JP2633391B2 - 付着的に結合した細胞を有するマトリックスおよびウイルス／ウイルス抗原の製造方法 - Google Patents
付着的に結合した細胞を有するマトリックスおよびウイルス／ウイルス抗原の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は付着的に結合したヒトまたは動物細胞を有す
る細胞マトリックス、並びにウイルス／ウイルス抗原の
製造方法、とりわけダニによって媒介される脳炎（TB
E）ウイルスのウイルス抗原の製造方法に関する。
る細胞マトリックス、並びにウイルス／ウイルス抗原の
製造方法、とりわけダニによって媒介される脳炎（TB
E）ウイルスのウイルス抗原の製造方法に関する。
ヨーロッパにおけるTBEウイルス感染は、第２次世界
大戦当時から観察されている。オーストリア、南ドイ
ツ、及びチェコスロバキアでは、毎年、数百人の患者が
定常的にTBE感染の治療を受けている。TBEウイルスはア
ルボウイルス（arbovirus）の早期血清学的グループＢ
のフラビウイルス（flavivirus）群に分類されており、
トガビリダエ（Togaviridae）ウイルス群の遺伝子を有
する。
大戦当時から観察されている。オーストリア、南ドイ
ツ、及びチェコスロバキアでは、毎年、数百人の患者が
定常的にTBE感染の治療を受けている。TBEウイルスはア
ルボウイルス（arbovirus）の早期血清学的グループＢ
のフラビウイルス（flavivirus）群に分類されており、
トガビリダエ（Togaviridae）ウイルス群の遺伝子を有
する。
最も重要かつ最も頻繁に起きるヒトの脳炎病原体の１
つ、日本脳炎ウイルス、に対する不活化ワクチンがこれ
までに利用可能となっている。これらのワクチンは感染
マウスの脳から回収、精製され、安全かつ有効であるこ
とが確かめられている［ホークら（Hoke et al.）,N.En
gl.J.Med.319,608（1988）］。
つ、日本脳炎ウイルス、に対する不活化ワクチンがこれ
までに利用可能となっている。これらのワクチンは感染
マウスの脳から回収、精製され、安全かつ有効であるこ
とが確かめられている［ホークら（Hoke et al.）,N.En
gl.J.Med.319,608（1988）］。
1976年以降、TBEワクチンが利用可能となり、保健機
関によって承認されている。このワクチンを製造するに
は感染した赤ん坊マウスの脳でウイルスを培養し、ニワ
トリ胚細胞内で増殖させ、ホルマリンで不活化した後、
有効な精製法に付すことからなる［ハインツら（Heinz
et al.）,J.Med.Virol.,6,103（1980）］。
関によって承認されている。このワクチンを製造するに
は感染した赤ん坊マウスの脳でウイルスを培養し、ニワ
トリ胚細胞内で増殖させ、ホルマリンで不活化した後、
有効な精製法に付すことからなる［ハインツら（Heinz
et al.）,J.Med.Virol.,6,103（1980）］。
文献にはワクチンの製造の可能性という観点から、多
くのアルボウイルス類を増殖し得る方法が記載されてい
る。今日最も多く用いられている方法はニワトリ胚線維
芽細胞にマウス脳から回収したTBEシード（種）ウイル
スを接種し、接種された細胞を培養することからなる。
この方法では、ワクチン接種をされるべきヒトに、得ら
れたワクチンの接種量を繰り返し接種したとき感作作用
が起きないよう、複雑な異種の生物学的物質を除去する
ために、抗原を複雑な方法で精製する必要がある。
くのアルボウイルス類を増殖し得る方法が記載されてい
る。今日最も多く用いられている方法はニワトリ胚線維
芽細胞にマウス脳から回収したTBEシード（種）ウイル
スを接種し、接種された細胞を培養することからなる。
この方法では、ワクチン接種をされるべきヒトに、得ら
れたワクチンの接種量を繰り返し接種したとき感作作用
が起きないよう、複雑な異種の生物学的物質を除去する
ために、抗原を複雑な方法で精製する必要がある。
ニワトリ胚細胞を得るためには、SPF（特異病原体を
含まない＝specific pathogen free）卵から出発する必
要がある。また、そのSPF状態を維持するために、使用
前にこれらのSPF卵を膨大な回数の、時間のかかる試験
に付す必要がある。
含まない＝specific pathogen free）卵から出発する必
要がある。また、そのSPF状態を維持するために、使用
前にこれらのSPF卵を膨大な回数の、時間のかかる試験
