BR9804283B1 - processo para a produção de flavivìrus em baixa densidade de células em cultura e processo para a produção de flavivìrus recombinante em baixa densidade de células em cultura. - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE FLAVIVIRUS EM BAIXA DENSIDADEDE CÉLULAS EM CULTURA E PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DEFLAVIVIRUS RECOMBINANTE EM BAIXA DENSIDADE DE CÉLULAS EMCULTURA

A presente invenção se refere à produção de vírus emcultura de células com elevado rendimento, particularmentepara a produção de Flavivirus em cultura de célulasfibroblastos, e mais particularmente para a produção dequalquer sub-linhagem 17D do vírus da febre amarela emcultura de fibroblastos de embrião de galinha. O vírus,presente em preparação de vacina, pode ser obtido porinativação ou atenuação do vírus ou por modificaçãogenética através da tecnologia de DNA recombinante.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As vacinas convencionais normalmente são preparadaspela produção de grandes quantidades de vírus em cultura detecido celular ou em animais de laboratório, tornando ovírus inócuo sem, no entanto, destruir suas propriedadesimunológicas. Tradicionalmente, isso é conseguido tantopela inativação da infecciosidade do vírus ou pela seleçãode um vírus não-virulento ou atenuado para uso emvacinas vivas. A atenuação é freqüentemente conseguidapela adaptação do vírus a condições de crescimentoque não são usualmente empregadas (ou seja, diferentesanimais hospedeiros ou culturas de células) e porfreqüentes passagens de quantidade significativa deinóculo viral em cultura de células com a finalidade deselecionar mutantes que não sejam virulentos e, assim,produzam sintomas mínimos ou até mesmo nenhum sintomaclínico.

Na passagem seriada em cultura de células, vírusvacinais atenuados têm a capacidade de, por mutação ouseleção, reverter ao fenótipo virulento. Assim, éprática comum usar o sistema de lote semente, no qual ovírus original, uma vez mostrado ter a atenuação comrelação à infecção humana, é passado uma única vez parao preparo de um lote semente primário (principal). Umaou mais alíquotas de vírus dessa semente primária sãopassadas uma vez mais para fornecer uma preparação desemente secundária (semente de trabalho) . Uma ou maisalíquotas dessa preparação de semente secundária sãousadas na produção de um lote de vacina. Dessa forma, apassagem seriada pode ser limitada e, assim, aprobabilidade de ocorrência de seleção ou mutação podeser minimizada. Um exemplo desse método de obtenção devírus vacinais atenuados é a produção de linhagensvacinais de vírus da Febre Amarela.

Na figura IA, é representada a história depassagem do vírus da Febre Amarela desde a linhagemoriginal Asibi da Febre Amarela (YF Asibi) bem como aderivação das linhagem vacinai 17D da Febre Amarela (YF17D) e algumas de suas sub-linhagens. A linhagem Asibido vírus da Febre Amarela foi subcultivado em tecidoembrionário de camundongo e em tecido embrionário totalde galinha, com ou sem tecido nervoso. Essas passagensproduziram as linhagens parental: 17D, na passagem 180;17 DD, na passagem 195 e 17D-204, na passagem 204 . Alinhagem 17DD foi posteriormente subcultivada até apassagem 241 e submetida a 43 passagens adicionais emovos de galinha embrionados, sendo a preparação finalde vacina correspondente à vacina produzida atualmentee usada para vacinação humana. A linhagem 17D-204 foiposteriormente subcultivada para produzir a linhagemColombia 88 a qual, após passagem em ovos de galinhaembrionado, deu origem a diferentes lotes semente devacina, atualmente em uso na França (Instituto Pasteur,na passagem 235) e nos Estados Unidos (Connaught, napassagem 234) . A linhagem 17D-213 foi derivada da 17D-204, o que aconteceu em conseqüência do uso do lotesemente primário (SI 112-69), originário da Alemanha(FRG (Republica Federal da Alemanha) 83-66), pelaOrganização Mundial da Saúde (OMS) para produzir umasemente 17D (SI 213/77), na passagem 237, livre devirus causadores da leucose aviária.

