SK279236B6

SK279236B6 - Bezsérové bunkové kultúry na výrobu antigénov a sp

Info

Publication number: SK279236B6
Application number: SK6590-90A
Authority: SK
Inventors: Wolfgang Mundt; Noel Barrett; Friedrich Dorner; Johann Eibl
Original assignee: Immuno Aktiengesellschaft
Priority date: 1989-12-22
Filing date: 1990-12-21
Publication date: 1998-08-05
Also published as: CZ281804B6; FI922851A0; FI98377B; WO1991009935A1; ATE113652T1; FI922851A; EP0506714A1; CA2071954A1; CA2071954C; CZ659090A3; SK659090A3; FI98377C; JP2633391B2; HRP921354A2; YU242390A; NO922422L; EP0506714B1; AT393356B; NO310305B1; HU213886B

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka bezsérovej bunkovej kultúry na výrobu antigénov a spôsobu výroby flavi-vírus/vírusového antigénu alebo arena-vírus/vírusového antigénu s použitím uvedenej kultúry.

Doterajší stav techniky

Infekcie vyvolané vírusom rannej letnej meningoencefalitidy (FSME) sa pozorujú v Európe od čias 2. svetovej vojny. V Rakúsku, v južnom Nemecku a v Československu sa každý rok lieči niekoľko stoviek pacientov v dôsledku prenosnej FSME - infekcie.

FSME-vírus sa zaraďuje do skupiny Flavi-vírusov, predošlej sérologickej skupiny B arbo-vírusov, ktorá predstavuje rod vírusov rodiny Togaviridae.

Proti jednému z najdôležitejších a najčastejších pôvodcov encefalitídy u ľudí, japonskému B-vírusu encefalitídy, existujú už dlhší čas vakcíny. Tieto vakcíny sa získavajú z mozgu infikovaných myší, čistia a sú považované za isté a bezpečné (Hoke et al., N. Engl. J. Med., 319, 608 (1988)).

Od r. 1976 je k dispozícii očkovacia látka proti FSME a táto je povolená zdravotnými úradmi. Na výrobu tejto očkovacej látky sa kultivuje vírus v mozgu infikovaných myších mláďat, rozmnožuje sa v embryonálnych bunkách kurčiat, inaktivuje formalínom, a potom sa podrobuje eficientnému čisteniu (Heinz et al., J. Med. Virol., 6, 103 (1980)).

V literatúre je opísaný rad možností rozmnožovania arbo-vírusov s ohľadom na možnú výrobu očkovacej látky. Dnes sa najčastejšie používa metóda očkovania embryonálnych fibroblastov kurčiat vypestovaným vírusom FSME získaným z mozgu myší a kultiváciou naočkovaných buniek. Táto metóda vyžaduje nákladné čistenie antigénu, aby sa odstránil komplexný, heterologický biologický materiál a aby sa pri opakovanom podávaní dávok očkovacej látky, ktorá bola z neho získaná, zabránilo senzitívnemu účinku u očkovaných osôb.

Na výrobu embryonálnych buniek kurčiat sa musí vychádzať od SPF (= speciftc pathogen free = špecificky bezpatogénnych) vajec. Tieto SPF-vajcia sa musia podrobiť pred každým použitím väčšiemu počtu dlhotrvajúcich skúšok na uchovanie ich SPF-štatútu.

Ďalej vykazujú kultúry embryonálnych buniek kurčiat len malý počet generácií pri ďalšej kultivácii, čím sú veľkosti šarží obmedzené, kultivácia primárnej kultúry sa len s ťažkosťami udržuje sterilná a neexistuje žiadna trvalá kvalita primárnych buniek s ohľadom na rozmnožovanie vírusu a výrobu antigénu.

Tieto nedostatky nespočívajú iba v spôsobe výroby antigénu FSME-virusu pri výrobe antigénu.

