经由送液通路206及泵207而送至单核细胞分离部203。分离剂保存部205例如可使用管。还可以对分离剂保存部205附上条形码等标识符来管理分离剂的信息。红血球凝聚剂例如可使用HetaSep(注册商标、STEMCELLTechnologies)或红血球凝聚剂(尼普洛(NIPRO)公司)等。在单核细胞分离部203内，由于红血球凝聚剂而使红血球沉降，从而分离单核细胞。将包含单核细胞分离部203内的单核细胞的上清液经由单核细胞送液通路208及泵209而送至单核细胞纯化过滤器210。在单核细胞纯化过滤器210中，将单核细胞以外的成分除去，获得包含作为导入前细胞的单核细胞的溶液。单核细胞纯化过滤器210可使用Purecell(注册商标、PALL)、Cellsorba E(旭化成株式会社)、Sepacell PL(旭化成株式会社)、Adacolumn(注册商标、JIMRO)、及分离袋(尼普洛株式会社)等。

在图7中，单核细胞分离部203、分离剂保存部205、单核细胞纯化过滤器210、及泵204、207、209等构成分离装置。然而，在如上所述那样使用预先准备的导入前细胞的情况下，也可以省略分离装置。

将包含导入前细胞的溶液经由导入前细胞送液通路211及泵212送至因子导入部213。因子导入部213例如可使用管。将体细胞诱导因子自包含体细胞诱导因子的因子保存部214，经由因子送液通路215及泵216而送至因子导入部213。因子保存部214例如可使用管。还可以在因子保存部214上附上条形码等标识符来管理体细胞诱导因子的信息。因子保存部214及泵216等构成诱导因子送液机构。在作为因子导入装置的因子导入部213中，利用例如RNA脂质转染法而将体细胞诱导因子导入至细胞中，制作诱导因子导入细胞。然而，诱导因子的转染方法并不限定于RNA脂质转染法。例如还可以使用包含体细胞诱导因子的仙台病毒载体。或者，体细胞诱导因子可以是蛋白质。而且，诱导因子的转染可以长达数日并进行多次。

将诱导因子导入细胞经由导入细胞送液通路217及泵218送至作为细胞制作装置的一部分的体细胞培养器219。导入细胞送液通路217例如为温度透过性且为CO₂透过性。在将体细胞诱导因子导入至细胞后的最初数日，自包含药剂含有细胞培养基的细胞培养基保存部220，经由培养基送液通路221及泵222而对体细胞培养器219补给药剂含有细胞培养基。药剂含有细胞培养基包含将未导入耐药因子的细胞杀死的药剂。培养基送液通路221例如为温度透过性且为CO₂透过性。还可以在药剂含有细胞培养基保存部220上附上条形码等标识符来管理药剂含有细胞培养基的信息。药剂含有细胞培养基保存部220、培养基送液通路221、及泵222构成培养基补给装置。

其后，将体细胞培养基自包含适于目标体细胞的体细胞培养基的体细胞培养基保存部223，经由培养基送液通路224及泵225补给至体细胞培养器219。还可以在体细胞培养基保存部223附上条形码等标识符来管理体细胞培养基的信息。培养基送液通路224例如为温度透过性且为CO₂透过性。体细胞培养基保存部223、培养基送液通路224、及泵225构成培养基补给装置。

药剂含有细胞培养基保存部220及体细胞培养基保存部223可以在例如冷藏保存部259中以4℃等的低温进行冷藏保存。自药剂含有细胞培养基保存部220及体细胞培养基保存部223送来的培养基可以利用例如冷藏保存部259外部的加热器升温至37℃后送至培养器中。或者，低温保存的培养基还可以以进入送液通路的时候升温至37℃的方式设定送液通路周围的温度。将体细胞培养器219内变旧的培养基经由废液送液通路226及泵227而送至废液保管部228。还可以在废液保管部228附上条形码等标识符来管理废液的信息。