に付す必要がある。
さらに、ニワトリ胚細胞培養は少ない世代数しか連続
培養できず、従ってバッチサイズに制限があり、１次培
養を滅菌状態に保つことが困難であり、ウイルス増殖お
よび抗原生産に関する１次細胞の質は一定でなかった。
培養できず、従ってバッチサイズに制限があり、１次培
養を滅菌状態に保つことが困難であり、ウイルス増殖お
よび抗原生産に関する１次細胞の質は一定でなかった。
これらの不利益はTBEウイルス抗原の製造方法のみな
らず、広く抗原一般の製造方法に存在している。
らず、広く抗原一般の製造方法に存在している。
本発明は上記の不利益が解消されたウイルス／ウイル
ス抗原、特にTBEウイルス／ウイルス抗原の製造方法の
改良、ならびに、特に大量生産を可能ならしめる細胞培
養におけるウイルス／ウイルス抗原の増殖方法であっ
て、同時に簡単な方法で培養を無菌状態に維持すること
ができる方法を提供することを目的とするものである。
さらに、望ましくない細胞タンパク質の培養上清への混
入を最小限にする。
ス抗原、特にTBEウイルス／ウイルス抗原の製造方法の
改良、ならびに、特に大量生産を可能ならしめる細胞培
養におけるウイルス／ウイルス抗原の増殖方法であっ
て、同時に簡単な方法で培養を無菌状態に維持すること
ができる方法を提供することを目的とするものである。
さらに、望ましくない細胞タンパク質の培養上清への混
入を最小限にする。
上記の目的を達成するために、マトリックス、即ち担
体マトリックスであってそれに付着的に結合しているウ
イルスに感染したヒトまたは動物細胞を有する担体マト
リックス、を提供する。本発明はウイルス増殖に適した
表面−依存性細胞がウイルスに感染した状態でもマトリ
ックスに付着的に結合したままであって、かなりの長期
間、連続してウイルス抗原を産生し、培養培地に分泌す
るという所見に基づいている。
体マトリックスであってそれに付着的に結合しているウ
イルスに感染したヒトまたは動物細胞を有する担体マト
リックス、を提供する。本発明はウイルス増殖に適した
表面−依存性細胞がウイルスに感染した状態でもマトリ
ックスに付着的に結合したままであって、かなりの長期
間、連続してウイルス抗原を産生し、培養培地に分泌す
るという所見に基づいている。
本発明のマトリックスは感染細胞を保持したまま数日
間、０℃から８℃の間で、即ち細胞の代謝、即ちウイル
ス生産が停止する条件下で、保管することができる。そ
の後、このようにして停止したマトリックスを培養培地
に入れ、個々の増殖条件を調節することでウイルス生産
に問題なく用いることができる。このように本発明のマ
トリックスは、その無菌状態のチェックが容易であり、
任意の時にウイルス抗原の製造に用いることができる、
一定の質と活性を持つストックとして製造され得る培養
出発物質を構成するものである。
間、０℃から８℃の間で、即ち細胞の代謝、即ちウイル
ス生産が停止する条件下で、保管することができる。そ
の後、このようにして停止したマトリックスを培養培地
に入れ、個々の増殖条件を調節することでウイルス生産
に問題なく用いることができる。このように本発明のマ
トリックスは、その無菌状態のチェックが容易であり、
任意の時にウイルス抗原の製造に用いることができる、
一定の質と活性を持つストックとして製造され得る培養
出発物質を構成するものである。
抗原−生産細胞の担体（キャリアー）への結合はま
た、生産に備えたウイルス感染細胞の取り扱いを極めて
簡単にする。即ち、例えばウイルス／ウイルス抗原の生
産を灌流リアクター（反応器）によって連続的に行うこ
とができる。抗原含有培養からの細胞の分離は、それが
マトリックスに結合していることで実質上容易になり、
その結果、本発明のマトリックスはウイルス／ウイルス
抗原の商業規模での製造を簡単にするものである。
た、生産に備えたウイルス感染細胞の取り扱いを極めて
簡単にする。即ち、例えばウイルス／ウイルス抗原の生
産を灌流リアクター（反応器）によって連続的に行うこ
とができる。抗原含有培養からの細胞の分離は、それが
マトリックスに結合していることで実質上容易になり、
その結果、本発明のマトリックスはウイルス／ウイルス
抗原の商業規模での製造を簡単にするものである。
好ましい態様では、本発明のマトリックスは付着的に
結合する細胞としてVero細胞ATCC CCL 81を用い、これ
を好ましくはTBEウイルス抗原の製造、即ちTBEウイルス
に感染させて用いる。
