FI98377C - Adherentisti sitoutuneita soluja sisältävä matriisi ja menetelmä virus/virusantigeenin tuottamiseksi - Google Patents
Adherentisti sitoutuneita soluja sisältävä matriisi ja menetelmä virus/virusantigeenin tuottamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI98377C FI98377C FI922851A FI922851A FI98377C FI 98377 C FI98377 C FI 98377C FI 922851 A FI922851 A FI 922851A FI 922851 A FI922851 A FI 922851A FI 98377 C FI98377 C FI 98377C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- virus
- cells
- antigen
- matrix
- fsme
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 50
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 20
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title description 38
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 title description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims abstract description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 9
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract 4
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims abstract 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 5
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 7
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000010539 reproductive behavior Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2531/00—Microcarriers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
98377
Adherentisti sitoutuneita soluja sisältävä matriisi ja menetelmä virus/virusantigeenin tuottamiseksi
Keksintö koskee matriisia, johon on sidottu adherentisti 5 ihmisen tai eläimen soluja, sekä menetelmä virus/virusanti- geenin, etenkin Friihsommer-Meningoenzephalitis- (varhais-kesämeningoenkefaliitti-) (FSME)-virusantigeenin tuottamiseksi.
10 Euroopassa on havaittu 2. maailmansodasta lähtien infekti oita, joita aiheuttaa varhaiskesämeningoenkefaliitti-(FSME) virus. Itävallassa, Etelä-Saksassa ja Tsekkoslovakiassa käsitellään joka vuosi useita satoja potilaita stationaa-risesti FSME-infektioiden johdosta.
15 FSME-virus kuuluu flavivirusten heimoon, aikaisempaan arbo-virusten serologiseen ryhmään B, joka muodostaa virusheimon
Togaviridae suvun.
20 Ihmisen erästä tärkeintä ja useimmiten esiintyvää efikefa- liitin aiheuttajaa, japanilaista enkefaliitti-B-virusta vastaan on ollut jo pitkään olemassa inaktivoituja rokotteita. Nämä inaktivoidut rokotteet otetaan talteen infek-toitujen hiirien aivoista, puhdistetaan ja ne on todettu 25 turvallisiksi ja tehokkaiksi [Hoke et ai., N. Engl. J.
Med., 319, 608 (1988)].
Vuodesta 1976 alkaen on ollut käytössä rokote FSME:tä vastaan ja se on terveysviranomaisten hyväksymä. Tämän rokot-30 teen valmistamiseksi kasvatetaan virus infektoitujen Baby- hiirien aivoissa, sitä lisätään kanan alkiosoluissa, inak-tivoidaan formaliinilla ja alistetaan sitten tehokkaaseen puhdistusmenetelmään [Heinz et ai., J. Med. Virol., 6, 103 (1980)].
35
Kirjallisuudessa esitetään useita mahdollisuuksia arbovi-rusten lisäämiseksi mahdollisen rokotevalmistuksen suhteen. Nykyisin useimmiten käytetty menetelmä on kanan alkiofibro-blastien ymppääminen hiiren aivoista saadulla FSME-siemen-40 viruksella ja ympättyjen solujen viljely. Tämä menetelmä 2 98377 vaatii antigeenin panoksellista puhdistamista kompleksisen, heterologisen biologisen materiaalin poistamiseksi ja herkistävän vaikutuksen välttämiseksi rokotettavissa annettaessa toistuvasti tästä saatuja rokoteannoksia.
5
Kanan alkiosolujen valmistamiseksi on lähdettävä SPF (= specific pathogen free) - munista. Nämä munat on alistettava niiden SPF-tilan säilyttämiseksi ennen jokaista käyttöä useihin pitkäaikaisiin tutkimuksiin.
10
Edelleen kanan alkiosoluviljelyillä on ainoastaan pieniä li-sääntymislukuja edelleenkasvatuksessa, minkä johdosta erä-koolle on asetettu rajat, primaariviljelykasvatuksen vaikea steriilinä pitäminen, ei mitään primaarisolujen laadun sta-15 biiliutta viruslisäämisen ja antigeenituotannon suhteen.
