WO1991009935A1 - Matrix mit daran adhärent gebundenen zellen, sowie verfahren zur produktion von virus/virusantigen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung besteht in einer Matrix, also einem Trägermaterial, mit daran adhärent gebundenen menschlichen oder tierischen Zellen, wobei die Zellen mit Virus infiziert sind. Es hat sich gezeigt, daß oberflächenabhängige Zellen, die zur Virusvermehrung geeignet sind, selbst in virusinfiziertem Zustand an einer Matrix adhärent gebunden bleiben, über relativ lange Zeit kontinuierlich Virusantigen produzieren und in das Kulturmedium abgeben. Zur Produktion von Frühsommer-Meningoenzephalitis-(FSME)-Virus-Antigen durch Züchten des FSME-Virus in Zellkulturen wird eine oberflächenabhängige permanente Zellinie, vorzugsweise die Vero-Zellinie ATTC CCL 81, mit dem FSME-Virus beimpft und die Zellen unter Aufrechterhaltung des Zellwachstums in einem nicht-lytischen serumfreien System an Trägern gebunden gehalten, um eine Antigenbildung aufrecht zu erhalten, worauf das antigenhältige Medium von den trägergebundenen Zellen getrennt und in bekannter Weise durch Aufkonzentrieren, Inaktivieren und Reinigen zu einem galenisch akzeptablen Präparat aufgearbeitet wird.
Description
Matrix mit daran adhärent gebundenen Zellen, sowie Verfahren zur Produktion von Virus/Virusantiqen
Die Erfindung betrifft eine Matrix mit daran adhärent gebundenen menschlichen oder tierischen Zellen, sowie ein Verfahren zur Produktion von Virus/Virusantigen, insbesondere von Frühsommer-Meningoenzephalitis-(FSME)- Virus-Antigen.
Infektionen mit dem Virus der Frühsoπuner-Meningoenzephalitis (FSME) werden seit dem 2. Weltkrieg in Europa beobachtet. In Österreich, in Süddeutschland und in der Tschechoslowakei werden jedes Jahr mehrere hundert Patienten aufgrund einer FSME-Infektion stationär behandelt.
Das FSME-Virus wird der Familie der Flaviviren zugeordnet, der früheren serologischen Gruppe B der Arboviren, die einen Genus der Virusfamilie Togaviridae darstellt.
Gegen eines der wichtigsten und häufigsten Enzephalitis-Er¬ reger beim Menschen, das Japanische Encephalitis-B-Virus, gibt es seit längerer Zeit Totimpfstoffe. Diese Totimpf¬ stoffe werden aus dem Gehirn infizierter Mäuse gewonnen, gereinigt, und sind als sicher und wirksam anerkannt (Hoke et al., N.Engl.J.Med., _3i£r 608 (1988)).
Seit dem Jahr 1976 ist ein Impfstoff gegen FSME verfügbar und von den Gesundheitsbehörden zugelassen. Zur Herstellung dieses Impfstoffes wird das Virus im Gehirn infizierter Baby-Mäuse angezüchtet, in Hühnerembryonalzellen vermehrt, mit Formalin inaktiviert und dann einem effizienten Reini¬ gungsverfahren unterworfen (Heinz et al., J.Med.Virol., 6., 103 (1980)).
In der Literatur werden eine Reihe von Möglichkeiten zur Vermehrung von Arboviren im Hinblick auf eine mögliche Impfstoffherstellung beschrieben. Die heute am meisten verwendete Methode ist die Beimpfung von
Hühnerembryonalfibroblasten mit einem aus dem Maushirn gewonnenen FSME-Saatvirus und die Kultivierung der beimpften Zellen. Diese Methode erfordert eine aufwendige Reinigung des Antigens, um komplexes, heterologes biologisches Materi¬ al zu entfernen und um bei wiederholter Verabreichung von daraus gewonnenen Impfstoffdosen einen sensitivierenden Effekt bei den Impflingen zu vermeiden.
Für die Bereitstellung der Hühnerembryonalzellen muß von SPF(= specific pathogen free)-Eiern ausgegangen werden. Diese SPF-Eier müssen zur Aufrechterhaltung ihres SPF-Status vor jeder Verwendung einer Vielzahl von langwierigen Unter¬ suchungen unterzogen werden.
