HU212597B - Method for the preparation of virus and/or virus antigens and a biomass for producing them - Google Patents
Method for the preparation of virus and/or virus antigens and a biomass for producing them Download PDFInfo
- Publication number
- HU212597B HU212597B HU9202127A HU212792A HU212597B HU 212597 B HU212597 B HU 212597B HU 9202127 A HU9202127 A HU 9202127A HU 212792 A HU212792 A HU 212792A HU 212597 B HU212597 B HU 212597B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- virus
- biomass
- cell
- medium
- mmol
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 54
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 54
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 54
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 54
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 68
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 48
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 31
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 17
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 3
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 claims description 2
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 claims 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000175212 Herpesvirales Species 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000845082 Panama Species 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás vírusok és/vagy vírusantigének és erre szolgáló biomassza előállítására.
Vírus/vírusantigén előállítására több eljárás ismeretes. A kiindulási anyag gyakran az úgynevezett primer sejttenyészet, amely emberi vagy állati szövetekből származik. A primer sejteket vírussal („oltóvírus”) fertőzik és a vírus sokszorozódása révén képződik a vírusantigén.
A 4 195 130 számú USA-beli szabadalmi leírásban macska fertőző peritonitisz vírust szaporítanak macska trachea-sejteken. A tenyésztő szövetet 2-napos és 9-hetes kor közötti macskák tracheájából nyerik. A tracheát
16-30 0,5-1 mm vastagságú gyűrűkre darabolják és ezeket a gyűrűket használják fel a sejtkultúrához.
A tavaszi-nyári-meningo-encephalitis-vírus (Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus=FSME- Vírus) sokszorozására szolgáló eljárást ismertet például az AT-B 358 167 számú szabadalmi leírás, eszerint csirkeembrió sejteket szuszpendálnak sejttenyésztéshez szolgáló táptalajban, megfertőzik a vírussal és ezt a biomasszát használják az FSME-vírusantigén termelésére. A biomasszát aerob körülmények között, 25-38 ’C hőmérsékleten, 1-5 napig szuszpenzióban tartják. Ezután a sejteket a sejttörmelékektől centrifugálással elválasztják, a kapott vírusszuszpenziót formaiinnal vagy β-propiolaktonnal inaktiválják, a vírusantigént ultraszűréssel betöményítik, tisztítják és vakcina céljára a szokásos módon dolgozzák fel. Az eljárás kitermelése azonban nem kielégítő.
A primer sejttenyészetek szokásos elkészítésekor különösen fontosnak tartják, hogy egyedi sejteket vagy lehetőleg kis sejtcsoportokat kapjanak. Ennek elérése érdekében a szövetet mechanikus vagy enzimes módszerrel lehetőleg erősen fel kell aprítani, jóllehet ez a kezelés egyidejűleg sok sejt pusztulásához vezet. Ha azonban az ilyen sejtkészftményeket megfelelő hordozóanyagok felületére telepítik, az elpusztult sejtek a felülúszóban maradnak és innen eltávolíthatók. Az FSME-vírusantigén előállítására szolgáló szuszpenziótenyészetekben azonban az ilyen sejtkészítmények használatakor nincs lehetőség arra, hogy az élő sejteket az élettelen, illetve károsodott sejtektől elválasszák. Minthogy az idő előrehaladtával a sejtek lizálódnak, ennek az lesz a következménye, hogy a táptalaj erősen szennyeződik sejtproteinekkel, amelyeket a kívánt terméktől nehéz elválasztani.
Egyedi sejtek szuszpenziójából álló, vírustenyésztésre szolgáló sejtkultúrát állítanak elő például a 190 919 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban oly módon, hogy 10-15 napos csirkeembriók szemét izolálják és nyíróerő alkalmazásával 2 mm3-es darabokra aprítják. A darabokat 0,1%-os tripszinnel emésztbe milliliterenként 300 000-400 000 sejtet tartalmazó sejtszuszpenziót kapnak.
Egyedi sejtek vagy kis sejtaggregátumok szuszpenzióban való alkalmazása esetén is csekély a vírus/vírusantigén termelés reprodukálhatósága, mert például a keverés nyíróereje erős sejtkárosodást okoz.