将在体细胞培养器219中培养的体细胞，经由导入细胞送液通路229、泵230、及任意的细胞团分割器231送至作为细胞制作装置的一部分的第1扩增培养器232。使其通过细胞团分割器231，由此将细胞团分割为更小的细胞团。在并未形成细胞团的情况下，可以省略细胞团分割器231。将体细胞培养基自包含体细胞培养基的体细胞培养基保存部223，经由培养基送液通路233及泵234补给至第1扩增培养器232。导入细胞送液通路229及培养基送液通路233例如为温度透过性且为CO₂透过性。体细胞培养基保存部223、培养基送液通路233、及泵234构成培养基补给装置。

将第1扩增培养器232内变旧的培养基经由废液送液通路235及泵236送至废液保管部228。

将在第1扩增培养器232中培养的体细胞，经由导入细胞送液通路237、泵238、及任意的细胞团分割器239送至作为细胞制作装置的一部分的第2扩增培养器240。使其通过细胞团分割器239，由此将细胞团分割为更小的细胞团。在并未形成细胞团的情况下，可以省略细胞团分割器239。将体细胞培养基自包含体细胞培养基的体细胞培养基保存部223，经由培养基送液通路241及泵242补给至第2扩增培养器240。导入细胞送液通路237及培养基送液通路241例如为温度透过性且为CO₂透过性。体细胞培养基保存部223、培养基送液通路241、及泵242构成培养基补给装置。

将第2扩增培养器240内变旧的培养基经由废液送液通路243及泵244送至废液保管部228。

将在第2扩增培养器240中培养的体细胞，经由导入细胞送液通路245及泵246送至溶液置换器247。溶液置换器247还可以具备例如图6所示的构造。在图7所示的溶液置换器247内，由过滤器保持体细胞，将培养基经由废液送液通路248及泵249送至废液保管部228。

在通过停止泵249的驱动停止而停止废液送液通路248内的溶液流动之后，或者用阀等将废液送液通路248关闭后，冻结保存液自包含冻结保存液的冻结保存液保存部250，经由送液通路251及泵252而进入至溶液置换器247。由此在冻结保存液中分散体细胞。

将分散有体细胞的冻结保存液，经由作为封装装置的一部分的送液通路253及泵254送至冻结保存容器255内。将冻结保存容器255放入至低温保管库256中。将例如-80℃的液氮，自液氮保管库257经由送液通路258送至低温保管库256。由此使冻结保存容器255内的体细胞冻结。然而，体细胞的冻结也可以不依赖液氮。例如，低温保管库256也可以是压缩式冷冻库、吸収式冷冻库、或帕尔贴式冷冻库等的冷冻库。而且，在无需冻结的情况下，也可以并不对体细胞进行冻结。

在上述的送液通路中还可以适宜设置逆流防止阀。将上述的送液通路、单核细胞分离部203、单核细胞纯化过滤器210、因子导入部213、体细胞培养器219、第1扩增培养器232、第2扩增培养器240、及溶液置换器247等容纳至由树脂等形成的例如盒状的盒体260中。盒体260例如由可杀菌处理的耐热性材料形成。盒体260内设为例如37℃、CO₂浓度为5％这样的适合细胞培养的环境。培养基流过的送液通路例如由CO₂透过性材料形成。然而，盒体260并不限定为盒状。例如可以是柔性袋。而且，上述的送液通路、单核细胞分离部203、单核细胞纯化过滤器210、因子导入部213、体细胞培养器219、第1扩增培养器232、第2扩增培养器240、及溶液置换器247等也可以分割容纳于多个盒体中。

盒体260配置于壳体200内。泵、血液保存部201、分离剂保存部205、因子保存部214、药剂含有细胞培养基保存部220、体细胞培养基保存部223、废液保管部228、冻结保存容器255、低温保管库256、及液氮保管库257配置于壳体200的内部且盒体260的外部。

