CN103800897B

CN103800897B - 一种肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗制备方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN103800897B
Application number: CN201410087842.5A
Authority: CN
Inventors: 金光瑞; 王琳
Original assignee: Individual
Current assignee: Li Jinzhen
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2034-03-12
Also published as: CN103800897A

Abstract

本发明提供了一种肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗制备方法，其中，所述方法包括采用鉴定的肿瘤特异表达的上皮细胞粘附分子的人白细胞抗原A201阳性表位多肽，即SEQ ID NO.1‑6中任一项所示的氨基酸序列组成的多肽，并由SEQ ID NO.1‑6中一项以上多肽负载树突状细胞，制备成树突状细胞疫苗，可引发很强的靶向抗肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞反应。本发明还提供了制备所述肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗的试剂盒。

Description

一种肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗制备方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及制备肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗的方法、使用所述方法的试剂盒、以及通过所述方法获得的树突细胞和疫苗。特别地，本发明涉及采用鉴定的肿瘤特异表达的上皮细胞粘附分子的人白细胞抗原A201阳性表位多肽，负载树突状细胞的制备方法、使用所述方法的试剂盒、以及通过所述方法获得的树突细胞疫苗。

背景技术

目前，恶性肿瘤是威胁人类健康最主要的疾病之一，全世界现有癌症病人2200万，每年新增病例1000万。中国每年新发癌症280万，并且癌症发病数以年均3％-5％的速度递增。现有技术即常规治疗手段手术、化疗和放疗等可以去除或杀死机体大部分恶性肿瘤，但还存在一些残余的肿瘤细胞或产生耐药的肿瘤细胞成为癌症复发和转移的“元凶”，使得患者不能得到较长的生存期以及预后不佳。随着分子生物学和细胞生物学的发展，临床治疗癌症的技术也不断呈现并发挥着很好效果，其中细胞免疫治疗癌症得到很好的发展，应用患者自体免疫细胞临床治疗各类实体肿瘤和血液肿瘤取得良好的疗效，能有效清除患者机体内残余肿瘤细胞，抑制肿瘤的复发和转移，而且临床上无任何毒副作用。树突状细胞是机体内最大的抗原呈递细胞，通过吞噬和加工机体内恶性肿瘤细胞，将肿瘤抗原表位多肽呈递到细胞表面，与T淋巴细胞结合并将抗原信息呈递给T淋巴细胞，由该T淋巴细胞对肿瘤细胞产生细胞毒性作用。树突状细胞疫苗已在临床上用于治疗恶性肿瘤病人，树突状细胞如何获得更佳地抗肿瘤效果，完全取决于恶性肿瘤特异表达的抗原，因而筛选和找到肿瘤特异表达的抗原是树突状细胞发挥作用的关键环节。

上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是一种膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白，与各种肿瘤的关系密切，包括肝癌、肺鳞癌、恶性黑素瘤、卵巢癌和乳腺癌等多种肿瘤，将成为这些肿瘤新的肿瘤标志物。研究发现，EpCAM在肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌及头颈部鳞状细胞癌中高表达的跨膜蛋白，提示EpCAM在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。已有研究报道了在原发性肝癌中鉴分离得到的人成熟肝癌细胞和人肝癌组织中特异地高表达EpCAM，而且在鉴定并分离得到的肝癌干细胞中也特异地高表达EpCAM，即，“EpCAM，a new marker for cancer stem cells in hepatocellularcarcinoma.(EpCAM作为原发性肝癌中肿瘤干细胞新的标志物)”，Benoit Terris等人，Journal of Hepatology(肝脏病学杂志)，第52卷第2期，280-281页，2010年2月中公开了，同时其发现EpCAM在正常肝干细胞中不表达，可以成为原发性肝癌靶向治疗的靶点，而不伤及正常肝干细胞。

最近我们对我国肺癌和胃癌临床样本蛋白印迹实验中发现，EpCAM蛋白在中国人肺癌中的阳性率为67.3％，在胃腺癌中的阳性率为59.1％。而且在阳性表达的肺腺癌和胃癌样本中，有淋巴结转移者和低分化组EpCAM均表达更显著，表明EpCAM蛋白肺腺癌和胃癌患者表达显著，其可作为肺腺癌和胃癌及其复发转移潜在的标志物。