結合する細胞としてVero細胞ATCC CCL 81を用い、これ
を好ましくはTBEウイルス抗原の製造、即ちTBEウイルス
に感染させて用いる。
しかしながら、マトリックスに付着的に結合した細胞
をフラビウイスルまたはアレナウイルスに感染させても
よい。
をフラビウイスルまたはアレナウイルスに感染させても
よい。
マトリックスの原料として、ガラス、交差結合デキス
トラン、ゼラチンまたは合成物質が適当であるが、粒子
径が好ましくは100μｍから3000μｍの範囲のマイクロ
キャリアーとして形成されたマトリックスが最良であ
る。これらのマイクロキャリアーは平滑表面または多孔
性表面のいずれを有するものでもよい。
トラン、ゼラチンまたは合成物質が適当であるが、粒子
径が好ましくは100μｍから3000μｍの範囲のマイクロ
キャリアーとして形成されたマトリックスが最良であ
る。これらのマイクロキャリアーは平滑表面または多孔
性表面のいずれを有するものでもよい。
さらに好ましい態様では、本発明のマトリックスは、
その表面面積（cm2）あたり1x105‐4x105個の細胞が付
着的に結合していることを特徴とする。
その表面面積（cm2）あたり1x105‐4x105個の細胞が付
着的に結合していることを特徴とする。
本発明はまた、本発明のマトリックスを用いるTBEウ
イルス抗原の製造方法であって、表面依存性永久細胞、
好ましくはVero細胞ATCC CCL 81にTBEウイルスを接種
し、細胞を、細胞内での抗原の生成が維持され抗原が培
地に分泌されるよう、生存性を保ちながら、血清不含培
地中のマトリックスに付着的に結合させたまま維持し、
そこで抗原含有培地を担体−結合細胞から分離し、製剤
的に許容される（galenically accepted）、既知方法で
濃縮、不活化および精製により処理することを特徴とす
る方法に関する。
イルス抗原の製造方法であって、表面依存性永久細胞、
好ましくはVero細胞ATCC CCL 81にTBEウイルスを接種
し、細胞を、細胞内での抗原の生成が維持され抗原が培
地に分泌されるよう、生存性を保ちながら、血清不含培
地中のマトリックスに付着的に結合させたまま維持し、
そこで抗原含有培地を担体−結合細胞から分離し、製剤
的に許容される（galenically accepted）、既知方法で
濃縮、不活化および精製により処理することを特徴とす
る方法に関する。
Vero細胞株ATCC CCL 81はミドリザル（Cercopithecus
aethiops）の腎組織から得られ、血清不含培地で代謝
的に活性に維持される。そのような永久細胞株のため
に、マザーシードセルバンク（mother seed cell ban
k）およびワーキングシードセルバンク（working seed
cell bank）が開始され、不純物のための全試験が行わ
れた。この永久細胞株は単にそれが混在細胞を含まない
ことのみならず、その培養行動、出発培養、増殖行動に
よっても正確に特徴付けられ、一度最適条件に調節する
と一定であると考えられる。
aethiops）の腎組織から得られ、血清不含培地で代謝
的に活性に維持される。そのような永久細胞株のため
に、マザーシードセルバンク（mother seed cell ban
k）およびワーキングシードセルバンク（working seed
cell bank）が開始され、不純物のための全試験が行わ
れた。この永久細胞株は単にそれが混在細胞を含まない
ことのみならず、その培養行動、出発培養、増殖行動に
よっても正確に特徴付けられ、一度最適条件に調節する
と一定であると考えられる。
本発明方法によれば、好ましくはマイクロキャリアー
に結合したVero細胞を用いる。その結果、本明細書で用
いる１次細胞培養を用いて、高細胞密度が、Rouxフラス
コ内または懸濁液としてでなく、達成されそれにより発
酵（培養）容量あたりのウイルスおよびウイルス抗原量
の相当な増大が可能となる。
に結合したVero細胞を用いる。その結果、本明細書で用
いる１次細胞培養を用いて、高細胞密度が、Rouxフラス
コ内または懸濁液としてでなく、達成されそれにより発
酵（培養）容量あたりのウイルスおよびウイルス抗原量
の相当な増大が可能となる。
本発明方法の優れた態様ではウイルス増殖および抗原
生成を連続操作される灌流反応装置で少なくとも５日
間、34〜37℃の温度にて、灌流速度0.3-10v/v/日で行
う。さらに、灌流反応装置では発酵（培養）容量1Lあた
り、2x109‐2x1010細胞の細胞密度［後者は流動床発酵