Weiters zeigen Hühnerembryonalzellkulturen nur geringe Generationszahlen bei der Weiterzucht, wodurch der Chargen¬ größe Grenzen gesetzt sind, ein schwieriges Sterilhalten der Primärkulturanzucht und keine Konstanz der Qualität der primären Zellen in bezug auf Virusvermehrung und Antigen- produktion.
Diese Nachteile bestehen nicht nur bei den Verfahren zur Produktion von FSME-Virusan igen, sondern bei der Antigen- herstellung ganz allgemein.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, die Produktion von Virus/Virusantigen, insbesondere von
FSME-Virus/Virusantigen, so zu verbessern, daß die oben genannten Nachteile beseitigt werden und ein Verfahren zur Züchtung von Virus/Virusantigen in Zellkulturen zur Verfügung zu stellen, das insbesondere eine Produktion im großtechnischen Maßstab erlaubt, wobei gleichzeitig die Kultur auf einfache Weise steril gehalten werden kann. Weiters soll die Abgabe unerwünschter zellulärer Proteine in den Kulturüberstand minimiert werden.
Zur Lösung der beschriebenen Aufgabe wird eine Matrix zur Verfügung gestellt, d.h. ein Trägermaterial, mit daran adhärent gebundenen menschlichen oder tierischen Zellen, wobei die Zellen mit Virus infiziert sind. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß oberflächenabhängige Zellen, die zur Virusvermehrung geeignet sind, selbst in virusinfi¬ ziertem Zustand an einer Matrix adhärent gebunden bleiben, über relativ lange Zeit kontinuierlich Virusantigen produ¬ zieren und in das Kulturmedium abgeben.
Es ist möglich, die mit infizierten Zellen beladene erfindungsgemäße Matrix einige Tage bei einer Temperatur zwischen 0°C und 8°C aufzubewahren, also unter Bedingungen, bei denen der Zellmetabolismus und damit die Virusproduktion unterbunden sind. Eine derartig aufbewahrte Matrix kann in der Folge problemlos durch Einbringen in ein Kulturmedium und Einstellen der jeweiligen Kultivierungsbedingungen zur Virusantigenproduktion verwendet werden. Die erfindungsgemä¬ ße Matrix stellt somit eine Ausgangskultur dar, die mit konstanter Qualität und Aktivität auf Vorrat produziert werden kann, deren Zustand hinsichtlich Sterilität leicht überprüfbar ist und die jederzeit zur Virusantigenproduktion herangezogen werden kann.
Die Bindung der antigenproduzierenden Zellen an den Träger gestattet weiters eine überaus einfache Handhabung der virusinfizierten und produktionsbereiten Zellen. So ist es beispielsweise möglich, die Virus/Virusantigenproduktion kontinuierlich in einem Perfusionsreaktor durchzuführen. Die Abtrennung der Zellen vom antigenhältigen Medium wird durch ihre Bindung an die Matrix wesentlich erleichtert, wodurch die erfindungsgemäße Matrix die Produktion von Virus/Virusantigen im großtechnischen Maßstab vereinfacht.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Matrix besteht darin, daß als adhärent gebundene Zellen Vero-Zellen ATTC CCL 81 vorgesehen sind, welche vorzugsweise zur Produk¬ tion von Frühsommer-Meningo-enzephalitis-(FSME)-Virus- Antigen vorgesehen sind und daher mit FSME-Virus infiziert sind.
Die an der Matrix adhärent gebundenen Zellen können aber auch mit Flavivirus oder mit Arenavirus infiziert sein.
Als Material für die Matrix hat sich Glas, quervernetztes Dextran, Gelatine oder Kunststoff als gut geeignet erwiesen, wobei die Matrix am besten als Microcarrier ausgebildet ist, dessen Teilchendurchmesser vorzugsweise im Bereich zwischen lOOμm und 3000μm liegt. Diese Microcarrier können eine glatte Oberfläche oder eine poröse Strukturierung aufweisen.