Nämä haitat eivät johdu ainoastaan menetelmästä FSME-virus-antigeenin tuottamiseksi, vaan aivan yleisesti antigeenin valmistuksesta.
20
Keksinnön tehtävänä on parantaa virus/virusantigeenin, etenkin FSME-virus/virusantigeenin tuottamista siten, että yllä mainitut haitat poistetaan ja saadaan aikaan menetelmä virus/virusantigeenin kasvattamiseksi soluviljelyissä, joka 25 menetelmä mahdollistaa etenkin suurimittakaavaisen tuotan non, jolloin samanaikaisesti viljelmä voidaan pitää steriilinä yksinkertaisella tavalla. Edelleen tarkoituksena on minimoida ei-toivottujen soluproteiinien luovutus viljelysu-pernatanttiin.
30
Esitetyn tehtävän ratkaisemiseksi saadaan aikaan matriisi, s.o. kantomateriaali, johon on sidottu adherentisti ihmisen tai eläimen soluja, jolloin solut on infektoitu viruksella. Keksintö perustuu siihen havaintoon, että pintariippuvaiset 35 solut, jotka soveltuvat viruksen lisäämiseen, pysyvät jopa virusinfektoidussa tilassa sitoutuneena matriisiin, tuottavat suhteellisen pitkän ajan jatkuvasti virusantigeeniä ja 3 98377 luovuttavat sitä viljelyalustaan.
Infektoiduilla soluilla kuormitettua keksinnön mukaista matriisia on mahdollista säilyttää joitakin päiviä 0° -5 8°C:ssa, siis olosuhteissa, joissa solumetabolismi ja siten virustuotanto on tukahdutettu. Tällä tavoin säilytettyä matriisia voidaan käyttää jatkossa sijoittamalla se viljely-alustalle ja säätämällä kulloinkin kyseessä olevat viljely-olosuhteet virusantigeenin tuottamiseksi. Keksinnön mukainen 10 matriisi muodostaa siten lähtöviljelmän, joka voidaan tuot taa vakiolla laadulla ja aktiivisuudella varastoon, jonka tila on helposti tarkastettavissa steriiliyden suhteen ja jota voidaan käyttää aina virusantigeenituotantoon.
15 Antigeeniä tuottavien solujen sitominen kantoaineeseen mah dollistaa edelleen virusinfektoitujen ja tuotantovalmiiden solujen erittäin yksinkertaisen käsittelyn. Siten on esimerkiksi mahdollista suorittaa virus/virusantigeenituotanto jatkuvatoimisesti perfuusioreaktorissa. Solujen erottamista 20 antigeenipitoisesta alustasta helpottaa olennaisesti niiden sitominen matriisiin, minkä ansiosta keksinnön mukainen matriisi yksinkertaistaa virus/virusantigeenin tuotantoa suuressa mittakaavassa.
25 Eräs keksinnön mukaisen matriisin edullinen suoritusmuoto on sellainen, että adherentisti sidottuina soluna käytetään ve-rosoluja ATTC CCL 81, jotka on tarkoitettu etenkin varhais-kesä-meningoenkefaliitti-(FSME)-virus-antigeenin tuottamiseksi ja jotka on infektoitu FSME-viruksella.
30
Matriisiin adherentisti sidotut solut voi olla infektoitu kuitenkin myös flaviviruksella tai arenaviruksella.
»
Matriisin materiaaliksi on osoittautunut hyväksi lasi, ris-35 tisilloitettu dekstraani, gelatiini tai muovi, jolloin mat riisi on muodostettu parhaiten mikrokantoaineeksi (Microcar-rier) , jonka hiukkasläpimitta on edullisesti 100 μιη - 300 4 98377 μπι. Näissä mikrokantoaineissa voi olla sileä pinta tai huokoinen rakenne.
Eräs toinen keksinnön mukaisen matriisin tarkoituksenmukai-5 nen suoritusmuoto on tunnettu siitä, että sen pintaan cm2:ä kohden on sidottu 1 x 105 - 4 x 105 solua.
