CN117511847A - 一种自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的方法，本发明通过利用采集的外周血单个核细胞PBMC通过重编程诱导为多能干细胞(iPSC)，进一步把iPSCs诱导分化为胰岛细胞。本发明方法成本低、应用范围广、不存在任何伦理问题，具有良好的诱导效果并且克服了异体胰岛β细胞移植技术会导致强烈排斥反应的缺陷，通过这两大步骤得到体外诱导分化的胰岛细胞，将极大改善目前糖尿病治疗的选择。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的方法。
背景技术
糖尿病是由胰岛素分泌受损以及各种不同程度的外周胰岛素抵抗所致的高糖血症而糖尿病一旦确诊，除少数早期病例外，无法治愈。1型糖尿病的主要病因是自身免疫性胰岛β细胞破坏而导致的胰岛素分泌不足，而2型糖尿病在初期出现胰岛素抵抗，但随后也出现胰岛β细胞受损和胰岛素分泌不足，因此在治疗策略上，1型糖尿病需要使用胰岛素治疗，而2型糖尿病后期也需要联用胰岛素治疗。长期使用胰岛素治疗，除了储存、使用不便之外，还容易出现胰岛素依赖和低血糖反应等不良反应。
目前对于大部分糖尿病患者，尚无较好的治愈方法，但是对于脆性糖尿病患者和糖尿病伴有严重并发症患者，目前有一种可治愈糖尿病的技术——胰岛移植。异体胰岛移植虽然可以改善血糖，但来源有限且需要终身服用免疫抑制药物也会给机体带来极大的副作用。
2006年日本京都大学山中伸弥教授开发出诱导多能干细胞(iPSCs)技术，而iPSC的分化能力在理论上可以分化为人体所有类型的细胞。2013年，Soyombo研究组已将BRCA1突变家系病人的体细胞重编程为iPS细胞，2017年，Qu等实现了人iPS细胞以3D形式分化为类乳腺结构。
发明人发现，利用外周血单个核细胞(PBMC)可以在体外成功诱导为诱导多能干细胞(iPSC)。因此，存在开发外周血单个核细胞(PBMC)诱导为诱导多能干细胞(iPSC)进而制备胰岛细胞团方法的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的方法，能够利用患者自体PBMC诱导多能干细胞并在体外分化为胰岛细胞团。
本发明自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的方法，可获得大量、成熟、可分泌胰岛素的胰岛细胞，易于体外扩增，足量、质优，为外周血单个核细胞在生物医学工程中的应用及胰岛素疾病治疗模型建立创造了条件。
本发明的另一目的是提供一种用于诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的培养基。
本发明的再一目的是提供使用上述方法或上述培养基诱导得到的胰岛细胞。
本发明的上述技术目的是通过如下方案实现的：
一种用于诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的培养基，包括依次使用的以下六种分化培养基；其中，
分化培养基1：包括MCDB131培养基、50-100μg/mL的激活素A、10-20mM的Y-27632、1-10mM的GSK-3抑制剂Chir99021和200-600μM的PI3K抑制剂PI-103；
分化培养基2：包括MCDB131培养基、0.1-0.5g的BSA、10-50μg/mL的角质蛋白生长因子、0.5-5mM的选择性ALK5抑制剂SB431542和0.5-5mM的PORCN抑制剂C59；
分化培养基3：包括DMEM培养基、20-50mM的维甲酸、0.2-2mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189、0.1-0.5mM的SANT-1、0.5-5mM的PORCN抑制剂C59；
分化培养基4：包括DMEM培养基、20-200μg/mL的表皮生长因子、0.2-2mM的TPB和0.1-0.5mM的SANT-1、1-5M的尼克酰胺；
分化培养基5：包括DMEM培养基、0.2-2.0mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189、0.5-5mM的PORCN抑制剂C59、1-10mM的ALK5抑制剂II、10-100mM的ISX9、0.1-10mM的γ分泌酶抑制剂21和10-20mM的Y-27632；
分化培养基6：包括DMEM培养基、1-10mM的ALK5抑制剂II、0.1-1mM的R248、1-10mM的Forskolin和0.1-0.5M的NAC。
本发明能够提供更适于胰岛细胞发育分化的培养环境，有利于获得大量、成熟、可分泌胰岛素的胰岛细胞，为人iPS细胞向胰岛的定向分化提供了一种新的研究思路，为探讨人iPS细胞向胰岛细胞分化的调控机制提供了新的研究线索。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基1中，激活素A的浓度可以为50μg/mL、70μg/mL、90μg/mL、100μg/mL。