Eine weitere zweckmäßige Ausführungsform der erfindungsgemä¬ ßen Matrix ist dadurch gekennzeichnet, daß an ihrer Oberflä¬ che pro cm2 zwischen lxl0B und 4xl05 Zellen adhärent gebun¬ den sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion von Frühsommer-Meningoenzephalitis-(FSME)-Virus-Antigen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Matrix, das dadurch gekenn¬ zeichnet ist, daß oberflächenabhängige permanente Zellen, vorzugsweise die Vero-Zellen ATTC CCL 81, mit dem FSME-Virus beimpft werden und die Zellen in einem serumfreien Medium unter Aufrechterhaltung ihrer Lebensfähigkeit an einer Matrix adhärent gebunden gehalten werden, um eine Antigen- bildung und eine Antigenabgabe an das Medium aufrecht zu erhalten, worauf das antigenhältige Medium von den trägerge¬ bundenen Zellen getrennt und in bekannter Weise durch Auf onzentrieren. Inaktivieren und Reinigen zu einem gale- nisch akzeptablen Präparat aufgearbeitet wird.
Die Verozellinie ATTC CCL 81 wird aus dem Nierengewebe der grünen Meerkatze (Cercopithecus aethiops) gewonnen und kann in serumfreiem Medium metabolisch aktiv gehalten werden. Für eine solche permanente Zellinie wird eine Muttersaatzellbank und eine Arbeitssaatzellbank einmal angelegt und alle Untersuchungen auf kontaminierende Substanzen durchgeführt. Diese permanente Zellinie ist somit genau charakterisierbar nicht nur im Hinblick auf Freiheit von kontaminierenden Mikroorganismen, sondern auch auf Wachstumsverhalten, Anzucht, Vermehrungsverhalten und - wenn einmal optimiert - als konstant zu betrachten.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Vero- zellen verwendet, die auf Microcarriern gebunden sind. Dadurch kann eine hohe Zelldichte erreicht werden, die bei den bisher benutzten primären Zellkulturen weder in Roux- flaschen noch in Suspension erreichbar war und eine erheb¬ liche Ausbeutesteigerung an Virus und an Virusantigen pro Fermentationsvolumen ermöglicht.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Virusvermehrung und Antigenbildung in einem kontinuierlich betriebenen Perfusi¬ onsreaktor während einer Dauer von mindestens 5 Tagen, bei einer Temperatur zwischen 34 und 37°C, durchgeführt wird, wobei die Perfusion mit einer Perfusionsrate von 0,3 bis 10 v/v/Tag durchgeführt werden kann. Im Perfusionsreaktor kann weiters eine eine Zelldichte von 2 x 109 bis 2 x 10xo Zellen pro Liter Fermentationsvolumen, letztere bei einem Fließbett-Fermenter, vorgesehen werden.
Die erfindungsgemäße VirusVermehrung in einer Perfusionskul¬ tur ermöglicht eine im Vergleich zu einer chargenweisen Kultivierung wesentliche Verkürzung der durch die Perfusi¬ onsrate vorgegebenen Verweilzeit des Virus- und des Virusan¬ tigens im Medium. Durch die kürzere Verweilzeit kommt es zu einer weit geringeren thermischen Inaktivierung und damit zu
einer höheren Produktivität des erfindungsgemäßen Verfah¬ rens. So kann im Perfusionsmedium eine Antigenkonzentration von 1 bis 10 μg/ml erreicht und aufrecht erhalten werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren können auf einfache Weise die zur Kultivierung optimalen Bedingungen eingestellt werden. Außerdem sind zur Durchführung wesentlich geringere Manipulationen erforderlich als bei allen bekannten Verfah¬ ren, was eine größere Sicherheit im Umgang mit dem infekti¬ ösem Material bedeutet und ein kontinuierliches rasches Aufarbeiten des Virus und der Virusantigene aus dem Kultur¬ medium ermöglicht.
Die Herstellung des Virusinokulums, die Anzucht der Zellen für die Virus- bzw. Virusantigenproduktion und die eigent¬ liche Virus- bzw. Virusantigenproduktion werden nachstehend näher beschrieben.
