JPH05502581A - 付着的に結合した細胞を有するマトリックスおよびウイルス／ウイルス抗原の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 付着的に結合した細胞を有するマトリックスおよびウィルス／ウィルス抗原の製 造方法 本発明は付着的に結合したヒトまたは動物細胞を有する細胞マトリックス、並び にウィルス／ウィルス抗原の製造方法、とりわけダニによって媒介される脳炎（ ＴＢＥ）ウィルスのウィルス抗原の製造方法に関する。

ヨーロッパにおけるＴＢＥウィルス感染は、第２次世昇天戦当時から観察されて いる。オーストリア、南ドイツ、及びチェコスロバキアでは、毎年、数百人の患 者が定常的にＴＨＥ感染の治療を受けている。ＴＢＥウィルスはアルボウィルス （ａｒｂｏｖｉｒｕｓ）の早期血清学的グループＢのワラビウイルス（ｆｌａｖ ｉｖｉｒｕｓ）群に分類されており、トガビリダニ（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ） ウィルス群の遺伝子を有する。

最も重要かつ最も頻繁に起きるヒトの脳炎病原体の１つ、日本脳炎ウィルス、に 対する不活化ワクチンがこれまでに利用可能となっている。これらのワクチンは 感染マウスの脳から回収、精製され、安全かつ有効であることが確かめられてい る［ホークら（Ｈｏｋｅ　ｅｔ　ａｌ、）　、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３ １９．６０８　（１９８８）］。

１１９７６年以降ＴＢＥワクチンが利用可能となり、保健機関によって承認され ている。このワクチンを製造するには感染した赤ん坊マウスの脳でウィルスを培 養し、ニワトリ胚細胞内で増殖させ、ホルマリンで不活化した後、有効な精製法 に付すことからなる［）１インツら（Ｈｅｉｎｚ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｊ、Ｍ ｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、、　６．１０３（１９８０）コ。

文献にはワクチンの製造の可能性という観点から、多くのアルボウィルス類を増 殖し得る方法が記載されている。今日最も多く用いられている方法はニワトリ胚 線維芽細胞にマウス脳から回収したＴＢＥシード（種）ウィルスを接種し、接種 された細胞を培養することからなる。この方法では、ワクチン接種をされるべき ヒトに、得られたワクチンの接種量を繰り返し接種したとき感作作用が起きない よう、複雑な異種の生物学的物質を除去するために、抗原を複雑な方法で精製す る必要がある。

ニワトリ胚細胞を得るためには、ＳＰＦ　（特異病原体を含まない＝ｓｐｅｃｉ ｆｉｃ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｆｒｅｅ）卵から出発する必要がある。また、その ＳＰＦ状態を維持するために、使用前にこれらのＳＰＦ卵を膨大な回数の、時間 のかかる試験に付す必要がある。

さらに、ニワトリ胚細胞培養は少ない世代数しか連続培養できず、従ってバッチ サイズに制限があり、１次培養を滅菌状態に保つことが困難であり、ウィルス増 殖および抗原生産に関する１次細胞の質は一定でなかった。

これらの不利益はＴＢＥウィルス抗原の製造方法のみならず、広く抗原一般の製 造方法に存在している。

本発明は上記の不利益が解消されたウィルス／ウィルス抗原、特にＴＢＥウィル ス／ウィルス抗原の製造方法の改良、ならびに、特に大量生産を可能ならしめる 細胞培養におけるウィルス／ウィルス抗原の増殖方法であって、同時に簡単な方 法で培養を無菌状態に維持することができる方法を提供することを目的とするも のである。

さらに、望ましくない細胞タンパク質の培養上清への混入を最小限にする。

上記の目的を達成するために、マトリックス、即ち担体マトリックスであってそ れに付着的に結合しているウィルスに感染したヒトまたは動物細胞を有する担体 マトリックス、を提供する。本発明はウィルス増殖に適した表面−依存性細胞が ウィルスに感染した状態でもマトリックスに付着的に結合したままであって、か なりの長期間、連続してウィルス抗原を産生じ、培養培地に分泌するという所見 に基づいている。