槽（fluidized bed fermenter）による］に達し得る。
生成を連続操作される灌流反応装置で少なくとも５日
間、34〜37℃の温度にて、灌流速度0.3-10v/v/日で行
う。さらに、灌流反応装置では発酵（培養）容量1Lあた
り、2x109‐2x1010細胞の細胞密度［後者は流動床発酵
槽（fluidized bed fermenter）による］に達し得る。
本発明の灌流培養によるウイルス増殖法はバッチ培養
に比較して培地中でのウイルスおよびウイルス抗原の、
−灌流速度依存性−居住時間（dwell time）を実質上、
減少することができる。居住時間が短縮される程、熱不
活化が少なくなり、本発明方法の高生産性に至る。即
ち、灌流培地内で抗原濃度1-10μg/mlが達成され、維持
される。
に比較して培地中でのウイルスおよびウイルス抗原の、
−灌流速度依存性−居住時間（dwell time）を実質上、
減少することができる。居住時間が短縮される程、熱不
活化が少なくなり、本発明方法の高生産性に至る。即
ち、灌流培地内で抗原濃度1-10μg/mlが達成され、維持
される。
本発明方法によれば、培養のための最適条件は単純な
方法で調節できる。さらに従来法に比較してその実施に
要する操作数が実質上少なく、感染性物質の取り扱いが
より安全であって、培地からのウイルスおよびウイルス
抗原の処理を連続的かつ迅速に行うことができる。
方法で調節できる。さらに従来法に比較してその実施に
要する操作数が実質上少なく、感染性物質の取り扱いが
より安全であって、培地からのウイルスおよびウイルス
抗原の処理を連続的かつ迅速に行うことができる。
以下に、ウイルス接種物の製造、ウイルスおよびウイ
ルス抗原の製造のための細胞の培養、およびそのままの
ウイルスおよびウイルス抗原の製造をさらに詳しく説明
する。
ルス抗原の製造のための細胞の培養、およびそのままの
ウイルスおよびウイルス抗原の製造をさらに詳しく説明
する。
1.ウイルス接種物 細胞（例、Vero ATCC CCL 81）をローラー（Roller）
フラスコ内で37℃において全面成長に達するまで培養
し、シード（種）ウイルス懸濁液1mlを接種する。感染
後２日目から開始し、毎日、培地の1/2を血清不含培地
で置換する。４日目から８日目までの培地上清は1mlあ
たり2-5x107p.f.u.を有し、これを−20℃でウイルス接
種に用いるまで保存する。
フラスコ内で37℃において全面成長に達するまで培養
し、シード（種）ウイルス懸濁液1mlを接種する。感染
後２日目から開始し、毎日、培地の1/2を血清不含培地
で置換する。４日目から８日目までの培地上清は1mlあ
たり2-5x107p.f.u.を有し、これを−20℃でウイルス接
種に用いるまで保存する。
2.ウイルス／ウイルス抗原製造のための細胞培養 液体窒素に保存したATCC CCL 81ワーキングシードセ
ル（working seed cell）を出発物質として用い、これ
らの細胞をファーメンター（発酵槽）への接種のための
量の細胞が得られるまで組織培養フラスコで培養する。
付着的に増殖するワーキングシードセルの付着のため
に、できるだけ多くの表面が得られるよう、細胞をさら
に発酵装置内で37℃で培養し続ける。そのような大量の
表面はガラス製またはポリスチレン製のRollerフラスコ
またはマイクロキャリアー（MC）を用いて得られる。サ
イズ170μm-250μｍの交差結合デキストランのMCが最適
である。
ル（working seed cell）を出発物質として用い、これ
らの細胞をファーメンター（発酵槽）への接種のための
量の細胞が得られるまで組織培養フラスコで培養する。
付着的に増殖するワーキングシードセルの付着のため
に、できるだけ多くの表面が得られるよう、細胞をさら
に発酵装置内で37℃で培養し続ける。そのような大量の
表面はガラス製またはポリスチレン製のRollerフラスコ
またはマイクロキャリアー（MC）を用いて得られる。サ
イズ170μm-250μｍの交差結合デキストランのMCが最適
である。
シードセルを有するMCを細胞密度が1x105‐4x105／cm
2になるまで37℃で培養する。通常、６日後にこの細胞
密度に達する。培養期間中、マイクロキャリアーに細胞
を完全に過剰増殖させ、最後に個々のマイクロキャリア
ーをそれぞれの表面に付着する細胞シートを介してまと
めるよう培養する。
2になるまで37℃で培養する。通常、６日後にこの細胞