A találmány feladata, hogy ezeket a hátrányokat kiküszöbölje és vírus/vírusantigén termeléséhez olyan biomasszát bocsásson rendelkezésre, amely tenyésztés esetén nagy termelékenységgel állítja elő a vfrus/vírusantigént, egyszerűen kezelhető, üzemi méretekben használható vírus/vírusantigén termelésre, amikoris a vírus/vírusantigén a táptalajból nagy tisztasággal izolálható.
A találmány alapja az a felismerés, hogy vfrusok/vírusantigének sejtkultúrákból történő nagyipari előállításakor a sejtaggregátumok nagysága az eljárás kritikus paramétere. Meglepődve tapasztaltuk ugyanis, hogy ha a sejtaggregátumok nagyságát 100 pm és 1000 pm közé állítjuk, kitermelés növekedést, nagyobb tisztasági fokot és optimális oltó vírus mennyiséget érünk el.
A találmány tehát eljárás vírus/vírusantigén termelésére szolgáló biomassza előállítására oly módon, hogy a biomassza sejtaggregátumainak az átmérőjét 100 pm és 1000 pm közé állítjuk és a biomasszát vírussal megfertőzzük.
A találmány szerinti biomassza sejtaggregátumait emberi vagy állati szövetekből állítjuk elő mechanikus vagy enzimes kezeléssel úgy, hogy a mechanikus úton felaprított szövetet a sejtcsoportok további szétoszlatása érdekében egy proteázzal, például tripszinnel, kimotripszinnel vagy elasztázzal tovább aprítjuk a sejtaggregátum kívánt nagyságának az eléréséig.
A találmány szerinti biomassza sejtaggregátumait emberből vagy állatból származó egyedi sejtekből is előállíthatjuk úgy, hogy ezeket sejtaggregáló anyagokkal, például agglutininnel kezeljük.
Az 1000 pm-nél nagyobb, illetve 100 pm-nél kisebb sejtaggregátumok és egyedi sejtek elválasztását szűréssel vagy előnyösen útépítéssel végezhetjük. A szűréssel szemben az ülepítés egyszerűbben megvalósítható, mert a 100 pm pórusnagyságú szűrők könnyen eltömődnek. Ezenkívül az ülepítés költséges és drága szeparátorok nélkül is megoldható és sterilitási szempontból is előnyös technikákat kínál. Azt találtuk, hogy a 100 és 1000 pm közötti átmérővel rendelkező sejtaggregátumok 1 cm/perc-nél nagyobb sebességgel ülepednek, míg a kisebb sejtaggregátumok ülepítésének a sebessége 1 cm/perc-nél kisebb. Az 1000 pm-nél kisebb méretű részecskék elválasztása szűréssel egyszerűen elvégezhető, mivel itt nem áll fenn az eltömődés veszélye.
A találmány szerinti eljárás egy előnyös változatát az jellemzi, hogy a táptalajban szuszpendált biomassza anyagcsere aktivitását - glükóz fogyasztással mérve óránként 3-5 mg gükóz/g biomassza értékre állítjuk be.
A találmány szerinti eljárásban felhasznált sejtaggregátumok további előnye abban rejlik, hogy már viszonylag kis mennyiségű oltóvírussal való megfertőzés esetén is nagy mennyiségű vírusantigént termelnek. Kimutattuk, hogy 100 pm-nél kisebb és 1000 pm-nél nagyobb sejtaggregátumok megfertőzéséhez lényegesen több oltóvírust kell felhasználni azonos mennyiségű vírus/vírusantigén termeléséhez. Felismertük továbbá, hogy a vírus/vírusantigén termelés tovább növelhető, ha a biomasszát a táptalajban legalább 0,01 mmol/liter, előnyösen 0,06 mmol/liter oxigénkoncentráció mellett tartjuk fenn.
HU 212 597 Β
A találmány tárgyát képezi tehát egy vírusok/vírusantigének előállítására szolgáló eljárás is a találmány szerinti eljárással előállított biomassza felhasználásával, ahol az eljárást legalább 0,01 mmol/liter, előnyösen 0,06 mmoVliter oxigén-koncentráció mellett valósítjuk meg.