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基1中，Y-27632的浓度可以为10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mMm、17mM、18mM、19mM、20mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基1中，GSK-3抑制剂Chir99021的浓度可以为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基1中，PI3K抑制剂PI-103的浓度可以为200μM、400μM、600μM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基2中，BSA的质量可以为0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基2中，角质蛋白生长因子的浓度可以为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基2中，选择性ALK5抑制剂SB431542的浓度可以为0.5mM、0.7mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基2中，PORCN抑制剂C59的浓度可以为0.5mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基3中，维甲酸的浓度可以为20mM、30mM、40mM、50mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基3中，选择性BMP信号抑制剂LDN-193189的浓度可以为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基3中，SANT-1的浓度可以为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基3中，PORCN抑制剂C59的浓度可以为0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基4中，表皮生长因子的浓度可以为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、160μg/mL、180μg/mL、200μg/mL。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基4中，TPB的浓度可以为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基4中，TPB的浓度可以为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基4中，SANT-1的浓度可以为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基4中，尼克酰胺的浓度可以为1M、2M、3M、4M、5M。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基5中，选择性BMP信号抑制剂LDN-193189的浓度可以为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基5中，PORCN抑制剂C59的浓度可以为0.5mM、0.7mM、0.9mM、1.1mM、1.3mM、1.5mM、1.7mM、1.9mM、2.1mM、2.3mM、2.5mM、2.7mM、3.0mM、3.5mM、4.5mM、5mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基5中，ALK5抑制剂II的浓度可以为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基5中，ISX9的浓度可以为10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基5中，γ分泌酶抑制剂21的浓度可以为0.1mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、10mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基5中，Y-27632的浓度可以为10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基6中，ALK5抑制剂II的浓度可以为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基6中，R248的浓度可以为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基6中，Forskolin的浓度可以为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM。
在本发明较佳的实施例中，分化培养基6中，NAC的浓度可以为0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M。
优选地，所述分化培养基包括依次使用的以下6种培养基：
分化培养基1：包括MCDB131培养基，50μg/mL的激活素A，10mM的Y-27632，1mM的GSK-3抑制剂Chir99021，200μM的PI3K抑制剂PI-103；
分化培养基2：包括MCDB131培养基，0.1gBSA，10μg/mL角质蛋白生长因子，0.5mM的选择性ALK5抑制剂SB431542，0.5mM的PORCN抑制剂C59；