综上，针对特异表达上皮细胞粘附分子的恶性肿瘤细胞进行杀伤具有很好的临床应用意义，可以高效准确地对恶性肿瘤细胞进行清除，而且可以靶向恶性程度高的癌症，并有效抑制恶性肿瘤的复发和转移，同时不影响机体正常细胞。

发明内容

为了高效靶向恶性肿瘤进行杀伤和有效抑制恶性肿瘤的复发和转移，本发明首先对恶性肿瘤特异表达并与肿瘤复发和转移密切相关的肿瘤抗原进行筛选，发现上皮细胞粘附分子恶性肿瘤中特异表达，同时在肿瘤干细胞中和复发转移的肿瘤中高表达，而正常组织细胞中不表达。本发明通过抗原表位预测系统分析了上皮细胞粘附分子抗原表位多肽，并进行细胞毒性T淋巴细胞实验鉴定得到6条可引发细胞毒性T淋巴细胞反应的HLA-A201阳性的表位多肽。本发明是提供了上皮细胞粘附分子的HLA-A201阳性的表位多肽，该多肽可以用于负载树突状细胞，引发特异性的靶向抗肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞反应。

本发明提供了一种肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗制备方法，以及提供使用本发明所述方法的试剂盒，通过本发明所述方法获得的树突细胞疫苗。

本发明提供了一种制备肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗的方法，其中，所述方法包括采用鉴定的肿瘤特异表达的上皮细胞粘附分子的人白细胞抗原A201阳性表位多肽，即SEQ ID NO.1-6中任一项所示的氨基酸序列组成的多肽，负载树突状细胞。通过采集人外周血中白细胞，经体外分离纯化获得的单个核细胞，在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素4诱导培养获得未成熟树突状细胞；未成熟树突状细胞负载EpCAM的SEQID NO.1-6中任一项抗原表位多肽后，并在肿瘤坏死因子α与脂多糖诱导培养条件下获得具有抗肿瘤作用的成熟树突状细胞疫苗。

根据本发明提供了一种制备肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗的方法，其特征在于，所述树突状细胞疫苗由SEQ ID NO.1-6中一项以上抗原表位多肽负载的树突状细胞。

本发明还提供了一种树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其中，所述树突状细胞为本发明所述的EpCAM的SEQ ID NO.1-6中抗原表位多肽负载的树突状细胞。

本发明还提供了一种制备肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：

2)上皮细胞粘附分子SEQ ID NO.1-6中一项以上抗原表位多肽；

3)人重组巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子；

4)人重组干扰素α；以及

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括权利要求1-3所述的方法。

通过本发明的方法，通过筛选和鉴定得到的上皮细胞粘附分子的人白细胞抗原A201阳性表位多肽，即SEQ ID NO.1-6中任一项所示的氨基酸序列组成的多肽。由本发明提供的方法得到的上皮细胞粘附分子的人白细胞抗原A201阳性表位多肽负载的树突状细胞的药物，能够在体内和体外引发免疫应答来杀死引起复发与转移的恶性肿瘤细胞，从而为克服恶性肿瘤耐受性、根治肝癌的复发和转移提供了可能，特别是原发性肝癌和肺鳞癌等。

附图说明

图1表示由实施例1、3或／和4所得EpCAM抗原表位多肽单负载的DC引发的酶联斑点图像自动分析仪检测干扰素γ酶联斑点计数结果。

图2表示由实施例1、3或／和4所得EpCAM抗原表位多肽多负载的DC引发的酶联斑点图像自动分析仪检测干扰素γ酶联斑点计数对比结果。

图3表示由实施例1、3或／和5所得EpCAM抗原表位多肽多负载树突状细胞引发的细胞毒性T淋巴细胞对表达EpCAM的肝癌细胞(Hep G2)产生的应答结果对比图。

图4表示由实施例1、3或／和5所得EpCAM抗原表位多肽多负载树突状细胞引发的细胞毒性T淋巴细胞对不表达和表达EpCAM的肺鳞癌细胞(NCI-H520)产生的应答结果对比图。