本発明のマトリックスは感染細胞を保持したまま数日間、０°Ｃから８℃の間で 、即ち細胞の代謝、即ちウィルス生産が停止する条件下で、保管することができ る。その後、このようにして停止したマトリックスを培養培地に入れ、個々の増 殖条件を調節することでウィルス生産に問題なく用いることができる。このよう に本発明のマトリックスは、その無菌状態のチェックが容易であり、任意の時に ウィルス抗原の製造に用いることができる、一定の質と活性を持つストックとし て製造され得る培養出発物質を構成するものである。

抗原−生産細胞の担体（キャリアー）への結合はまた、生産に備えたウィルス感 染細胞の取り扱いを極めて簡単にする。即ち、例えばウィルス／ウィルス抗原の 生産を潅流リアクター（反応器）によって連続的に行うことができる。抗原含有 培養からの細胞の分離は、それがマトリックスに結合していることで実質上容易 になり、その結果、本発明のマトリックスはウィルス／ウィルス抗原の商業規模 での製造を簡単にするものである。

好ましい態様では、本発明のマトリックスは付着的に結合する細胞としてＶｅｒ ｏ細胞ＡＴＣＣＣＣＬ　８１を用い、これを好ましくはＴＢＥウィルス抗原の製 造、即ちＴＢＥウィルスに感染させて用いる。

しかしながら、マトリックスに付着的に結合した細胞をフラビウイスルまたはア レナウイルスに感染させてもよい。

マトリックスの原料として、ガラス、交差結合デキストラン、ゼラチンまたは合 成物質が適当であるが、粒子径が好ましくは１００μｍから３０００μｍの範囲 のマイクロキャリアーとして形成されたマトリックスが最良である。これらのマ イクロキャリアーは平滑表面または多孔性表面のいずれを有するものでもよい。

さらに好ましい態様では、本発明のマトリックスは、その表面面積（ｃｍ２）あ たり１ｘ１０５−４ｘｌＯ５個の細胞が付着的に結合していることを特徴とする 。

本発明はまた、本発明のマトリックスを用いるＴＢＥウィルス抗原の製造方法で あって、表面依存性永久細胞、好ましくはＶ　ｅｒｏ細胞ＡＴＣＣＣＣＬ　８１ にＴＢＥウィルスを接種し、細胞を、細胞内での抗原の生成が維持され抗原が培 地に分泌されるよう、生存性を保ちながら、血清不含培地中のマトリックスに付 着的に結合させたまま維持し、そこで抗原含有培地を担体−結合細胞から分離し 、製剤的に許容される（ｇａｌｅｎｉｃａｌｌｙ　ａｃｃｅｐｔｅｄ）、既知方 法でａ縮、不活化および精製により処理することを特徴とする方法に関する。

Ｖ　ｅｒｏ細胞株ＡＴＣＣＣＣＬ　８１はミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃ ｕｓ　ａｅｔｈｉｏｐｓ）の腎組織から得られ、血清不含培地で代謝的に活性に 維持される。そのような永久細胞株のために、マザーンードセルバンク（ｍｏｔ ｈｅｒ　５ｅｅｄ　ｃｅｌｌ　ｂａｎｋ）およびワーキングシードセルバンク（ ｗｏｒｋｉｎｇ　５ｅｅｄ　ｃｅｌｌ　ｂａｎｋ）が開始され、不純物のための 全試験が行われた。この永久細胞株は単にそれが混在細胞を含まないことのみな らず、その培養行動、出発培養、増殖行動によっても正確に特徴付けられ、一度 最適条件に調節すると一定であると考えられる。

本発明方法によれば、好ましくはマイクロキャリアーに結合したｖ　ｅｒｏ細胞 を用いる。その結果、本明細書で用いる１次細胞培養を用いて、高細胞密度が、 Ｒｏｕｘフラスコ内または懸濁液としてでなく、達成されそれにより発酵（培養 ）容量あたりのウィルスおよびウィルス抗原量の相当な増大が可能となる。