分化培养基3：包括DMEM培养基，20mM维甲酸、0.2mM选择性BMP信号抑制剂LDN-193189，0.1mM SANT-1，0.5mM PORCN抑制剂C59；
分化培养基4：包括DMEM培养基，20μg/mL表皮生长因子，0.2mM TPB，0.1mM SANT-1，1M的尼克酰胺；
分化培养基5：包括DMEM培养基，0.2mM选择性BMP信号抑制剂LDN-193189，0.5mMPORCN抑制剂C59，1mMALK5抑制剂II，10mM ISX9，0.10mMγ分泌酶抑制剂21，10mM的Y-27632；
分化培养基6：包括DMEM培养基，1mMALK5抑制剂II，0.1mM R248，1mM Forskolin，0.1M NAC。
本发明还提供了自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.采集糖尿病患者自体外周抗凝血，获取PBMC；
S2.重编程S1中得到的PBMC并诱导产生iPSC；
S3.将S2中得到的iPSC接种于细胞培养板培养；
进一步的，细胞接种密度为1.35×105/cm2；
S4.弃去步骤S3的培养基，更换为分化培养基1培养；
S5.弃去步骤S4的培养基，更换为分化培养基2培养；
S6.弃去步骤S5的培养基，更换为分化培养基3培养；
S7.弃去步骤S6的培养基，更换为分化培养基4培养；
S8.弃去步骤S7的培养基，更换为分化培养基5培养；
S9.弃去步骤S8的培养基，更换为分化培养基6培养。
本发明获取PBMC细胞并转染为iPS细胞后，直接更换为分化培养基，诱导细胞向胰岛细胞方向分化，通过该方法可获取大量、成熟、可分泌胰岛素的胰岛细胞。
在本发明较佳的实施例中，步骤S1中获取PBMC的方法为：在离心管中加入细胞分离液Ficoll，取糖尿病患者自体外周抗凝血与无菌PBS按照1：1的比例混合加入到细胞分离液Ficoll上，离心后吸取上中页面层中的条带洗涤得到目标细胞。
在本发明较佳的实施例中，步骤S2中，重编程S1中得到的PBMC诱导产生iPSC的方法为：根据细胞数量，使用CytoTuneTM iPS2.0仙台病毒重编程试剂盒(ThermoFisher，A16517)按照标准操作进行细胞转染。
进一步的，步骤S4的培养时间为3-5天。
更优选的，步骤S4的培养时间为4天。
进一步的，步骤S5的培养时间为20-28小时。
更优选的，步骤S5的培养时间为24小时。
进一步的，步骤S6的培养时间为3-5天。
更优选的，步骤S6的培养时间为4天。
进一步的，步骤S7的培养时间为1-3天。
更优选的，步骤S7的培养时间为2天。
进一步的，步骤S8的培养时间为5-7天。
更优选的，步骤S8的培养时间为6天。
进一步的，步骤S9的培养时间为3-5天。
更优选的，步骤S9的培养时间为4天。
优选地，在更换培养基时，用PBS清洗细胞1-2次。
优选地，所述的培养是在37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱下进行培养。
使用上述培养基或上述方法诱导得到的胰岛细胞或胰岛细胞团也属于本发明的保护范围。
本发明开发一种利用患者自体PBMC诱导多能干细胞并在体外分化为胰岛细胞团的方法，该方法通过利用特定培养基、控制培养时间点和分化培养基组合来控制细胞命运，先将外周血单个核细胞分化为iPS细胞，再进一步诱导iPS细胞向胰岛细胞分化，从而实现外周血单个核细胞体外定向分化为具有生物活性的胰岛细胞的目的。
本发明提供的患者自体PBMC诱导多能干细胞并在体外分化为胰岛细胞团的方法成本低、应用范围广、不存在任何伦理问题，具有良好的诱导效果并且克服了异体胰岛β细胞移植技术会导致强烈排斥反应的缺陷。
附图说明
图1为本发明实施例中患者来源外周血单个核细胞分离示意图，所述标示表示为处于离心管内上层和中层之间的外周血单个核细胞；
图2为本发明实施例中细胞重悬于ImmunStemTM单核细胞完全培养基的示意图；
图3为本发明实施例中转染完成后，将细胞重悬于ImmunStemTM单核细胞完全培养基的细胞示意图；
图4为本发明实施例中胞于ImmunStemTMY8培养基上的细胞示意图；
图5为本发明实施例中使用TRA-1-60Alexa FluorTM594偶联试剂盒(ThermoFisher，A24882)对形成iPSC克隆细胞团进行荧光染色鉴定的荧光染色示意图；
图6为本发明实施例中分化完成的细胞团示意图；
图7为本发明实施例中细胞团流式细胞仪染色流式图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，下述的实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的分化培养基
用于外周血单个核细胞体外定向分化为具有生物活性的胰岛细胞的培养基，包括依次使用的以下六种分化培养基：
(1)分化培养基1：是在500mL MCDB131培养基的基础上加入了500mM的葡萄糖，50μg/mL的激活素A，0.1M的维生素C，10mM的Y-27632，1mM的GSK-3抑制剂Chir99021，200μM的PI3K抑制剂PI-103；
(2)分化培养基2：是在500mL MCDB131培养基的基础上加入了0.1g的BSA，500mM的葡萄糖，0.1的维生素C，10μg/mL的角质蛋白生长因子，0.5mM的选择性ALK5抑制剂SB431542，0.5mM的PORCN抑制剂C59；