Keksintö koskee myös menetelmää varhaiskesämeningoenkefa-liitti-(FSME)-virus-antigeenin tuottamiseksi käyttämällä 10 keksinnön mukaista matriisia, jolle menetelmälle on ominais ta, että pintariippuvaiset pysyvät solut, etenkin veroso-lut ATTC CCL 81 ympätään FSME-viruksella ja solut pidetään seerumivapaassa alustassa säilyttämällä niiden elinkelpoisuus matriisissa adherentisti sidottuina antigeenimuodostuk-15 sen säilyttämiseksi ja antigeeniluovutuksen säilyttämiseksi alustaan, minkä jälkeen antigeenipitoinen alusta erotetaan kantoaineeseen sidotuista soluista ja käsitellään tunnetulla tavalla konsentroimalla, inaktivoimalla ja puhdistamalla ga-leenisesti hyväksyttäväksi valmisteeksi.
20
Verosolulinja ATTC CCL 81 saadaan vihreän marakatin (Cerco-pithecus aethiops) munuaiskudoksesta ja se voidaan pitää seerumivapaassa alustassa metabolisesti aktiivisena. Tällaista pysyvää solukantaa varten asetetaan kerran kantasie-25 mensolupankki ja työsiemensolupankki ja suoritetaan kaikki tutkimukset saastuttavien aineiden suhteen. Tätä pysyvää solukantaa ei voi pitää siten tarkasti karakterisoitavana ainoastaan saastuttavien mikro-organismien vapauden suhteen, vaan myös kasvukäyttäytymisen, viljelyn, lisääntymiskäyttäy-30 tymisen suhteen ja - kerran optimoituna - vakiona.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään edullisesti ve-rosoluja, jotka on sidottu mikrokantoaineisiin. Siten voidaan saada aikaan suuri solutiheys, jota ei ole voitu saa-35 vuttaa tähän asti käytetyissä primaarisissa soluviljelyissä
Roux-pulloissa eikä suspensiossa ja joka mahdollistaa huomattavan viruksen ja virusantigeenin saannon kasvun fermen- 5 98377 tointitilavuutta kohden.
Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritusmuodossa viruksen lisääminen ja antigeenin muodostaminen 5 suoritetaan jatkuvatoimisessa perfuusioreaktorissa vähintään 5 päivän kuluessa 34 - 37°C:n lämpötilassa, jolloin perfuu-sio voidaan suorittaa prefuusionopeudella 0,3 - 10 v/v/päi-vä. Perfuusioreaktoriin voidaan järjestää edelleen soluti-heys, joka 2 x 109 - 2 x 1010 solua/1 fermentointitilavuus, 10 viimeksi mainittu leijukerrosfermentointiastiässä.
Keksinnön mukainen viruksen lisääminen perfuusioreaktorissa mahdollistaa erittäin tapahtuvaan viljelyyn verrattuna virus- ja virusantigeenin perfuusionopeuden määräämän oloa-15 jän olennaisen lyhenemisen alustassa. Lyhyemmän oloajan joh dosta saadaan aikaan paljon pienempi terminen inaktivointi ja siten keksinnön mukaisen menetelmän suurempi tuottavuus. Siten perfuusioalustassa voidaan saada aikaan ja säilyttää 1-10 ^g/l:n antigeenikonsentraatio.
20
Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan säätää yksinkertaisella tavalla viljelyyn optimaaliset olosuhteet. Tämän lisäksi tarvitaan sen suorittamiseksi olennaisesti vähemmän manipulaatioita kuin kaikissa tunnetuissa menetelmissä, mikä 25 merkitsee suurempaa turvallisuutta infektioosisen materiaa lin käsittelyssä ja mahdollistaa viruksen ja virusantigee-nien jatkuvan nopean käsittelyn viljelyalustasta.
Seuraavassa selitetään lähemmin virusinokulaatin valmistusko ta, solujen kasvatusta virus- tai vastaavasti virusanti- geenituotantoa varten ja varsinaista virus- tai vastaavasti virusantigeenituotantoa.
