DD271057A1 - Verfahren zur herstellung von tollwutimpfstoffen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung inaktivierter Tollwutimpfstoffe fuer die Human- und die Veterinaermedizin auf der Grundlage eines an eine primaere Zellkultur angepassten Tollwuthirnimpfstammes. Das Ziel der Erfindung ist ein Tollwutimpfstoff, der wegen seines hohen Reinheitsgrades sowohl zur prae- als auch postexpositionellen Behandlung beim Menschen und unkonzentriert zur vorbeugenden Anwendung in der Veterinaermedizin geeignet ist. Bestimmte Varianten eines Tollwutvirus vom Kaninchengehirn werden an Einschicht-Nieren-Zellkulturen von Hunden durch Wechsel bzw. fortlaufende Passagen bei einer bestimmten Temperatur angepasst und zu einer hohen Vermehrungsrate gebracht und das auf diese Weise an Einschicht-Nieren-Zellkultur von Hunden angepasste Tollwutvirus sowohl in diesem Zellsystem selbst oder in einer permanenten Zelle fuer die Impfstoffherstellung vermehrt, wobei die letztgenannten Vermehrungssubstrate vorzugsweise fuer die Herstellung eines inaktivierten Tollwutimpfstoffes fuer die Veterinaermedizin verwendet werden koennen.

Description

1· Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung inaktivierter Tollwutimpfstoffe

2. Anwendungsgebiet dar Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines inaktivierten Tollwutimp;*stoffes, der sowohl zur Anwendung in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin geeignet ist.

3. Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bei bekannten Verfahren zur Herstellung eines Tollwutimpfstoffes werden bestimmte Varianten des Tollwutvirus mit charakteristischen biologischen Eigenschaften im Gehirn, zum Beispiel von Schafen oder Säuglingsmäusen, vermehrt. Die auf dieser Basis gewonnenen Impfstoffe sind hoch reaktogen und verursachen schwerwiegende neurale Kompli- kationen. Weitere Impfstoffe werden auf der Basis von aviären Embryonen hergestellt. Sie sind weniger reaktogen aber ihre Immunantwort ist im allgemeinen unzureichende Moderne Impfstoffe werden in wenigen Ländern auf der Basis von Zellkulturen hergestellt. Eine Vermehrung des Virus fixe auf Zellkulturen besitzt den Vorteil, daß der Impfstoff sich durch einen geringen Anteil nichtviraler Ballaststoffe auszeichnet und dadurch über eine gute allgemeine und lokale Verträglichkeit verfügt. Bei den Adaptationsverfahren des Gehirnimpfstammes an die Zellkultur wurde das Virusmaterial nur einige Tage auf den Zellen gelassen« Die auf Zellkulturen vermehrten Viren werden durch bekannte Verfahren der Inaktivierung, Konzentrierung und Reinigung zum Beispiel Fällcingsreaktionen, Ultrafiltration, Ultrazentrifugation und anschließender Lyophilisation zu einem Impfstoff verarbeitet.

4. Ziel der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde_e inaktivierte Tollwutimpfstoffe zu entwickeln« die wegen des hohen Reinheitsgrades und hohen Antigengehaltes sowohl zur prae- als auch zur postexpositionellen Behandlung beim Menschen geeignet sind und in weniger konzentrierter Form zur Tollwutimpfung von Hunden und anderen Haustieren eingesetzt werden können·

5. Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Erreichung des genannten Zieles so zu entwickeln, daß das für die Impfstoffherstellung verwendete Tollwutvirus in Zellkulturen vermehr., wird, so daß der auf diese Weise hergestellte Impfstoff einen geringen Anteil an nichtviralen Ballaststoffen besitzt und somit über eine gute lokale und allgemeine Verträglichkeit verfügt. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß bestimmte Varianten des Tollwutvirus vom Kaninchengehirn an Einschicht-Nieren-Zellkulturen von Hunden durch Wechsel bzw· fortlaufende Passagen bei einer bestimmten Temperatur (z.B. nach 20 Passagen bei 30° - 38° vorzugsweise 34⁰C) angepaßt und zu einer hohen Vermehrungsrate gebracht werden kann und daß das auf diese Weise an die Einschicht-Nieren-Zellkultur von Hunden angepaßte Tollwutvirus sowohl in diesem Zellsystem selbst oder in einer permanenten Zelle (z.B. BHK-21 13 S, CER, Neuroblastomzelle) für die Impfstoffherstellung vermehrt werden kann, wobei die letztgenannten Vermehrungssubstrate neben der Einschicht-Nieren-Zellkultur vorzugsweise für die Herstellung eines Veterinärtollwutimpfstoffes verwendet werden können. Überraschend zeigte sich, daß die Adaptation an die Zelle beschleunigt werden kann, wenn das Virusmaterial von einer äußerst späten Ernte verwendet wird, einer Ernte bei der der Maximaltiter bereits überschritten ist.