Vynález si kladie za základnú úlohu zlepšiť výrobu vírus/vírus antigénu, obzvlášť FSME-vírus/vírus antigénu tak, že sa uvedené nedostatky odstránia a poskytne sa k dispozícii spôsob kultivácie vírus/vírus antigénu v bunkových kultúrach, ktorý dovolí realizovať výrobu vo veľkoprevádzkovom meradle, pričom sa súčasne kultúra uchová sterilná jednoduchým spôsobom. Ďalej sa má minimalizovať uvoľňovanie nežiaducich celulámych proteínov do narastenej kultúry.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu je bezsérová bunková kultúra, obsahujúca matricu s adherentne na ňu nadviazanými ľudskými alebo zvieracími bunkami na produkciu flavi-vírus/virusového antigénu alebo arena-vírus/vírusového antigénu, pričom bunky sú infikované flavi-vírusom alebo arena-vírusom.

Vynález spočíva na poznatku, že bunky závislé od povrchu, ktoré sa hodia na rozmnožovanie vírusov, zostanú samé od seba i v infikovanom stave adherentne viazané na matrici, relatívne dlhý čas produkujú kontinuálne antigén vírusu a odovzdávajú ho do média kultúry.

Je možné uchovať prostriedok podľa vynálezu s naadsorbovanými infikovanými bunkami niekoľko dní pri teplote medzi 0 °C až 8 °C, teda za podmienok, pri ktorých je brzdený metabolizmus bunky a tým produkcia vírusu. Týmto spôsobom uchovávaný prostriedok sa môže nasledovne bez problému vnášaním do média kultúry a nastavením potrebných podmienok na kultiváciu použiť na výrobu antigénu vírusu. Prostriedok podľa vynálezu predstavuje teda východiskovú kultúru, ktorá sa môže vyrábať s konštantnou kvalitou a aktivitou do zásoby a ktorej stav sa s ohľadom na sterilitu dá ľahko preskúšať a môže sa použiť kedykoľvek na výrobu antigénu vírusu.

Väzba buniek produkujúcich antigén na nosič dovoľuje ďalej celkom jednoduchú manipuláciu s bunkami infikovanými vírusmi a schopnými produkcie. Tak je napríklad možné vykonávať výrobu antigénu vírusu kontinuálne v perfúznom reaktore. Oddelenie buniek od média obsahujúceho antigén sa podstatne uľahčí ich väzbou na matricu, čím sa zjednoduší výroba antigénu vírusu vo veľkoprevádzkovom meradle.

Výhodná forma realizácie prostriedku podľa vynálezu spočíva v tom, že sa ako adherentne viazané bunky použijú vero-bunky ATTC CCL 81, ktoré sa používajú výhodne na výrobu antigénu rannej letnej meningoeneefalitídy (FSME), a preto sú infikované vírusom FSME.

Bunky viazané adherentne na matrici sa môžu ale tiež infikovať flavi-vírusom alebo arena-vírusom.

Ako materiál na matricu sa dobre osvedčilo sklo, priečne zosietený dextrán, želatína alebo plastická hmota, pričom matrica sa vytvorí najlepšie ako mikronosič, ktorého priemer častíc sa výhodne pohybuje v oblasti medzi 100 pm až 300 pm. Tieto mikronosiče môžu mať hladký povrch alebo povrch s poréznou štruktúrou.

Ďalšia výhodná forma realizácie bunkovej kultúry podľa vynálezu je charakterizovaná tým, že na cm⁷ povrchu matrice je adherentne viazané medzi 1x10^ až 4x10$ buniek.

Predmetom predloženého vynálezu je ďalej spôsob výroby flavi-vírus/vírusového antigénu alebo arena-vírus/vírusového antigénu s použitím uvedenej bunkovej kultúry, ktorého podstata spočíva v tom, že sa od povrchu závislej permanentnej bunky, výhodne vero-bunky ATTC CCL 81, zaočkujú flavi-vírusom a bunky sa udržujú v médiu, bez séra so zachovaním ich životaschopnosti, adherentne viazané na matrici, aby sa zachovala tvorba antigénu v bunkách a odovzdávanie antigénu do média, potom sa antigén obsahujúci médium oddelí od buniek viazaných na nosiči a známym spôsobom sa spracuje zakoncentrovaním, inaktiváciou a čistením na galenicky prijateľný preparát.