(3)分化培养基3：是在500mL DMEM培养基的基础上加入了20mM的维甲酸，0.2mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189，0.1mM的SANT-1，0.5mM的PORCN抑制剂C59及B27添加物；
(4)分化培养基4：是在500mL DMEM培养基的基础上加入了20μg/mL的表皮生长因子，0.1的维生素C，0.2mM的TPB，0.1mM的SANT-1，1M的尼克酰胺；
(5)分化培养基5：是在500mL DMEM培养基的基础上加入了0.1的维生素，0.2mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189，0.5mM的PORCN抑制剂C59，1mM的ALK5抑制剂II，10mM的ISX9，0.10mM的γ分泌酶抑制剂21，0.1的T3、10mM的ISX9，5mg/mL的肝素10mM的Y-27632及B27添加物；
(6)分化培养基6：是在500mL DMEM培养基的基础上加入了0.1M的维生素C，1mM的ALK5抑制剂II，0.1mM的T3，0.1mM的R248，1mM的Forskolin，10mM的锌盐，0.1M的NAC，5mg/mL的肝素及B27添加物。
实施例2自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团
用本发明的方法体外诱导多能干细胞定向分化制备胰岛细胞团，具体包括以下步骤：
一、PBMC获得
第1～5天
选取患者肘静脉穿刺点，碘酒酒精涂抹消毒后，穿刺采集20mL外周血于抗凝管中，混匀后置于4度，送至实验室。
血样在实验室恢复至室温，按1:1比例加入PBS稀释。
50mL离心管加入10mL Ficoll淋巴细胞分离液，将稀释后的血样缓缓加入。
使用水平转子的低速离心机，1200g，离心20分钟。
外周血单个核细胞(PBMC)分布于离心管上层和中层之间，如图1所示。
小心吸取中间白膜层，加入5倍PBS洗涤2次，即可获得患者来源的外周血单个核细胞(PBMC)。
细胞计数，按照5×105/mL的细胞浓度，将PBMC重悬于ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基中，加入24孔培养板，每孔1mL。
放入37摄氏度、5％二氧化碳的细胞培养箱。
每天换液，共四天。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图2所示，细胞生长状态良好。
二、iPSC获得；
第5天：
细胞计数，根据CytoTuneTM iPS2.0(ThermoFisher，A16517)仙台病毒重编程试剂盒的批号计算好所需的病毒量，开始转染。
调整细胞浓度为5×105/mL，取1mL加入圆底离心管。
将计算好的病毒量加入1mL预热的ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基中，混匀后加入细胞选一种，1000g离心20分钟，再加入1mL ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基；混匀。
以上全部加入12孔细胞培养板的一个孔中，放入细胞培养箱。
第6天：
将孔中细胞转入15mL离心管离心10分钟，重悬于1mL的ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基，转入24孔细胞培养板，放入培养箱二天。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图3所示。
第8天：
活细胞计数，然后重悬于StemPro-34(ThermoFisher，10639011)培养基，调整细胞浓度为0.5×105/mL，然后加入预先覆盖VTN-N(ThermoFisher，A14700)的6孔培养板，每孔2mL，放入细胞培养箱。
每天换液，共三天。
第12天：
室温预热ImmunStemTMY8(Immunolife，YL-S-008)培养基，从培养板中吸出全部培养基，然后加入预热好的ImmunStemTMY8(Immunolife，YL-S-008)培养基，放入培养箱。
每天换液，共二十一天。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图4所示。
荧光染色鉴定：
第34天：
在培养板的一个孔中加入20μL的TRA-1-60Alexa FluorTM594偶联抗体(ThermoFisher，A24882)，放入培养箱30分钟。
加入2mL预热的FluoroBrite DMEM培养基冲洗细胞，重复三次。
在荧光显微镜下观察并标记完全的iPSC克隆。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图5所示。
将标记好的克隆转移至新的培养板中，每天换液。
三、胰岛细胞获得
第40天：
iPSC生长至80-90％时，用Accutase消化为单细胞，转入15mL离心管离心，弃上清，加入10mL DMEM/F12，离心，弃上清，重悬于ImmunStemTMY8(Immunolife，YL-S-008)培养基，按照1.35×105个细胞/cm2，种植于预先用Matrigel覆盖的6孔板中，每孔1.35×106个细胞/2mL培养基，加入10μm的Y-27632。
第41天：
