RU2099419C1 - Способ выращивания вирусов - Google Patents
Способ выращивания вирусов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2099419C1 RU2099419C1 SU925052917A SU5052917A RU2099419C1 RU 2099419 C1 RU2099419 C1 RU 2099419C1 SU 925052917 A SU925052917 A SU 925052917A SU 5052917 A SU5052917 A SU 5052917A RU 2099419 C1 RU2099419 C1 RU 2099419C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- biomass
- cell
- mmol
- culture
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 39
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 18
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 16
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 68
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 41
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 41
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 38
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 22
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Использование: настоящее изобретение относится к медицине и биотехнологии. Сущность изобретения: в качестве клеточной культуры эмбрионов используют биомассу, состоящую из клеточных агрегатов куриных эмбрионов размером 100 - 1000 мкм, которую после инфицирования вируссодержащим материалом культивируют в питательной среде при содержании кислорода не менее 0,01 ммоль/л, преимущественно 0,006 ммоль/л. 5 з. п. ф-лы, 5 табл.
Description
Изобретение относится к способу выращивания вирусов.
Способы выращивания вирусов и вирусных агентов известны. Исходными материалами для этих способов часто являются так называемые культуры первичных клеток, которые получают из тканей человека и животных. Эти первичные клетки инфицируют вирусом ("посевным вирусом") и размножением вируса образуют антиген.
Методика размножения, например, таежного весенне-летнего энцефалита /вирус/ FSME вирус/ изложена в патенте Австрии В 358167, в котором описан способ выращивания вирусов, предусматривающий инфицирование посевным материалом клеточной культуры куриных эмбрионов, суспендирование ее в питательной среде с последующим культивированием и выделением вирусов. Для этой цели полученную таким образом биомассу выдерживают в аэробных условиях при температуре от 25 до 38oC в течение 1-5 дней в суспензии. После этого клетки, а затем части клеток отделяют центрифугированием, полученную вирусную суспензию инактивируют посредством формалина или β-пропиолактона и вирусный агент концентрируют при помощи ультрафильтрации, очищают и обычным образом перерабатывают в вакцины.
При обычных обработках первичных клеточных культур особое внимание обращают на то, чтобы получить отдельные клетки или по возможности, максимально небольшие соединения клеток. Для достижения этой цели ткань необходимо механически или ферментативно максимально сильно измельчить. Такая обработка приводит однако одновременно также и к отмиранию многих клеток. Если такие клеточные приготовления поселяют на поверхности подходящих носителей, то мертвые клетки могут остаться в надосадочной жидкости. При применении таких клеточных приготовлений в суспензиях культур для производства вирусного антигена FSME нет никакой возможности отделить живые клетки от мертвых или же поврежденных клеток. Происходящий со временем лизис клеток ведет впоследствии к значительным загрязнениям протеинов клетки в среде, которые с трудом отделяются от желаемого продукта.
Так незначительна и репродуцируемость производства вируса/вирусного антигена при применении отдельных клеток или небольших клеточных агрегатов в суспензии, потому что это приводит к сильному повреждению клеток, например, из-за воздействия режущих усилий во время процесса перемешивания.
Настоящее изобретение ставит перед собой задачу устранения вышеперечисленных недостатков и тем самым разработку способа выращивания вирусов, согласно которому вирусы можно получать из питательной среды с высокой чистотой и производительностью.
Задача решается тем, что в качестве клеточной культуры куриных эмбрионов используют биомассу, состоящую из клеточных агрегатов куриных эмбрионов размером 100 1000 мкм, которую после инфицирования вирусосодержащим материалом культивируют в питательной среде при содержании кислорода не менее 0,01 ммоль/л, преимущественно 0,006 ммоль/л, при этом биомасса для выращивания вирусов при культивировании обеспечивает высокую производительность вирусов, проста в обращении и может быть использована для широкомасштабного производства вирусов.
Способ согласно изобретению позволяет получать клеточные агрегаты посредством механической или ферментативной обработки куриных эмбрионов, причем размельченную механическим путем массу для дальнейшего распадения клеточных скоплений можно продолжить измельчать до желаемой величины клеточных агрегаций при помощи протеазы, как, например, трипсином, химотрипсином или эластазой.