1. Virusinokulum
Zellen (z.B. Vero ATTC CCL 81) werden in Rollerflaschen bei 37°C bis zur Konfluenz angezüchtet und mit 1 ml einer Saatvirussupension infiziert. Ab dem 2. Tag nach Infektion wird täglich ein halber Medienwechsel mit serumfreiem Medium durchgeführt. Die Medienüberstände vom 4. bis zum 8. Tag enthalten 2-5 x 10v p.f.u. pro ml und werden bis zu ihrer Verwendung als Virusinokulum bei -20°C gelagert.
2. Anzucht der Zellen für Virus/Virusantigenproduktion
Ausgehend von den in Flüssigstickstoff gelagerten ATTC CCL 81 Arbeitssaatzellen, wird eine Vermehrung dieser Zellen in Gewebekulturflaschen durchgeführt bis eine Zellmenge er¬ reicht ist, die es erlaubt, einen Fermenter zu inokulieren. Die weitere Kultivierung der Zellen erfolgt in Fermentati¬ onsgefäßen bei 37°C, wobei man den adhärent wachsenden Arbeitssaatzellen möglichst viel Oberfläche zum Anhaften zur
Verfügung stellen soll. Solche großen Oberflächen bieten sich in der Verwendung von Rollerflaschen aus Glas oder Polystyrol oder in der Verwendung von Microcarriern (MC) an. Am besten sind MC aus quervernetztem Dextran mit einer Größe zwischen 170μm und 250μm geeignet.
Die mit Saatzellen beladenen MC werden bei 37°C kultiviert bis eine Zelldichte von 1.10= - 4.10s Zellen pro cm2 erreicht ist. Diese Zelldichte ist im allgemeinen nach sechs Tagen erreicht. Während der Kultivierung kommt es zu einer vollständigen Überwachsung der Microcarrier mit Zellen, wobei schließlich einzelne Microcarrier über den auf ihrer Oberfläche haftenden Zellrasen miteinander zur Gruppen verwachsen können.
3. Virus/Virusantigenproduktion
Nachdem die angegebene Zelldichte erreicht wurde, werden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Matrix die am MC gebunde¬ nen Zellen mit dem Virusinokulum infiziert (1-0,01 pfu/Zelle, bevorzugt 0,1 pfu/Zelle) . Die erfindungsgemäße Matrix kann einige Tage bei einer Temperatur zwischen 0°C und 8°C gelagert werden oder sofort zur Virusantigenproduk¬ tion verwendet werden.
Zur Antigenproduktion werden die mit infizierten Zellen beladenen MC in einen Perfusionsreaktor eingebracht. Ab diesem Zeitpunkt der Virusinfektion wird in der Kultur nur serumfreies Medium verwendet, das kontinuierlich durch den Perfusionsreaktor gepumpt wird, während die auf den Micro¬ carriern kultivierten Zellen mittels einer Rückhaltevorrich¬ tung im Reaktor zurückgehalten werden. Im ablaufenden Kulturmedium befindet sich ab dem 2. Tag nach Infektion Virusantigen in hoher Konzentration und kann mindestens 10 Tage daraus kontinuierlich gewonnen werden.
Mit den nachfolgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren noch weiter erläutert. Die Bestimmung des Virus¬ antigens erfolgte in allen Beispielen mit einem Antigen- ELISA.
Beispiel 1
Vero-Zellen ATCC CCL 81 wurden in einem 6-1-Fermenter auf Microcarrier (Cytodex 3 der Firma Pharmacia) bei 37° C bis zu einer Zellzahl von 2xl06 pro ml Kulturmedium (DMEM = Dulbecco's Eagle Medium) kultiviert und
a) mit FSME-Virus (0,1 pfu/Zelle) infiziert und die Virusvermehrung chargenweise durchgeführt
Die Produktivität betrug pro 1 Fermentationsvolumen 4mg Virus/Virusantigen.
b) mit FSME-Virus (0,1 pfu/Zelle) infiziert und Kultur¬ medium (DMEM) kontinuierlich mit 0,5 Volumen/Fermentervolumen/Tag perfundiert
Die Produktivität betrug pro 1 Fermentationsvolumen 13,7 mg Virus/Virusantigen.
c) mit FSME-Virus (0,1 pfu/Zelle) infiziert und Kultur¬ medium (DMEM) kontinuierlich mit 1 Volumen/Fermentervolumen/Tag perfundiert
Beispiel 2
Vero-Zellen (ATCC CCL 81) wurden in einem 40-1-Fermenter auf Microcarrier (Cytodex 3 der Firma Pharmacia) bei 37° C bis zu einer Zellzahl von 2xl06 Zellen/ml kultiviert und nach Infektion mit FSME-Virus (0,1 pfu/Zelle) kontinuierlich mit Medium (DMEM) (0,33 Vol/Fermentervolumen/Tag) perfundiert.
