FI106241B - Biomassa virus/virusantigeenin tuottamiseksi - Google Patents
Biomassa virus/virusantigeenin tuottamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI106241B FI106241B FI923099A FI923099A FI106241B FI 106241 B FI106241 B FI 106241B FI 923099 A FI923099 A FI 923099A FI 923099 A FI923099 A FI 923099A FI 106241 B FI106241 B FI 106241B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- virus
- biomass
- cell
- mmol
- antigen
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 54
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 46
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 46
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 52
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 16
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 3
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 claims description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 claims description 2
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 claims description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 3
- 230000000712 assembly Effects 0.000 claims 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 claims 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 37
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004578 fetal growth Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
106241
Biomassa virus/virusantigeenin tuottamiseksi
Keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaista biomassaa ja vaatimuksen 7 johdannon mukaista menetelmää 5 virus/virusantigeenin tuottamiseksi.
Tunnetaan menetelmiä virus/virus-antigeenin tuottamiseksi. Lähtöaineina ovat usein niin kutsutut primaarisoluviljelmät, jotka saadaan ihmisen tai eläimen kudoksista. Nämä primaari-10 solut infektoidaan viruksella ("siemenviruksella II) ja virusantigeeni muodostetaan viruksen lisääntymisen kautta.
Eräs menetelmä esimerkiksi varhaiskesämeningoenkefaliitti-viruksen (FSME-virus) lisäämiseksi on esitetty julkaisussa 15 AT-B 358.176: kanan sikiösoluja suspendoidaan soluviljely-alustaan, infektoidaan viruksella ja käytetään biomassana FSME-virusantigeenin tuottamiseksi. Tätä varten biomassa pidetään suspensiossa aerobisissa olosuhteissa 25- 38°C:n lämpötilassa yhden - viiden päivän ajan. Sitten solut ja 20 solujen osat erotetaan sentrifugoimalla, saatu virussuspen-sio inaktivoidaan formaliinin tai β-propiolaktonin avulla ja virusantigeeni konsentroidaan ultrasuodattamalla, puhdistetaan ja käsitellään edelleen tavanomaisella tavalla rokotteiksi .
25
Primaarisoluviljelmien tavanomaisissa valmisteissa pannaan paljon arvoa etenkin sille, että saadaan yksittäissoluja tai mahdollisimman pieniä solusidoksia. Tämän aikaansaamiseksi kudos on hienonnettava mahdollisimman voimakkaasti mekaani-30 sesti ja entsymaattisesti. Käsittely johtaa kuitenkin samanaikaisesti myös useiden solujen kuolemiseen. Jos tällaisia soluvalmisteita siirretään sopivien kantomateriaalien pintaan, kuolleet solut jäävät supernatanttiin ja ne voidaan poistaa. Käytettäessä tällaisia soluvalmisteita suspensio-35 viljelmissä FSME-virusantigeenien valmistamiseksi ei ole kuitenkaan mahdollista erottaa eläviä soluja kuolleista tai vast, vahingoittuneista soluista. Solujen aikaa myöten ta-’· pahtuva lyysi johtaa jatkossa alustassa soluproteiinien suu- 2 106241 reen epäpuhtauteen, mikä voidaan erottaa vaikeasti halutusta tuotteesta.
Virus/virusantigeeni-valmistuksen jäljennettävyys on myös 5 vähäinen käytettäessä yksittäissoluja tai pieniä soluaggre-gaatteja suspensiossa, koska solut vahingoittuvat voimakkaasti esim. sekoituksen yhteydessä esiintyvien leikkaus-voimien johdosta.
10 Keksinnön tehtävänä on poistaa nämä haitat ja siten saada aikaan biomassa virus/virusantigeenin tuottamiseksi, joka biomassa kehittää viljelyssä virus/virusantigeenin korkean tuotantokapasiteetin, on yksinkertainen käsitellä ja jota voidaan käyttää suurteknisessä mittakaavassa virus/virus-15 antigeenin tuottamiseksi, jolloin virus/virusantigeeni voidaan ottaa talteen viljelyalustasta erittäin puhtaana.
