CZ281804B6

CZ281804B6 - Prostředek pro výrobu antigenů a způsob výroby viru ranné letní meningocefalitidy

Info

Publication number: CZ281804B6
Application number: CS906590A
Authority: CZ
Inventors: Wolfgang Dr. Mundt; Noel Dr. Barrett; Friedrich Prof. Dr. Dorner; Johann Dr. Eibl
Original assignee: Immuno Aktiengesellschaft
Priority date: 1989-12-22
Filing date: 1990-12-21
Publication date: 1997-02-12
Also published as: FI922851A0; FI98377B; WO1991009935A1; ATE113652T1; FI922851A; EP0506714A1; SK279236B6; CA2071954A1; CA2071954C; CZ659090A3; SK659090A3; FI98377C; JP2633391B2; HRP921354A2; YU242390A; NO922422L; EP0506714B1; AT393356B; NO310305B1; HU213886B

Abstract

Řešení se týká prostředku pro výrobu antigenů, který pro produkci flavi-virus/virového antigenu nebo arena-virus/virového antigenu obsahuje matrici s adherentně na ni navázanými bezsérově kultivovanými lidskými nebo zvířecími buňkami, přičemž tyto buňky jsou infikovány flavi-virem nebo arena-virem. Dále se týká způsobu výroby antigenu viru ranné letní meningoencefalitidy (FSME) za použití uvedeného prostředku, při kterém se na povrchu závislé pernamentní buňky, výhodně vero-buňky ATTC CCl 81, zaočkují FSME-virem a buňky se udržují v mediu, prostém séra za zachování jejich životaschopnosti, adherentně vázané na matrici, aby se zachovala tvorba antigenu v buňkách a předávání antigenu do media, načež se antigen obsahující medium oddělí od buněk, vázaných na nosiči a známým způsobem se zpracuje zakoncentrováním, inaktivací a čištěním na galenicky přijatelný preparát. ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká prostředku pro výrobu antigenů a způsobu výroby antigenů viru ranné letní meningoencefalitidy (FSME) za použiti uvedeného prostředku.

Dosavadní stav techniky

Infekce vyvolané virem ranné letní meningoencefalitidy /FSME/ se pozorují v Evropě od doby 2. světové války. V Rakousku, v jižním Německu a v Československu se každý rok léčí více set pacientů v důsledku přenosné FSME - infekce.

FSME - vir se řadí do rodiny Flavivirů, dřívější serologické skupiny B arbovirů, která představuje rod virů rodiny Togaviridae.

Proti jednomu z nejdůležitějších a nejčastějších původců encefalitidy u lidí, japonskému B-viru encefalitidy, existují již delší dobu vakciny. Tyto vakciny se získávají z mozku infikovaných myší, čistí a jsou považovány za jisté a bezpečné /Hoke et al., N. Engl. J. med., 319. 608 /1988//.

Od r. 1976 je k dispozici očkovací látka proti FSME a tato je povolena zdravotními úřady, pro výrobu této očkovací látky se kultivuje vir v mozku infikovaných myších mládat, rozmnožuje se v embryonálních buňkách kuřat, inaktivuje formalinem a potom se podrobuje eficientnímu čištění /Heinz et al., J. Med. Virol., 6, 103 /1980//.

V literatuře je popsána řada možností pomnožování arbovirů s ohledem na možnou výrobu očkovací látky. Dnes se nejčastěji používá methoda očkování embryonálních fibroblastů kuřat vypěstovaným virem FSME získaným z mozku myši a kultivací naočkovaných buněk. Tato methoda vyžaduje nákladné čištění antigenů, aby se odstranil komplexní, heterologický biologický materiál a aby se při opakovaném podávání dávek očkovací látky, která z něho byla získána, zabránilo sensitivnímu účinku u očkovaných osob.

Pro výrobu embryonálních buněk kuřat se musí vyjít od SPF /= specific pathogen free = specificky bezpathogenních/ vajec. Tyto SPF-vejce se musí podrobit pro uchování jejich SPF-statutu před každým použitím většímu počtu dlouhotrvajících zkoušek.