Azt is tapasztaltuk, hogy előnyös, ha a táptalajban a sejtaggregátumok koncentrációja legalább 10 mg sejtaggregátum/ml.
A találmány szerinti módon előállított biomassza különösen a tavaszi-nyári-meningoencephalitis-vfrus (FSME-vírus)/vírusantigén termelésére alkalmas, ha az madárembrió sejtekből, különösen csirkeembrió sejtekből származó sejtaggregátumokből áll. Ugyanakkor tovább növelhető a vírus/vírusantigén termelés, ha a táptalajban az oxigén átáramoltatás sebességét 1,60 mmol O2/liter/óra értéknél magasabbra, előnyösen 1,65 és 2,40 mmol/liter/óra közé állítjuk be.
Az oxigén átáramoltatása sebessége (OTR = oxygen transfer rate), amelyet a mmol O2/liter/óra értékkel fejezünk ki, ismert mértéke a sejttenyészetbe bevitt oxigénnek. Az oxigénfelvétel sebessége (OUR = oxygen uptake rate) általában ugyancsak mértéke a sejtanyagcsere teljesítményének és így közvetetten a sejt vfrus/vfrusantigén szintetizáló teljesítményének.
Az FSME-vírusantigén termelés összes ma ismert eljárásánál a specifikus termelőteljesítményt a vírusantigénre korlátozzák, mivel a táptalajban jelenlévő nagymennyiségű fertőzött sejt esetén a táptalaj pH-értéke csökken, ami a vírustiter nemkívánt csökkenéséhez és a vírusantigén bomlásához vezet.
Azt találtuk, hogy az erősen levegőztetett tenyészet pH-értéke nem csökken és a vírus/vírusantigén termelés teljesítményét állandó magas szinten tarthatjuk, ha a tápfolyadékba elegendő mennyiségű oxigént juttatunk be keverés révén vagy statikus és/vagy dinamikus gázelosztóval.
A mérési eredmények azt mutatták, hogy egy olyan tenyészetben, amelyben a sejtsűrűség 2-1O7 sejt/ml és csak a felülete érintkezik oxigén atmoszférával, az FSME termelés nagymértékben lecsökken. Ezzel szemben, ha az oxigént bevisszük a tenyészetbe, az antigén kitermelést erősen megnövelhetjük.
A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja abban áll, hogy az oxigén átáramoltatás sebességét 1,60 mmol 02/liter/óra értéknél magasabbra, előnyösen 1,65 és 2,40 mmol Oj/liter/óra érték közé állítjuk be, ekkor a nedves sejtmassza mennyisége előnyösen legfeljebb 30 g/liter táptalaj.
A kísérleti eredmények azt mutatták, hogy az FSME-vírus/vfrusantigén termelés a találmány szerinti alkalmazott sejtaggregátumok koncentrációjával arányos. A találmány szerinti eljárás 10 mg/ml sejtaggregátum koncentráció mellett is megvalósítható. Ezzel szemben megállapítottuk, hogy fertőzött egyedi sejtek tenyésztése esetén legalább 10 mg/ml koncentráció szükséges ahhoz, hogy vírus/vírusantigén termelést érjünk el.
A primer sejttenyésztet fertőzéshez szükséges magas oltóvírus litert rendszerint úgy érjük el, hogy a vírust egéragyban szaporítjuk. Azáltal, hogy a találmány szerint a sejtaggregátumot lényegesen kevesebb vírusmennyiséggel lehet beoltani, a biomassza megfertőzéséhez szükséges oltóvírust sejttenyészet-felülúszókból is megkaphatjuk. Ez jelentősen csökkenti az egéragy-proteinnel való szennyezés tehetségét.
Azt is kimutattuk, hogy a madárembrió sejtekből származó, találmány szerinti sejtaggregátumokból álló biomassza influenza-, vaccinia- vagy avipox-vírusantigén termelésére szintén alkalmazható.
Az alábbi példákkal közelebbről bemutatjuk a találmányt, anélkül, hogy a példákkal a találmány oltalmi körét korlátoznánk.