密度に達する。培養期間中、マイクロキャリアーに細胞
を完全に過剰増殖させ、最後に個々のマイクロキャリア
ーをそれぞれの表面に付着する細胞シートを介してまと
めるよう培養する。
3.ウイルス／ウイルス抗原製造 指定の細胞濃度に達したとき、MCに結合した細胞をウ
イルス接種物で感染させ（1-0.01pfu/細胞、好ましくは
0.1pfu/細胞）本発明のマトリックスを得る。本発明の
マトリックスは０〜８℃の間で数日間保管でき、ウイル
ス抗原の製造のために即座に用いることができる。
イルス接種物で感染させ（1-0.01pfu/細胞、好ましくは
0.1pfu/細胞）本発明のマトリックスを得る。本発明の
マトリックスは０〜８℃の間で数日間保管でき、ウイル
ス抗原の製造のために即座に用いることができる。
抗原の製造のためには感染細胞を有するMCを灌流反応
装置に入れる。ウイルス感染進行のこの時点から、マイ
クロキャリアー上で培養された細胞を保持装置によって
反応装置内に維持しつつ、血清不含培地のみを用い、該
培地を灌流反応装置を介して連続的にポンプで送りなが
ら培養する。感染後２日目から始めて少なくとも10日間
は高濃度のウイルス抗原が存在し、連続的にそこから回
収される。
装置に入れる。ウイルス感染進行のこの時点から、マイ
クロキャリアー上で培養された細胞を保持装置によって
反応装置内に維持しつつ、血清不含培地のみを用い、該
培地を灌流反応装置を介して連続的にポンプで送りなが
ら培養する。感染後２日目から始めて少なくとも10日間
は高濃度のウイルス抗原が存在し、連続的にそこから回
収される。
以下に実施例を挙げ、本発明方法をさらに詳しく説明
する。全実施例において、抗原−ウイルス抗原を抗原−
ELISAによって測定した。
する。全実施例において、抗原−ウイルス抗原を抗原−
ELISAによって測定した。
実施例１ Vero細胞ATCC CCL 81を6Lファーメンター中、マイク
ロキャリアー上（Cytodex 3,Pharmacia）で37℃におい
て細胞数が2x106/ml培養培地（DMEM＝ダルベッコのイー
グル培地）に達するまで培養し、以下のいずれかに付
す。
ロキャリアー上（Cytodex 3,Pharmacia）で37℃におい
て細胞数が2x106/ml培養培地（DMEM＝ダルベッコのイー
グル培地）に達するまで培養し、以下のいずれかに付
す。
ａ）これにTBEウイルス（0.1pfu/細胞）を感染させ、バ
ッチ内でウイルスを増殖させる。
ッチ内でウイルスを増殖させる。
表１感染後の日数 ウイルス／ウイルス抗原（μg/ml） ２ 0.20 ３ 0.70 ４ 1.60 ５ 2.70 ６ 4.00 ７ 3.80 ８ 2.90 発酵容量1Lあたりのウイルス／ウイルス抗原の生産量
は4mgに達した。
は4mgに達した。
ｂ）これにTBEウイルス（0.1pfu/細胞）を感染させ、培
養培地を0.5容量／ファーメンター容量／日で連続的に
灌流する。
養培地を0.5容量／ファーメンター容量／日で連続的に
灌流する。
表２感染後の日数 ウイルス／ウイルス抗原（μg/ml） ２ 0.30 ３ 1.60 ４ 4.50 ５ 4.50 ６ 2.50 ７ 3.20 ８ 2.90 ９ 2.50 10 2.30 発酵容量1Lあたりのウイルス／ウイルス抗原の生産量
は13.7mgに達した。
は13.7mgに達した。
ｃ）これにTBEウイルス（0.1pfu/細胞）を感染させ、培
養培地（DMEM）を１容量／ファーメンター容量／日で連
続的に灌流する。
養培地（DMEM）を１容量／ファーメンター容量／日で連
続的に灌流する。
表３感染後の日数 ウイルス／ウイルス抗原（μg/ml） ２ 0.45 ３ 1.40 ４ 2.00 ５ 2.00 ６ 1.70 ７ 1.60 ８ 1.10 ９ 1.10 10 0.90 発酵容量1Lあたりのウイルス／ウイルス抗原の生産量
は12.4mgに達した。
は12.4mgに達した。
実施例２ Vero細胞（ATCC CCL 81）を40Lファーメンター中、マ
イクロキャリアー上（Cytodex 3、Pharmacia）で37℃に
おいて細胞数が2x106/mlになるまで培養培し、TBEウイ
ルス（0.1pfu/細胞）感染後、培地（DMEM）で連続的に
灌流した（0.33容量／ファーメンター容量／日）。
イクロキャリアー上（Cytodex 3、Pharmacia）で37℃に
おいて細胞数が2x106/mlになるまで培養培し、TBEウイ
ルス（0.1pfu/細胞）感染後、培地（DMEM）で連続的に