24小时后，更换为2mL分化培养基1，分化培养基1：500mL MCDB131培养基的基础上加入了500mM的葡萄糖，50μg/mL的激活素A，0.1M的维生素C，10mM的Y-27632，1mM的GSK-3抑制剂Chir99021，200μM的PI3K抑制剂PI-103。
每天换液，加入2mL分化培养液1，共四天。
第45天：
更换为分化培养基2，分化培养基2：500mL MCDB131培养基的基础上加入了0.1g的BSA，500mM的葡萄糖，0.1的维生素C，10μg/mL的角质蛋白生长因子，0.5mM的选择性ALK5抑制剂SB431542，0.5mM的PORCN抑制剂C59。
每天换液，共二天。
第47天：
更换为分化培养基3，分化培养基-3：500mL DMEM培养基的基础上加入了20mM的维甲酸，0.2mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189，0.1mM的SANT-1，0.5mM的PORCN抑制剂C59及B27添加物。
每天换液，共四天。
对细胞团进行消化重悬处理
第51天：
用Accutase消化，37度6-8分钟，离心(300g，3分钟)，弃上清，加入10mL DMEM/F12，离心(300g，10分钟)，弃上清。
细胞重悬于分化培养基4中，种植在6孔培养皿中，每孔种5×106个细胞，并加入10μM的Y27632，放到培养箱中。
20小时后，将形成聚集团块的细胞用枪头转入加入分化培养液4的超低吸附6孔培养板，将此培养板放在培养箱里的摇床上，转速每分钟90转。
第52天：
更换为分化培养基4，分化培养基-4：500mL DMEM培养基的基础上加入了20μg/mL的表皮生长因子，0.1的维生素C，0.2mM的TPB，0.1mM的SANT-1，1M的尼克酰胺。
每天换液，共六天。
第58天：
更换为分化培养基5，分化培养基-5：500mL DMEM培养基的基础上加入了0.1的维生素，0.2mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189，0.5mM的PORCN抑制剂C59，1mM的ALK5抑制剂II，10mM的ISX9，0.10mM的γ分泌酶抑制剂21，0.1的T3、10mM的ISX9，5mg/mL的肝素10mM的Y-27632及B27添加物。
每天换液，共六天。
第64天：
更换为分化培养基6，分化培养基-6：500mL DMEM培养基的基础上加入了0.1M的维生素C，1mM的ALK5抑制剂II，0.1mM的T3，0.1mM的R248，1mM的Forskolin，10mM的锌盐，0.1M的NAC，5mg/mL的肝素及B27添加物。
每天换液，共四天。
最终收获目标细胞或目标细胞团。
实施例3自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的方法
用本发明的方法体外诱导多能干细胞定向分化制备胰岛细胞团，具体包括以下步骤：
一、PBMC获得
第1～5天
选取患者肘静脉穿刺点，碘酒酒精涂抹消毒后，穿刺采集20mL外周血于抗凝管中，混匀后置于4度，送至实验室。
血样在实验室恢复至室温，按1:1比例加入PBS稀释。
50mL离心管加入10mL Ficoll淋巴细胞分离液，将稀释后的血样缓缓加入。
使用水平转子的低速离心机，1200g，离心20分钟。
外周血单个核细胞(PBMC)分布于离心管上层和中层之间，如图1所示。
小心吸取中间白膜层，加入5倍PBS洗涤2次，即可获得患者来源的外周血单个核细胞(PBMC)。
细胞计数，按照5×105/mL的细胞浓度，将PBMC重悬于ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基中，加入24孔培养板，每孔1mL。
放入37摄氏度、5％二氧化碳的细胞培养箱。
每天换液，共四天。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图2所示，细胞生长状态良好。
二、iPSC获得；
第5天：
细胞计数，根据CytoTuneTM iPS2.0(ThermoFisher，A16517)仙台病毒重编程试剂盒的批号计算好所需的病毒量，开始转染。
调整细胞浓度为5×105/mL，取1mL加入圆底离心管。
将计算好的病毒量加入1mL预热的ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基中，混匀后加入细胞选一种，1000g离心20分钟，再加入1mL ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基；混匀。
以上全部加入12孔细胞培养板的一个孔中，放入细胞培养箱。
第6天：
将孔中细胞转入15mL离心管离心10分钟，重悬于1mL的ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基，转入24孔细胞培养板，放入培养箱二天。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图3所示。
第8天：
活细胞计数，然后重悬于StemPro-34(ThermoFisher，10639011)培养基，调整细胞浓度为0.5×105/mL，然后加入预先覆盖VTN-N(ThermoFisher，A14700)的6孔培养板，每孔2mL，放入细胞培养箱。
每天换液，共三天。
第12天：