Novas sub-linhagens 17D foram desenvolvidasatravés do uso da tecnologia do DNA recombinante, asquais requereram um melhor conhecimento da estruturagenômica e expressão dos flavivirus. 0 virus da FebreAmarela é o virus protótipo para o gênero Flavivirus dafamília Flaviviridae de vírus RNA de fita positiva. OsFlavivirus têm a forma esférica com 40-60 nm dediâmetro e com capsideo icosaédrico contendo umamolécula de RNA de fita única positiva, sendo que areplicação viral acontece inteiramente no citoplasmacelular. O RNA genômico do virus da Febre Amarelaconsiste de 10.862 nucleotideos com estreitas regiõesnão-traduzidas 5' (118 nucleotideos) e 3' (511nucleotideos) . Esse único RNA é também o mensageiroviral e sua tradução na célula infectada resulta nasíntese de uma poliproteína precursora que, apósclivagens proteolíticas pós-traducionais gera 10polipeptídeos vírus-específicos. O estudo pioneiro deRocaniello e Baltimore (Rocaniello, V.R. and Baltimore,D. (1981). "Cloned poliovirus complementary DNA isinfectious in mammalian cells". Science. 214: 916-919)mostrou, pela primeira vez, a possibilidade de se gerarvírus a partir do cDNA clonado. Com o desenvolvimentodos sistemas de transcrição in vitro (ver Melton, D.A.;Krieg, P.A.; Rabagliati, M.R.; Maniatis, T.; Zinn, K.and Green, M.R. (1984)y "Efficient in vitro synthesisof biologically active RNA and RNA hybridization probesfrom plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter".Nucl. Acids. Res. 12: 7035-7056) tornou-se possívelsintetizar, in vitro, o RNA viral completo com umaeficiência muito maior do que a da transcrição do cDNAna célula. 0 desenvolvimento de metodologias maiseficientes de transcrição na célula, tais comolipossomas e eletroporação ajudou a melhorar aeficiência de transfecção de células em cultura comRNA. Já está estabelecida a metodologia básica pararealizar o que hoje é conhecido como a tecnologia declone infeccioso. Para um bom número de virus de fitapositiva, o cDNA infeccioso já está disponível e podeser usado para se entender a base molecular de diversosfenômenos biológicos, incluindo a atenuação. Em 1989(Rice et ai, 1989) , foi desenvolvido, pela primeiravez, o cDNA completo do vírus da Febre Amarela, dandoorigem ao vírus amarílico, após a transfecção com RNAsintetizado in vitro de células de vertebrados emcultura.