灌流した（0.33容量／ファーメンター容量／日）。
表４感染後の日数 ウイルス／ウイルス抗原（μg/ml） ２ 1.60 ３ 3.50 ４ 5.00 ５ 4.30 ６ 4.00 ７ 2.90 ８ 2.70 ９ 2.10 10 2.00 発酵容量1Lあたりのウイルス／ウイルス抗原の生産量
は10.7mgに達した。
は10.7mgに達した。
実施例３ Vero細胞（ATCC CCL 81）を40Lファーメンター中、マ
イクロキャリアー上（Cytodex 3、Pharmacia）で37℃に
おいて細胞数が3x106/mlになるまで培養培し、TBEウイ
ルス（0.1pfu/細胞）感染後、培地（DMEM）で連続的に
灌流した（１容量／ファーメンター容量／日）。
イクロキャリアー上（Cytodex 3、Pharmacia）で37℃に
おいて細胞数が3x106/mlになるまで培養培し、TBEウイ
ルス（0.1pfu/細胞）感染後、培地（DMEM）で連続的に
灌流した（１容量／ファーメンター容量／日）。
表５感染後の日数 ウイルス／ウイルス抗原（μg/ml） ２ 1.10 ３ 3.80 ４ 3.90 ５ 3.00 ６ 2.30 ７ 2.20 ８ 2.00 ９ 3.15＊＊ 10 2.30 ＊＊：灌流速度は0.5容量／ファーメンター容量／日
に下げた。発酵容量1Lあたりのウイルス／ウイルス抗原
の生産量は21.7mgに達した。
に下げた。発酵容量1Lあたりのウイルス／ウイルス抗原
の生産量は21.7mgに達した。
実施例４ Vero細胞（ATCC CCL 81）を150Lファーメンター中、
マイクロキャリアー上（Cytodex 3、Pharmacia）で37℃
において細胞数が2x106/mlになるまで培養培し、TBEウ
イルス（0.1pfu/細胞）感染後、培地（DMEM）で連続的
に灌流した（0.33容量／ファーメンター容量／日）。
マイクロキャリアー上（Cytodex 3、Pharmacia）で37℃
において細胞数が2x106/mlになるまで培養培し、TBEウ
イルス（0.1pfu/細胞）感染後、培地（DMEM）で連続的
に灌流した（0.33容量／ファーメンター容量／日）。
表６感染後の日数 ウイルス／ウイルス抗原（μg/ml） ２ 0.20 ３ 1.90 ４ 2.40 ５ 4.80 ６ 5.40 ７ 4.10 ８ 4.40 ９ 3.20 10 4.50 発酵容量1Lあたりのウイルス／ウイルス抗原の生産量
は14.7mgに達した。
は14.7mgに達した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 アイブル，ヨハン オーストリア共和国、アー―1180ヴィー ン、グスタフ・ツェルマークガッセ２番 (56)参考文献 特開 昭60−102187（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−78634（ＪＰ，Ａ) Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｖｏ ｌ．31，Ｎｏ．２（1987）Ｐ．370−375
Claims (10)
- 【請求項１】TBEウイルスまたはアレナウイルスに感染
したヒトまたは動物細胞が付着的に結合しているフラビ
ウイルス／ウイルス抗原またはアレナウイルス／ウイル
ス抗原製造のためのマトリックスを含有する血清不含細
胞培養物。 - 【請求項２】付着的に結合している細胞としてVero細胞
ATCC CCL 81が用いられていることを特徴とする請求項
１の細胞培養物。 - 【請求項３】マトリックスがガラス、交差結合デキスト
ラン、ゼラチンまたは合成物質からなることを特徴とす
る請求項１または２に記載の細胞培養物。 - 【請求項４】マトリックスがマイクロキャリアーとして
設計されていることを特徴とする請求項３に記載の細胞
培養物。 - 【請求項５】マトリックスの表面１cm2あたり1x105‐4x
105個の細胞が付着的に結合していることを特徴とする
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養物。 - 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載のマトリッ
クスを用いるダニに媒介される脳炎（TBE）ウイルス抗
原の製造方法であって、表面依存性永久細胞、好ましく
はVero細胞ATCC CCL 81にTBEウイルスを接種し、細胞