1. példa
A CE (chick embryo) sejtaggregátum nagyságának befolyása az FSME vírusantigén kitermelésre SPF tyúktojásokat 12 napon át 37 ’C-on keltetünk (SPF = specifikus pathogen free, azaz specifikus kórokozóktól mentes), majd a tojások átvilágításával megvizsgáljuk, hogy végbement-e az embrió növekedése. A tojásokat alkohollal fertőtlenítjük és sterilboxban felnyitjuk. Az embriókat kivesszük, megmossuk és aprítőkészülékben durván felaprftjuk. Ezután az embrionális szövetet 37 ’C-on 20 percig enzimmel emésztjük, proteolítikus enzimek (1 mg/embrió) hozzáadásával. A kapott szövetszuszpenzióból egy >1000 gm szemnagyságú szűrővel elválasztjuk az 1000 gm-nél nagyobb szövetdarabokat. Ezeknek a sejtaggregátumoknak a további elválasztása ülepítő eljárással történik, ekkor az elválasztás kritériuma a > 1 cm/perc ülepedési sebesség. Ekkor a sejtszuszpenziót ülepítőedényen nyomjuk át alulról fölfelé 1 cm/perc sebességgel. Az egyedi sejtek, illetve kis sejtaggregátumok a szuszpenziőban maradnak, míg a nagyobb sejtcsoportok az edény aljára kiülepednek. A különböző pórusnagyság szűrőkkel végzett kísérletek azt mutatták, hogy az ilyen feltételek mellett kiülepedett sejtcsoportok méreteloszlása <1000 gm-től >100 gm-ig terjed. A szuszpenziőban maradó sejtcsoportok nagysága tehát <100 gm.
Ilyen módon a sejtaggregátumokból három frakciót kapunk, amelyek átmérője:
1. <100 gm,
2. >1000 gm,
3. <1000 gm, azaz 100 gm és 1000 gm közötti.
Ezekből a frakciókból azonos biomassza koncentrációkat (30 g/liter) szuszpendáltunk egy táptalajban (Med 199) és FSME vírussal (1 x 105 pfu/mg biomassza) megfertőztük. A vírus szaporítását 37 ’C-on végeztük és a sejteket egyenletes keveréssel szuszpenzióban tartottuk fenn. Négy nap múlva ELISA módszerrel határoztuk meg a képződött vírusantigén mennyiségét.
Az 1. frakció esetében (a sejtaggregátum kisebb lOOgm-nél) a vírus/vírusantigén termelés 4,9 gg/ml volt, a 2. frakció esetén (a sejtaggregátum nagyobb 1000 gm-nél) a vírus/vírusantigén termelés 4,7 gg/ml volt, a találmány szerint alkalmazott frakció esetében a vírus/vírusantigén termelés 9,3 gg/ml volt.
HU 212 597 Β
2. példa
Λ CE sejtaggregátum nagyságának befolyása a
CEC (chick embryo cell) proteinnel való szennyeződésére
Az 1. példa szerinti módon előállított 1. és 3. frakció táptalaját a tenyésztés megkezdése után két nap múlva CEC-protein tartalomra vizsgáltuk. Az 1. frakció táptalaja 1,80 mg/ml CEC-proteint, a 3. frakció táptalaja csupán 0,84 mg/ml CEC-proteint tartalmazott.
3. példa
Az oltóvírus mennyiségének befolyása a vírus/vírusarttigén termelésre
Az 1., illetve a 3. frakció sejtaggregátumainak megfelelő nagyságú sejtaggregátumokat tartalmazó biomasszákat tenyésztettünk az 1. példában leírt módon és meghatároztuk a vírus/vírusantigén termelést Frakciónként négy, eltérő mennyiségű oltóvirust használtunk a fertőzéshez: 1 mg biomasszához 3,2 x 103 pfu, 1 x 104 pfu,
3,2 x 104 pfu, illetve 1 x 105 pfu mennyiséget. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze. A táblázatból látható, hogy a találmány szerint alkalmazott 3. frakciónál, azonos mennyiségű oltóvírus esetén lényegesen nagyobb vírus/vírusantigén kitermelést kaptunk.