Keksinnön mukainen biomassa, joka vastaa mainittuja vaatimuksia, koostuu soluaggregaateista, joiden läpimitta on 20 100 μΐ,πι - 1000 μΐ,ιη, ja on infektoitu viruksella.
Keksinnön mukaiselle biomassalle on tunnusomaista se, mikä on esitetty vaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa, ja menetelmälle se, mikä on esitetty vaatimuksen 7 tunnusmerkkiosassa. 25 ; Keksinnön mukaisen biomassan soluaggregaatit voidaan saada käsittelemällä mekaanisesti ja entsymaattisesti ihmisen tai eläimen kudosta, jolloin mekaanisesti hajotettu kudos voidaan hienontaa edelleen solusidosten hajottamiseksi edelleen 30 proteaasilla, kuten trypsiinillä, kymotrypsiinillä tai elastaasilla soluaggregaattien haluttuun kokoon.
«« « ·
Keksinnön mukaisen biomassan soluaggregaatit voidaan kuitenkin saada myös ihmisen tai eläimen yksittäissoluista 35 siten, että nämä käsitellään soluja aggregoivilla aineilla, kuten agglutiniinilla.
3 106241
Soluaggregaattien ja yksittäissolujen erotus, joiden läpimitta on yli 1000 μπι tai vast, alle 100 μιη, voidaan suorittaa seulomalla tai etenkin sedimentoimalla. Sedimentointi on seulontaan verrattuna yksinkertaisempi suorittaa, koska ' 5 seulat, joiden huokoskoko on 100 μπι, tukkeutuvat hyvin helposti. Edelleen sedimentointi voidaan suorittaa ilman panoksellisia ja kalliita separaattoreita ja se tarjoaa myös steriiliteknisiä etuja. On osoittautunut, että soluag-gregaatit, joiden läpimitta on 100 μιη - 1000 μπ», sedimen- 10 toituvat nopeudella, joka on yli 1 cm/min., kun taas pienemmät soluaggregaatit sedimentoituvat nopeudella, joka on alle 1 cm/min. Hiukkasten erottaminen, joiden koko on alle 1000 μιη, voidaan suorittaa yksinkertaisesti seuloilla, koska tässä tukkeutumisvaara on vähäinen.
15
Keksinnön mukaisen biomassan eräs edullinen suoritusmuoto on tunnettu siitä, että sillä on viljelyalustaan suspen-doidussa tilassa korkea metabolinen aktiivisuus; glukoosin kulutuksesta mitattuna metabolinen aktiivisuus on tuntia 20 kohden 3 - 5 mg glukoosia/g biomassaa.
Keksinnön mukaisen biomassan valmistamiseksi käytetyillä soluaggregaateilla on edelleen se etu, että ne tuottavat jo infektoitaessa suhteellisen pienellä siemenviruksen määräl-V 25 lä suuria määriä virusantigeenia. On osoittautunut, että soluaggregaattien infektoimiseksi, jotka ovat alle 100 μπι tai yli 1000 μπι, on käytettävä olennaisesti enemmän siemen-virusta virus/virusantigeenin saman määrän tuottamiseksi.
30 Virus/virusantigeenin tuotantoa voidaan parantaa edelleen, % · jos keksinnön mukainen biomassa pidetään viljelyalustassa vähintään 0,01 mmoolia/l:n, etenkin vähintään 0,06 mmoo-* lia/l:n happikonsentraatiossa.