盒体260与壳体200具备例如相互嵌合的嵌合部。因此，盒体260配置于壳体200内的规定位置。而且，在壳体200内，泵、血液保存部201、分离剂保存部205、因子保存部214、药剂含有细胞培养基保存部220、体细胞培养基保存部223、废液保管部228、冻结保存容器255、低温保管库256、及液氮保管库257配置于规定位置。如果盒体260配置于壳体200内的规定位置，则盒体260内的送液通路与泵、血液保存部201、分离剂保存部205、因子保存部214、药剂含有细胞培养基保存部220、体细胞培养基保存部223、废液保管部228、冻结保存容器255、低温保管库256、及液氮保管库257相连接。

例如，盒体260及其内含物为一次性的，在体细胞的冻结完成后，可以废弃而更换为新的。或者，在再利用盒体260及其内含物的情况下，还可以在盒体260上附上条形码等标识符来管理使用次数等。

利用以上所说明的实施方式的体细胞制造系统，可以并不经由人地从导入前细胞自动地制造体细胞。

(其他实施方式)

如上所述地利用实施方式而记载本发明，但不应理解为进行该揭示的一部分的记述及附图限定本发明。根据该揭示，本领域技术人员应明白有各种替代实施方式、实施方式及运用技术。例如，因子导入装置30也可以通过使用逆转录病毒、慢病毒、及仙台病毒等病毒载体或质粒的转染，或者蛋白质转染来诱导细胞。或者，因子导入装置30还可以通过电穿孔来诱导细胞。而且，导入前细胞送液通路20、导入细胞送液通路31、第1体细胞送液通路51、扩增培养送液通路71、第2体细胞送液通路72、及封装前细胞流路91也可以利用微流体技术而设于基板上。如上所述，应理解本发明包含此处并未记载的各种实施方式等。

(实施例1)

准备涂布了可溶化基底膜制剂(Matrigel、Corning)的12孔皿，在各孔中放入以10μmol/L的浓度含有ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho结合激酶)抑制剂(Selleck)的无饲养层培养基(mTeSR(注册商标)1、STEMCELL Technologies)。ROCK抑制剂抑制细胞死亡。

将iPS细胞分散于组织/培养细胞的剥离/分离/分散溶液(Accutase、InnovativeCell Technologies)中，将其接种于12孔皿中。以每1孔为4×10⁵个的密度接种转染的细胞。另外，1孔的底面积为4cm²。以每1孔为2×10⁵个的密度接种并未转染的对照细胞。其后，将细胞在无饲养层培养基中进行24小时的培养。此时，温度为37℃，CO₂浓度为5％，氧浓度为25％以下。

将1.25mL的Xeno-Free培养基(Pluriton、STEMGENT)、0.5μL的PluritonSupplement(STEMGENT)、2μL的浓度为100ng/μL的B18R重组蛋白质含有液(eBioscience)加以混合而准备转染培养基。在转染前，将各孔的无饲养层培养基更换为转染培养基，在37℃下对细胞进行2小时的培养。

准备绿色荧光蛋白质(GFP)mRNA(TriLink)。mRNA用Anti-Reverse Cap Analog(ARCA)进行封端，并进行多聚腺苷酸化，用5-甲基胞苷及假尿苷进行置换。

进一步分别准备孔的数量的1.5mL的微量离心分离管A和1.5mL的微量离心分离管B。

在管A中放入62.5μL的低血清培养基(Opti-MEM(注册商标)、Gibco)，于其中加入1.875μL的mRNA导入用试剂(Lipofectamine MessengerMax(注册商标)、Invitrogen)，充分混合而作为第1反应液。其后，在室温下10分钟轻轻敲打管A以使第1反应液混合。

在管B中放入62.5μL的低血清培养基(Opti-MEM(注册商标)、Gibco)，加入500ng的GFP mRNA(Trilink)，充分混合而作为第2反应液。