Línia verobuniek ATTC CCL 81 sa získa z tkaniva obličiek zeleného kočkodana (cercopithecus aethiops) a môže sa uchovávať metabolický aktívna v bezsérovom médiu. Na takéto permanentné línie buniek sa jedenkrát založí banka na materskú zásobu buniek a banka na spracovanie materských zásobných buniek a vykonajú sa všetky vyšetrenia na kontaminujúce látky. Táto permanentná línia buniek je teda tým presne charakterizovaná nielen s ohľadom na neprítomnosť kontaminujúcich mikroorganizmov, ale i čo sa týka správania pri raste, kultivácii,

SK 279236 Β6 správaní pri rozmnožovaní a - ak sú jedenkrát optimalizované možno na ne nahliadať ako na konštantné.

Pri spôsobe podľa vynálezu sa výhodne používajú vcrobunky, ktoré sú viazané na mikronosič. Tým sa môže dosiahnuť vysoká hustota buniek, ktorú nebolo možné dosiahnuť pri doteraz používaných primárnych bunkových štruktúrach ani v Roux-fľašiach ani v suspenzii a ďalej sa dosiahne veľké zvýšenie antigénu vírusu na objem fermentácie.

Výhodný spôsob realizácie podľa vynálezu spočíva v tom, žc sa rozmnožovanie vírusu a tvorba antigénu vykonáva v kontinuálne prevádzkovanom perfúznom reaktore počas najmenej 5 dní, pri teplote medzi 34 až 37 °C, pričom perfúzia sa môže realizovať s perfúznym výťažkom 0,3 až 10 v/v/deň. V perfúznom reaktore sa môže ďalej dosiahnuť hustota buniek 2 x 10⁹až 2 x 10¹⁹ buniek na liter fermentačného objemu, posledný údaj fermentora s fluidným lôžkom.

Rozmnožovanie vírusu podľa vynálezu v perfúznej kultúre umožňuje v porovnaní so šaržovitou kultiváciou podstatné skrátenie zotrvávania vírusu a antigénu v médiu, ktoré je dopredu dané perfúznym výťažkom. Pomocou kratšieho zotrvávania dochádza k podstatne nižšej termickej inaktivácii a tým i k vyššej produktivite spôsobu podľa vynálezu. Tak sa môže v perfúznom médiu získať a uchovať koncentrácia antigénu 1 až 10 pg/ml.

Pri spôsobe podľa vynálezu sa môžu nastaviť jednoduchým spôsobom optimálne podmienky na kultiváciu. Okrem toho je pri spôsobe realizácie podstatne menej manipulácií ako pri všetkých ostatných známych spôsoboch, čo predstavuje väčšiu bezpečnosť pri zaobchádzaní s infekčným materiálom a umožňuje kontinuálne rýchle spracovanie vírusu a antigénu vírusu z média kultúry.

Výroba inokula vírusu, kultivácia buniek na výrobu vírusu prípadne antigénu vírusu a vlastná výroba vírusu, prípadne antigénu vírusu budú bližšie opísané.

Príklady uskutočnenia vynálezu

1. Inokulum vírusu

Bunky (napríklad Vero ATTC CCL 81) sa kultivujú vo valcovitých fľašiach pri 37 °C až do konfluencie a infikujú sa 1 ml suspenzie vírusov. 2. deň po infekcii sa denne vykonáva výmena polovice média za bezsérové médium. Prebytky média od 4. až do 8. dňa obsahujú 2 - 5 x 10² p. f. u. na ml a skladujú sa až do svojho použitia ako inokulum vírusu pri -20 °C.

2. Kultivácia buniek na výrobu vírus/vírus antigénu

Vychádzajúc od ATTC CCL 81 pracovných základných buniek uložených v kvapalnom dusíku, zrealizuje sa rozmnoženie týchto buniek vo fľašiach na tkanivá kultúr až sa dosiahne také množstvo buniek, ktoré dovolí inokulovať ferment. Ďalšia kultivácia buniek prebieha vo fermentačných nádobách pri 37 °C, pričom má byť adherentne rastúcim pracovným základným bunkám k dispozícii čo najväčší povrch na adhéziu, prilipnutie. Takéto veľké povrchy sú k dispozícii pri použití valcových fliaš zo skla alebo polystyrénu alebo pri použití mikronosičov /MC/. Najlepšie sú MC z priečne zosieťovaného dextránu s veľkosťou medzi 170 pm až 250 pm.

