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Diese Erfindung bezieht sich auf ein Züchtungsmedium für Mikroorganismen auf Basis einer heteroploiden menschlichen Leberzellenart.
Unter"heteroploid"wird ein Zellsystem verstanden, bei welchem weniger als 75% den gleichen Karyotypus aufweisen, wie die normalen Zellen des Teils, von welchem die Zellen ursprünglich erhalten wurden.
Es ist bekannt, dass gewisse Typen von menschlichen Geweben in vitro als Gewebekulturen gezüchtet wer- den können und einige von diesen verwandeln sich in Zellenarten, die imstande sind, mehrmals in ange- messenem Massstab fortgepflanzt und übertragen zu werden. Besonders nützlich sind diese, die eine weitgehende
Chromosomenveränderung erhalten haben und in ihrer Beschaffenheit heteroploid wurden, da solche Zellen- arten kontinuierlich sind und praktisch unbegrenzt in sehr grossem Massstab übertragen und vervielfacht werden können und so die Basis für die industrielle Produktion von Viren und der entsprechenden Impfstoffe ergeben.
Zahlreiche Arten von pathogenen Viren infizieren die Leber und vervielfachen sich darin, so dass ein grosser
Bedarf für eine kontinuierliche Zellenart bestand, die imstande ist, solche Viren zu unterhalten.
Nur fibroblastische Diploidzellenarten wurden bis jetzt aus Leberzellen erhalten, aber diesehatten-eine begrenzte Lebensdauer. Permanente Heteroploidzellenarten aus menschlichen Leberzellen, die ihre Beschaffen- heit erhalten und denForschern die Möglichkeit geben, die Natur einiger Pathogene in solchen Zellen zu unter- suchen, diese in kontinuierlichen Kulturen zu züchten und dadurch die Möglichkeit für die Herstellung anti- genischen Materials aus den fortgepflanzten und isolierten Viren für Impf-und Diagnosezwecke zu schaffen, wurden bis jetzt nicht erhalten. Ein Gegenstand der Erfindung ist es, ein Züchtungsmedium mit einer solchen
Zellenart zu beschaffen, insbesondere einer menschlichen Epithelleberzellenart, die Glykogen enthält und die in ihrer Morphologie und in ihrer biochemischen Aktivität Leberzellen in vivo ähnelt.
Erfindungsgemäss wird eine menschliche Epithelheteroploidleberzellenart (Art WRL 68) eingesetzt, die bei der Züchtung in einem Wuchsmedium individuell getrennte Inseln oder getrennte Klumpen bildet und eine sehr ähnliche Morphologie mit den Hepatozyten. der menschlichen Leber und eine Bildungszeit von nicht mehr als
24 h hat und die weiters eine verstärkte Produktion von Glykogen in der Gegenwart von 10/0 Glucose im Medium ergibt und befähigt ist, Viren zu unterhalten.
Gegenstand derErfindung istsomit einZüchtungsmedium für Mikroorganismen, insbesondere Viren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die neue heteroploide Epithelleberzellenreihe, hinterlegt bei der American
Type Culture Collection unter der Nr. CL 48, in einem geeigneten Medium, insbesondere Eagle, s Minimal
Essential oder Basal Medium oder Medium 199, enthält.
Die Zellenart WRL 68 ist bei derWelIcome Collection ofMicro-organisms and Cultures, Beckenham, Kent,
England und auch bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, Vereinigte Staaten von Amerika (ATCC Zugangsnummer (accession number) CL 48) deponiert.
Der Typus der erfindungsgemäss eingesetzten Zellenart ist heteroploid, d. h. die Anzahl der typisch menschlichen Chromosomen, etwa 63 bis 91, durchschnittlich etwa 72, ist überwiegend nicht diploid oder nicht normal. Unter dem optischen Mikroskop sind die Zellen im Aussehen polygonal und epitheloid u. ähnl. den Hepa- tozyten.
Um die Erfindung leichter zu verstehen und um die Hauptmerkmale der Zellen zu erkennen, werden jetzt die unter dem optischen Mikroskop und dem Elektronenmikroskop sichtbaren Merkmale der Zellenart WRL 68 in Form eines Beispiels mit Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in welchen Fig. 1 eine
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Vergrösserung sichtbaren Hauptmerkmal zeigt.
Fig. 2 stellt eine Zeichnung dar, die wiedergibt, was unter einem Elektronenmikroskop bei 19000facher Vergrösserung eines Abschnitts zu sehen ist.
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dem Elektronenmikroskop das Zytoplasma-CP-viele Körnchen-MB-enthält, die wahrscheinlich aus Upoidmaterial bestehen. Sowohl Mitochondrien-M-als auch Glykogen-GL-sind sehr zahlreich. Das Aussehen im Elektronenmikroskop ist dem von typischen menschlichen Hepatozyten sehr ähnlich und ist von der üblichen Struktur fibroblastischer Zellen sehr verschieden.
Züchtungsmedien mit solchen und praktisch identischen Zellenarten, die durch den Fachmann durch Ab- änderung oder Clonieren der beschriebenen Zellenarten erhalten werden können und dadurch von der Erfindung ohne wesentliche Änderung der morphologischen und funktionellen Eigenschaften der Zellenarten oder der der Kultur erhalten werden, liegen im Rahmen der Erfindung. Obwohl die aufgezeigte allgemeine Zugänglichkeit den einfachsten Weg darstellt, um eine Zellenart gemäss der Erfindung zu erhalten, ist es nicht gänzlich unmöglich oder unwahrscheinlich, dass ähnliche und funktionell im wesentlichen identische menschliche Epithelheteroploidleberzellenarten durch andere Methoden od. ähnl. unerwartete Zufallsvorgänge hergestellt werden können.