を、細胞内での抗原の生成が維持され抗原が培地に分泌
されるよう、生存性を保ちながら、血清不含培地中のマ
トリックスに付着的に結合させたまま維持し、そこで抗
原含有培地を担体−結合細胞から分離し、製剤的に許容
される既知の方法で濃縮、不活化および精製により処理
することを特徴とする方法。 - 【請求項７】ウイルス増殖および抗原生成を連続的に操
作される灌流反応装置で少なくとも５日間、34〜37℃の
温度で行うことを特徴とする請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】灌流を灌流速度0.3-10v/v/日で行うことを
特徴とする請求項６に記載の方法。 - 【請求項９】灌流リアクター内で、発酵容量1Lあたり、
2x109‐2x1010細胞の細胞密度（後者は流動床発酵槽に
よる）が得られることを特徴とする請求項６に記載の方
法。 - 【請求項１０】培地内の抗原濃度1-10μg/mlが維持され
ることを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT2928/89 | 1989-12-22 | ||
| AT2928/89A AT393356B (de) | 1989-12-22 | 1989-12-22 | Verfahren zur herstellung von fsme-virus-antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05502581A JPH05502581A (ja) | 1993-05-13 |
| JP2633391B2 true JP2633391B2 (ja) | 1997-07-23 |
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ID=3542524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50113291A Expired - Fee Related JP2633391B2 (ja) | 1989-12-22 | 1990-12-21 | 付着的に結合した細胞を有するマトリックスおよびウイルス／ウイルス抗原の製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0506714B1 (ja) |
| JP (1) | JP2633391B2 (ja) |
| AT (2) | AT393356B (ja) |
| CA (1) | CA2071954C (ja) |
| CZ (1) | CZ281804B6 (ja) |
| DE (1) | DE59007659D1 (ja) |
| DK (1) | DK0506714T3 (ja) |
| ES (1) | ES2067916T3 (ja) |
| FI (1) | FI98377C (ja) |
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| HU (1) | HU213886B (ja) |
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| RU (1) | RU2082757C1 (ja) |
| SK (1) | SK659090A3 (ja) |
| WO (1) | WO1991009935A1 (ja) |
| YU (1) | YU242390A (ja) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2005511078A (ja) * | 2001-12-10 | 2005-04-28 | バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム | Ａ型肝炎ウイルスの大規模生成の方法 |
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1989
- 1989-12-22 AT AT2928/89A patent/AT393356B/de not_active IP Right Cessation
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1990
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