A Figura 1B mostra a derivação da progênie dosvírus a partir do clone infeccioso da Febre Amarela. ORNA viral das sub-linhagens 17D mencionadas na Figura1A, denominadas F-204, C-204, 17D-213 e vacina 17DDforam objeto de determinação da seqüência nucleotídicacompleta por diversos grupos de pesquisadores que jápublicaram trabalhos a respeito. Cada uma das sub-linhagens 17D-204, F-204 e C-204 foi submetida apurificação em placa em diferentes linhagens decélulas, sendo o vírus obtido dessa purificaçãoamplificado em células SW13 para análise de clonagem esequenciamento com o cDNA. Para os vírus 17D-213 e17DD, o RNA foi extraído do vírus que havia sidopurificado a partir de preparação vacinai e, assim,pode-se dizer, com mais segurança, que essaspopulações representam a seqüência que confere ao virusvacinai o fenótipo atenuado. 0 primeiro cDNA derivadodo vírus da Febre Amarela originou-se da biblioteca decDNA da linhagem C-204 (Rice, C.M.; Grakoui, A. ;Galler, R. and Chambers, T. (1989). "Transcription ofinfectious yellow fever RNA from full-length cDNAtemplates produced by in vitro ligation". The NewBiologist. 1: 285-296), mas a caracterização do vírusrecuperado desse cDNA, após transfecção em células CEF(YFiv5.2/SL na passagem 241) e uma passagem em ovosembrionados utilizando a metodologia de produção devacina de Febre Amarela (Yfiv 5.2/VL na passagem 242),revelou um vírus com grau inaceitável deneurovirulência em primatas não-humanos e, desse modo,não apropriado para testes em vacinação humana(Marchevsky, R.S., Mariano, J., Ferreira, V.S.,Almeida, E., Cerqueira, M.J., Carvalho, R., Pissurno,J.W., Travassos da Rosa, A.P.A., Simões, M.C., Santos,C.N.D., Ferreira, I.I., Muylaert, I.R., Mann, G.F.,Rice, C.M. and Galler, R., "Phenotypic analysis ofyellow fever virus derived from complementary", DNA Am.J. Trop. Med. Hyg., 52(1), pp. 75-80, 1995). Acomparação das seqüências nucleotídicas das sub-linhagens 17D-213 e 17DD, mostradas na figura IA, levouà necessidade da modificação genética do cDNA do vírusC-204 para torná-lo mais ssemelhante ao vírus 17DD.Este novo cDNA foi usado para se obter a síntese invitro do RNA que, após transfecção em células CEF, deuorigem ao novo vírus semente denominado Yfiv 5.2/DD napassagem 241. Este vírus foi então usado para prepararos lotes semente primário e secundário, ambos em CEF,nas passagens 242 e 243, respectivamente, como descritono Pedido de Patente Brasileiro PI 9701774, depositadoem nome do mesmo titular do presente pedido. Em suma,dado as bem conhecidas propriedades vacinais do vírus17D da Febre Amarela com respeito à segurança eeficácia, a capacidade de manipular o seu genoma abriucaminho para o seu desenvolvimento como vetor para aexpressão de antígenos de outros patógenos.

Independentemente do vírus vacinai ser obtido porinativação, atenuação ou pelo uso de tecnologia do DNArecombinante, o vírus precisa ser compatível com acélula hospedeira, isto é, ser capaz de replicaçãoautônoma na célula hospedeira. Mais do que isso, naprodução em larga-escala, a célula hospedeira precisater características tais que o vírus possa crescer nelacom rendimento elevado. Células para a produção devacinas de vírus "vivo" para uso parenteral em humanossão limitadas àquelas que estão livres de agentesfortuitos, que sejam não-tumorgênicas ecariotipicamente normais. Tais células incluem culturasprimárias ou culturas de passagens seriadas derivadasde uma grande variedade de tecidos de aves oumamíferos, tais como fibroblastos diplóides humanos(por exemplo, MRC-5), rim de macaco (MK), fibroblastosde embrião de aves (por exemplo, fibroblastos deembrião de galinha) e muitos outros. Essas células sãoinfectadas com o vírus ("vírus semente") que entãoreplica na célula e é usualmente liberado no meio decultura. As condições e materiais usados no processocompleto precisam ser cuidadosamente monitoradas paraevitar problemas relacionados principalmente com avariabilidade genética, perda de imunogenicidade,inativação do vírus, neurovirulência, baixo rendimentocom relação ao vírus inicial e contaminação por agentesestranhos ao processo.

Nos documentos US 5,391,491 e US 5,550,051 foiproposto um método de produção de vírus/antígeno viral,em particular ao flavivirus denominado vírus daencefalite causada por carrapato, por infecção de umabiomassa consistindo de agregados de células de embriãode aves tendo diâmetros entre 100 μιη e 1, 000 μιτι com odito vírus em um meio de cultura tendo uma concentraçãode oxigênio de pelo menos 0,01 mmol/1, o agregado decélulas estando presente em uma concentração de pelomenos 10 mg de agregados de células por ml. Odepositante mencionou que o controle do tamanho dosagregados e da concentração de oxigênio visa tanto aredução da contaminação provocada pelas proteínascelulares contidas no meio, originadas da gradual Iisecelular, como o aumento da reprodutibilidade dovirus/antigeno viral que pode ser baixo quando célulasindividuais ou agregados pequenos estão presentes nasuspensão. É também mencionado, com base em medidasefetuadas, que foi demonstrado que a produção devirus/antigeno viral será fortemente reduzida, em umaprodução de maior escala, em uma cultura tendo umadensidade celular de 2 χ IO7 células por ml, culturaessa que se comunica com o oxigênio atmosféricoexclusivamente através da superfície.