35 Edullisesti viljelyalustan soluaggregaattien konsentraatio on vähintään 10 mg soluaggregaatteja/ml.
4 106241
Keksinnön mukainen biomassa soveltuu erittäin hyvin var-haiskesä-meningoenkefaliitti-virus (FSM-virus)/virusanti-geenin tuottamiseksi, kun se koostuu linnun sikiösolujen, etenkin kanan sikiösolujen soluaggregaateista, jolloin 5 virus/virusantigeenin tuotantotehoa parannetaan edelleen, jos viljelyalustaan säädetään hapensiirtonopeudeksi yli 1,60 mmoolia 02 Γ1 h1, etenkin 1,65 - 2,40 mmoolia 02 Γ1 h1.
Hapensiirtonopeus (oxygen transfer rate, OTR), joka ilmais-10 taan mmoolia 02 l'1 h1, on tunnetusti mitta hapen tuottamiselle soluviljelmään. Hapenvastaanottonopeus (oxygen uptake rate, OUR) on puolestaan mittana solun metaboliselle suorituskyvylle yleensä ja siten välillisesti solun virus/virusantigeenin synteesikapasiteetille.
15
Kaikissa nykyään tunnetuissa menetelmissä FSME-virusanti-geenin tuottamiseksi virus-antigeenin spesifinen tuotantokapasiteetti on rajoitettu, koska infektoituneiden solujen suurien määrien esiintyessä soluviljelmässä sen pH-arvo voi 20 laskea ja siten voi tapahtua virustitterin ei-toivottu inaktivoituminen ja virusantigeenin tuhoutuminen.
Nyt on havaittu, että tällaisen voimakkaasti ilmastetun viljelmän pH-arvo ei laske ja että virus/virusantigeenin 25 vakiosuuruinen ja korkea tuotantokapasiteetti voidaan säilyttää, jos viljelynesteeseen voidaan tuottaa riittäviä määriä happea, esim. sekoittamalla tai staattisen ja/tai dynaamisen kaasunjakajan avulla.
30 Mittaukset ovat osoittaneet, että viljelmässä, jonka solu-; tiheys on 2 x 107 solua/ml ja joka on yksinomaan pintansa ' kautta yhteydessä happiatmosfääriin, FSME-tuotanto vähenee voimakkaasti suuremmassa mittakaavassa. Jos happea sitä vastoin tuodaan aktiivisesti viljelmään, niin antigeeni-35 saantoa voidaan lisätä voimakkaasti.
5 106241
Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritusmuodossa hapensiirtonopeudeksi säädetään yli 1,65 mmoolia 02 Γ1 h'1, etenkin 1,65 - 2,40 mmoolia 02 l*1 h'1, jolloin kostean solumassan määrä on parhaiten maksimaalisesti 30 g/1 5 viljelyalustaa.
Kokeet ovat osoittaneet, että FSME-virus/virusantigeenituo-tanto on verrannollinen keksinnön mukaisesti käytettyjen soluaggregaattien konsentraatioon. Keksinnön mukainen mene- 10 telmä voidaan tehdä myös soluaggregaattikonsentraatiossa, joka on alle 10 mg/ml. Sitä vastoin on todettu, että vil-jeltäessä infektoituja yksittäissoluja tarvitaan ehdottomasti 10 mg/ml:n vähimmäiskonsentraatio virus/virusanti-geenituotantoa varten.
15
Primaariviljelyn infektoimiseksi tarvittavat korkeat sie-menvirustitterit saadaan aikaan tavanomaisesti ainoastaan lisäämällä virusta hiiren aivoissa. Sen johdosta, että soluaggregaatit voidaan infektoida keksinnön mukaisesti 20 olennaisesti pienemmällä virusmäärällä, voidaan biomassan infektoimiseksi tarvittava siemenvirus saada myös soluvil-jelmäsupernatanteista. Tämä vähentää merkittävästi saastu-mismahdollisuutta hiiren aivoproteiinilla.
·. 25 Edelleen on osoittautunut, että keksinnön mukainen biomassa, joka koostuu linnun sikiösolujen soluaggregaateista, soveltuu samoin influenssa-, vaccinia- tai avipox-virusan-tigeenin tuotantoon.