Dále vykazují kultury embryonálních buněk kuřat jen malý počet generací při další kultivací, čímž jsou velikosti šarží omezeny, kultivace primární kultury se jen obtížně udržuje sterilní a neexistuje žádná trvalá kvalita primárních buněk s ohledem na pomnožování viru a výrobu antigenů.

Tyto nedostatky nespočívají pouze ve způsobu výroby antigenů FSME-viru při výrobě antigenů.

-1CZ 281804 B6

Vynález si klade za základní úlohu zlepšit výrobu vir/vir antigenů, zejména pak FSME-vir/vir antigenů tak, že se shora uvedené nedostatky odstraní a poskytne se k dispozici způsob kultivace Vir/vir antigenů v buněčných kulturách, který dovolí zejména provádět výrobu ve velkoprovozním měřítku, přičemž se současně kultura uchová jednoduchým způsobem sterilní. Dále se má minimalizovat uvolňování nežádoucích celulárních proteinů do vzrostlé kultury.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je prostředek pro výrobu antigenů, který pro produkci flavi-virus/virového antigenů nebo aréna-virus/virového antigenů obsahuje matrici s adherentně na ni navázanými bezsérové kultivovanými lidskými nebo zvířecími buňkami, přičemž tyto buňky jsou infikovány flavi-virem nebo arena-virem.

Vynález spočívá které se hodí pro na poznatku, pomnožování i v infikovaném stavu adherentně dlouhou dobu produkují kontinuálně média kultury.

že buňky závislé na povrchu, virů, zůstanou samy od sebe vázány na matrici, relativně antigen viru a předávají ho do

Je možné uchovat prostředek podle vynálezu s naadsorbovanými infikovanými buňkami několik dní při teplotě mezi 0 ’C až 8 °C, tedy za podmínek, při kterých je brzděn metabolismus buňky, a tím produkce viru. Tímto způsobem uchovávaný prostředek se může následovně bez problému vnášením do média kultury a nastavením potřebných podmínek pro kultivaci použít pro výrobu antigenů viru. Prostředek podle vynálezu představuje tedy výchozí kulturu, která se může vyrábět s konstantní kvalitou a aktivitou do zásoby a jejíž stav s ohledem na sterilitu se dá snadno přezkoušet a může se použít kdykoliv k výrobě antigenů viru.

Vazba buněk produkujících antigen na nosič dovoluje dále zcela jednoduchou manipulaci s buňkami infikovanými viry a schopnými produkce. Tak je například možné provádět výrobu antigenů viru kontinuálně v perfúzním reaktoru. Oddělení buněk od média obsahujícího antigen se podstatně usnadní jejich vazbou na matrici, čímž se zjednoduší výroba antigenů viru ve velkoprovozním měřítku.

Výhodná forma provedení prostředku podle vynálezu spočívá v tom, že se jako adherentně vázané buňky použijí vero-buňky ATTC CCL 81, které se používají s výhodou pro výrobu antigenů viru ranné letní meningoencefalitidy /FSME/ a proto jsou infikovány virem FSME.

Buňky vázané adherentně na matrici se mohou ale také infikovat flavivirem nebo arenavirem.

Jako materiál pro matrici se dobře osvědčilo sklo, příčně zesítěný dextran, želatina nebo plastická hmota, přičemž matrice se vytvoří nejlépe jako mikronosič, jehož průměr částic se s výhodou pohybuje v oblasti mezi 100 y.m až 300 p.m. Tyto mikronosiče mohou mít hladký povrch nebo povrch s porézní strukturou.

-2CZ 281804 B6

Další výhodná forma provedení prostředku podle vynálezu je charakterizována tím, že na cm² povrchu matrice je adherentně vázáno mezi 1 χ 10⁵ až 4 χ 10⁵ buněk.