Diversas tentativas têm sido feitas para preservara imunogenicidade do vírus vacinai. No documento US5,021,347 é descrito um vírus vaccinia recombinante oqual expressa a proteína do vírus da EncefaliteJaponesa visando evitar a redução das propriedadesimunogênicas do vírus vacinai. A cultura de célulasanimais usadas na infecção com o vírus pode serqualquer célula na qual o vírus vaccinia possa crescer.

Os exemplos específicos de cultura de células citadosna patente incluem TK-143 (derivada de osteosarcomahumano), FL (derivada de aminiom humano), Hela(derivada de carcinoma de colo de útero humano), KB(derivada de carcinoma rino-faríngeo humano), CV-I(derivada de rim de macaco), BSC-I (derivada de rim demacaco), RK13 (derivada de rim de coelho) , L929(derivada de tecido conjuntivo de camundongo), célulaCE (embrião de galinha), células CEF (fibroblastos deembrião de galinha).

Adicionalmente, é informado, em Marchevsky et al(Marchevsky et al, 1995), que culturas primárias defibroblastos de embrião de galinha (CEF), produzidas apartir de ovos livres de patógenos específicos (SPF),certificados para a produção de vacina humana, sãoapropriados para a preparação de lotes sementeoriginais de um vírus vacinai recombinante de FebreAmarela.

Apesar das vantagens no uso de célulascertificadas SPF-CEF para produzir vírus vacinais, taiscomo sarampo, cachumba, rubéola, é verificadofreqüentemente que o processo torna-se relativamenteanti-econômico devido a baixos rendimentos. Isso éparticularmente verdadeiro para o vírus vacinai daFebre Amarela produzida em CEF nas densidades celularesnormalmente usadas (1 χ IO6 células/cm2) nas quais orendimento é diretamente proporcional à concentraçãoinicial do vírus. Assim, a quantidade e custos do vírussemente necessário sob essas condições é excessivamenteelevado devido à necessidade da realização de testescaros de neurovirulência em cada lote semente.

As condições ótimas de produção de vírus precisamser cuidadosamente controladas em termos de temperaturae tempo de incubação, densidade celular e inóculo devírus. Adicionalmente, um número razoável de outrosfatores determinam o rendimento viral. Assim, algunsvírus facilmente geram partículas defectivas deinterferência que são evitadas pelo uso de baixasconcentrações virais no inóculo. Alguns vírus são bonsindutores de interferon e podem ser sensíveis à suaação. A estabilidade no meio de cultura que está sendoutilizado é também um fator de vital importância pois orendimento é estabelecido pelo equilíbrio entre aprodução e a perda de infectividade.

0 papel do interferon no sistema vírus/células temsido estudado desde a descoberta do interferon porIsaacs e Lindemann (Isaacs, A. e Lindemann, J. Proc.Roy. Soe. Ser. B., 147: 258. 1957). Os interferons sãosubstâncias que possuem propriedades anti-virais. Elessão produzidos por certos tipos de células que tenhamsido estimuladas por exposição ao vírus, a certosácidos nucléicos ou a complexos antígenos/mitógenos.

Os interferons de aves e de mamíferos podem serclassificados em três categorias principais, alfa, betae gama. O interferon alfa é produzido por leucócitos, obeta por fibroblastos e o gama por linfócitos KTnaturais estimuladas por antígenos, tumores emitógenos. Os três são secretados pelas respectivascélulas após serem estimuladas por vírus ou outroindutor. Os interferons são freqüentementereferenciados à célula que lhes dá origem e, assim, ointerferon gama é também conhecido como "imuno"interferon. A atividade do interferon étradicionalmente determinada com base na sua capacidadede induzir resistência em células quando estas sãodesafiadas por um virus sensível a interferon. Naprodução de vírus vacinais em cultura de células, osistema de interferon é responsável por baixorendimento viral de alguns vírus vacinais, pois elespodem ser bons indutores de interferon e/ou sensíveis àsua ação. 0 vírus vacinai 17D de Febre Amarela é tantoum bom indutor de interferon como é extremamentesensível à sua ação.