Die Produktivität betrug pro 1 Fermentationsvolumen 10,7 mg Virus/Virusantigen.
Beispiel 3
Vero-Zellen (ATCC CCL 81) wurden in einem 40-1-Fermenter auf Microcarrier (Cytodex 3 der Firma Pharmacia) bei 37βC bis zu einer Zellzahl von 3xl06 Zellen/ml kultiviert und nach Infektion mit FSME-Virus (0,1 pfu/Zelle) kontinuierlich mit Medium (DMEM) (1 Vol/Fermentervolumen/Tag) perfundiert.
**) Perfusionsrate wurde auf 0,5 V/Fermenter- volumen/Tag reduziert
Die Produktivität betrug pro 1 Fermentationsvolumen 21,7 mg Virus/Virusantigen.
Beispiel 4
Vero-Zellen (ATCC CCL 81) wurden in 150-1-Fermenter auf Microcarrier (Cytodex 3 der Firma Pharmacia) bei 37° C bis 2xl06/ml kultiviert und nach Infektion mit FSME-Virus (0,1 pfu/Zelle) kontinuierlich mit Medium (DMEM) (0,33 Vol/Fermentervolumen/Tag) perfundiert.
Tage nach Infektion Virus/Virusantigen μg/ml
6 5,40
7 4,10
8 4,40
9 3,20 10 4,50
Die Produktivität betrug pro 1 Fermentationsvolumen 14,7 mg Virus/Virusantigen.
Claims
1. Matrix mit daran adhärent gebundenen menschlichen oder tierischen, virusinfizierten Zellen zur Produktion von Virus/Virusantigen.
2. Matrix nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als adhärent gebundene Zellen Vero-Zellen ATTC CCL 81 vorgesehen sind.
3. Matrix nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die adhärent gebundenen Zellen mit Frühsommer-Meningo- enzephalitis-(FSME)-Virus infiziert sind.
4. Matrix nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die adhärent gebundenen Zellen mit Flavivirus oder mit Arenavirus infiziert sind.
5. Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß sie aus Glas, quervernetztem Dextran, Gelatine oder Kunststoff besteht.
6. Matrix nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Microcarrier ausgebildet ist.
7. Matrix nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß an ihrer Oberfläche pro cm2 zwischen 1x10= und 4x10= Zellen adhärent gebunden sind.
8. Verfahren zur Produktion von Frühsommer-Meningoen- zephalitis-(FSME)-Virus-Antigen unter Verwendung einer Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß oberflächenabhängige permanente Zellen, vorzugsweise die Vero-Zellen ATTC CCL 81, mit dem FSME-Virus beimpft werden und die Zellen in einem serumfreien Medium unter Aufrechterhaltung ihrer Lebensfä¬ higkeit an einer Matrix adhärent gebunden gehalten werden, um eine Antigenbildung in den Zellen und eine Antigenabgabe an das Medium aufrecht zu erhalten, worauf das antigen- hältige Medium von den trägergebundenen Zellen getrennt und in bekannter Weise durch Aufkonzentrieren. Inaktivieren und Reinigen zu einem galenisch akzeptablen Präparat aufgearbei¬ tet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Virusvermehrung und Antigenbildung in einem kontinuierlich betriebenen Perfusionsreaktor während einer Dauer von mindestens 5 Tagen bei einer Temperatur zwischen 34 und 37°C durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Perfusion mit einer Perfusionsrate von 0,3 bis 10 v/v/Tag durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß im Perfusionsreaktor eine Zelldichte von 2 x 109 bis 2 x lO10 Zellen pro Liter Fermentationsvolumen, letztere bei einem Fließbett-Fermenter, vorgesehen wird.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß im Medium eine
Virus/Virusantigenkonzentration von 1 bis 10 μg/ml aufrecht erhalten wird.
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