1. Virusistutus 35
Soluja (esim. Vero ATTC CCL 81) kasvatetaan pyöröpulloissa 37°C:ssa yhtymiseen asti ja ne infektoidaan 1 ml:11a siemen- 6 98377 virussuspensiota. 2. päivästä infektion jälkeen suoritetaan puoli alustavaihtoa seerumivapaalla alustalla. Alustasuper-natantit 4. päivästä 8. päivään sisältävät 2 - 5 x 107 p.f.u./ml ja ne varastoidaan -20°C:ssa siihen asti, kunnes 5 niitä käytetään virusistutuksina.
2. Solujen kasvatus virus/virusantigeenituotantoa varten Lähdettäessä nestetypessä varastoiduista ATTC CCL 81-työsie-10 mensoluista näiden solujen lisääminen suoritetaan kudosvil- jelypulloissa, kunnes on saatu aikaan solumäärä, joka mahdollistaa fermentointilaitteen inokuloimisen. Solujen edel-leenviljely tapahtuu fermentointiastioissa 37°C:ssa, jolloin adherentisti kasvavilla työsiemensoluilla tulee olla mahdol-15 lisimman paljon pintaa tarttumista varten. Tällaisia suuria pintoja saadaan käyttämällä lasista tai polystyreenistä olevia pyöröpulloja tai käyttämällä mikrokantoaineita (MC). Parhaiten soveltuvat MC:t, jotka ovat ristisilloitettua dekstraania ja joiden koko on 170 μιη - 250 Mm.
20
Siemensoluilla kuormitettuja MC:itä viljellään 37°C:ssa, kunnes solutiheydeksi saadaan lxlO5 - 4xl05 solua/cm2. Tämä solutiheys saavutetaan yleensä kuuden päivän kuluttua. Viljelyn aikana mikrokantoaineet kasvavat täyteen soluja, jol-25 loin lopuksi yksittäiset mikrokantoaineet voivat kasvaa kes kenään ryhmiksi niiden pinnoille tarttuvien solukettojen kautta.
3. Virus/virusantigeenituotanto "0
Sen jälkeen, kun esitetty solutiheys on saavutettu, keksinnön mukaisen matriisin valmistamiseksi MC:hen sitoutuneet solut infektoidaan virusistutuksella (1 - 0,01 pfu/solu, etenkin 0,1 pfu/solu). Keksinnön mukaista matriisia voidaan 35 varastoida muutaman päivän ajan 0° - 8°C:ssa tai se voidaan käyttää heti virusantigeenituotantoon.
7 98377
Antigeenituotantoa varten infektoiduilla soluilla kuormitetut MC:t sijoitetaan perfuusioreaktoriin. Tästä virusinfek-* tion ajankohdasta alkaen viljelyssä käytetään ainoastaan seerumivapaata alustaa, jota pumpataan jatkuvasti perfuusio-5 reaktorin läpi samalla, kun mikrokantoaineilla viljeltyjä soluja pidätetään pidätyslaitteen avulla reaktorissa. Poistuvassa viljelyväliaineessa on infektion 2. päivästä alkaen virusantigeenia korkeana konsentraationa ja sitä voidaan ottaa siitä talteen vähintään 10 päivän ajan jatkuvasti.
10
Seuraavilla esimerkeillä selitetään vielä lähemmin keksinnön mukaista menetelmää. Virusantigeenin määritys tapahtui kaikissa esimerkeissä antigeeni-ELISAlla.
15 Esimerkki 1
Verosoluja ATCC CCL 81 viljeltiin 6 l:n fermentointilait-teessa mikrokantoaineiden päällä (Cytodex 3, valmistaja Pharmacia) 37°C:ssa solumäärään 2 x 106/ml viljelyalustaa 20 (DMEM = Dulbecco's Eagle Medium) ja a) infektoitiin FSME-viruksella (0,1 pfu/solu) ja viruksen lisääminen suoritettiin erittäin.