30 Keksintöä selitetään lähemmin seuraavien suoritusesimerkki- : en avulla.
' Esimerkki 1: Soluaggregaattikoon vaikutus antigeenisaantoon 35 SPC-(specifie pathogen free)-kananmunia haudottiin 12 päi vän ajan 37°C:ssa, tarkastettiin liukulaitteella tapahtu- 6 106241 neen sikiökasvun suhteen, desinfioitiin alkoholilla ja avattiin steriilissä laatikossa. Sikiöt poistettiin, pestiin ja hienonnettiin karkeasti leikkuulaitteella. Tämän jälkeen suoritettiin sikiökudoksen entsymaattinen sulatus 5 lisäämällä proteolyyttisiä entsyymejä (1 mg/sikiö) 37°C:ssa 20 minuutin ajan. Tästä kudossuspensiosta erotettiin kudos-kappaleita 1000 Mm seulalla, jossa oli vastaava silmukkakoko alle 1000 Mm. Näiden soluaggregaattien edelleenhajotus voitiin saada aikaan sedimentointimenetelmällä, jolloin 10 erotuskriteeriksi valittiin sedimentointinopeus alle l cm/min. Tätä varten solususpensio pumpattiin 1 cm:n/min. virtausnopeudella alhaalta ylöspäin sedimentointiastian läpi. Yksittäissolut tai vast, pienet soluaggregaatit jäivät suspensioon, kun taas suuremmat solusidokset laskeu-15 tuivat astian pohjalle. Erilaisia huokoskokoja omaavilla seuloilla suoritetut tutkimukset osoittivat, että näissä olosuhteissa laskeutuvien solusidosten kokojakautuma oli < 1000 μτα, > 100 Mm. Suspensioon jäävien solusidosten koko oli siten < 100 μη.
20 Tällä tavalla saatiin soluaggregaattien kolme farktiota 1. < 100 μτα 2. > 1000 μτα -.25 3. < 1000 μτα > 100 μτα.
Näistä fraktioista kulloinkin samat biomassa-konsentraatiot (30 g/1) suspendoitiin viljelyalustaan (Med 199) ja infek-toitiin FSME-viruksella (1 x 105 pfu/mg biomassaa). Viruk-30 sen lisääminen tapahtui 37°C:ssa, jolloin solut pidettiin : suspensiossa sekoittamalla tasaisesti. Neljän päivän kulut tua muodostunut virusantigeenimäärä määritettiin ELISAlla.
ψ
Fraktiossa 1 (soluaggregaatit alle 100 μτα) virus/virusanti-3 5 geeni-tuotanto oli 4,9 μq/τalf fraktiossa 2 (soluaggregaatit yli 1000 μτα) oli virus/virusantigeeni-tuotanto 4,7 μ^/ταί, 106241 7 keksinnön mukaisesti käytetyssä fraktiossa virus/virusanti-geeni-tuotanto oli 9,3 μg/ml.
Esimerkki 2: 5
Soluaggregaattikoon vaikutus saastumiseen CEC-(chick embryo cell)-proteiinilla
Esimerkissä 1 saatuja fraktioiden l ja 3 viljelyalustoja 10 tutkittiin kahden päivän kuluttua viljelyn aloittamista niiden CEC-proteiinin pitoisuuden suhteen. Fraktion 1 vil-jelyalusta sisälsi 1,80 mg CEC-proteiinia/ml, kun taas fraktion 3 viljelyalustassa todettiin ainoastaan 0,84 mg CEC-proteiinia/ml.