1. táblázat
| Fertőzéshez használt oltóvfms mennyisége (pfu/mg biomaszsza) | Vírus/vírusantigén kitermelés (pg/ml) | |
| 1. frakció | 3. frakció | |
| 3,2 X 103 | 2,0 | 8,8 |
| 1,0 X104 | 3,2 | 10,3 |
| 3,2 X 104 | 5,0 | 11,0 |
| 1,0 X 105 | 5,0 | 11,0 |
4. példa
Az oxigén koncentráció vefolyása az antigén kitermelésre
Az 1. példában megadott körülmények között a táptalaj különböző oxigén koncentrációi mellett tenyésztettük a találmány szerinti biomasszát, majd meghatároztuk a vírus/vírusantigén mennyiségét. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze, ahol a vírus/vírusantigén kitermelést 0,06 mmol/liter oxigénkoncentráció mellett 100%-nak vettük.
2. táblázat
| Oxigén koncentráció (nmol/liter) | Vírus/vírusantigén kitermelés (%) |
| 0,06 | 100 |
| 0,02 | 90 |
| 0,004 | 35 |
| 0 | 10 |
5. példa
Az oxigén-átáramoltatás befolyása a vírus/vírusantigén kitermelésre
A 3. frakció szerinti sejtaggregátumokból álló biomasszát az 1. példában leírtak szerint vírussal megfertőzzük. A tenyésztést különböző nagyságú edényekben végeztük. Ezeket úgy levegőztettük, hogy különböző OTR értékeket kapjunk. A szuszpenziókat 4 napon át 33-37 ’C-on tartottuk és meghatároztuk a vírus/vírusantigén kitermelést.
Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg.
3. táblázat
| Tenyésztő edény | Tenyészet térfogata (literi | OTR mmol/l/óra | Vírus/vírusantigén kitermelés* (pg/ml) |
| 0,5 1-es hengeres palack (Technespinner) | 0,1 | 2,38 | 5,9 |
| 0,3 | 0,795 | 0,97 | |
| 21-es hengeres palack (Technespinner) | 0,3 | 1,65 | 2,0 |
| 1,0 | 0,49 | 0,32 | |
| 101-es keverős palack (keverő hossza 5,5 cm, 150-160 ford/perc) | 3,0 | 0,41 | 0,38 |
| 501-es keverős palack (keverő hossza 15 cm, 80-90 ford/perc) | 18 | 1,10 | 0,97 |
| 30 | 0,87 | 0,22 |
* Meghatározás ELISA-val
A 3. táblázatban szereplő eredményekből következik, hogy ahol az OTR nagyobb 2-nél, ott körülbelül 6 pg/ml vírus/vírusantigén kitermelés érhető el.
6. példa
Az 1. példa szerinti 3. frakciót az ott leírtak szerint az alábbi 4. táblázatban felsorolt influenza törzsekkel megfertőztük. Standard sejtkultúraként az 1. példa szerinti 1. és 2. frakciót használtuk, amelyekben a sejtaggregátumok átmérője 100 pm-nél kisebb, illetve 1000 μπι-nél nagyobb volt. Egy-egy liter táptalajban körülbelül 30 g standard sejtkultúrát, illetve 30 g, 100 pm és 1000 pm közötti átmérőjű sejtaggregátumot szuszpendáltunk és mindegyiket megfertőztük a 4. táblázatban felsorolt influenza vírus törzsekkel (1 x 105 pfu/mg biomassza). A vírustenyésztést 37 ’C-on végeztük, a sejteket ezalatt egyenletes keveréssel szuszpenziőban tartottuk. Négy nap múlva összegyűjtöttük a vírustartalmú táptalajokat és a szokásos módon [Hirst, G., The Agglutination of Red Cells by Allantoic Fluid of Chick Embryos Infected With Influenza Cirus, Science, 94 (2427), 22-23, (1941)] meghatároztuk a Ha-titert. A 4. táblázatban megadjuk a kapott titer-értékeket.
HU 212 597 Β
4. táblázat
| A vírus altípusa | Vírus törzse | HA-titer Találmány szerinti Standard sejtkultúra | |
| B | B/Panama | 6 | 2 |
| A/H1N1 | Brazil | 7 | 5 |
| Szingapúr 6 | 2 | 0 | |
| A/H3N2 | Hong Kong 5 | 2 | 0 |
Amint a 4. táblázat adataiból látható, a találmány szerinti sejtkultúra esetén magasabb influenza vírus kitermelést kaptunk, mint a standard sejtkultúrákkal. Ezen túlmenően a magasabb kitermelést nem kísérték a szokásos sejtkultúrák alkalmazásakor tapasztalható hátrányok.