室温预热ImmunStemTMY8(Immunolife，YL-S-008)培养基，从培养板中吸出全部培养基，然后加入预热好的ImmunStemTMY8(Immunolife，YL-S-008)培养基，放入培养箱。
每天换液，共二十一天。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图4所示。
荧光染色鉴定：
第34天：
在培养板的一个孔中加入20μL的TRA-1-60Alexa FluorTM594偶联抗体(ThermoFisher，A24882)，放入培养箱30分钟。
加入2mL预热的FluoroBrite DMEM培养基冲洗细胞，重复三次。
在荧光显微镜下观察并标记完全的iPSC克隆。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图5所示。
将标记好的克隆转移至新的培养板中，每天换液。
三、胰岛细胞获得
第40天：
iPSC生长至80-90％时，用Accutase消化为单细胞，转入15mL离心管离心，弃上清，加入10mL DMEM/F12，离心，弃上清，重悬于ImmunStemTMY8(Immunolife，YL-S-008)培养基，按照1.35×105个细胞/cm2，种植于预先用Matrigel覆盖的6孔板中，每孔1.35×106个细胞/2mL培养基，加入10μm的Y-27632。
第41天：
24小时后，更换为2mL分化培养基1，分化培养基1：MCDB131培养基500mL，加入80μg/mL的激活素A、15mM的Y-27632、5mM的GSK-3抑制剂Chir99021和300μM的PI3K抑制剂PI-103。
每天换液，加入2mL分化培养液1，共四天。
第45天：
更换为分化培养基2，分化培养基2：MCDB131培养基500mL，加入0.3的BSA、30μg/mL的角质蛋白生长因子、1mM的选择性ALK5抑制剂SB431542和2mM的PORCN抑制剂C59。
每天换液，共二天。
第47天：
更换为分化培养基3，分化培养基-3：DMEM培养基500mL，加入30mM的维甲酸、1mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189、0.3mM的SANT-1、2mM的PORCN抑制剂C59。
每天换液，共四天。
对细胞团进行消化重悬处理
第51天：
用Accutase消化，37度6-8分钟，离心(300g，3分钟)，弃上清，加入10mL DMEM/F12，离心(300g，10分钟)，弃上清。
细胞重悬于分化培养基4中，种植在6孔培养皿中，每孔种5×106个细胞，并加入10μM的Y27632，放到培养箱中。
20小时后，将形成聚集团块的细胞用枪头转入加入分化培养液4的超低吸附6孔培养板，将此培养板放在培养箱里的摇床上，转速每分钟90转。
第52天：
更换为分化培养基4，分化培养基-4：DMEM培养基500mL，加入100μg/mL的表皮生长因子、1mM的TPB和0.2mM的SANT-1、2M的尼克酰胺。
每天换液，共六天。
第58天：
更换为分化培养基5，分化培养基-5：DMEM培养基500mL，加入0.5mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189、1mM的PORCN抑制剂C59、2mM的ALK5抑制剂II、20mM的ISX9、5mM的γ分泌酶抑制剂21和15mM的Y-27632。
每天换液，共六天。
第64天：
更换为分化培养基6，分化培养基-6：DMEM培养基500mL，加入2mM的ALK5抑制剂II、0.2mM的R248、5mM的Forskolin和0.2M的NAC。
每天换液，共四天。
最终收获目标细胞或目标细胞团。
实施例4自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的方法
用本发明的方法体外诱导多能干细胞定向分化制备胰岛细胞团，具体包括以下步骤：
一、PBMC获得
第1～5天
选取患者肘静脉穿刺点，碘酒酒精涂抹消毒后，穿刺采集20mL外周血于抗凝管中，混匀后置于4度，送至实验室。
血样在实验室恢复至室温，按1:1比例加入PBS稀释。
50mL离心管加入10mL Ficoll淋巴细胞分离液，将稀释后的血样缓缓加入。
使用水平转子的低速离心机，1200g，离心20分钟。
外周血单个核细胞(PBMC)分布于离心管上层和中层之间，如图1所示。
小心吸取中间白膜层，加入5倍PBS洗涤2次，即可获得患者来源的外周血单个核细胞(PBMC)。
细胞计数，按照5×105/mL的细胞浓度，将PBMC重悬于ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基中，加入24孔培养板，每孔1mL。
放入37摄氏度、5％二氧化碳的细胞培养箱。
每天换液，共四天。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图2所示，细胞生长状态良好。
二、iPSC获得；
第5天：
细胞计数，根据CytoTuneTM iPS2.0(ThermoFisher，A16517)仙台病毒重编程试剂盒的批号计算好所需的病毒量，开始转染。
调整细胞浓度为5×105/mL，取1mL加入圆底离心管。
将计算好的病毒量加入1mL预热的ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基中，混匀后加入细胞选一种，1000g离心20分钟，再加入1mL ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基；混匀。