具体实施方式

人外周血、骨髓或脐带血来源的单个核细胞，去除红细胞、血小板和粒细胞等，细胞计数仪计数后单个核细胞用AIM-V培养基稀释到3-5×10⁶，加入75cm2培养瓶中贴壁；在37℃、5％CO₂培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来，用于激活毒性T淋巴细胞之用；贴壁细胞加入完全AIM-V培养基诱导培养，含有5％的自体血清、1000IU／mL重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和500IU／mL重组人干扰素α；培养到第四天收获未成熟树突状细胞(DCs)；成熟DCs采用完全AIM-V培养基再诱导到第五天得到，含5％的自体血清、1000IU／mL重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和500IU／mL重组人干扰素α。培养到第四天，3×10⁶个未成熟DCs用上皮细胞粘附分子蛋白SEQ ID NO.1-6中一项以上抗原表位多肽组合物在37℃、5％CO₂培养箱中负载2-4小时；全AIM-V培养基诱导培养到第五天，成熟的抗原多肽负载DCs通过离心收获得到；所得DCs经生理盐水洗涤3次，后重悬到生理盐水中，至浓度为5×10⁶成熟DC／mL，并添加终浓度为质量体积比1％的人血白蛋白，从而制备成抗原多肽负载的DC疫苗。

优选地，由SEQ ID NO.1-6中三项以上抗原表位多肽组合物负载。

本发明提供了EpCAM抗原表位多肽负载的树突状细胞可激发细胞毒性T淋巴细胞反应，将EpCAM抗原表位多肽负载的树突状细胞与T淋巴细胞共培养，激活T淋巴细胞的增殖，以及干扰素γ酶联免疫斑点分析可检测特异激活T淋巴细胞分泌干扰素γ。

培养到第4-5天收获的DC细胞均可用于冻存，即将获得DC细胞苔盼兰计数，5×10⁶个DC细胞冻存1毫升，冻存管放置程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱过夜，第二天转至液氮冻存。DC可在需要时复苏进行增殖培养，仍可保持同样的细胞活率、细胞表型以及分泌干扰素γ，促使Th1细胞免疫应答的功能。

优选地，本发明所述方法为：培养到第5天收获的DC细胞均可用于冻存。

作为本发明制造方法中使用的细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶、细胞培养袋，可例举，为75cm²细胞培养瓶、175cm²细胞培养瓶、250mL细胞培养袋等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选细胞培养瓶。

本发明的制造方法中对DC细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50％小牛血清、40％细胞培养液和10％二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为DC细胞培养液。复苏后培养的DC细胞仍高表达共刺激分子并具有激活毒性T淋巴细胞应答的功能。

在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于0容量％至10容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优选为5％(体积比)。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。

本发明的EpCAM抗原表位多肽负载的树突状细胞的制备使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37℃、5％CO₂等条件下培养。还可以实施如下等操作：间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。

本发明还提供DC细胞在临床应用中多次多疗程的抗肿瘤治疗，更好地在生物体内发挥抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述DC细胞还具有如下优点，多次多疗程DC细胞治疗将更好地引发Th1细胞免疫应答，产生高效、长效地抗肿瘤免疫效应，因此非常利于患者疗效的提高和生存期的延长。

1)树突状细胞基础培养基；

2)上皮细胞粘附分子SEQ ID NO.1-6中一项以上抗原表位多肽；

3)人重组巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子；

4)人重组干扰素α；以及

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括权利要求1-3所述的方法。

根据本发明所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒，优选地包括SEQ ID NO.1-6中三项以上抗原表位多肽组合物。

所述树突状细胞基础培养基可以是本领域任何能够用于培养树突状细胞的培养基，例如：淋巴细胞及DC细胞培养基(GT-T551)、AIM-V、X-VIVO-15、X-VIVO-20、CellGro和RPMI1640等，所有培养基均有商品化产品，可购买到，其中优选为GT-T551和AIM-V。所述树突状细胞培养体系包括上皮细胞粘附分子SEQ ID NO.1-6中抗原表位多肽和1mL-100mL、优选30-80mL的树突状细胞基础培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。其中，所述人重组巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在EpCAM抗原表位多肽负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度500IU／mL-3000IU／mL。所述人重组干扰素α在EpCAM抗原表位多肽负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度100IU／mL-1500IU／mL。