25 Taulukko l päiviä infektiosta virus/virusantigeeni
Mg/ml 2 0,20 3 0,70 30 4 1,60 5 2,70 6 4,00 7 3,80 8 2,90 35
Tuottavuus oli 1 fermentointitilavuutta kohden 4 mg virus/-virusantigeeniä.
8 98377 b) infektoitiin FSME-viruksella (0,1 pfu/solu) ja viljely-alustaa (DMEM) perfundoitiin jatkuvasti 0,5 tilavuudella/ f ermentointitilavuus/päivä 5 Taulukko 2 päiviä infektiosta virus/virusantigeeni μg/ml 2 0,30 3 1,60 10 4 4,50 5 4,50 6 2,50 7 3,20 8 2,90 15 9 2,50 10 2,30
Tuottavuus oli 1 fermentointitilavuutta kohden 13,7 mg vi-rus/virusantigeeniä.
20 c) infektoitiin FSME-viruksella (0,1 pfu/solu) ja viljely-alustaa (DMEM) perfundoitiin jatkuvasti 1 tilavuudella/fermentointitilavuus/päivä 75 Taulukko 3 päiviä infektiosta virus/virusantigeeni
Mg/ml 2 0,45 3 1,40 30 4 2,00 5 2,00 6 1,70 7 1,60 8 1,10 35 9 1,10 10 0,90 9 98377
Tuottavuus oli 1 fermentointitilavuutta kohden 12,4 mg virus/ virusantigeeniä .
Esimerkki 2 5
Verosoluja (ATCC CCL 81) viljeltiin 40 l:n fermentointilait-teessa mikrokantoaineiden päällä (Cytodex 3, valmistaja Pharmacia) 37°C:ssa solumäärään 2 x 106/ml ja perfundoitiin FSME-viruksella (0,1 pfu/solu) suoritetun infektoinnin jäl-10 keen jatkuvasti alustalla (DMEM) (0,33 tilavuutta/fermen- tointitilavuus/päivä).
Taulukko 4 päiviä infektiosta virus/virusantigeeni 15 Mg/ml 2 1,60 3 3,50 4 5,00 5 4,30 20 6 4,00 7 2,90 8 2,70 9 2,10 10 2,00 25
Tuottavuus oli 1 fermentointitilavuutta kohden 10,7 mg virus/ virusantigeeniä .
Esimerkki 3 30
Verosoluja (ATCC CCL 81) viljeltiin 40 l:n fermentointilait-teessa mikrokantoaineiden päällä (Cytodex 3, valmistaja Pharmacia) 37°C:ssa solumäärään 3 x 106/ml ja perfundoitiin FSME-viruksella (0,1 pfu/solu) suoritetun infektoinnin jäl-35 keen jatkuvasti alustalla (DMEM) (1 tilavuus/fermentointi- tilavuus/päivä).
10 98377
Taulukko 5 päiviä infektiosta virus/virusantigeeni
Mg/ml 2 1,10 5 3 3,80 4 3,90 5 3,00 6 2,30 7 2,20 10 8 2,00 9 3,15**) 10 2,30 **) Perfuusionopeutta vähennettiin 0,5 tilavuuteen/fermen-15 tointitilavuus/päivä.
Tuottavuus oli 1 fermentointitilavuutta kohden 21,7 mg vi-rus/virusantigeeniä.
20 Esimerkki 4
Verosoluja (ATCC CCL 81) viljeltiin 150 l:n fermentointi-laitteessa mikrokantoaineiden päällä (Cytodex 3, valmistaja Pharmacia) 37°C:ssa solumäärään 2 x 106/ml ja perfundoitiin 25 FSME-viruksella (0,1 pfu/solu) suoritetun infektoinnin jälkeen jatkuvasti alustalla (DMEM) (0,33 tilavuutta/fermen- tointitilavuus/päivä).
11 98377
Taulukko 6 päiviä infektiosta virus/virusantigeeni μq/ml 2 0,20 5 3 1,90 4 2,40 5 4,80 6 5,40 7 4,10 10 8 4,40 9 3,20 10 4,50
Tuottavuus oli 1 fermentointitilavuutta kohden 14,7 mg vi-15 rus/virusantigeeniä.