本発明方法の優れた態様ではウィルス増殖および抗原生成を連続操作される潅流 反応装置で少なくとも５日間、３４〜３７℃の温度にて、潅流速度０．３−１０ Ｖ／Ｖ／日で行う。さらに、潅流反応装置では発酵（培養）容量ＩＬあたり、２ ｘｌＯ’−２ｘｌＯ”細胞の細胞密度［後者はフルイツトベッドファーメンタ− （ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ　ｂｅｄ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）による］に達し得る。

本発明の潅流培養によるウィルス増殖法はバッチ培養に比較して培地中でのウィ ルスおよびウィルス抗原の、−潅流速度依存性−居住時間（ｄｗｅｌｌ　ｔｉｍ ｅ）を実質上、減少することができる。居住時間が短縮される程、熱不活化が少 なくなり、本発明方法の高生産性に至る。即ち、潅流培地内で抗原濃度１−１０ μｇ／ｍｌが達成され、維持される。

本発明方法によれば、培養のための最適条件は単純な方法で調節できる。さらに 従来法に比較してその実施に要する操作数が実質上少なく、感染性物質の取り扱 いがより安全であって、培地からのつ・１′ルスおよびウィルス抗原の処理を連 続的かつ迅速に行うことができる。

以下に、ウィルス接種物の製造、ウィルスおよびウィルス抗原の製造のための細 胞の培養、およびそのままのウィルスおよびウィルス抗原の製造をさらに詳しく 説明する。

１、ウィルス接種物 細胞（例、Ｖｅｒｏ　ＡＴＣＣＣＣＬ　８１）をローラー（Ｒｏｌｌｅｒ）フラ スコ内で３７℃において全面成長に達するまで培養し、シード（種）ウィルス懸 濁液１ｍｌを接種する。感染後２日目から開始し、毎日、培地の１／２を血清不 含培地で置換する。４日目から８日目までの培地上清は１ｍｌあたり２−５ｘ１ ０７ｐ、ｆ、ｕ、を有し、これを−２０℃でウィルス接種に用いるまで保存する 。

２、ウィルス／ウィルス抗原製造のための細胞培養液体窒素に保存したＡＴＣＣ ＣＣＬ　８１ワーキングンードセル（ｗｏｒｋｉｎｇ　５ｅｅｄ　ｃｅｌｌ）を 出発物質として用い、これらの細胞をファーメンタ−への接種のための量の細胞 が得られるまで組織培養フラスコで培養する。付着的に増殖するワーキングシー ドセルの付着のために、できるだけ多（の表面が得られるよう、細胞をさらに発 酵装置内で３７℃で培養し続ける。そのような大量の表面はガラス製またはポリ スチレン製のＲｏｌｌｅｒフラスコまたはマイクロキャリアー（ＭＣ）を用いて 得られる。サイズ１７０μｍ　−２５０μｍの交差結合デキストランのＭＣが最 適である。

シードセルを有するＭＣを細胞密度が１ｘｌＯ５−４ｘ１０５／ｃｍ２になるま で３７℃で培養する。通常、６日後にこの細胞密度に達する。培養期間中、マイ クロキャリアーに細胞を完全に過剰増殖させ、最後に個々のマイクロキャリアー をそれぞれの表面に付着する細胞シートを介してまとめるよう培養する。

３、ウィルス／ウィルス抗原製造 指定の細胞濃度に達したとき、ＭＣに結合した細胞をウィルス接種物で感染させ （１−０，０１ｐｆｕ／細胞、好ましくは０．１　ｐ　ｆＵ／細胞）本発明のマ トリックスを得る。本発明のマトリックスは０〜８℃の間で数日間保管でき、ウ ィルス抗原の製造のために即座に用いることができる。