15
Esimerkki 3:
Siemenviruksen määrän vaikutus virus/antigeenituotantoon 20 Viljeltiin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla biomassoja, joissa oli fraktioiden 1 ja 3 soluaggregaattikoot, ja määritettiin virus/antigeeni-tuotanto, jolloin fraktiota kohden käytettiin infektointia varten neljä erisuuruista sie-menvirusmäärää (3,2xl03 pfu, lxlO4 pfu, 3,2xl04 pfu ja lxlO5 25 pfu kulloinkin biomassan mg:aa kohden). Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 1, josta nähdään, että keksinnön mukaisesti käytetyssä fraktiossa 3 on samassa siemenvirus-määrässä olennaisesti suurempi virus/virusantigeenin tuotto.
\ J
« 8 106241
Taulukko l
Siemenviruksen määrä Virus/virusantigeeni-saanto infektointia varten (jug/ml) 5 (pfu/mg biomassaa) Fraktio 1 Fraktio 3 3.2 x 103 pfu 2,0 Mg/ml 8,8 /xg/ml 1 x 104 pfu 3,2 Mg/ml 10,3 Mg/ml 3.2 x 104 pfu 5,0 Mg/ml 11,0 /xg/ml 1 x 105 pfu 5,0 Mg/ml 11,0 Mg/ml 10
Esimerkki 4:
Happikonsentraation vaikutus antigeeni-tuotantoon 15 Esimerkissä 1 esitettyjen olosuhteiden mukaisesti keksinnön mukaista biomassaa viljeltiin eri happikonsentraatioissa viljelyalustassa ja määritettiin virus/virusantigeenin määrä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 2, jolloin virus/virusantigeenin saannoksi laskettiin 100 % 0,06 20 mmoolia/l:n happikonsentraatiossa.
Taulukko 2
Happikonsentraatio Virus/virusantigeenin saanto 25 0,06 mmoolia/1 100 % 0,02 mmoolia/1 90 % 0,004 mmoolia/1 35 % 0 10 % 30 Esimerkki 5:
Happisiirron vaikutus virus/antigeenisaantoon
Biomassa, jossa oli fraktion 3 soluaggregaatteja, infektoi- 35 tiin viruksella esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, viljel tiin erisuuruisissa viljelyastioissa ja kaasutettiin ilmal- 9 106241 la erilaisten OTR-arvojen saamiseksi. Suspensio pidettiin 4 päivän ajan 33°C - 37°C:n lämpötilassa ja määritettiin virus/antigeeni-saanto. (Ks. taulukko 3).
’ 5 Taulukko 3
Viljelyastia Työtilavuus OTR Virus/antigeeni- saanto 0,5 l:n kehrääjä 0,1 2,38 5,9 10 (teknekehrääjä) 0,3 0,795 0,97 2 l:n kehrääjä 0,3 1,65 2,0 (teknekehrääjä) 1,0 0,49 0,32 15 10 l:n sekoituspullo (sekoitinpituus 5,5 3,0 0,41 0,38 cm, 150 - 160 rpm) 50 l:n sekoituspullo 20 (sekoitinpituus 15 18 1,10 0,97 cm, 80 - 90 rpm) 30 0,87 0,22
Työtilavuus: litraa, OTR: mmoolia 02 Γ1 h'1, virus/virus antigeeni-saanto: Mg/ml (määritetty ELISAlla).
. 25
Taulukossa 3 esitetyistä tuloksista voidaan johtaa, että OTR:n ollessa yli 2 voidaan saada virus/antigeeni-saantoja, jotka ovat n. 6 μg/ml.
» · 9
Claims (12)
1. Biomassa virus/virusantigeenin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että biomassa koostuu soluaggregaateista, 5 joiden läpimitta on 100 μπι - 1000 μπι, ja se on infektoitu viruksella.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen biomassa, tunnet -t u siitä, että soluaggregaatit saadaan käsittelemällä melo kaanisesti ja entsymaattisesti eläimen kudos.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen biomassa, tunnet -t u siitä, että soluaggregaatit saadaan eläimen yksittäissoluista käsittelemällä soluja aggregoivilla 15 aineilla.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen biomassa, tunnet-t u siitä, että viljelyalustaan suspendoidun biomassan metabolinen aktiivisuus mitattuna glukoosin kulutuksesta on 20 tuntia kohden 3 - 5 mg glukoosia/g biomassaa.