本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其包括给患者施用选自由本发明方法制备的EpCAM抗原表位多肽组合物、本发明的树突状细胞疫苗所组成的组中的药物。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

制备例1人上皮细胞粘附分子HLA-A2010阳性表位多肽预测

应用生物信息学与分子分析体系(BIMAS)进行HLA多肽结合预测，筛选了人上皮细胞粘附分子特异结合的HLA抗原表位多肽，选择了6种与HLA-A0201结合亲和力超过100以上的氨基酸序列，即见表一：

排名	起始位点	多肽氨基酸序列	结合亲和力评分
				1	174	YQLDPKFIT	125.377
2	184	ILYENNVIT	68.146
				3	260	SMQGLKAGV	50.232
4	11	LLLAAATAT	46.873
				5	271	VIVVVVIAV	37.393
6	5	QVLAFGLLL	26.281

制备例2树突状细胞获取

通过血细胞分离机单采肿瘤患者2-4升外周血并经淋巴细胞分离液纯化得到单个核细胞；细胞计数仪计数后单个核细胞用AIM-V培养基稀释到3-5×10⁶，加入75cm²培养瓶中贴壁；

在37℃、5％CO₂培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来，用于激活T淋巴细胞之用；贴壁细胞加入完全AIM-V培养基诱导培养，含有5％的自体血清、1000IU／mL重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和500IU／mL重组人干扰素α；

培养到第四天收获未成熟树突状细胞(DCs)；成熟DCs采用完全AIM-V培养基再诱导到第五天得到，含5％的自体血清、1000IU／mL重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和500IU／mL重组人干扰素α。在第四天时添加特殊抗原(如EpCAM SEQ ID NO.1-6中任一项抗原表位多肽)，负载DCs。

实施例3EpCAM抗原表位多肽负载DCs

培养到第四天，3×10⁶个未成熟DCs用上皮细胞粘附分子蛋白SEQ ID NO.1-6中一项以上抗原表位多肽组合物在37℃、5％CO₂培养箱中负载2-4小时；全AIM-V培养基诱导培养到第五天，成熟的抗原多肽负载DCs通过离心(10min，1000rpm)收获得到；所得DCs经生理盐水洗涤3次，后重悬到生理盐水中，至浓度为5×10⁶成熟DC／mL，并添加终浓度为质量体积比1％的人血白蛋白，从而制备成EpCAM抗原表位多肽组合物负载的DC疫苗。

实施例1所述的EpCAM SEQ ID NO.1-6中一项以上抗原表位多肽组合物负载树突状细胞通过CD86-PE、CD80-PE、CD40-FITC、CD83-PE、CD11c-FITC和HLA-DR-PerCP(BD公司)染色，流式细胞仪检测负载后DC表型变化。检测结果显示所制备的DC表型平均值为CD11c+／HLA-DR+为98.1％，CD11c+／CD83+为84.3％，CD86+／HLA-DR+为91.5％，CD80+／HLA-DR+为91.7％和CD40+／HLA-DR+为88.2％，符合DC细胞特异表型，并高表达共刺激分子。

实施例4酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测细胞毒性T淋巴细胞分泌IFN-γ水平

用IFN-gamma抗体包被ELISPOT96-孔板：

在5ml PBS中加入1mg／mL的抗人IFN-γ抗体R4-6A2(Pharmingen公司-18181D)25ul，使浓度达5ug／ml，每孔加入50ul，加盖4℃过夜。弃去包被抗体，用含10％胎牛血清的完全培养基(RPMI-10)洗涤一次，每孔加入200ul完全培养基，加盖于室温封闭2小时，弃去培养基。

T淋巴细胞激活：

(1)实施例1所制备的DC细胞与T淋巴细胞以1∶5比例，在37℃、5％CO₂培养箱中共培养48小时。

(2)取共培养48小时T淋巴细胞，胎盘蓝计数，用R-5无酚红培养基稀释3个稀释度(2×10⁵、1×10⁵、0.5×10⁵和2.5×10⁴)。分别加入到IFN-γ抗体包被ELISPOT96孔板中，使每孔体积为100ul。