Claims (10)
1. Seerumivapaa soluviljelmä, tunnettu siitä, että se sisältää matriisin, johon on sidottu adherentisti ihmi- 5 sen tai eläimen soluja flavivirus/virusantigeenin tai aren avirus /virusantigeenin tuottamiseksi, jotka solut on infek-toitu FSME-viruksella tai arenaviruksella.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen soluviljelmä, t u n - 10. e t t u siitä, että adherentisti sidottuina soluina käy tetään Vero-soluja ATTC CCL 81 .
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen soluviljelmä, tunnettu siitä, että matriisi on lasia, ristisil- 15 loitettua dekstraania, gelatiinia tai muovia.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen soluviljelmä, tunnettu siitä, että matriisi on muodostettu mikrokanto-aineeksi. 20
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen soluviljelmä, tunnettu siitä, matriisin pintaan on sidottu adherentisti cm2:ä kohden 1 x 105 - 4 x 105 solua.
6. Menetelmä Frtihsommer-Meningoenzephalitis- (varhaiskesä- meningoenkefaliitti-) (FSME)-virusantigeenin tuottamiseksi käyttämällä jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaista matriisia, tunnettu siitä, että pintariippuvaiset pysyvät solut, etenkin Vero-solut ATTC CCL 81 ympätään 30 FSME-viruksella ja solut pidetään seerumivapaassa alustassa niiden elinkelpoisuuden säilyttämiseksi matriisiin adherentisti sidottuina antigeenimuodostumisen säilyttämiseksi soluissa ja antigeeniluovutuksen säilyttämiseksi alustaan, minkä jälkeen antigeenipitoinen alusta erotetaan kantoai-35 neeseen sidotuista soluista ja käsitellään tunnetulla ta- 13 98377 valla konsentroimalla, inaktivoimalla ja puhdistamalla galeenisesti hyväksyttäväksi valmisteeksi.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet- 5. u siitä, että viruksen lisääminen ja antigeenin muodos taminen suoritetaan jatkuvatoimisessa perfuusioreaktorissa vähintään 5 päivän kuluessa 34 - 37 oc:ssa.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet- 10. u siitä, että perfuusio suoritetaan perfuusionopeudella, joka on 0,3 - 10 v/v/päivä.
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että perfuusioreaktoriin laitetaan solutihey- 15 deksi 2 x 109 - 2 x 101 solua/1 fermentointitilavuutta, viimeksi mainittu leijukerrosfermentointilaitteessa. Yhden tai useamman patenttivaatimuksista 6-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alustassa säilyte- 20 tään virus/virusantigeenikonsentraatiota 1
- 10 Mg/ml. 14 98377
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT292889 | 1989-12-22 | ||
| AT2928/89A AT393356B (de) | 1989-12-22 | 1989-12-22 | Verfahren zur herstellung von fsme-virus-antigen |
| PCT/AT1990/000128 WO1991009935A1 (de) | 1989-12-22 | 1990-12-21 | Matrix mit daran adhärent gebundenen zellen, sowie verfahren zur produktion von virus/virusantigen |
| AT9000128 | 1990-12-21 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI922851A0 FI922851A0 (fi) | 1992-06-18 |
| FI922851A FI922851A (fi) | 1992-06-18 |
| FI98377B FI98377B (fi) | 1997-02-28 |
| FI98377C true FI98377C (fi) | 1997-06-10 |
Family
ID=3542524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI922851A FI98377C (fi) | 1989-12-22 | 1992-06-18 | Adherentisti sitoutuneita soluja sisältävä matriisi ja menetelmä virus/virusantigeenin tuottamiseksi |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0506714B1 (fi) |
| JP (1) | JP2633391B2 (fi) |
| AT (2) | AT393356B (fi) |
| CA (1) | CA2071954C (fi) |
| CZ (1) | CZ281804B6 (fi) |
| DE (1) | DE59007659D1 (fi) |
| DK (1) | DK0506714T3 (fi) |
| ES (1) | ES2067916T3 (fi) |
| FI (1) | FI98377C (fi) |
| HR (1) | HRP921354A2 (fi) |
| HU (1) | HU213886B (fi) |
| NO (1) | NO310305B1 (fi) |