5. Menetelmä virus/virusantigeenin tuottamiseksi käyttämällä yhden tai useamman edellä olevan patenttivaatimuksen 1 -4 mukaista biomassaa, tunnettu siitä, että se 25 tehdään viljelyalustassa vähintään 0,01 mmoolia/l:n, eten kin vähintään 0,06 mmoolia/l:n happikonsentraatiossa.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että se tehdään viljelyalustassa, jossa on : 30 vähintään 10 mg soluaggregaattia ml:aa kohden.
7. Menetelmä varhaiskesä-meningoenkefaliittivirus (FSME-vi- r rus)/virusantigeenin tuottamiseksi patenttivaatimuksen 5 menetelmän mukaisesti tunnettu siitä, että käyte- 35 tään biomassaa, joka koostuu linnun sikiösolujen, etenkin kanan sikiösolujen soluaggregaateista. il 106241
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että viljelyalustaan säädetään hapensiir-tonopeudeksi yli 1,60 mmoolia 02 l’1 h'1, etenkin 1,65 - 2,40 5 mmoolia 02 l'1 h'1.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että hapensiirtonopeuden ollessa 1,65 mmoolia 02 l'1 h"1 biomassaksi säädetään maksimaalisesti 30 g/1 vil- 10 jelyalustaa.
10. Menetelmä influenssa-, vaccinia- tai avipox-vi-rus/virusantigeenin tuottamiseksi patenttivaatimuksen 5 mukaisesti, tunnettu siitä, että käytetään biomas- 15 saa, joka koostuu linnun sikiösolujen soluaggregaateista.
10 106241
11. Soluaggregaattien käyttö, joiden läpimitta on 100 pm -1000 pm, patenttivaatimuksen 1 mukaisen biomassan valmista- .. miseksi.
» · « 12 106241
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT1890 | 1990-01-04 | ||
| AT18/90A AT393277B (de) | 1990-01-04 | 1990-01-04 | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
| AT9100003 | 1991-01-03 | ||
| PCT/AT1991/000003 WO1991009937A1 (de) | 1990-01-04 | 1991-01-03 | Biomasse zur produktion von virus/virusantigen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI923099A FI923099A (fi) | 1992-07-03 |
| FI923099A0 FI923099A0 (fi) | 1992-07-03 |
| FI106241B true FI106241B (fi) | 2000-12-29 |
Family
ID=3479351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI923099A FI106241B (fi) | 1990-01-04 | 1992-07-03 | Biomassa virus/virusantigeenin tuottamiseksi |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5391491A (fi) |
| EP (1) | EP0509008B1 (fi) |
| JP (1) | JP2633392B2 (fi) |
| AT (2) | AT393277B (fi) |
| CA (1) | CA2073168C (fi) |
| CZ (1) | CZ279725B6 (fi) |
| DE (1) | DE59103696D1 (fi) |
| DK (1) | DK0509008T3 (fi) |
| ES (1) | ES2067921T3 (fi) |
| FI (1) | FI106241B (fi) |
| HR (1) | HRP921353A2 (fi) |
| HU (1) | HU212597B (fi) |
| NO (1) | NO310472B1 (fi) |
| RU (1) | RU2099419C1 (fi) |
| SK (1) | SK279200B6 (fi) |
| WO (1) | WO1991009937A1 (fi) |
| YU (1) | YU391A (fi) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5719051A (en) * | 1989-12-22 | 1998-02-17 | Immuno Aktiengesellschaft | Perfusion system and a method for the large scale production of virus or virus antigen |
| AT393277B (de) * | 1990-01-04 | 1991-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
| US6146873A (en) * | 1994-11-10 | 2000-11-14 | Baxter Aktiengesellschaft | Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media |
| EP2290053A1 (en) | 1994-11-10 | 2011-03-02 | Baxter Healthcare S.A. | Method for producing Influenza virus in protein-free cell culture medium |
| US5753489A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-19 | Immuno Ag | Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture |
| US5698433A (en) * | 1994-11-10 | 1997-12-16 | Immuno Ag | Method for producing influenza virus and vaccine |
| US5756341A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-26 | Immuno Ag | Method for controlling the infectivity of viruses |
| DE19612966B4 (de) | 1996-04-01 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg | MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren |
| BR9804283B1 (pt) * | 1998-03-18 | 2010-11-30 | processo para a produção de flavivìrus em baixa densidade de células em cultura e processo para a produção de flavivìrus recombinante em baixa densidade de células em cultura. | |
| US7445924B2 (en) * | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| DE10144906B4 (de) | 2001-09-12 | 2013-11-28 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh | Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen |
| US20040023358A1 (en) * | 2001-12-21 | 2004-02-05 | Wyeth | Avian embryo particulate biomass for the production of virus antigens |
| NZ538575A (en) * | 2002-09-05 | 2007-03-30 | Bavarian Nordic As | Method for the amplification of a virus wherein primary avian cells are cultivated in a serum-free medium comprising growth factors and attachment factors |
| US7998488B2 (en) | 2008-11-14 | 2011-08-16 | Baxter International Inc. | Vaccine formulations and uses thereof |
| JP2013538577A (ja) | 2010-09-23 | 2013-10-17 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | 組み換えウイルスベクターおよび黄熱病ウイルスに対する免疫反応を惹起するための方法 |
| CN103458922B (zh) | 2011-01-31 | 2017-10-03 | 纳米医疗公司 | 诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的重组病毒载体和方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4059485A (en) * | 1976-11-03 | 1977-11-22 | Monsanto Company | Adaptation of cell lines to suspension culture |
| US4195130A (en) * | 1978-04-20 | 1980-03-25 | Cornell Research Foundation, Inc. | Propagation of feline infectious peritonitis virus in tissue cultures |
| AT358167B (de) * | 1978-12-22 | 1980-08-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- -meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)- -vakzinen |
| US4335215A (en) * | 1980-08-27 | 1982-06-15 | Monsanto Company | Method of growing anchorage-dependent cells |
| AT393277B (de) * | 1990-01-04 | 1991-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
| US5114855A (en) * | 1990-04-19 | 1992-05-19 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for aggregating cells with small microspheres |
-
1990
- 1990-01-04 AT AT18/90A patent/AT393277B/de not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-03 EP EP19910901647 patent/EP0509008B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 RU SU925052917A patent/RU2099419C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-01-03 DK DK91901647T patent/DK0509008T3/da active
- 1991-01-03 DE DE59103696T patent/DE59103696D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-03 AT AT91901647T patent/ATE114713T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-03 YU YU391A patent/YU391A/sh unknown
- 1991-01-03 US US07/854,630 patent/US5391491A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 JP JP50199791A patent/JP2633392B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-03 WO PCT/AT1991/000003 patent/WO1991009937A1/de active IP Right Grant
- 1991-01-03 CA CA 2073168 patent/CA2073168C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 ES ES91901647T patent/ES2067921T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 HU HU9202127A patent/HU212597B/hu unknown