抗原の製造のためには感染細胞を有するＭＣを潅流反応装置に入れる。ウィルス 感染進行のこの時点から、マイクロキャリアー上で培養された細胞を保持装置に よって反応装置内に維持しつつ、血清不含培地のみを用い、該培地を潅流反応装 置を介して連続的にポンプで送りながら培養する。感染後２日目から始めて少な くとも１０日間は高濃度のウィルス抗原が存在し、連続的にそこから回収される 。

以下に実施例を挙げ、本発明方法をさらに詳しく説明する。全実施例において、 抗原−ウィルス抗原を抗原−ＥＬＩ　ＳＡによって測Ｖｅｒｏ細胞ＡＴＣＣＣＣ Ｌ　８１を６Ｌファーメンタ−中、マイクロキャリアー上（Ｃｙｔｏｄｅｘ　３ ．　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で３７℃において細胞数が２　ｘ　１０６／ｍｌ培養 培地（ＤＭＥＭ＝ダルベツコのイーグル培地）に達するまで培養し、以下のいず れかに付す。

ａ）これにＴＢＥウィルス（０，１ｐｆｕ／細胞）を感染させ、バッチ内でウィ ルスを増殖させる。

表１ 感染後の日数　ウィルス／ウィルス抗原（μｇ／ｍｌ）発酵容量ＩＬあたりのウ ィルス／ウィルス抗原の生産量は４ｍｇに達した。

ｂ）これにＴＢＥウィルス（０，１ｐｆｕ／細胞）を感染させ、培養培地を０． ５容量／ファーメンタ−容量７日で連続的に潅流する。

轟一旦 感染後の日数　ウィルス／ウィルス抗原（μｇ／ｍｌ）発酵容量ＩＬあたりのウ ィルス／ウィルス抗原の生産量は１３゜７ｍｇに達した。

Ｃ）これにＴＢＥウィルス（０，１ｐｆｕ／細胞）を感染させ、培養培地（ＤＭ ＥＭ）を１容量／ファーメンタ−容量７日で連続的に潅流する。

煮−１ 発酵容量ＩＬあたりのウィルス／ウィルス抗原の生産量は１２゜４１１ｇに達し た。

実施例２ Ｖ　ｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　８１）を４ＯＬファーメンタ−中、マイクロ キャリアー上（Ｃｙｔｏｄｅｘ　３、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で３７℃において細 胞数が２　ｘ　１０　’／ｍｌになるまで培養基し、ＴＢＥウィルス（０，１ｐ ｆｕ／細胞）感染後、培地（ＤＭＥＭ）で連続的に潅流した（０３３容量／ファ ーメンタ−容量７日）。

表−Ａ 感染後の日数　ウィルス／ウィルス抗原（μｇ／ｍ１）１０　２、００ 発酵容量ＩＬあたりのウィルス／ウィルス抗原の生産量は１０゜７ｍｇに達した 。

実施例３ Ｖ　ｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　８１）を４０Ｌ７ｙ−メンタ−中、マイクロ キャリアー上ＣＣｙｔｏｄｅｘ　３、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で３７℃において細 胞数が３　ｘ　１０　’／ｍｌになるまで培養培し、ＴＢＥウィルス（０，１ｐ ｆｕ／細胞）感染後、培地（ＤＭＥＭ）で連続的に潅流した（１容量／ファーメ ンタ−容量／臼）。

表５ 感染後の日数　ウィルス／ウィルス抗原（μｇ／ｍｌ）＊＊：潅流速度は０．５ 容量／ファーメンタ−容量７日に下げた。

発酵容量ＩＬあたりのウィルス／ウィルス抗原の生産量は２１．７ｍＶｅｒｏ細 胞（ＡＴＣＣｃＣＬ　８１）を１５ＯＬファーメンタ−中、マイクロキャリアー 上（Ｃｙｔｏｄｅｘ　３、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で３７℃において細胞数が２　 ｘ　１０　’／ｍｌになるまで培養培し、ＴＢＥウィルス（０，１ｐｆｕ／細胞 ）感染後、培地（ＤＭＥＭ）で連続的に潅流した（０３３容量／ファーメンタ− 容量７日）。