6_β Ausführungebeispiele

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren wird der Tollwutvirus fixstamm "Pasteur Potsdam" verwendet, der durch 4 Wechselpassagen (Zelle-Mäusesäugling) und anschließender direkter Zellpassagierung des "Pasteur^v-Stammes (Original 2061 Kaninchenhirnpassage, "Pasteur"-Institut, Paris) auf den primären Hundenierenzellkulturen gewonnen wurde und dabei etwa 25% (2095 Passage) der ursprünglichen peripheren Haftfähigkeit des "Pasteur"-Stammes (i.m.; cc; i.p.) auf verschiedenen Versuchstieren (Maus, Ratte, Kaninchen, Hamster) verloren hatte. Zur Produktion eines humanen Tollwutimpfstoffes wird die primäre Hundenierenzellkultur mit einer Einsaatdichte

5 5 von 1 · 10 - 3 · 10 Zellen/ml stationär als auch im Roller angelegt· Als Wachstumsmedium dient Hanks-Medium (pH 7,2) mit 0,5% Laktalbuminhydrolysat, 10% Kälberserum und Antibiotika. Die Trypsination der Hundeniere erfolgt entweder von frischem oder eingefrorenem Organmaterial· Die 5-7tägige Zellkultur wird bei 37⁰C 1 h mit dem "Pasteur Potsdam"-Stamm inkubiert und anschließend bei 34⁰C 2-4 Tage mit einem Hanks-Gelatine-Oextran-Medium (o,25% Gelatine, 0,6% Dextran, 0,5% Laktalbuminhydrolyosat, ohne Antibiotika pH 7,5 - 8,0) und 2% Kälberserum gehalten· Nach Dekantieren des Oberstandes werden die Zellen mit Hanks-Gelatine-Dextran-Medium ohne Serum und ohne Antibiotika versetzt. Im Abstand von 1-4 Tagen sind 3-5 Ernten mit einem Titer von 10⁵»⁰ - 10^7f0/ml (MICLD₅₀) möglich. Die Inaktivierung erfolgt mit ß-Propiolacton, z,B, im Verhältnis 1 ; 4000 (0,025%) innerhalb von 18 h bei 4⁰C. Anschließend wird das Material zur Hydrolyse des ß-Propiolactons 2 h bei 37⁰C gehalten. Die Konzentrierung und Reinigung wird mittels Zonenzentrifugation auf einem Saccharosedichtegradienten durchgeführt. Anschließend wird das'Material auf den gewünschten Konzentrierungsfaktor z.B. 20 mit NTE-Puffer pH 7,8 verdünnt, mit einem geeigneten Stabilisator versetzt, ampulliert und gefriergetrocknet. Mit dem NIH-Test wird ein Antigenwert von mindestens 2,5 erreicht,

Zur Virusvermehrung des "Pasteur Potsdam"-Stammes mit dem Ziel einer Herstellung von inaktiviertem Veterinärtollwutimpfstoff werden BHK 21 13 S Zellen in Flaschen oder Rollern mit MEM Medium Glasgow Modifikation, welches 10% Tryptosephospbatbrei, 10% inaktiviertes Kälberserum und Antibiotika (200 IE Penizillin, 200,ug Streptomycin/ml) enthält, kultiviert, Nach 3-4 Tagen erfolgt die Inkubation der Zellen mit dem

'^l "Pasteur Potsdam"-Stamm für 1 h bei 37⁰C. Die Virusvermehrung

. _#erfolgt in einem Haltungsmedium von MEM Glasgow Modifikation, 0,2% Rinderserumalbumin Fraktion V und Neomycin bei pH 7,5 8,0 bei einer Temperatur von 34⁰C₀ Nach 1-4 Tagen erfolgt die Ernte. Bei guter Zellqualität ist eine weitere Ernte

möglich. Die Virustiter liegen bei 10⁶'⁵ - 10⁹ (MICLD₅₀). Das Virusmaterial wird mit Betapropiolakton inaktiviert, mit einem geeigneten Stabilisator versetzt und lyophilisiert_β An Stelle der BHK 21 13 S Zelle kann die primäre Hundeniereni'.elle (vgl. Beispiel 1) ohne Konzentrierung und Reinigung verwendet werden.

Claims (2)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung von inaktivierten Tollwutimpfstoffen gekennzeichnet dadurch, daß zur Herstellung der Impfstoffe eine Variante des Tollwutvirus verwendet wird, die sich vom Kaninchengehirn ableitet und an stationäre Einschichtzellkultur von Hundenieren unter Verwendung des Virusmaterials eines spaten Erntezeitpunktes, gegebenenfalls durch mehrfachen Wechsel des Vermehrungssubstrates (Gehirn, primäre Hundenierenzelle) bei 30 - 37⁰C, vorzugsweise Lai 34⁰C angepaßt wurde.

   Z, Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß die Vermehrung des erfindungsgemäß an Hundenierenzellen angepaßten Tollwutvirus in stationären, Roller und Mikrocarrierkulturen erfolgt,

   3« Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß die

   Vermehrung des an Hundenierenzellen angepaßten Tollwutvirus

   in permanenten Zellkulturen (BHK-21 13 S, CER, Neuroblastomzelle) erfolgt.
2. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1-3 gekennzeichnet dadurch, daß das Tollwutvirus durch an sich bekannte Verfahren der Virusreinigung und Inaktivierung und nachfolgender Lyophilisation zu einem Impfstoff verarbeitet wird₀

   5, Verfahren gemäß Anspruch 4 gekennzeichnet dadurch, daß die Lyophilisation des konzentrierten und gereinigten und inaktivierten Tollwutvirus in Gegenwart eines Stabilisators zur Verhinderung von Antigenverlusten durchgeführt wird.