- 1991-01-04 CZ CS9112A patent/CZ279725B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-01-04 SK SK12-91A patent/SK279200B6/sk not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-07-02 NO NO19922622A patent/NO310472B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-07-03 FI FI923099A patent/FI106241B/fi active
- 1992-11-25 HR HRP921353 patent/HRP921353A2/xx not_active Application Discontinuation
-
1994
- 1994-12-01 US US08/352,077 patent/US5550051A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO310472B1 (no) | 2001-07-09 |
| US5391491A (en) | 1995-02-21 |
| YU391A (sh) | 1994-04-05 |
| NO922622D0 (no) | 1992-07-02 |
| DE59103696D1 (de) | 1995-01-12 |
| SK279200B6 (sk) | 1998-07-08 |
| CZ279725B6 (cs) | 1995-06-14 |
| WO1991009937A1 (de) | 1991-07-11 |
| EP0509008A1 (de) | 1992-10-21 |
| AT393277B (de) | 1991-09-25 |
| FI923099A (fi) | 1992-07-03 |
| ES2067921T3 (es) | 1995-04-01 |
| CS9100012A2 (en) | 1991-08-13 |
| EP0509008B1 (de) | 1994-11-30 |
| HUT64583A (en) | 1994-01-28 |
| HRP921353A2 (en) | 1995-10-31 |
| FI923099A0 (fi) | 1992-07-03 |
| NO922622L (no) | 1992-07-23 |
| JPH05503843A (ja) | 1993-06-24 |
| RU2099419C1 (ru) | 1997-12-20 |
| DK0509008T3 (da) | 1995-04-18 |
| US5550051A (en) | 1996-08-27 |
| CA2073168C (en) | 1999-04-27 |
| ATE114713T1 (de) | 1994-12-15 |
| HU212597B (en) | 1996-08-29 |
| JP2633392B2 (ja) | 1997-07-23 |
| CA2073168A1 (en) | 1991-07-05 |
| ATA1890A (de) | 1991-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI106241B (fi) | Biomassa virus/virusantigeenin tuottamiseksi | |
| Bratbak et al. | Viral control of Emiliania huxleyi blooms? | |
| EP1427817B1 (de) | Vermehrung von viren in zellkultur | |
| JP6067560B2 (ja) | 無血清培養及び浮遊培養に適応されたｍｄｃｋ細胞株及び前記細胞を使用してワクチン用ウイルスを製造する方法 | |
| CN100335619C (zh) | 大规模生产病毒抗原的方法 | |
| JP2000507448A (ja) | インフルエンザウイルスの複製のための動物細胞および方法 | |
| KR20160096215A (ko) | 바이러스 항원 및 백신의 제조 방법 | |
| US6146891A (en) | Methods for cultivating cells and propagating viruses | |
| US7666654B2 (en) | Method for preparing viral material | |
| CN108546670A (zh) | 一种高粱原生质体的制备方法及制备的原生质体的转化方法 | |
| WO1998033886A1 (en) | Methods for cultivating cells and propagating viruses | |
| FI98377C (fi) | Adherentisti sitoutuneita soluja sisältävä matriisi ja menetelmä virus/virusantigeenin tuottamiseksi | |
| CN107858322B (zh) | 一种海马原代细胞培养体系的建立方法 | |
| Barreau et al. | An efficient and easy method of infection of mosquito larvae from virus-contaminated cell cultures | |
| KR101591729B1 (ko) | 박쥐나방 동충하초 균사체의 배양방법 및 그 배양방법으로 배양된 박쥐나방동충하초 균사체 | |
| CN103160477B (zh) | 一种提高乙型脑炎病毒效价的方法 | |
| Nikolay | Intensified yellow fever and Zika virus production in animal cell culture | |
| RU2082432C1 (ru) | Способ получения вакцины против клещевого энцефалита | |
| CN102327608A (zh) | 一种乙型脑炎疫苗的纯化方法 | |
| CN1513553B (zh) | Vero细胞森林脑炎灭活疫苗 | |
| RU2142816C1 (ru) | Способ получения антигерпетической вакцины и лекарственная форма на ее основе | |
| WO2012129872A1 (zh) | 一种生物制品及其制备方法 | |
| Vazeille-Falcoz et al. | Unusual morphology of a virus which produces carbon dioxide sensitivity in mosquitoes | |
| RU2221041C1 (ru) | ШТАММ Bacillus licheniformis БСТ-1-ПРОДУЦЕНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНАЗЫ | |
| RU2353649C2 (ru) | Способ культивирования лептоспир |