MC s naadsorbovanými základnými bunkami sa kultivuje pri 37 °C až do hustoty buniek 1.10 - 4.10 buniek na cm. Táto hustota buniek je dosiahnutá vo všeobecnosti po šiestich dňoch. Počas kultivácie dôjde k dokonalému nárastu mikronosiča bunkami, pričom nakoniec môžu jednotlivé mikronosiče zrásť pomocou svojich bunkových trávnikov prilipnutých na povrchu dokopy za tvorby skupín.

3. Výroba vírus/vírus antigénu

Potom, čo sa dosiahla uvedená hustota buniek, infikujú sa na výrobu matrice podľa vynálezu bunky viazané na MC inokulom vírusu (1 - 0,01 pfu/bunku, výhodne 0,1 pfu/bunku). Matrica podľa vynálezu sa môže skladovať niekoľko dní pri teplote medzi 0°C C až 8 °C C a ihneď sa použiť na výrobu antigénu vírusu.

Na výrobu antigénu sa MC s naadsorbovanými infikovanými bunkami vnesú do perfúzneho reaktora. Od tohto okamihu vírusovej infekcie sa v kultúre používa len bezsérové médium, ktoré sa čerpá kontinuálne perfúznym reaktorom, zatiaľ čo sa bunky kultivované na mikronosičoch zadržujú pomocou retenčného zariadenia v reaktore. V odtekajúcom kultivačnom médiu kultúry sa nachádza od 2. dňa po infekciu antigénu vírusu vo vysokej koncentrácii a môže sa z neho získavať kontinuálne minimálne 10 dní.

Pomocou nasledujúcich príkladov bude spôsob podľa vynálezu ešte ďalej vysvetlený. Stanovenie antigénu vírusu sa realizovalo vo všetkých príkladoch pomocou ELISY na stanovenie antigénu.

Príklad 1

Vero-bunky ATTC CCL 81 boli kultivované v šesťlitrovom fermentore na mikronosiči (Cytodex 3 firmy Pharmacia) pri 37 °C až do počtu buniek 2 x ÍO*³ na ml kultivačného média (DMEM = Dulbecco's Eagle médium) a a/ infikuje sa FSME vírusom (0,1 pfu/bunku) a zrealizuje sa množenie vírusu po šaržiach

Tabuľka 1

dni po infekcii	antigén vírusu pg/ml
2	0,20
3	0,70
4	1,60
5	2,70
6	4,00
7	3,80
8	2,90

Produktivita činidla na 1 fermentačný objem 4 mg antigénu vírusu.

b/ infikuje sa FSME-vírusom (0,1 pfu/bunka) a kultivačné médium/DMEM/ perfunduje kontinuálne s objemom 0,5/objem fermentora/deň.

Tabuľka 2

dni po infekcii	antigén vírusu pg/ml
2	0,30
3	1,60
4	4,50
5	4,50
6	2,50
7	3,20
8	2,90
9	2,50
10	2,30

Produktivita činidla na 1 fermentačný objem 13,7 mg antigénu vírusu.

SK 279236 Β6

c) infikuje sa FSME-vírusom (0,1 pfu/bunku) a kultivačné médium (DMEM) kontinuálne perfunduje s 1 objemom/objem fermcntoru/deň.

Tabuľka 3

dni po infekcii	antigén vírusu pg/ml
2	0,45
3	1,40
4	2,00
5	2,00
6	1,70
7	1,60
8	1,10
9	1,10
10	0,90

Produktivita činidla na 1 fermentačný objem 12,4 mg antigénu vírusu.

Príklad 2

Vero-bunky (ATTC CCL 8 l/)boli kultivované v štyridsaťlitrovom fermentore na mikronosičoch (Cytodex 3 firmy Pharmacia) pri 37 °C až do počtu buniek 2 x 10/ml a po infekcii FSME-vírusom (0,1 pfu/bunka) perfundované kontinuálne médiom (DMEM) (0,33 obj./fermentora obj./deň).