Na verdade, a atividade do interferon é acapacidade das células resistirem à infecção causadapor vírus. Desse modo, os interferons são drogaspotencialmente potentes que se mostram promissores comoagentes clínicos anti-virais.

Se, por um lado, a atividade anti-viral dosinterferons é uma vantagem com relação ao tratamento deseres humanos contra doenças causadas por vírus, poroutro, ela é uma desvantagem quando se trata daprodução in vitro de vírus devido à inibição destespelos interferons, especificamente, na replicação devírus em células. Essa é provavelmente a principalcausa dos baixos rendimentos na produção de muitosvírus vacinais.

Tanto isso é verdade que o documento de patente FR2 689 519 propõe um processo de cultura in vitro decélulas infectadas com um vírus associado à escleroseno qual a cultura primária de células é infectada com ovirus em um meio de cultura que contém anticorpospoliclonais anti-interferon-beta para inibir aatividade anti-viral do interferon-beta. A desvantagemdesse processo é a adição de anticorpos contaminantesque podem ser difíceis de separar do produto desejado,limitando, assim, sua utilidade na produção de vírusvacinai.

Portanto, fica demonstrada a grande necessidade deum processo aperfeiçoado para produzir vírus vacinaisindutores e sensíveis ao interferon sem as desvantagensacima mencionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

0 objetivo da invenção é um processo para aprodução de vírus em cultura de células com rendimentoelevado e baixos níveis de contaminação por proteínascelulares, sendo o vírus apropriado para uso napreparação de lotes semente e vacinas. Como aqui usado,o termo "vírus" significa vírus inativado, vírusatenuado ou vírus recombinante, incluindo vírusquimérico. Em particular, o vírus quimérico pode ter umgenoma que compreende seqüências de ácido nucléicocodificantes de pelo menos uma proteína estrutural deum flavivirus e seqüências de ácido nucléicocodificantes do restante do genoma de outro flavivirusque o torne funcional. Mais particularmente, o vírusquimérico pode ter um genoma que compreende seqüênciasde ácido nucléico codificantes de pelo menos" umaproteína estrutural de um flavivirus e seqüências deácido nucléico codificantes do restante do genoma dovírus 17D da Febre Amarela que o torne funcional.

Em uma primeira concretização, a presente invençãose refere a um processo que compreende as etapas de:(a) preparação de uma cultura de células que sãopermissivas ao vírus e aceitáveis como um substrato naprodução de vacina; (b) suspensão das células em ummeio apropriado seguida da semeadura de células abaixas densidades; (c) incubação da cultura de célulasa 30 até 40°C por um período de tempo apropriado; (d)remoção do meio de cultura de células da etapa (c) einoculação com vírus semente; (e) incubação da culturade células da etapa (d) a 25 até 40°C por um período detempo apropriado; (f) remoção do meio seguido delavagem das células uma ou mais vezes para reposição domeio; (g) incubação da cultura de células obtidas naetapa (f) a 25 até 40°C por um período de tempoapropriado; (h) coleta parcial ou completa dosobrenadante de cultura contendo o vírus, com ou semadição de estabilizador; (i) opcionalmente, realizaçãode coletas múltiplas de meio contendo o vírus, aintervalos desejados, pela reposição do meio removido ere-incubação da cultura por um período de tempoapropriado; (j) opcionalmente, remoção dos restoscelulares e das células íntegras do vírus coletado; (1)opcionalmente, inativação do vírus e; (m) armazenagemdo vírus a -45°C ou temperaturas mais baixas.