Solche funktionelle im wesentlichen identische Zellenarten sind biologisch äquivalent der Zellenart WRL 68 und liegen daher auch im allgemeinen Rahmen der Erfindung.
Die Zellenart WRL 68 wurde, soweit bekannt ist, durch eine vollkommen unerwartete und originelle spontane Transformation erhalten, wenn menschliche Embryolebergewebe mit Trypsin versetzt wurde und in
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Basal (Eagle H., J. Exp. Med. Bd. 102 [1955], S. 595) Media" verwendet werden, da diese leicht zugänglich sind, Wie üblich, können diese mit Rinderserum, insbesondere Kalbserum, ergänzt werden. Bevorzugt wird die übliche Menge an Aminosäuren und Vitaminen auf einen Faktor von etwa 2 vergrössert. Medium 199 (Morgan J. F., et. al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Bd. 73 [1950], S. l) kann auch verwendet werden. Die Bildungszeit ist gewöhnlich 15 h unter günstigen Bedingungen, wie z.
B. bei 370C. Die Zellenart bildet nicht kontinuierliche Scheiben, sondern wächst als Inseln oder getrennte Klumpen, die Leberlobula ähneln. Ihre durchschnittliche Grösse liegt zwischen 2 und 3 mm oder etwa bei 3 mm.
Biochemisch erzeugen die erfindungsgemäss eingesetzten Zellenarten Glykogen wie die funktionierenden Zellen, die Hepa. tozyten der Leber. Als vollkommen menschliche permanente Heteroploidarten sind sie onkogenisch, wenn sie in den Hamsterbackentaschen getestet werden.
Das erfindungsgemässe Züchtungsmedium kann für die Züchtung von verschiedenen menschlichen und tie-
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bis-Virus.
Die auf diese Weise erhaltenen Viren sind in bekannter Weise für eine weitere Verwendung geeignet, z. B. zur Übertragung in die gleiche oder in andere Zellkulturen, um einen gereinigten oder verdünnten Stamm und ein Lebendvakzine zu erhalten. Das erfindungsgemäss gezüchtete antigenische Virusmaterial kann auch durch die üblicherweise angewendeten Methoden inaktiviert werden, um inaktivierte Vakzine herzustellen. Lebendvakzine oder inaktivierte Vakzine werden gewöhnlich in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger in flüssiger oder fester Form in den Handel gebracht.
Eine andere Möglichkeit, das erfindungsgemässe Züchtungsmedium zu verwenden, ist in der Forschung,
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B.für die menschlichen Hepatitisviren ; füngieren, welche bis jetzt noch in keiner Kultur erfolgreich In vihv ge- züchtet wurden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung (zu dem in den Beispielen angeführten San Carlos Virus, s. "Diseases of the Liver" von A. J. Zuckermann ; zu den übrigen Viren "Viruses of Vertebrates" von Andrews & Pereira).
Beispiel l : Eine Probe der Heteroploidleberzellenart WRL 68, die ungefähr etwa 105 bis 106 Zellen repräsentiert, wird in eine 1 Unzenarzneiflasche, die "Eaglets Minimal Essential Medium" ergänzt mit 10%
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sorbieren gelassen. Der Überschuss des Virus wird mit dem Erhaltungsmedium (ohne Serum) ausgewaschen und die Kultur bei 370C ausgebrütet.
Ein zytopathischer Effekt, der typisch für die Adenoviren ist, wurde nach 3 Tagen beobachtet. Die Kultur wird dann eingefroren und aufgetaut, um das Virus von den Zellen zu befreien. Die Zellenreste werden abfiltriert und die Anwesenheit des Virus im Medium wird durch Hämagglutination der roten Blutzellen von Patasaffen nachgewiesen. Der Titer war 128, was anzeigt, dass die maximale Verdünnung noch Hämagglutination zeigt.
Adenovirusstämme-4, 5,7 und 15-- wurden auch in der Zellenart gezüchtet und ergaben zufriedenstellende Titer.
Beispiel 2 : Der Lister-Stamm des Vaccina : virus wurde in einer Kultur der Heteroploidleberzellenart,
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licher zytopathischer Effekt wurde beobachtet.
Beispiel 3 : Die folgenden Viren wurden auch erfolgreich wie in den vorangehenden Beispielen beschrieben, in der Heteroploidleberzellenart WRL 68 gezüchtet : Poliomyelitisvirus, Echoviren-2, 7, 9,11, 15,17, 20, 23 und 25--, die vorhergehend an Hela-Zellkulturen adaptiert wurden, Sendai-Virus, Herpesvirus, Katzeninfektionsenteritisvirus, San Carlos-Virus und'Orbo- viren, wie z. B. das Semliki Forest-Virus und das Sindbis-Virus.
Diese Viren zeigen zufriedenstellende antigenische Eigenschaften nach ihrer Anpassung an die menschliche Heteroploidleberzellenart. Solche und andere empfängliche Viren können daher in einer solchen Zellenart gezüchtet werden und als ein Impfstoff in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger nach angemessener Inaktivierung oder Verdünnung gemäss bekannter Verfahren in den Handel gebracht werden.