Vynález se týká rovněž způsobu výroby antigenů viru ranné letní memingoencefalitidy /FSME/ za použití matrice podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se permanentní buňky závislé na povrchu, s výhodou vero-buňky ATTC CCL 81, očkují FSME-virem a buňky se uchovávají adherentně vázány na matrici v bezsérovém médiu při zachováni jejich životaschopnosti, aby se udržela tvorba antigenů a předávání antigenů médiu, načež se médium obsahující antigen oddělí od buněk vázaných na nosiči a zpracují se známým způsobem zkoncentrováním, inaktivací a čištěním na galenicky přijatelný preparát.

Linie verobuněk ATTC CCL 81 se získá z tkáně ledvin zeleného kočkodana /cercopithecus aethiops/ a může se uchovávat metabolicky aktivní v bezsérovém médiu. Pro takovéto permanentní linie buněk se jednou založí banka pro mateřskou zásobu buněk a banka pro zpracování mateřských zásobních buněk a provedou se všechna vyšetřeni na kontaminující látky. Tato permanentní linie buněk je tedy tím přesně charakterizována nejen s ohledem na nepřítomnost kontaminujících mikroorganismů, nýbrž i co se týká chování při růstu, kultivaci, chování při pomnožování a - jestliže jsou jednou optimalizovány - lze na ně pohlížet jako na konstantní.

U způsobu podle vynálezu se s výhodou používají verobuňky, které jsou vázány na mikronosič. Tím se může dosáhnout vysoká hustota buněk, kterou nebylo možné u dosud používaných primárních buněčných kultur dosáhnout ani v Roux-lahvich ani v suspensi a velkého zvýšení výtěžku viru a antigenů viru na objem fermentace.

Výhodné provedení způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se pomnožování viru a tvorba antigenů provádí v kontinuálně provozovaném perfúznim reaktoru po dobu nejméně 5 dnů, při teplotě mezi 34 až 37 °C, přičemž perfúze se může provádět s perfúznim výtěžkem 0,3 až 10 v/v/den. V perfúznim reaktoru se může dále dosáhnout hustoty buněk 2 χ 10⁹ až 2 x 10¹⁰ buněk na litr fermentačního objemu, poslední u fermentoru s fluidnim ložem.

Pomnožování viru podle vynálezu v perfúzní kultuře umožňuje ve srovnání se šaržovitou kultivací podstatné zkrácení prodlevy viru a antigenů viru v médiu, která je předem dána perfúznim výtěžkem. Pomocí kratší prodlevy dochází k podstatně nižší termické inaktivaci, a tím i k vyšší produktivitě způsobu podle vynálezu. Tak se může v perfúznim médiu získat a uchovat koncentrace antigenů 1 až 10 μg/ml.

Při způsobu podle vynálezu se mohou nastavit jednoduchým způsobem optimální podmínky pro kultivaci. Kromě toho je pro provedení podstatně méně manipulaci než při všech ostatních známých způsobech, což představuje větší bezpečnost při zacházení s infekčním materiálem a umožňuje kontinuální rychlé zpracování viru a antigenů viru z média kultury.

-3CZ 281804 B6

Výroba inokula viru, kultivace buněk pro výrobu viru popřípadě antigenů viru a vlastní výroba viru popřípadě antigenů viru budou dále blíže popsány.

Příklady provedení vynálezu

1. Inokulum viru

Buňky /například Věro ATTC CCL 81/ se kultivují ve válcovitých lahvích při 37 C až do konfluence a infikují se 1 ml suspense virů. Od 2-hého dne po infekci se denně provádí výměna poloviny média za bezsérové médium. Přebytky média od 4. až do

8. dne obsahuji 2 - 5 x 10 p.f-μ. na ml a skladuji se až do svého použití jako inokulum viru při - 20 °C.

2. Kultivace buněk pro výrobu vir/vir antigenů

Vycházeje od ATTC CCL 81 pracovních základních buněk uložených v kapalném dusíku, provede se pomnožení těchto buněk v lahvích pro tkáně kultur až se dosáhne takového množství buněk, které dovolí inokulovat fermentor. Další kultivace buněk probíhá ve fermentačních nádobách při 37 ’C, přičemž má být adherentně rostoucím pracovním základním buňkám k dispozici co největší povrch pro adhezi /přilnutí/. Takovéto velké povrchy se nabízejí při použiti válcových lahví ze skla nebo polystyrenu nebo při použití mikronosičů /MC/. Nej lepší jsou MC z příčně zesilovaného dextranu s velikostí mezi 170 μιη až 250 μπι.