Tabuľka 4

dni po infekcii	antigén vírusu Mg/ml
2	1,60
3	3,50
4	5,00
5	4,30
6	4,00
7	2,90
8	2,70
9	2,10
10	2,00

Produktivita činidla na 1 fermentačný objem 10,7 mg antigénu vírusu.

Príklad 3

Vero-bunky (ATTC CCL 81) boli kultivované v štyridsaťlitrovom fermentore na mikronosičoch (Cytodex 3 firmy Pharmacia) pri 37 °C až do počtu buniek 2 x 10/ml a po infekcii FSME-vírusom (0,1 pfu/bunka) perfundované kontinuálne médiom (DMEM) (1 obj./fermentora obj./deň).

Tabuľka 5

dni po infekcii	antigén vírusu Mg/ml
2	1,10
3	3,80
4	3,90
5	3,00
6	2,30
7	2,20
8	2,00
9	3,15
10	2,30

Výťažok bol redukovaný na 0,5 V/objem fermentoru/deň.

Produktivita bola na 1 fermentačný objem 13,7 mg antigén vírusu.

Vero-bunky (ATTC CCL 81) boli kultivované v stopäťdesiatlitrovom fermentore na mikronosičoch (Cytodex 3 firmy Pharmacia) pri 37 °C až do počtu buniek 2 x KÚ/ml a po infekcii FSME-vírusom (0,1 pfu/bunka) perfunduje kontinuálne médiom (DMEM) (0,33 obj./fermentora obj./deň).

Tabuľka 6

dni po infekcii	antigén vírusu Mg/ml
2	0,20
3	1,90
4	2,40
5	4,80
6	5,40
7	4,10
8	4,40
9	3,20
10	4,50

Produktivita Činidla na 1 fermentačný objem 14,7 mg antigénu vírusu.

Claims

PATENOTVÉ NÁROKY

L Bezsérové bunkové kultúry, obsahujúce matricu s adherentne na ňu naviazanými ľudskými alebo zvieracími bunkami na produkciu flavi-virus/vírusového antigénu alebo arena-vírus/vírusového antigénu, pričom bunky sú infikované flavi-vírusom alebo aréna-vírusom.
2. Bunkové kultúry podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že ako adherentne viazané bunky obsahujú vero-bunky ATCC CCL 81.
3. Bunkové kultúry podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúce sa tým, že matrica pozostáva zo skla, priečne zosieteného dextránu, želatíny alebo plastu.
4. Bunkové kultúry podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že matrica je vytvorená ako mikronosič.
5. Bunkové kultúry podľa jedného alebo niekoľkých nárokov laž 4, vyznačujúce sa tým, že na povrchu matrice je na jednom cm² adherentne viazané 1 x x 1θ5 až 4 x 1()5 buniek.
6. Spôsob výroby flavi-virus/vírusového antigénu alebo arena-vírus/vírusového antigénu s použitím matrice podľa niektorého z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa od povrchu závislé permanentné bunky, výhodne vero-bunky ATTC CCL 81, zaočkujú flavi-vírusom alebo arena-vírusom a bunky sa udržiavajú v médiu, bez séra za zachovania ich životaschopnosti, adherentne viazané na matrici, aby sa zachovala tvorba antigénu v bunkách a odovzdávanie antigénu do média, na čo sa antigén obsahujúce médium oddelí od buniek, viazaných na nosiči a známym spôsobom sa spracuje zakoncentrovanim, inaktiváciou a čistením na galenicky prijateľný preparát.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sa rozmnožovanie vírusu a tvorba antigénu vykonáva kontinuálne perfúznym spôsobom počas aspoň 5 dní pri teplote v rozmedzí 34 až 37 °C.
8. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sa perfúzia vykonáva s perfúznou hodnotou 0,3 až 10 v/v/deň.
9. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sa v perfúznom reaktore používa hustota buniek 2 x 10® až 2 x 101 θ buniek na jeden liter fermentačného objemu, vyššia pri fermentore s fluidným lôžkom.
10. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých nárokov 6 až 9, vyznačujúci sa tým, že sa v médiu udržuje koncentrácia vírus/antigén vírusu 1 až 10 pg/ml.