将第2反应液加入到管A内的第1反应液中制成混合反应液，其后，在室温下5分钟轻轻敲打管A以形成脂质体。其次，将混合反应液加入到各个孔中，在37℃下静置一晚。由此在各个孔中加入500ng的GFP mRNA。

第二天，使用荧光显微镜观察细胞，结果如图8、图9所示那样确认发生转染的细胞显色。进一步如图10所示那样确认细胞的生存率。由此可知，可使用脂质转染试剂与RNA而在iPS细胞中导入mRNA，从而表达蛋白质。

(实施例2)

准备涂布了可溶化基底膜制剂(Matrigel、Corning)的12孔皿，在各孔中放入以10μmol/L的浓度包含ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho结合激酶)抑制剂(Selleck)的无饲养层培养基(mTeSR(注册商标)1、STEMCELL Technologies)。ROCK抑制剂抑制细胞死亡。

将iPS细胞分散于组织/培养细胞的剥离/分离/分散溶液(Accutase、InnovativeCell Technologies)中，将其接种于12孔皿中。以每1孔为4×10⁵个的密度接种转染的细胞。以每1孔为2×10⁵个的密度接种并未转染的对照细胞。其后，将细胞在无饲养层培养基中进行24小时的培养。

准备Ngn2-T2A-Puro mRNA(Trilink)与绿色荧光蛋白质(GFP)mRNA(Trilink)。mRNA用Anti-Reverse Cap Analog(ARCA)进行封端，并进行多聚腺苷酸化，用5-甲基胞苷及假尿苷进行置换。而且，mRNA用二氧化硅膜进行纯化，与mRNA导入用试剂(LipofectamineMessengerMax(注册商标)、Invitrogen)一起，通过以pH为6的1mmol/L的柠檬酸钠为溶剂的溶液而进行。进一步分别准备孔的数量的1.5mL的微量离心分离管A和1.5mL的微量离心分离管B。

在管B中放入62.5μL的低血清培养基(Opti-MEM(注册商标)、Gibco)，于其中加入500ng的Ngn2-T2A-Puro mRNA(Trilink)和1500ng的GFP mRNA(Trilink)，充分混合而作为第2反应液。

将第2反应液加入到管A内的第1反应液中制成混合反应液，其后，在室温下5分钟轻轻敲打管A以形成脂质体。其次，将混合反应液加入到各个孔中，在37℃下静置一晚。由此在各个孔中加入500ng的Ngn2mRNA和100ng的GFPmRNA。

在导入mRNA后，在第一天进行观察，结果如图11所示那样确认细胞的显色。

在其后的2天，每隔1天用以10μmol/L的浓度包含ROCK抑制剂(Selleck)且以1mg/L的浓度包含抗生素(嘌呤霉素)的神经分化培养基(N2/DMEM/F12/NEAA、Invitrogen)将培养基完全更换，选择转染了mRNA的细胞。在第3天，用以200ng/mL的浓度包含B18R重组蛋白质含有液(eBioscience)的神经分化培养基(N2/DMEM/F12/NEAA、Invitrogen)对培养基进行置换。其后，用相同的培养基以每次一半的量进行培养基更换直至第7天。

在第7天，自孔中除去培养基并以1mL的PBS清洗。其后，放入4％PFA而在4℃下进行15分钟的反应，并进行固定。其后，用PBS进行2次清洗后，用5％CCS、0.1％Triton的PBS培养基对一次抗体进行稀释，添加500μL。一次抗体利用兔抗人类Tuj1抗体(BioLegend 845501)及小鼠抗大鼠及人类Ngn2抗体(R and D Systems)，将用缓冲剂将兔抗人类Tuj1抗体(BioLegend845501)稀释至1/1000、或用缓冲剂将小鼠抗大鼠及人类Ngn2抗体(R and DSystems)稀释至1/75，且进一步用缓冲剂将DAPI稀释至1/10000而成者添加到各孔中，在室温下使其反应1小时。Tuj1抗体是针对β-IIITubulin的抗体。