Клеточные агрегации биомассы можно получать также и из отдельных клеток человека или животных, обрабатывая последние при помощи агрегатирующих клетки субстанций, как, например, агглютинином.
Отделение клеточных агрегаций и отдельных клеток с диаметром больше, чем 1000 mм или меньше, чем 100 μм можно осуществлять просеиванием или же преимущественно осаждением. Проводить осаждение по сравнению с просеиванием легче, потому что легко происходит закупорка сит, содержащих величину пор, равную 100 μм. Кроме того, осаждение производится без сложных и дорогих сепарирующих устройств, причем здесь имеются также преимущества в отношении обеспечения стерильности. Оказалось, что клеточные агрегации с диаметром между 100 μм и 1000 μм осаждаются со скоростью свыше 1 см/мин, в то время как меньшие клеточные агрегации осаждаются со скоростью менее 1 см/мин. Отделение частиц с крупностью менее 1000 μм можно производить простым путем при помощи сит, потому что в данном случае возможность закупорки сит небольшая.
Предпочтительная форма выполнения способа согласно изобретению отличается тем, что культивирование проводят при исходной метаболической активности биомассы, измеренной по потреблению глюкозы, равной 5 мг глюкозы на грамм биомасс в ч.
Клеточные агрегации, применяемые в способе с использованием биомассы, согласно изобретению обладают, кроме того, также и тем преимуществом, что они уже при инфицировании сравнительно небольшим количеством посевного вируса производят большое количество антигена. Оказалось, что для инфицирования клеточных агрегаций (менее, чем 100 μм или более, чем 1000 μм) необходимо применять существенно большее количество посевного вируса, чтобы получить такое же количество вируса/вирусного антигена.
Производство вируса/вирусного антигена можно дополнительно повысить, если биомассу выдерживать в питательной среде при концентрации кислорода, равной по меньшей мере 0,01 ммоль/л, но преимущественно по меньшей мере 0,06 ммоль/л.
Выгодно, если по способу согласно изобретению культивирование проводят при исходной биомассе, равной 10 30 мг клеточных агрегаций на 1 мл питательной среды.
Способ согласно изобретению особенно пригоден для производства вируса таежного весенне-летнего энцефалита (вирус FSME) вирусного антигена, если она состоит из клеточных агрегаций клеток куриного эмбриона, при этом производительность при получении вируса/вирусного антигена можно далее повысить тем, если в питательной среде устанавливают долю кислород-трансфер на уровне 1,60 ммоль О2 • 1 л-1 ч-1 oC 2,40 ммоль О2 • 1 л-1 • ч-1, но преимущественно между 1,65 и 2,40 ммоль О2 • 1 л-1 • 1 ч-1.
Доля кислород-трансфер (oxygen transfer rate, OTR) выраженная в ммоль О2 • л-1 • 1 ч-1, является, как известно, мерой внесения кислорода в клеточную культуру. Доля поглощения кислорода (oxygen uptake rate, OUR) является в свою очередь метаболической производительностью клетки в общем и тем самым косвенным указанием на производительность вируса/вирусного антигена клетки.
Согласно всем известным сегодня методикам производства вирусного антигена FSME удельная производительность вирусного антигена ограничена, потому что наличие большого количества инфицированных клеток в питательной среде может привести к нежелательной инактивации вирусного титра и разрушению вирусного антигена.
Было обнаружено, что значение pH такой сильно аэрированной культуры не снижается и что можно поддерживать постоянным уровень производительности вируса/вирусного антигена, если в питательную жидкость вводить достаточное количество кислорода, например, перемешиванием или же посредством постоянного и/или динамического газораспределителя.
Как показали измерения, культура с плотностью клеток, равной 2 • 107 клеток на миллилитр, которая контактирует с кислородной атмосферой исключительно через свою поверхность, в значительной степени снижает производительность FSME. Если же, напротив, активным образом вносить кислород в культуру, то выход антигена может сильно возрасти.