7. példa
A találmány szerinti, 100 és 1000 gm közötti átmérőjű sejtaggregátumokat tartalmazó sejtszuszpenziót és a 6. példában leírt standard sejtkultúrát vizsgáltunk Herpes simplex vírus/vírusantigén (HSV) termelésre. Egy-egy liter táptalajban körülbelül 30 g standard sejtkultúrát, illetve 30 g, 100 gm és 1000 gm közötti átmérőjű sejtaggregátumot szuszpendálunk és mindegyiket megfertőztük HSV-vel (1 x 105 pfu/mg biomassza). A megfertőzött sejtkultúrákat 72 órán át inkubáljuk, naponta mintát vettünk belőlük és a kultúrákat állandó pH-értéken és közepes glükóz-koncentráción tartottuk.
A vírus/antigén teremlést ELISA-val és vírustitrálással vizsgáltuk. ELISA-val az alábbi módon határoztuk meg a HSV-antigén termelést. A Herpes simplex vírus ELISA kit-et (Dakopatts) félkvantitatív vizsgálathoz átalakítottuk. Az antigének peroxidázhoz kötött HSV-1 specifikus nyúl immunoglobulinnal mutattuk ki. Az ELISA egységeket (EU) 16 EU/ml tartalmú, standard BL, V81 vakcina készítmény hígításaival határoztuk meg. Egy ELISA egység annak a legnagyobb hígításnak a reciproka, amely 492 nm-en 0,1-nél nagyobb adszorbanciát eredményezett és legalább kétszeres negatív kontrollt A vírus litert Reed és Muench módszerével határoztuk meg [A Simple Method of estimating Fifty Per Cent Endpoints, The American Journal of Hygiene, 27, (3), 493-497. oldal, (1938)].
Az 5. táblázatban összehasonlítjuk a találmány szerinti biomassza és a standard sejtkultúrák alkalmazásával kapott HSV titereket. Amint az a táblázatból látható, a találmány szerinti biomasszával kapott antigén mennyiség körülbelül 2,8 x 105 egység és a HSV titer körülbelül 4,4 x 109 100 ml kultúrára számítva.
5. táblázat
| Vírus bevitel 1 X 105 mg sejttömeg Titer (összes) | Idő (óra) | Biomassza sejtaggregátumok | Standard sejtkultúra | ||
| ELISA | TCID/5 0 | ELISA | TCID/5 0 | ||
| 1 x 107 | 72 | 280000 | 4,4X10 9 | 1000 | 1X107 |
Amint a fenti táblázatból látható, a vírus/vírusantigén kitermelés Herpes simplex vírus alkalmazása esetén jelentősen növekedett, amikor a szokásos sejtkultúrák helyett a találmány szerinti biomassza sejtaggregátumokat alkalmaztuk.
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás vírus és/vagy vírusantigén termelésére szolgáló biomassza előállítására, azzal jellemezve, hogy a biomassza sejtaggregátumainak az átmérője 100 gm és 1000 gm közé állítjuk be és a biomasszát vírussal megfertőzzük.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtaggregátumok méretét emberi vagy állati szövetek mechanikus és enzimes kezelésével állítjuk be.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtaggregátumok méretét emberi vagy állati egysejtek sejtaggregációt előidéző anyagokkal való kezelésével állítjuk be.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a táptalajban szuszpendált biomassza anyagcsere aktivitását - glükóz fogyasztással mérve - óránként3-5 mg glükóz/g biomassza értékre állítjuk be.
- 5. Eljárás vírus és/vagy vírusantigén termelésére az1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított biomassza alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy hogy a termelést táptalajban, legalább 0,01 mmol/liter, előnyösen legalább 0,06 mmol/liter oxigén koncentráció mellett végezzük.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termelést olyan táptalajban végezzük, amely ml-enként legalább 10 mg sejtaggregátumot tartalmaz.