在室温下反应1小时后，在各孔中添加1mL的PBS，在孔中充分融合后，将PBS废弃。再次添加PBS，废弃，在渗透缓冲液中分别添加500μL的包含1/1000稀释的驴抗小鼠IgG(H+L)二次抗体Alexa Fluor(注册商标)555复合体(Thermofisher)，且包含1/1000稀释的驴抗兔IgG(H+L)二次抗体AlexaFluor(注册商标)647复合体(Thermofisher)的包含二次抗体的渗透缓冲液，在室温下进行30分钟反应。

在室温下进行30分钟反应后，将细胞用PBS清洗2次，用荧光显微镜进行观察，对发出荧光的细胞进行计数。

图12是使用脂质转染导入Ngn2-T2A-Puro mRNA，其后添加嘌呤霉素进行2天培养后，进一步未添加嘌呤霉素地进行5天培养，用Tuji1进行染色而用荧光显微镜观察的照片。图13表示通过上述步骤，利用各转染试剂转染Ngn2-T2A-Puro mRNA，在第7天的TUJ-1阳性细胞的比率。根据这些结果可知，诱导了神经细胞。

(实施例3)

准备涂布了可溶化基底膜制剂(Matrigel、Corning)的12孔皿，在各孔中放入以10μmol/L的浓度包含ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho结合激酶)抑制剂(Selleck)的无饲养层培养基(mTeSR(注册商标)1、STEMCELL Technologies)。

将iPS细胞分散于组织/培养细胞的剥离/分离/分散溶液(Accutase、InnovativeCell Technologies)中，将其接种于12孔皿中。以每1孔为4×10⁵个的密度接种转染的细胞。以每1孔为1×10⁵个的密度接种并未转染的对照细胞。其后，将细胞在无饲养层培养基中进行24小时的培养。此时，温度为37℃，CO₂浓度为5％，氧浓度为25％以下。

将1.25mL的Xeno-Free培养基(Pluriton、STEMGENT)、0.5μL的PluritonSupplement(STEMGENT)、2μL的浓度为100ng/μL的B18R重组蛋白质含有液(eBioscience)加以混合而准备含有B18R的转染培养基。而且，将1.25mL的Xeno-Free培养基(Pluriton、STEMGENT)、0.5μL的Pluriton Supplement(STEMGENT)加以混合而准备未含有B18R的转染培养基。

在转染前，将各孔的无饲养层培养基更换为含有B18R的转染培养基或未含有B18R的转染培养基，在37℃下对细胞进行2小时的培养。

准备Ngn2-T2A-Puro mRNA(Trilink)与GFPmRNA(Trilink)。mRNA用Anti-ReverseCap Analog(ARCA)进行封端，并进行多聚腺苷酸化，用5-甲基胞苷及假尿苷进行置换。

在管B中放入62.5μL的低血清培养基(Opti-MEM(注册商标)、Gibco)，于其中加入500ng的Ngn2-T2A-Puro mRNA(Trilink)和100ng的GFP mRNA(Trilink)，充分混合而作为第2反应液。

将第2反应液加入到管A内的第1反应液中制成混合反应液，其后，在室温下5分钟轻轻敲打管A以形成脂质体。其次，将混合反应液加入到各个孔中，在37℃下静置一晚。由此在各个孔中加入500ng的Ngn2mRNA和100ng的GFP mRNA。而且，如图14所示，准备进行了1次、2次、3次转染者。