| RU (1) | RU2082757C1 (fi) |
| SK (1) | SK659090A3 (fi) |
| WO (1) | WO1991009935A1 (fi) |
| YU (1) | YU242390A (fi) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996015231A2 (en) * | 1994-11-10 | 1996-05-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing biologicals in protein-free culture |
| FR2737412B1 (fr) * | 1995-08-01 | 1997-10-24 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de production d'un vaccin contre le virus de l'encephalite japonaise et vaccin obtenu par ce procede |
| EP0841942B2 (fr) * | 1995-08-01 | 2007-12-12 | Sanofi Pasteur | Procede de production industrielle d'un vaccin contre l'encephalite japonaise et vaccin obtenu |
| AU743546B2 (en) * | 1998-10-05 | 2002-01-31 | Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University, The | Enhanced immunogen for inactivated vaccine for infection with Japanese encephalitis viruses and process for producing the same |
| AT409379B (de) | 1999-06-02 | 2002-07-25 | Baxter Ag | Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen |
| US6951752B2 (en) | 2001-12-10 | 2005-10-04 | Bexter Healthcare S.A. | Method for large scale production of virus antigen |
| US6855535B2 (en) * | 2001-12-10 | 2005-02-15 | Baxter Healthcare S.A. | Method of large scale production of Hepatitis A virus |
| JP2007068401A (ja) * | 2003-08-07 | 2007-03-22 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 西ナイルウイルスワクチン |
| DK2235197T3 (en) * | 2007-12-27 | 2017-10-09 | Baxalta GmbH | Methods of cell culture |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT358167B (de) * | 1978-12-22 | 1980-08-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- -meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)- -vakzinen |
| SE445116B (sv) * | 1979-09-12 | 1986-06-02 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Sett att odla celler pa mikroberare med fibronektinytskikt |
| NO161446C (no) * | 1981-03-13 | 1989-08-16 | Damon Biotech Inc | Fremgangsmaate for dyrking av celler som er avhengige av forankring. |
| SE8103138L (sv) * | 1981-05-19 | 1982-11-20 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Mikroberare for odling av forankringsberoende celler |
| CA1206900A (en) * | 1981-12-21 | 1986-07-02 | Raymond L. Downs | Hollow glass shell microcarrier for growth of cell cultures, and method of shell manufacture |
| AT385203B (de) * | 1985-04-26 | 1988-03-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer fruehsommermeningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-vakzine |
| DD274336A3 (de) * | 1985-10-03 | 1989-12-20 | Npo Biolar | Verfahren zur Gewinnung einer Mikroträgersubstanz für die Zellkultivierung |
-
1989
- 1989-12-22 AT AT2928/89A patent/AT393356B/de not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-12-21 DE DE59007659T patent/DE59007659D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-21 JP JP50113291A patent/JP2633391B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-21 CZ CS906590A patent/CZ281804B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-12-21 ES ES91900666T patent/ES2067916T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-21 YU YU242390A patent/YU242390A/sh unknown
- 1990-12-21 CA CA 2071954 patent/CA2071954C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-21 RU SU905052769A patent/RU2082757C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1990-12-21 EP EP19910900666 patent/EP0506714B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-21 AT AT91900666T patent/ATE113652T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-12-21 SK SK6590-90A patent/SK659090A3/sk not_active IP Right Cessation
- 1990-12-21 WO PCT/AT1990/000128 patent/WO1991009935A1/de active IP Right Grant