- 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás tavaszi-nyári-meningoencephalitis-vírus (FSME-vírus)/vírusantigén termelésére, azzal jellemezve, hogy egy madérembrió sejtekből, különösen csirkeembrió sejtekből származó sejtaggregátumből álló biomasszát alkalmazunk táptalajként.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a táptalajban az oxigén átáramoltatás sebességét 1,60 mmol O2/liter/óra fölötti, előnyösen1,65 és 2,49 mmol O2/liter/óra közötti értékre állítjuk be.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1,65 mmol O2/Iiter/óra oxigén átáramoltatási sebesség mellett a biomassza mennyiségét maximum 30 g/liter táptalaj értékre állítjuk be.
- 10. Az 5. igénypont szerinti eljárás influenza-, vaccinia- vagy avipox-vírus és/vagy vírusantigén teremlésére, azzal jellemezve, hogy madárembriósejtekből származó sejtaggregátumokból álló biomasszát alkalmazunk táptalajként
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT18/90A AT393277B (de) | 1990-01-04 | 1990-01-04 | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT64583A HUT64583A (en) | 1994-01-28 |
| HU212597B true HU212597B (en) | 1996-08-29 |
Family
ID=3479351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202127A HU212597B (en) | 1990-01-04 | 1991-01-03 | Method for the preparation of virus and/or virus antigens and a biomass for producing them |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5391491A (hu) |
| EP (1) | EP0509008B1 (hu) |
| JP (1) | JP2633392B2 (hu) |
| AT (2) | AT393277B (hu) |
| CA (1) | CA2073168C (hu) |
| CZ (1) | CZ279725B6 (hu) |
| DE (1) | DE59103696D1 (hu) |
| DK (1) | DK0509008T3 (hu) |
| ES (1) | ES2067921T3 (hu) |
| FI (1) | FI106241B (hu) |
| HR (1) | HRP921353A2 (hu) |
| HU (1) | HU212597B (hu) |
| NO (1) | NO310472B1 (hu) |
| RU (1) | RU2099419C1 (hu) |
| SK (1) | SK279200B6 (hu) |
| WO (1) | WO1991009937A1 (hu) |
| YU (1) | YU391A (hu) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5719051A (en) * | 1989-12-22 | 1998-02-17 | Immuno Aktiengesellschaft | Perfusion system and a method for the large scale production of virus or virus antigen |
| AT393277B (de) * | 1990-01-04 | 1991-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
| ES2378409T3 (es) | 1994-11-10 | 2012-04-12 | Baxter Healthcare S.A. | Método para producir sustancias biológicas en cultivo sin proteínas |
| US5753489A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-19 | Immuno Ag | Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture |
| US6146873A (en) * | 1994-11-10 | 2000-11-14 | Baxter Aktiengesellschaft | Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media |
| US5756341A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-26 | Immuno Ag | Method for controlling the infectivity of viruses |
| US5698433A (en) * | 1994-11-10 | 1997-12-16 | Immuno Ag | Method for producing influenza virus and vaccine |
| DE19612966B4 (de) | 1996-04-01 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg | MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren |
| BR9804283B1 (pt) * | 1998-03-18 | 2010-11-30 | processo para a produção de flavivìrus em baixa densidade de células em cultura e processo para a produção de flavivìrus recombinante em baixa densidade de células em cultura. | |
| US7445924B2 (en) | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| DE10144906B4 (de) | 2001-09-12 | 2013-11-28 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh | Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen |
| US20040023358A1 (en) * | 2001-12-21 | 2004-02-05 | Wyeth | Avian embryo particulate biomass for the production of virus antigens |
| CA2494379C (en) * | 2002-09-05 | 2012-11-06 | Bavarian Nordic A/S | Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions |
| US7998488B2 (en) * | 2008-11-14 | 2011-08-16 | Baxter International Inc. | Vaccine formulations and uses thereof |
| JP2013538577A (ja) | 2010-09-23 | 2013-10-17 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | 組み換えウイルスベクターおよび黄熱病ウイルスに対する免疫反応を惹起するための方法 |