Предпочтительная форма выполнения способа согласно изобретению заключается в том, что при скорости переноса кислорода в питательной среде, равной 1,65 ммоль O2 • 1 л-1 • 1 ч-1, концентрацию биомассы в питательной среде устанавливают на уровне 30 мг на 1 мл питательной среды.
Эксперименты показали, что производительность вируса FSME /вирусного антигена пропорциональна концентрации применяемой согласно изобретению клеточной агрегации. Способ согласно изобретению можно осуществлять также при концентрации клеточных агрегаций, равной менее чем 10 мг/мл. В противоположность этому, было установлено, что в случае культивации инфицированных отдельных клеток необходима обязательно минимальная концентрация для производства вируса/вирусного антигена, равная 10 мг/мл.
Высокие титры посевного вируса, необходимые для инфицирования первичных клеточных культур достигают, как всегда размножением вируса в мозгу мыши. Благодаря тому, что клеточные агрегации согласно изобретению можно инфицировать существенно небольшим количеством вируса, существует возможность получать необходимый для инфицирования биомассы посевной вирус из надосадочной клеточной культуры. Это значительно снижает вероятность контаминации протеина мозга мыши.
Оказалось, кроме того, что биомасса, используемая в способе и согласно изобретению состоящая из клеточных агрегаций куриных эмбрионов, точно так же пригодна для производства вирусного антигена гриппа вакцины или авипокса (Avipox).
Заявленным способом сначала получают по большей части именно все вирусы. Из полученной суспензии вирусов, например, путем разрушения структуры вирусов при переработке, возникают вирусные антигены (= вирусные фрагменты), несущие антигенные поверхностные детерминанты.
Согласно изобретению количество полученного антигена определяется методом Elisa. Метод Elisa является стандартным методом определения вируса или вирусного антигена, подробно описанным во многих литературных источниках, например, в публикации Antigenic Variation among Members of the Tick-borne Encephalitis complex, John R. Stephenson, a и др. J. Gen. Virol (1984 год), 65, 81 89, в которой полно представлена методика получения количеств например, FSME антигена по способу Elisa. Эта же публикация подтверждает и обозначает очень тесную связь понятий вирус и вирусный антиген и в равной мере относится к получению того и другого.
Более подробно предмет изобретения описывается ниже при помощи нижеследующих примеров его выполнения.
Пример 1. Влияние величины клеточных агрегаций на выход антигена.
Куриные яйца SPF (cpecific pathogen free) высиживают в течение 12 дней при температуре 37oC, проверяют при помощи теневого прибора успешное развитие эмбриона, дезинфицируют спиртом и открывают в стерильном боксе. Эмбрионы извлекают, промывают и грубо измельчают в режущем устройстве. После этого проверяют ферментативное "переваривание" эмбриональной ткани с помощью добавки протеолитических ферментов (1 мг/эмбрион) при температуре 37oC в течение 20 мин. Из этой тканевой суспензии были отделены куски ткани > 1000 μм через сито с размером отверстий, равным более 1000 μм. Дальнейшее разделение этих клеточных агрегаций можно было осуществить осадительным способом, при котором в качестве критерия разделения была выбрана норма осаждения ≥1 см/мин. Для этой цели клеточную суспензию нагнетали через осадительный сосуд снизу вверх при норме потока ≥1 см/мин. Отдельные клетки или небольшие клеточные агрегации оставались в суспензии, в то время как клеточные соединения большей величины осаждались на дне сосуда. Исследования, проведенные при помощи сит с различной величиной пор, свидетельствовали о том, что осаждающиеся в этих условиях клеточные соединения имели величины разделения, равные от <1000 μм и >100 μм. Величины остающихся в суспензии клеточных соединений была поэтому <100 μм.
Таким образом было получено три фракции клеточных агрегаций:
Из этих фракций были суспендированы соответственно одинаковые концентрации биомасс (30 г на литр) в питательной среде (Med 199) и инфицированы вирусом FSME (10•105 pfu на мг биомассы). Размножение вируса осуществляли при температуре 37oC, причем клетки в суспензии держали при равномерном перемешивании. Через четыре дня определили количества образованного антигена, для чего применили Elisa.