MC s naadsorbovanými základními buňkami se kultivuje při 37 ’C až do hustoty buněk 1.10⁵ - 4.10⁵ buněk na cm². Tato hustota buněk je dosažena obecně po šesti dnech. Během kultivace dojde k dokonalému zárůstu mikronosiče buňkami, přičemž nakonec mohou jednotlivé mikronosiče srůst pomocí svých buněčných trávníků lpících na povrchu dohromady za tvorby skupin.

3. Výroba vir/vir antigenů

Poté co se dosáhla uvedená hustota buněk, infikují se pro výrobu matrice podle vynálezu buňky vázané na MC inokulem viru /1 - 0,01 pfu/buňku, s výhodou 0,1 pfu/buňku/. Matrice podle vynálezu se může skladovat několik dní při teplotě mezi 0 °C až 8 ’C a ihned použít pro výrobu antigenů viru.

Pro výrobu antigenů se MC s naadsorbovanými infikovanými buňkami vnesou do perfúzního reaktoru. Od tohoto okamžiku virové infekce se v kultuře používá pouze bezsérové médium, které se čerpá kontinuálně perfúzním reaktorem, zatím co se buňky kultivované na mikronosičích zadržují pomocí retenčního zařízení v reaktoru. V odtékajícím kultivačním médiu kultury se nachází od

2. dne po infekci antigenů viru ve vysoké koncentraci a může se z něho získávat kontinuálně minimálně 10 dnů.

Pomocí následujících příkladů bude způsob podle vynálezu ještě dále vysvětlen. Stanovení antigenů viru se provádělo ve všech příkladech pomocí ELISY pro stanovení antigenů.

-4CZ 281804 B6

Přiklad 1

Vero-buňky ATCC CCL 81 byly kultivovány v šestilitrovém fermentoru na mikronosiči /Cytodex 3 firmy Pharmacia/ při 37 °C až do počtu buněk 2 χ 10⁶ na ml kultivačního média /DMEM = Dulbecco s Eagle Medium/ a a/ infikuje se FSME virem /0,1 pfu/buňku/ a provede se pomnožení viru po šaržích

Tabulka 1

dni po infekci	antigen viru μg/ml
2	0,20
3	0,70
4	1,60
5	2,70
6	4,00
7	3,80
8	2,90

Produktivita činila pro 1 fermentační objem 4 mg antigenu viru.

infikuje se b//FSME-virem /0,1 pfu/buňka/ a kultivační médium /DMEM/ perfunduje kontinuálně s objemem 0,5/objem fermentoru/den.

Tabulka 2

dni po infekci	antigen viru μα/ιηΐ
2	0,30
3	1,60
4	4,50
5	4,50
6	2,50
7	3,20
8	2,90
9	2,50
10	2,30

Produktivita činila na 1 fermentační objem 13,7 mg antigenu viru.

c/ infikuje se FSME-virem /0,1 pfu/buňku/ a kultivační médiu /DMEM/ kontinuálně perfunduje s 1 objemem/objem fermentoru/den .

-5CZ 281804 B6

Tabulka 3

dni po infekci	antigen viru úg/ml
2	0,45
3	1,40
4	2,00
5	2,00
6	1,70
7	1,60
8	1,10
9	1,10
10	0,90

Produktivita činila na 1 fermentační objem 12,4 mg antigenů viru.

Příklad 2

Vero-buňky /ATCC CCL 81/ byly kultivovány ve 40ti litrovém fermentoru na mikronosičích /Cytodex 3 firmy Pharmacia/ při 37 C až do počtu buněk 2 x 10⁶ buněk/ml a po infekci FSME-virem /0,1 pfu/buňka/ perfundovány kontinuálně médiem /DMEM/ /0,33 obj./obj. fermentoru/den/.