(3)实验组每孔加入100ul含表达EpCAM的肝癌细胞系HepG2(细胞数为1×10⁴／ml)的R1640-10，效靶比为20∶1、10∶1、5∶1和2.5∶1。

(4)对照组每孔加入100ul对应的未激活的T淋巴细胞。

(5)阴性对照加入100ul培养基。

混匀于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时。

ELISPOT试剂盒操作：

(1)用无菌水洗板2次，用1×洗涤缓冲液或PBST洗涤6次，每次洗涤时浸洗1～2min。

(2)将抗体(生物素偶联鼠抗人IFN-γ抗体)加至12ml(10组量)的稀释缓冲液1中，终浓度为2ug／ml。

(3)每孔加入50ul上步混合液，4℃过夜或室温2小时。

(4)用1×洗涤缓冲液或PBST洗涤3次。

(5)将链霉亲和素-辣根过氧化酶浓缩液A(美国BD公司)加至稀释缓冲液比值为1∶100，每孔加入50ul混合液。

(6)4℃过夜，用PBST洗涤4次，用PBS洗涤2次。

(7)每孔加50ul ELISPOT染色液(AEC底物，货号：551951，20ul的色原体(chronogen)加入到1mL的AEC底物溶液中)。

(8)避光室温放置5-60分钟，弃去染色液，用蒸馏水洗涤

(9)室温空气干燥2小时或过夜干燥，保存数据。

96孔ELISPOT板通过酶联斑点图像自动分析仪检测斑点数，图1中为在效靶比为10∶1时酶联斑点图像自动分析仪检测斑点计数结果，对照组为EpCAM抗原表位多肽负载的DC未激活的T淋巴细胞，实验组为一条EpCAM抗原表位多肽负载的DC激活的T淋巴细胞。实验组产生的IFN-γELISPOT斑点均超过对照组，其中EpCAM174、EpCAM184、EpCAM260和EpCAM5更为显著。图2中对照组为EpCAM抗原表位多肽负载的DC未激活的T淋巴细胞，实验组为一条以上EpCAM抗原表位多肽负载的DC激活的T淋巴细胞，随着负载EpCAM抗原表位多肽条数增多，产生的IFN-γELISPOT斑点数也越多，在负载了四条EpCAM抗原表位多肽时达到最高；并且随着效靶比提高，产生的IFN-γELISPOT斑点数也不断增多，效靶比最高时IFN-γELISPOT斑点数也达到最高。

实施例5：EpCAM抗原表位多肽负载的DC疫苗体外杀瘤试验

在75cm²培养瓶中，仍以含5％小牛血清的AIM-V为培养基，按上述抗原表位多肽负载的成熟树突状细胞∶T细胞＝1∶5的比例混合上述抗原负载的成熟树突状细胞和T细胞，同时加入GM-CSF(终浓度为800U／mL)和IL-4(终浓度为20ng／mL)，共培养3天，期间每隔1天均半量换液(含5％小牛血清、终浓度为800U／mL的GM-CSF和终浓度为20ng／mL的IL-4的RPMI1640培养基)，得到CTL细胞。

选择相应的肝癌细胞(表达EpCAM的Hep-G2)和肺癌细胞(不表达的EpCAM的NCI-H520和导入表达EpCAM基因的NCI-H520)作为靶细胞，用⁵¹Cr标记，即靶细胞(2×10⁶／mL)通过与300μCi⁵¹Cr在RPMI1640培养基中37℃孵育2小时。标记好的靶细胞用1×PBS洗涤三次，并最终用RPMI1640(含10％小牛血清)重悬到2×10⁵的浓度。以每孔2×10⁴个标记的靶细胞(0.1mL)添加到96孔板的孔中。

将上述产生的CTL细胞(效应细胞)分别以2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1和40∶1的效靶比加入对应的孔中，在37℃孵育4小时。孵育后，取上清75μL组分用γ放射计数器计数。特异的⁵¹Cr释放的百分比根据下述的公式进行计算。

其中，自发释放的每分脉冲数通过单独培养靶细胞(未加效应细胞)获得，最大释放的每分脉冲数是用终浓度2％NP-40(表面活性剂，上海生工)处理的单独培养靶细胞后获得的。检测的每分脉冲数通过添加效应细胞的靶细胞培养获得的。