Из этих фракций были суспендированы соответственно одинаковые концентрации биомасс (30 г на литр) в питательной среде (Med 199) и инфицированы вирусом FSME (10•105 pfu на мг биомассы). Размножение вируса осуществляли при температуре 37oC, причем клетки в суспензии держали при равномерном перемешивании. Через четыре дня определили количества образованного антигена, для чего применили Elisa.
В случае фракции 1 (клеточные агрегации меньше, чем 100 μм производство вируса/вирусного антигена составило 4,9 μг/мл. В случае фракции 2 (клеточные агрегации превышают 1000 μм) производство вируса/вирусного антигена составило 4,7 μг/мл, а в случае фракции согласно изобретению производство вируса/вирусного антигена составило 9,3 μг/мл.
Пример 2. Влияние величины клеточных агрегаций на загрязнение с CEC - протеином CEC (chick embrio cell) +, (см. + клетка эмбриона цыпленка).
Питательные среды фракций 1 и 3, полученные согласно примеру 1, проверили через два дня после начала культивирования на содержание CEC-протеина. Питательная среда содержала 1,80 мг CEC-протеина/мл, в то время как в питательной среде фракции 3 было установлено только 0,84 мг CEC-протеина/мл.
Пример 3. Влияние количества посевного вируса на производство вируса/вирусного антигена.
Биомассы с величинами клеточных агрегаций фракций 1 и 3 культивировали и определяли производство вируса/вирусного антигена по способу, описанному в примере 1, при этом в случае для инфицирования использовали на фракцию четыре различных количества посевного вируса (3,2•103 pfu, 1•104 pfu, 3,2•104 pfu и 1•105 pfu соответственно на мг биомассы). Полученные результаты можно видеть на приведенной нижеследующей таблице 1, свидетельствующей о том, что фракция 3, применяемая согласно изобретению, дает при том же самом количестве посевного вируса существенно более высокий выход вируса/вирусного антигена.
Пример 4. Влияние концентрации кислорода на производство вирусного антигена.
Биомассу согласно изобретению культивировали в питательной среде согласно описанным в примере 1 условиям при различных концентрациях кислорода, и определяли количество вирусов/вирусных антигенов. Полученные результаты представлены в нижеследующей таблице 2, причем выход вируса/вирусного антигена при концентрации кислорода, равной 0,06 ммоль/л, принят за 100
Пример 5. Влияние трансфера перевода кислорода на выход вируса/вирусного антигена.
Пример 5. Влияние трансфера перевода кислорода на выход вируса/вирусного антигена.
Биомассу с клеточными агрегациями фракции 3, инфицировали, как это было описано в примере 1, вирусом, культивировали в сосудах различной величины, аэрируя воздухом, чтобы получить различные значения OTR. Суспензию выдерживали в течение 4 дней при температуре от 33oC до 37oC и определили выход вируса/вирусного антигена (см. таблицу 3).
Из приведенных в таблице 3 результатов можно прийти к заключению, что в случае, когда OTR превышает 2 выход вируса/вирусного антигена можно получить около 6 μг /мл.
Пример 6. Вирус гриппа, продуцируемый стандартной клеточной биомассой и биомассой клеточных агрегатов.
Штаммы гриппа, перечисленные в приведенной ниже таблице 4, были использованы как для инфицирования стандартной клеточной культуры, так и для биомассы клеточных агрегатов. Биомассу клеточных агрегатов получали как раскрыто в USSN 07/854, 630, PCT применение WO 91/09937. 30 г биомассы суспендировали в 1 л культуральной среды и инфицировали вирусом гриппа (1•105 pfu (plaque forming unit бляшкообразующая единица на мг биомассы). Размножение вируса имело место при 37oC, клетки хранили в суспензии при равномерном перемешивании. Через 4 дня вируссодержащую среду собирали и определяли HA-титр, полученный для различных штаммов гриппа, продуцируемых стандартной клеточной культурой и биомассой клеточных агрегатов. Таким образом, можно видеть, что использование биомассы клеточных агрегатов согласно настоящему изобретению увеличивает выход большинства штаммов, в то время как выходы вирусных штаммов, выращенных в стандартной клеточной культуре, не отличаются от выходов, получаемых при культивировании клеток другими способами.