在第7天，自孔中除去培养基并以1mL的PBS清洗。其后，放入4％PFA而在4℃下进行15分钟的反应，并进行固定。其后，用PBS进行2次清洗后，将用在PBS中包含5％CCS及0.1％TritonX的渗透缓冲液进行了稀释的一次抗体每次50μL地添加于各孔中，在室温下进行1小时反应。一次抗体是用渗透缓冲液将小鼠抗人类Tuj1抗体(BioLegend 845501)稀释为1：1000，将小鼠抗人类Ngn2抗体(R and D Systems，MAB3314-SP)稀释为1：150而成者，进一步以成为1：10,000的方式添加DAPI。

1小时后，在各孔中添加1mL的PBS，在孔中充分融合后，将PBS废弃。再次添加PBS，废弃，在渗透缓冲液中添加500μL的含有二次抗体的渗透缓冲液，在室温下进行30分钟反应，该含有二次抗体的渗透缓冲液以1：1000含有驴抗小鼠IgG(H+L)二次抗体Alexa Fluor(注册商标)555复合体(Thermofisher、A-21428)，且以1：1000含有驴抗兔IgG(H+L)二次抗体AlexaFluor(注册商标)647复合体(Thermofisher、A31573)。

将细胞用PBS清洗2次，用荧光显微镜进行观察，对发出荧光的细胞进行计数。其结果，如图15所示那样，仅转染一次mRNA的情况下，在第9天基本不能发现GFP。另一方面，在转染了3次mRNA的情况下，即便在第9天也能发现GFP。由此可知，mRNA在细胞内分解，蛋白质的表达为暂时性的。

如上所示，可以在接种iPS细胞后，转染RNA后数日诱导为神经细胞。而且，可短时间地诱导为神经细胞，因此可以不必在培养基中包含B18R蛋白质，所述B18R蛋白质通常用于抑制伴随着将RNA插入至细胞中时的免疫反应的细胞死亡。