| JP6169494B2 (ja) | 2011-01-31 | 2017-07-26 | ナノセラピューティクス・インコーポレイテッドＮａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． | インフルエンザａウイルスに対するヘテロサブタイプ免疫応答を誘導するための組換えウイルスベクターおよび方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4059485A (en) * | 1976-11-03 | 1977-11-22 | Monsanto Company | Adaptation of cell lines to suspension culture |
| US4195130A (en) * | 1978-04-20 | 1980-03-25 | Cornell Research Foundation, Inc. | Propagation of feline infectious peritonitis virus in tissue cultures |
| AT358167B (de) * | 1978-12-22 | 1980-08-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- -meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)- -vakzinen |
| US4335215A (en) * | 1980-08-27 | 1982-06-15 | Monsanto Company | Method of growing anchorage-dependent cells |
| AT393277B (de) * | 1990-01-04 | 1991-09-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen |
| US5114855A (en) * | 1990-04-19 | 1992-05-19 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for aggregating cells with small microspheres |
-
1990
- 1990-01-04 AT AT18/90A patent/AT393277B/de not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-03 DE DE59103696T patent/DE59103696D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-03 RU SU925052917A patent/RU2099419C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-01-03 AT AT91901647T patent/ATE114713T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-03 JP JP50199791A patent/JP2633392B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-03 YU YU391A patent/YU391A/sh unknown
- 1991-01-03 DK DK91901647T patent/DK0509008T3/da active
- 1991-01-03 ES ES91901647T patent/ES2067921T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 WO PCT/AT1991/000003 patent/WO1991009937A1/de active IP Right Grant
- 1991-01-03 CA CA 2073168 patent/CA2073168C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 US US07/854,630 patent/US5391491A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 HU HU9202127A patent/HU212597B/hu unknown
- 1991-01-03 EP EP19910901647 patent/EP0509008B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-04 CZ CS9112A patent/CZ279725B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-01-04 SK SK12-91A patent/SK279200B6/sk not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-07-02 NO NO19922622A patent/NO310472B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-07-03 FI FI923099A patent/FI106241B/fi active
- 1992-11-25 HR HRP921353 patent/HRP921353A2/xx not_active Application Discontinuation
-
1994
- 1994-12-01 US US08/352,077 patent/US5550051A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HRP921353A2 (en) | 1995-10-31 |
| EP0509008A1 (de) | 1992-10-21 |
| AT393277B (de) | 1991-09-25 |
| RU2099419C1 (ru) | 1997-12-20 |
| YU391A (sh) | 1994-04-05 |
| CA2073168C (en) | 1999-04-27 |
| JP2633392B2 (ja) | 1997-07-23 |
| CA2073168A1 (en) | 1991-07-05 |
| ATA1890A (de) | 1991-02-15 |
| WO1991009937A1 (de) | 1991-07-11 |
| FI106241B (fi) | 2000-12-29 |
| DK0509008T3 (da) | 1995-04-18 |
| US5391491A (en) | 1995-02-21 |
| NO922622L (no) | 1992-07-23 |
| DE59103696D1 (de) | 1995-01-12 |
| JPH05503843A (ja) | 1993-06-24 |
| NO922622D0 (no) | 1992-07-02 |
| FI923099A0 (fi) | 1992-07-03 |
| CS9100012A2 (en) | 1991-08-13 |
| ES2067921T3 (es) | 1995-04-01 |
| SK279200B6 (sk) | 1998-07-08 |
| CZ279725B6 (cs) | 1995-06-14 |
| HUT64583A (en) | 1994-01-28 |
| US5550051A (en) | 1996-08-27 |
| NO310472B1 (no) | 2001-07-09 |
| EP0509008B1 (de) | 1994-11-30 |
| FI923099A (fi) | 1992-07-03 |
| ATE114713T1 (de) | 1994-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5264843B2 (ja) | 細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製の方法、および本方法によって入手可能なインフルエンザウイルス | |
| JP4243349B2 (ja) | インフルエンザウイルスの複製のための動物細胞および方法 | |
| HU212597B (en) | Method for the preparation of virus and/or virus antigens and a biomass for producing them | |
| EP1427817B1 (de) | Vermehrung von viren in zellkultur | |
| DE10144906B4 (de) | Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen | |
| US7666654B2 (en) | Method for preparing viral material | |
| US3935066A (en) | Cell lines |