Пример 7. Вирус простого герпеса (HSV), продуцируемый стандартной клеточной культурой и биомассой клеточных агрегатов.
Суспензия культуры биомассы клеточных агрегатов, имеющих диаметр от 100 до 1000 мкм, как раскрыто в USSN 07/854, 630 и стандартная клеточная культура, были испытаны для производства HSV вируса/вирусного антигена.
30 г биомассы суспендировали в 1 л культуральной среды и инфицировали HSV (1•105 pfu на мг биомассы). Инфицированную культуру инкубировали в течение 72 ч. В течение этого времени ежедневно культуру анализировали. Величину pH и содержание глюкозы в среде поддерживали постоянными.
Накопление вирусного антигена при помощи ферментного иммуносорбентного теста (Elisa) и при помощи вирусного титрования. Elisa для определения HSV-вируса представляет собой: набор Elisa для вируса простого герпеса (Dakopatts) модифицированный для применения в полуколичественном анализе. Антигены определяли при помощи HSV-1 специфичного кроличьего иммуноглобулина, связанного с пероксидазой. Elisa-единицы (EU) определяли согласно разбавлению стандартного препарата BLV 81, содержащей 16 EU/мл в этой системе. Одну Elisa-единицу определяли как эквивалент максимального разбавления, которое дает поглощение при 492 нм больше, чем 0,1 и по меньшей мере двукратно превышает негативный контроль. Вирусный титр определяли как описано Reed и Muench. В таблице 5 сравниваются титры, полученные при помощи биомассы клеточных агрегатов и стандартной клеточной культуры. Титровое количество антигена, полученное из биомассы клеточных агрегатов, составляло около 2,8•105 единиц и HSV-титр 4,4 • 109 в 100 мл культуры.
В таблице 4 сравнивается выход HA-антигена, полученного для различных штаммов гриппа A и B при помощи стандартной клеточной культуры и биомассы клеточных агрегатов.
Claims (6)
1. Способ выращивания вирусов, предусматривающий инфицирование посевным вируссодержащим материалом клеточной культуры куриных эмбрионов, суспендирование ее в питательной среде с последующим культивированием и выделением вирусов, отличающийся тем, что в качестве клеточной культуры куриных эмбрионов используют биомассу, состоящую из клеточных агрегатов куриных эмбрионов размером 100 1000 мкм, которую после инфицирования вируссодержащим материалом культивируют в питательной среде при содержании кислорода не менее 0,01 ммоль/л, преимущественно 0,006 ммоль/л.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточные агрегаты получают посредством механической или ферментативной обработки куриных эмбрионов.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что скорость переноса содержащегося в питательной среде кислорода устанавливают на уровне 1,60 ммоль О2 • 1л-1•1ч-1 2,40 ммоль О2 •1л-1•1ч-1, преимущественно 1,65 2,40 ммоль О2•1л-1•1ч-1.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование проводят при исходной концентрации биомассы, равной 10 30 мг на 1 мл питательной среды.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование проводят при исходной метаболической активности биомассы, измеренной по потреблению глюкозы, равной 3 5 мг глюкозы на 1 г биомассы в 1 ч.