- 1990-12-21 DK DK91900666T patent/DK0506714T3/da not_active Application Discontinuation
- 1990-12-21 HU HU9202009A patent/HU213886B/hu unknown
-
1992
- 1992-06-18 FI FI922851A patent/FI98377C/fi active
- 1992-06-19 NO NO19922422A patent/NO310305B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-11-25 HR HRP921354 patent/HRP921354A2/xx not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59007659D1 (de) | 1994-12-08 |
| EP0506714A1 (de) | 1992-10-07 |
| AT393356B (de) | 1991-10-10 |
| HU9202009D0 (en) | 1992-10-28 |
| SK279236B6 (sk) | 1998-08-05 |
| WO1991009935A1 (de) | 1991-07-11 |
| HUT65410A (en) | 1994-06-28 |
| CZ281804B6 (cs) | 1997-02-12 |
| EP0506714B1 (de) | 1994-11-02 |
| RU2082757C1 (ru) | 1997-06-27 |
| ATA292889A (de) | 1991-03-15 |
| NO922422D0 (no) | 1992-06-19 |
| FI922851A0 (fi) | 1992-06-18 |
| HRP921354A2 (en) | 1996-02-29 |
| NO310305B1 (no) | 2001-06-18 |
| SK659090A3 (en) | 1998-08-05 |
| CA2071954C (en) | 1996-06-18 |
| NO922422L (no) | 1992-08-17 |
| FI98377B (fi) | 1997-02-28 |
| JPH05502581A (ja) | 1993-05-13 |
| ATE113652T1 (de) | 1994-11-15 |
| CZ659090A3 (en) | 1996-11-13 |
| CA2071954A1 (en) | 1991-06-23 |
| HU213886B (en) | 1997-11-28 |
| FI922851A (fi) | 1992-06-18 |
| JP2633391B2 (ja) | 1997-07-23 |
| ES2067916T3 (es) | 1995-04-01 |
| YU242390A (sh) | 1993-05-28 |
| DK0506714T3 (da) | 1995-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101548790B1 (ko) | 백신 제조를 위한 고역가 폴리오바이러스의 제조 | |
| Igarashi | Isolation of a Singh’s Aedes albopictus cell clone sensitive to Dengue and Chikungunya viruses | |
| KR100968141B1 (ko) | 세포 배양물에서 바이러스의 증식 방법 | |
| CN101100657B (zh) | 大规模生产病毒抗原的方法 | |
| Van Hemert et al. | Homogeneous cultivation of animal cells for the production of virus and virus products | |
| CN1970080A (zh) | 用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法 | |
| CN1681917A (zh) | 用于细胞培养的无动物蛋白质培养基 | |
| KR20150002762A (ko) | 백신 제조를 위한 바이러스의 세포 배양 증폭 시스템 및 방법 | |
| CN101062411A (zh) | 应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法 | |
| FI98377C (fi) | Adherentisti sitoutuneita soluja sisältävä matriisi ja menetelmä virus/virusantigeenin tuottamiseksi | |
| Toriniwa et al. | Japanese encephalitis virus production in Vero cells with serum-free medium using a novel oscillating bioreactor | |
| US5719051A (en) | Perfusion system and a method for the large scale production of virus or virus antigen | |
| US9932562B2 (en) | Drain down and re-feed of microcarrier bioreactor | |
| IE47060B1 (en) | Process for the cultivation of viruses | |
| KR20120027381A (ko) | 일본뇌염 백신 및 그것의 제조 방법 | |
| NO860180L (fi) | ||
| Igarashi | A mutant of Chikungunya virus isolated from a line of Singh's Aedes albopictus cells by plaque formation on virus-sensitive cloned cells obtained from another Singh's A. albopictus cell line | |
| Rafajko | Routine establishment of serial lines of hamster embryo cells transformed by adenovirus type 12 | |
| RU2142816C1 (ru) | Способ получения антигерпетической вакцины и лекарственная форма на ее основе | |
| RU2816765C1 (ru) | Способ получения культуральной инактивированной вакцины против вируса бешенства | |
| Choi et al. | Production of a chimeric porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)-2 vaccine using a lab-scale packed-bed bioreactor CelCradle | |
| EP0727484A1 (en) | Process for growing virus | |
| CN1513553B (zh) | Vero细胞森林脑炎灭活疫苗 | |
| SU1317021A1 (ru) | Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека,используемый дл культивировани вирусов | |
| RU2014084C1 (ru) | Способ получения вирионной герпетической вакцины |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application |