符号说明

2 管

10 分离装置

20 导入前细胞送液通路

21 诱导因子送液机构

30 因子导入装置

31 导入细胞送液通路

40 细胞制作装置

50 体细胞培养装置

51 体细胞送液通路

60 分割机构

70 扩增培养装置

71 扩增培养送液通路

72 体细胞送液通路

80 分割机构

90 体细胞搬送机构

91 封装前细胞流路

100 封装装置

101 溶液置换器

102 过滤器

103 送液流路

104 送液流路

105 排出流路

106 排出流路

110 冻结保存液送液机构

200 壳体

201 血液保存部

202 血液送液通路

203 单核细胞分离部

204 泵

205 分离剂保存部

206 送液通路

207 泵

208 单核细胞送液通路

209 泵

210 单核细胞纯化过滤器

211 导入前细胞送液通路

212 泵

213 因子导入部

214 因子保存部

215 因子送液通路

216 泵

217 导入细胞送液通路

218 泵

219 体细胞培养器

220 细胞培养基保存部

221 培养基送液通路

222 泵

223 体细胞培养基保存部

224 培养基送液通路

225 泵

226 废液送液通路

227 泵

228 废液保管部

229 导入细胞送液通路

230 泵

231 细胞团分割器

232 扩增培养器

233 培养基送液通路

234 泵

235 废液送液通路

236 泵

237 导入细胞送液通路

238 泵

239 细胞团分割器

240 扩增培养器

241 培养基送液通路

242 泵

243 废液送液通路

244 泵

245 导入细胞送液通路

246 泵

247 溶液置换器

248 废液送液通路

249 泵

250 冻结保存液保存部

251 送液通路

252 泵

253 送液通路

254 泵

255 冻结保存容器

256 低温保管库

257 液氮保管库

258 送液通路

259 冷藏保存部

260 盒体

301 袋

302 袋

Claims

1.一种体细胞制造系统，其具备：导入前细胞送液通路，使包含导入前细胞的溶液通过；

因子导入装置，与所述导入前细胞送液通路连接，于所述导入前细胞中导入体细胞诱导因子而制作诱导因子导入细胞；及

细胞制作装置，对所述诱导因子导入细胞进行培养而制作体细胞。

2.根据权利要求1所述的体细胞制造系统，其进一步具备壳体，所述壳体容纳所述导入前细胞送液通路、所述因子导入装置、及所述细胞制作装置。

3.根据权利要求1或2所述的体细胞制造系统，其中，所述体细胞不包括多能性干细胞。

4.根据权利要求1或2所述的体细胞制造系统，其中，所述体细胞包括分化细胞。

5.根据权利要求1或2所述的体细胞制造系统，其中，所述体细胞包括成体性干细胞。

6.根据权利要求1或2所述的体细胞制造系统，其中，所述体细胞包括神经系细胞。

7.根据权利要求1或2所述的体细胞制造系统，其中，所述导入前细胞包括多能性干细胞。

8.根据权利要求1或2所述的体细胞制造系统，其中，所述导入前细胞包括成体性干细胞。

9.根据权利要求1或2所述的体细胞制造系统，其中，所述导入前细胞包括分化的体细胞。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的体细胞制造系统，其中，所述细胞制作装置具备：

体细胞培养装置，对在所述因子导入装置中制作的诱导因子导入细胞进行培养；及

扩增培养装置，对在所述体细胞培养装置中确立的体细胞进行扩增培养，

所述体细胞培养装置具备对所述诱导因子导入细胞补给培养基的第1培养基补给装置，

所述扩增培养装置具备对所述体细胞补给培养基的第2培养基补给装置。

11.根据权利要求10所述的体细胞制造系统，其中，所述体细胞培养装置进一步具备药剂补给装置，所述药剂补给装置供给包含杀死未导入耐药因子的细胞的药剂的溶液。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的体细胞制造系统，其中，所述因子导入装置具备：

因子导入部，与所述导入前细胞送液通路连接；

因子保存部，保存所述体细胞诱导因子；

因子送液通路，用以使所述体细胞诱导因子自所述因子保存部向所述导入前细胞送液通路或所述因子导入部流动；及

泵，用以使所述因子送液通路内的液体流动。

13.根据权利要求12所述的体细胞制造系统，其中，所述体细胞诱导因子是DNA、RNA、或蛋白质。

14.根据权利要求12所述的体细胞制造系统，其中，在所述因子导入部中，利用RNA脂质转染而于所述导入前细胞中导入所述体细胞诱导因子。

15.根据权利要求12所述的体细胞制造系统，其中，所述体细胞诱导因子植入至载体中。

16.根据权利要求15所述的体细胞制造系统，其中，所述载体是仙台病毒载体。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的体细胞制造系统，其进一步具备封装装置，所述封装装置对在所述细胞制作装置中制作的所述体细胞进行封装，所述壳体容纳所述封装装置。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的体细胞制造系统，其进一步具备溶液置换器，所述溶液置换器具备筒状构件、及

配置于所述筒状构件内部的液体透过过滤器，

在所述筒状构件上设有：

体细胞导入孔，用以将在所述细胞制作装置中制作的包含所述体细胞的溶液导入至所述液体透过过滤器上；

置换溶液导入孔，用以将置换溶液导入至所述液体透过过滤器上；

体细胞流出孔，用以使包含所述体细胞的置换溶液流出至所述液体透过过滤器上；及

废液流出孔，使透过所述液体透过过滤器的溶液流出。

19.根据权利要求18所述的体细胞制造系统，其进一步具备与所述废液流出孔连接的废液送液通路，在废弃包含所述体细胞的溶液的溶液时，容许所述废液送液通路中的溶液流动，在使所述体细胞分散于所述置换溶液中时，并不容许所述废液送液通路中的溶液流动。

20.根据权利要求18或19所述的体细胞制造系统，所述置换溶液是冻结保存液。

21.根据权利要求1所述的体细胞制造系统，其进一步具备自血液中分离所述导入前细胞的分离装置，包含在所述分离装置中分离的所述导入前细胞的溶液通过所述导入前细胞送液通路。