6. Способ по пп. 3 и 4, отличающийся тем, что при скорости переноса кислорода в питательной среде, равной 1,65 ммоль O2 •1л-1•1ч-1 концентрацию биомассы в питательной среде устанавливают на уровне 30 мг на 1 мл среды.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT18/90A AT393277B (de) | 1990-01-04 | 1990-01-04 | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
| ATA18/90 | 1990-01-04 | ||
| PCT/AT1991/000003 WO1991009937A1 (de) | 1990-01-04 | 1991-01-03 | Biomasse zur produktion von virus/virusantigen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2099419C1 true RU2099419C1 (ru) | 1997-12-20 |
Family
ID=3479351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU925052917A RU2099419C1 (ru) | 1990-01-04 | 1991-01-03 | Способ выращивания вирусов |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5391491A (ru) |
| EP (1) | EP0509008B1 (ru) |
| JP (1) | JP2633392B2 (ru) |
| AT (2) | AT393277B (ru) |
| CA (1) | CA2073168C (ru) |
| CZ (1) | CZ279725B6 (ru) |
| DE (1) | DE59103696D1 (ru) |
| DK (1) | DK0509008T3 (ru) |
| ES (1) | ES2067921T3 (ru) |
| FI (1) | FI106241B (ru) |
| HR (1) | HRP921353A2 (ru) |
| HU (1) | HU212597B (ru) |
| NO (1) | NO310472B1 (ru) |
| RU (1) | RU2099419C1 (ru) |
| SK (1) | SK279200B6 (ru) |
| WO (1) | WO1991009937A1 (ru) |
| YU (1) | YU391A (ru) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5719051A (en) * | 1989-12-22 | 1998-02-17 | Immuno Aktiengesellschaft | Perfusion system and a method for the large scale production of virus or virus antigen |
| AT393277B (de) * | 1990-01-04 | 1991-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
| US5753489A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-19 | Immuno Ag | Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture |
| ATE429246T1 (de) | 1994-11-10 | 2009-05-15 | Baxter Healthcare Sa | Verfahren zur herstellung von biologischen produkten in protein-freiem kultur |
| US5698433A (en) * | 1994-11-10 | 1997-12-16 | Immuno Ag | Method for producing influenza virus and vaccine |
| US6146873A (en) * | 1994-11-10 | 2000-11-14 | Baxter Aktiengesellschaft | Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media |
| US5756341A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-26 | Immuno Ag | Method for controlling the infectivity of viruses |
| DE19612966B4 (de) | 1996-04-01 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg | MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren |
| BR9804283B1 (pt) * | 1998-03-18 | 2010-11-30 | processo para a produção de flavivìrus em baixa densidade de células em cultura e processo para a produção de flavivìrus recombinante em baixa densidade de células em cultura. | |
| US7445924B2 (en) * | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| DE10144906B4 (de) | 2001-09-12 | 2013-11-28 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh | Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen |
| US20040023358A1 (en) * | 2001-12-21 | 2004-02-05 | Wyeth | Avian embryo particulate biomass for the production of virus antigens |
| EP1434858B2 (en) * | 2002-09-05 | 2018-12-19 | Bavarian Nordic A/S | Method for the amplification of a poxvirus under serum free conditions |
| US7998488B2 (en) * | 2008-11-14 | 2011-08-16 | Baxter International Inc. | Vaccine formulations and uses thereof |
| EP2618840A2 (en) | 2010-09-23 | 2013-07-31 | Baxter International Inc. | Recombinant viral vectors and methods for inducing an immune response to yellow fever virus |
| CN103458922B (zh) | 2011-01-31 | 2017-10-03 | 纳米医疗公司 | 诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的重组病毒载体和方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4059485A (en) * | 1976-11-03 | 1977-11-22 | Monsanto Company | Adaptation of cell lines to suspension culture |
| US4195130A (en) * | 1978-04-20 | 1980-03-25 | Cornell Research Foundation, Inc. | Propagation of feline infectious peritonitis virus in tissue cultures |
| AT358167B (de) * | 1978-12-22 | 1980-08-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- -meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)- -vakzinen |
| US4335215A (en) * | 1980-08-27 | 1982-06-15 | Monsanto Company | Method of growing anchorage-dependent cells |
| AT393277B (de) * | 1990-01-04 | 1991-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