以上全部加入12孔细胞培养板的一个孔中，放入细胞培养箱。
第6天：
将孔中细胞转入15mL离心管离心10分钟，重悬于1mL的ImmunStemTM(Immunolife，YL-S-001)单核细胞完全培养基，转入24孔细胞培养板，放入培养箱二天。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图3所示。
第8天：
活细胞计数，然后重悬于StemPro-34(ThermoFisher，10639011)培养基，调整细胞浓度为0.5×105/mL，然后加入预先覆盖VTN-N(ThermoFisher，A14700)的6孔培养板，每孔2mL，放入细胞培养箱。
每天换液，共三天。
第12天：
室温预热ImmunStemTMY8(Immunolife，YL-S-008)培养基，从培养板中吸出全部培养基，然后加入预热好的ImmunStemTMY8(Immunolife，YL-S-008)培养基，放入培养箱。
每天换液，共二十一天。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图4所示。
荧光染色鉴定：
第34天：
在培养板的一个孔中加入20μL的TRA-1-60Alexa FluorTM594偶联抗体(ThermoFisher，A24882)，放入培养箱30分钟。
加入2mL预热的FluoroBrite DMEM培养基冲洗细胞，重复三次。
在荧光显微镜下观察并标记完全的iPSC克隆。
在100X光学显微镜下观察，观察结果如图5所示。
将标记好的克隆转移至新的培养板中，每天换液。
三、胰岛细胞获得
第40天：
iPSC生长至80-90％时，用Accutase消化为单细胞，转入15mL离心管离心，弃上清，加入10mL DMEM/F12，离心，弃上清，重悬于ImmunStemTMY8(Immunolife，YL-S-008)培养基，按照1.35×105个细胞/cm2，种植于预先用Matrigel覆盖的6孔板中，每孔1.35×106个细胞/2mL培养基，加入10μm的Y-27632。
第41天：
24小时后，更换为2mL分化培养基1，分化培养基1MCDB131培养基500mL，加入100μg/mL的激活素A、20mM的Y-27632、10mM的GSK-3抑制剂Chir99021和600μM的PI3K抑制剂PI-103。
每天换液，加入2mL分化培养液1，共四天。
第45天：
更换为分化培养基2，分化培养基2：MCDB131培养基500mL，加入0.5g的BSA、50μg/mL的角质蛋白生长因子、5mM的选择性ALK5抑制剂SB431542和5mM的PORCN抑制剂C59。
每天换液，共二天。
第47天：
更换为分化培养基3，分化培养基-3：DMEM培养基500mL，加入50mM的维甲酸、2mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189、0.5mM的SANT-1、5mM的PORCN抑制剂C59。
每天换液，共四天。
对细胞团进行消化重悬处理
第51天：
用Accutase消化，37度6-8分钟，离心(300g，3分钟)，弃上清，加入10mL DMEM/F12，离心(300g，10分钟)，弃上清。
细胞重悬于分化培养基4中，种植在6孔培养皿中，每孔种5×106个细胞，并加入10μM的Y27632，放到培养箱中。
20小时后，将形成聚集团块的细胞用枪头转入加入分化培养液4的超低吸附6孔培养板，将此培养板放在培养箱里的摇床上，转速每分钟90转。
第52天：
更换为分化培养基4，分化培养基-4：DMEM培养基500mL，加入200μg/mL的表皮生长因子、2mM的TPB和0.5mM的SANT-1、5M的尼克酰胺。
每天换液，共六天。
第58天：
更换为分化培养基5，分化培养基-5：DMEM培养基500mL，加入2.0mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189、5mM的PORCN抑制剂C59、10mM的ALK5抑制剂II、100mM的ISX9、10mM的γ分泌酶抑制剂21和20mM的Y-27632。
每天换液，共六天。
第64天：
更换为分化培养基6，分化培养基-6：DMEM培养基500mL，加入10mM的ALK5抑制剂II、1mM的R248、10mM的Forskolin和0.5M的NAC。
每天换液，共四天。
最终收获目标细胞或目标细胞团。
实施例5自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞鉴定
1.按照实施例2的方法，先将外周血单个核细胞重编程转染为iPS细胞，再进一步诱导iPS细胞向胰岛细胞分化。如图五所述，实验发现对外周血单个核细胞转染后约29天已经基本形成iPS细胞。
2.收获细胞消化成单细胞后使用流式细胞仪进行鉴定
如图7所述，使用NKX6.1抗体(绿色荧光标记-Alexa-488)和C肽抗体(红外荧光标记-Alexa-647)，在流式细胞仪上调整FSC和SSC参数，先用未染色细胞设置FSC和SSC参数，然后用Alexa-488标记的微球和Alexa-647标记的微球进行荧光补偿，并设置荧光强度，Alexa-488的荧光强度在250-450之间，Alexa-647的荧光强度在400-600之间，两个抗体都阳性的细胞即为具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞。