图3显示了由实施例1或／和4所得EpCAM174单负载，EpCAM174和EpCAM184双负载，EpCAM174、EpCAM184和EpCAM260三负载以及EpCAM174、EpCAM184、EpCAM260和EpCAM5四负载树突状细胞，得到细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，由该CTL细胞产生的对表达EpCAM的肝癌细胞系(Hep G2)的应答结果。如图3所示，随着效靶比不断提高，对肝癌细胞Hep G2产生的CTL应答也特异升高，并且负载了四条EpCAM抗原表位多肽的DC效果最佳。其中，G-DC1表示为EpCAM174单负载的树突状细胞引发对肝癌细胞Hep G2的毒性活性；GG-DC2表示为EpCAM174和EpCAM184双负载的树突状细胞引发对肝癌细胞Hep G2的毒性活性；GGG-DC3表示为EpCAM174、EpCAM184和EpCAM260三负载的树突状细胞引发对肝癌细胞Hep G2的毒性活性；GGGG-DC4表示为EpCAM174、EpCAM184、EpCAM260和EpCAM5四负载的树突状细胞引发对肝癌细胞Hep G2的毒性活性。

图4显示了由实施例1或／和4所得EpCAM174单负载，EpCAM174和EpCAM184双负载，EpCAM174、EpCAM184和EpCAM260三负载以及EpCAM174、EpCAM184、EpCAM260和EpCAM5四负载树突状细胞，得到细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，由该CTL细胞产生的对不表达EpCAM和导入表达EpCAM基因的肺鳞癌细胞NCI-H520的应答结果。如图4所示，在效靶比10∶1时，负载EpCAM抗原表位多肽越多对肺鳞癌细胞NCI-H520产生的CTL应答也特异升高，并且负载了四条EpCAM抗原表位多肽的DC效果最佳。其中，对表达EpCAM的NCI-H520比不表达EpCAM的NCI-H520产生的CTL应答更特异升高。

Claims

1.一种肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗制备方法，其特征在于，所述方法包括采用鉴定的肿瘤特异表达的上皮细胞粘附分子的人白细胞抗原A201阳性表位多肽，即SEQ ID NO.1-6中三项以上所示的氨基酸序列组成的多肽，负载树突状细胞，可引发特异性的靶向抗肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞反应；

所述树突状细胞通过以下方法获取：

通过血细胞分离机单采肿瘤患者2-4升外周血并经淋巴细胞分离液纯化得到单个核细胞；细胞计数仪计数后单个核细胞用AIM-V培养基稀释到3-5×10⁶，加入75cm²培养瓶中贴壁；在37℃、5％CO₂培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来，用于激活毒性T淋巴细胞之用；贴壁细胞加入完全AIM-V培养基诱导培养，含有5％的自体血清、1000IU/mL重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和500IU/mL重组人干扰素α；

培养到第四天收获未成熟树突状细胞(DCs)；成熟DCs采用完全AIM-V培养基再诱导到第五天得到，含5％的自体血清、1000IU/mL重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和500IU/mL重组人干扰素α。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原多肽负载DCs通过以下方法获取：培养到第四天，3×10⁶个未成熟DCs用上皮细胞粘附分子蛋白SEQ ID NO.1-6中三项以上抗原表位多肽组合物在37℃、5％CO₂培养箱中负载2-4小时；全AIM-V培养基诱导培养到第五天，成熟的抗原多肽负载DCs通过离心收获得到；所得DCs经生理盐水洗涤3次，后重悬到生理盐水中，至浓度为5×10⁶成熟DC/mL，并添加终浓度为质量体积比1％的人血白蛋白，从而制备成抗原多肽负载的DC疫苗。

3.一种制备肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)树突状细胞基础培养基；

2)上皮细胞粘附分子SEQ ID NO.1-6中三项以上抗原表位多肽；

3)重组人巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子；

4)重组人干扰素α；以及

5)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括权利要求1-2任一项所述的方法。

4.一种根据权利要求1-3中任一项所述的树突状细胞疫苗在制备治疗肿瘤药物中的应用。