| US5114855A (en) * | 1990-04-19 | 1992-05-19 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for aggregating cells with small microspheres |
-
1990
- 1990-01-04 AT AT18/90A patent/AT393277B/de not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-03 DE DE59103696T patent/DE59103696D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-03 HU HU9202127A patent/HU212597B/hu unknown
- 1991-01-03 JP JP50199791A patent/JP2633392B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-03 US US07/854,630 patent/US5391491A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 DK DK91901647T patent/DK0509008T3/da active
- 1991-01-03 YU YU391A patent/YU391A/sh unknown
- 1991-01-03 AT AT91901647T patent/ATE114713T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-03 WO PCT/AT1991/000003 patent/WO1991009937A1/de active IP Right Grant
- 1991-01-03 EP EP19910901647 patent/EP0509008B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 RU SU925052917A patent/RU2099419C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-01-03 CA CA 2073168 patent/CA2073168C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 ES ES91901647T patent/ES2067921T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-04 CZ CS9112A patent/CZ279725B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-01-04 SK SK12-91A patent/SK279200B6/sk not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-07-02 NO NO19922622A patent/NO310472B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-07-03 FI FI923099A patent/FI106241B/fi active
- 1992-11-25 HR HRP921353 patent/HRP921353A2/xx not_active Application Discontinuation
-
1994
- 1994-12-01 US US08/352,077 patent/US5550051A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| АТ, патент, 358167, кл. A 61 K 39/12, 1980. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AT393277B (de) | 1991-09-25 |
| JPH05503843A (ja) | 1993-06-24 |
| FI923099A0 (fi) | 1992-07-03 |
| ATA1890A (de) | 1991-02-15 |
| CS9100012A2 (en) | 1991-08-13 |
| SK279200B6 (sk) | 1998-07-08 |
| NO310472B1 (no) | 2001-07-09 |
| EP0509008A1 (de) | 1992-10-21 |
| NO922622L (no) | 1992-07-23 |
| CA2073168C (en) | 1999-04-27 |
| EP0509008B1 (de) | 1994-11-30 |
| NO922622D0 (no) | 1992-07-02 |
| ES2067921T3 (es) | 1995-04-01 |
| DE59103696D1 (de) | 1995-01-12 |
| FI923099A (fi) | 1992-07-03 |
| US5550051A (en) | 1996-08-27 |
| CA2073168A1 (en) | 1991-07-05 |
| CZ279725B6 (cs) | 1995-06-14 |
| HU212597B (en) | 1996-08-29 |
| HUT64583A (en) | 1994-01-28 |
| HRP921353A2 (en) | 1995-10-31 |
| US5391491A (en) | 1995-02-21 |
| WO1991009937A1 (de) | 1991-07-11 |
| ATE114713T1 (de) | 1994-12-15 |
| FI106241B (fi) | 2000-12-29 |
| YU391A (sh) | 1994-04-05 |
| DK0509008T3 (da) | 1995-04-18 |
| JP2633392B2 (ja) | 1997-07-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2099419C1 (ru) | Способ выращивания вирусов | |
| JP5264843B2 (ja) | 細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製の方法、および本方法によって入手可能なインフルエンザウイルス | |
| Bratbak et al. | Viral control of Emiliania huxleyi blooms? | |
| JP4243349B2 (ja) | インフルエンザウイルスの複製のための動物細胞および方法 | |
| US6168944B1 (en) | Methods for cultivating cells and propagating viruses | |
| JP2008067720A (ja) | 細胞培養およびウイルス増殖のための方法 | |
| US6146891A (en) | Methods for cultivating cells and propagating viruses | |
| JP5096920B2 (ja) | ウイルス物質の製造方法 | |
| Danner et al. | In vitro studies on Borna virus: I. The use of cell cultures for the demonstration, titration and production of Borna virus | |
| US3935066A (en) | Cell lines | |
| RU2082757C1 (ru) | Субстрат для культивирования флавивирусов или ареновирусов на основе культуры клеток и способ получения антигена флавивируса или ареновируса | |
| US5719051A (en) | Perfusion system and a method for the large scale production of virus or virus antigen | |
| RU2142816C1 (ru) | Способ получения антигерпетической вакцины и лекарственная форма на ее основе | |
| Shibley et al. | New method for large-scale growth; and concentration of the Epstein-Barr viruses | |
| RU2082432C1 (ru) | Способ получения вакцины против клещевого энцефалита | |
| CN1239696C (zh) | 牙鲆淋巴囊肿病毒毒株及其制备方法和应用 | |
| JPS5825645B2 (ja) | 細胞培養系の製造方法 | |
| WO2011047900A2 (en) | Novel process | |
| GB2082202A (en) | Method of increasing virus yield | |
| NO751303L (ru) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100104 |