综上结果可知，利用本发明的专用培养基，将外周血单个核细胞以重编程转染的方式获得iPS细胞后，直接更换培养基并使用特定的培养基组合，可高效诱导细胞向胰岛细胞方向分化，而且通过该方法可获取大量、成熟、可分泌胰岛素的胰岛细胞，易于体外扩增，足量、质优，为外周血单个核细胞在生物医学工程中的应用及胰岛素疾病治疗模型建立创造了条件。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的培养基，其特征在于，包括依次使用的以下六种分化培养基，其中，
分化培养基1：包括MCDB131培养基，50-100μg/mL的激活素A，10-20mM的Y-27632，1-10mM的GSK-3抑制剂Chir99021，200-600μM的PI3K抑制剂PI-103；
分化培养基2：包括MCDB131培养基，0.1-0.5g的BSA，10-50μg/mL的角质蛋白生长因子，0.5-5mM的选择性ALK5抑制剂SB431542，0.5-5mM的PORCN抑制剂C59；
分化培养基3：包括DMEM培养基，20-50mM的维甲酸，0.2-2mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189，0.1-0.5mM的SANT-1，0.5-5mM的PORCN抑制剂C59；
分化培养基4：包括DMEM，20-200μg/mL的表皮生长因子，0.2-2mM的TPB，0.1-0.5mM的SANT-1，1-5M的尼克酰胺；
分化培养基5：包括DMEM培养基，0.2-2mM的选择性BMP信号抑制剂LDN-193189，0.5-5mM的PORCN抑制剂C59，1-10mM的ALK5抑制剂II，10-100mM的ISX9，0.1-10mM的γ分泌酶抑制剂21，10-20mM的Y-27632；
分化培养基6：包括DMEM培养基，1-10mM的ALK5抑制剂II，0.1-1mM的R248，1-10mM的Forskolin，0.1-0.5M的NAC。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，包括依次使用的以下六种分化培养基，其中，
分化培养基1：包括MCDB131培养基，50μg/mL的激活素A，10mM的Y-27632，1mM的GSK-3抑制剂Chir99021，200μM的PI3K抑制剂PI-103；
分化培养基2：包括MCDB131培养基，0.1gBSA，10μg/mL角质蛋白生长因子，0.5mM的选择性ALK5抑制剂SB431542，0.5mM的PORCN抑制剂C59；
分化培养基3：包括DMEM培养基，20mM维甲酸、0.2mM选择性BMP信号抑制剂LDN-193189，0.1mM SANT-1，0.5mM PORCN抑制剂C59；
分化培养基4：包括DMEM培养基，20μg/mL表皮生长因子，0.2mMTPB，0.1mMSANT-1，1M的尼克酰胺；
分化培养基5：包括DMEM培养基，0.2mM选择性BMP信号抑制剂LDN-193189，0.5mMPORCN抑制剂C59，1mMALK5抑制剂II，10mM ISX9，0.10mMγ分泌酶抑制剂21，10mM的Y-27632；
分化培养基6：包括DMEM培养基，1mM ALK5抑制剂II，0.1mM R248，1mM Forskolin，0.1MNAC。
3.自体诱导多能干细胞体外制备胰岛细胞团的方法，其特征在于，将人外周血单个核细胞在权利要求1、2任一项所述的分化培养基1-6上依次培养，包括如下步骤：
S1.获取PBMC；
S2.重编程S1中得到的PBMC并诱导产生iPSC；
S3将S2中得到的iPSC接种于细胞培养板培养；
S4.弃去步骤S3的培养基，更换为分化培养基1培养；
S5.弃去步骤S4的培养基，更换为分化培养基2培养；
S6.弃去步骤S5的培养基，更换为分化培养基3培养；
S7.弃去步骤S6的培养基，更换为分化培养基4培养；
S8.弃去步骤S7的培养基，更换为分化培养基5培养；
S9.弃去步骤S8的培养基，更换为分化培养基6培养。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S4的培养时间为3-5天。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S5的培养时间为20-28小时。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S6的培养时间为3-5天。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S7的培养时间为1-3天。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S8的培养时间为5-7天。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S9的培养时间为3-5天。
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| Publication Number | Publication Date |
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