Tabulka 4

dni po infekci	antigen viru μg/ml
2	1,60
3	3,50
4	5,00
5	4,30
6	4,00
7	2,90
8	2,70
9	2,10
10	2,00

Produktivita činila na 1 viru.

fermentační objem 10,7 mg antigenů

Přiklad 3

Vero-buňky /ATCC CCL 81/ byly kultivovány ve 40ti litrovém fermentoru na mikronosičích /Cytodex 3 firmy Pharmacia/ při 37 ’C až do počtu buněk 3 x 10⁶ buněk/ml a po infekci FSME-virem /0,1 pfu/buňka/ perfundovány kontinuálně médiem /DMEM/ /1 obj./obj. fermentoru/den/.

-6CZ 281804 B6

Tabulka 5

dni po infekci	antigen viru ůg/ml
2	1,10
3	3,80
4	3,90
5	3,00
6	2,30
7	2,20
8	2,00
9	3,15 * *
10	2,30

* * Výtěžek perfúze byl redukován na 0,5 V/objem fermentoru/den.

Produktivita činila na 1 fermentační objem 21,7 mg antigenu viru.

Příklad 4

Vero-buňky /ATCC CCL 81/ byly kultivovány ve 150ti litrovém fermentoru na mikronosičich /Cytodex firmy Pharmacia/ při 37 “C až do počtu buněk 2 x 10⁶/ml a po infekci FSME-virem /0,1 pfu/buňka/ perfunduje kontinuálně médiem /DMEM/ /0,33 obj./objem fermentoru/den/.

Tabulka 6

dni po infekci	antigen viru μg/ml
2	0,20
3	1,90
4	2,40
5	4,80
6	5,40
7	4,10
8	4,40
9	3,20
10	4,50

Produktivita činila na 1 fermentační objem 14,7 mg antigenu viru.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostředek pro výrobu antigenů, vyznačující se tím, že pro produkci flavi-virus/virového antigenů nebo arena-virus/virového antigenů obsahuje matrici s adherentně na ni navázanými bezsérové kultivovanými lidskými nebo zvířecími buňkami, přičemž tyto buňky jsou infikovány flavi-virem nebo arena-virem.
2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako adherentně vázané buňky obsahuje vero-buňky ATCC CCL 81.
3. Prostředek podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že matrice sestává ze skla, příčné zesitěného dextranu, želatiny nebo plastu.
4. Prostřed podle nároku 3, vyznačující se tím, že matrice je vytvořena jako mikronosič.
5. Prostředek podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že na povrchu matrice je na jednom cm² adherentně vázáno 1 x 10⁵ až 4 x 10⁵ buněk.
6. Způsob výroby antigenů viru ranné letní meningoencefalitidy (FSME) za použití prostředku podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se na povrchu závislé permanentní buňky, výhodné vero-buňky ATTC CCL 81, zaočkují FSME-virem a buňky se udržují v médiu, prostém séra za zachováni .jejich životaschopnosti, adherentně vázané na matrici, aby se zachovala tvorba antigenů v buňkách a předávání antigenů do média, načež se antigen obsahující médium oddělí od buněk, vázaných na nosiči a známým způsobem se zpracuje zakoncentrováním, inaktivací a čištěním na galenicky přijatelný preparát.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se rozmnožování viru a tvorba antigenů provádí v kontinuálně pracujícím perfúzním reaktoru po dobu alespoň 5 dnů při teplotě v rozmezí 34 až 37 “C.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se perfúze provádí s perfúzní hodnotou 0,3 až 10 v/v/den.
9. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se v perfúzním reaktoru používá hustota buněk 2 x 10^{8 9} až 2 x 10³·⁰ buněk pro jeden litr fermentačniho objemu, vyšší u fermentoru s fluidním ložem.

-8CZ 281804 B6
10.Způsob podle jednoho nebo několika nároku 6 až 9, vyznačující se tím, že se v médiu udržuje koncentrace vir/antigen viru 1 až 10 μg/ml.