表６ 感染後の日数　ウィルス／ウィルス抗原（μｇ／＋ｎｌ）発酵容量ＩＬあたりの ウィルス／ウィルス抗原の生産量は１４７ｍｇに達した。

要　約　書 付着的に結合した細胞を有するマトリックスおよびウィルス／ウィルス／抗原の 製造方法 本発明は、付着的に結合した、ウィルスに感染したヒトまたは動物細胞を有する マトリックス、即ち担体マトリックスに関する。ウィルス増殖に適した表面−依 存性細胞がウィルスに感染した状態でもマトリックスに付着的に結合したままで あって、かなりの長期間連続してウィルス抗原を産生じ、培養培地に分泌すると いうことが判明した。

ダニによって媒介される脳炎（ＴＢＥ）ウィルスを細胞培養中で増殖させること によりＴＢＥウィルス抗原を生産するために、表面依存性永久細胞、好ましくは Ｖｅｒｏ細胞ＡＴＣＣＣＣＬ８１にＴＢＥウィルスを接種し、抗原の生成を維持 する様に、細胞を、細胞の増殖を保持しながら、非溶菌性の血清不含系で担体に 結合させたまま維持し、そこで抗原含有培地を担体−結合細胞から分離し、既知 方法で濃縮、不活化および精製することにより製剤的に許容し得る製剤に加工す る。

国際調査報告 国際調査報告 曇 国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ウイルスに感染したヒトまたは動物細胞が付着的に結合しているウイルス／ ウイルス抗原製造のためのマトリックス。
2. ２．付着的に結合している細胞としてＶｅｒｏ細胞ＡＴＣＣ　ＣＣＬ８１が用い られていることを特徴とする請求項１のマトリックス。
3. ３．付着的に結合している細胞がダニによって媒介される脳炎（ＴＢＥ）ウイル スに感染していることを特徴とする請求項１または２のマトリックス。
4. ４．付着的に結合している細胞がフラビウイスルまたはアレナウイルスに感染し ていることを特徴とする請求項１または２のマトリックス。
5. ５．ガラス、交差結合デキストラン、ゼラチンまたは合成物質からなることを特 徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のマトリックス。
6. ６．マイクロキャリアーとして設計されていることを特徴とする請求項５のマト リックス。
7. ７．その表面１ｃｍ２あたり１ｘ１０５−４ｘ１０５個の細胞が付着的に結合し ていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項、またはそれ以上に記載の マトリックス。
8. ８．請求項１〜３または５〜７のいずれかに記載のマトリックスを用いるダニに 媒介される脳炎（ＴＢＥ）ウイルス抗原の製造方法であって、表面依存性永久細 胞、好ましくはＶｅｒｏ細胞ＡＴＣＣＣＣＬ８１にＴＢＥウイルスを接種し、細 胞を、細胞内での抗原の生成が維持され抗原が培地に分泌されるよう、生存性を 保ちながら、血清不含培地中のマトリックスに付着的に結合させたまま維持し、 そこで抗原含有培地を担体−結合細胞から分離し、製剤的に許容される既知の方 法で濃縮、不活化および精製により処理することを特徴とする方法。
9. ９．ウイルス増殖および抗原生成を連続的に操作される灌流反応装置で少なくと も５日間、３４〜３７℃の温度で行うことを特徴とする請求項８の方法。
10. １０．灌流を灌流速度０．３−１０ｖ／ｖ／日で行うことを特徴とする請求項９ の方法。
11. １１．灌流リアクター内で、発酵容量１Ｌあたり、２ｘ１０９−２ｘ１０１０細 胞の細胞密度（後者は連続フローファーメンターによる）が得られることを特徴 とする請求項９の方法。
12. １２．培地内の抗原濃度１−１０μｇ／ｍｌが維持されることを特徴とする請求 項８〜１１のいずれか１項または数項の方法。