Em outra concretização, a presente invenção serefere a um processo de produção de vacina deFlavivirus em cultura de células, compreendendo asetapas de: (a) preparação de uma cultura de células quesão permissivas ao vírus e aceitáveis como um substratona produção de vacina; (b) suspensão das células em ummeio apropriado seguida da semeadura de células abaixas densidades; (c) incubação da cultura de célulasa 30 até 40°C por um período de tempo apropriado; (d)remoção do meio da cultura de células da etapa (c) einoculação com vírus semente; (e) incubação da culturade células da etapa (d) a 25 até 40°C por um período detempo apropriado; (f) remoção do meio seguido delavagem das células uma ou mais vezes para reposição domeio; (g) incubação da cultura de células obtidas naetapa (f) a 25 até 40°C por um período de tempoapropriado; (h) coleta parcial ou completa dosobrenadante de cultura contendo o vírus, com ou semadição de estabilizador; (i) opcionalmente, realizaçãode coletas múltiplas de meio contendo o vírus, aintervalos desejados, pela reposição do meio removido ere-incubação da cultura por um período de tempoapropriado; (j) opcionalmente, remoção dos restoscelulares e das células íntegras do vírus coletado; (1)opcionalmente, inativação do vírus e; (m)opcionalmente, liofilização da composição de vacina dasetapas h, i, j ou 1 para obter a forma liofilizada dacomposição de vacina. Se for usado estabilizador, elepode ser adicionado ao virus coletado nas etapas em quehaja troca de meio antes da estocagem a -45 até -196°C.O produto de vacina apropriadamente não contém níveissignificativos de proteínas da célula hospedeira, porexemplo, proteínas de galinha (< 100 nanogramas/dosehumana).

A presente invenção representa um grande avanço naprodução de lotes semente e de vírus vacinais e écaracterizada por um controle preciso das condições deprocesso e das matérias primas, tais como densidade etipo de células a serem infectadas pelo vírus,quantidade de inóculo viral e uso de estabilizadores.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 ilustra a passagem histórica da linhagemoriginal Asibi do vírus da Febre Amarela e a derivaçãoda linhagem vacinai 17D do vírus da Febre Amarela esuas sub-linhagens (A) ; e a progênie de vírus do cloneinfeccioso do vírus da Febre Amarela (B).

Figura 2 ilustra o rendimento da linhagem 17D dovírus da Febre Amarela com relação ao tempo deincubação (A) ; ao nível de interferon induzido comrelação ao tempo de incubação (B) e o grau deresistência ao desafio com o vírus Sindbis com relaçãoao tempo de incubação (C).Figura 3 mostra a inibição mediada por interferondo vírus Sindbis em culturas de células de fibroblastosde embrião de galinha infectadas com o vírus da FebreAmarela, linhagem YF 17D. As culturas foram infectadascom diluições seriais de vírus da Febre Amarela eincubadas a 37°C. Após 5 horas (A), 24 horas (B) e 72horas © as culturas foram submetidas à ação do vírusSindbis.

Figura 4 mostra a influência do pré-tratamento dascélulas com Actinomicina D: referente ao interferoninduzido com o tempo de incubação (A) e referente aorendimento de vírus da Febre Amarela, linhagem 17D, como tempo de incubação.

Figura 5 mostra diagramaticamente a estrutura doprotótipo do genoma do Flavivirus e a estrutura dosvírus quiméricos obtidos pelo uso da metodologia dapresente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Diversos fatores podem influenciar o rendimento devírus. 0 elevado grau de pureza requerido para vacinasque são administradas ao homem limita os métodosalternativos que podem ser aplicados para elevar orendimento do vírus obtido.

No Simpósio Internacional de Febre Amarela eDengue ("International Symposium on Yellow Fever andDengue - Fifty years from the introduction of the 17Dstrain in Brazil", Rio de Janeiro, Brasil, Maio 15-19,1988), foi discutida a necessidade de se aperfeiçoar oprocesso de produção do vírus vacinai da Febre Amarela.Lopes, O.S. (Lopes, O.S, "Development of a Yellow Fevervaccine in tissue culture". In International Symposiumon Yellow Fever and Dengue - Fifty years from theintroduction of the 17D strain in Brazil Annals)introduziu o uso de cultura de células CEF na produçãodo vírus vacinai 17D da Febre Amarela. O incentivo parase usar cultura de células ao invés de embrião degalinha, foi o de solucionar diversos problemasimportantes relacionados ao elevado conteúdo deproteínas de ovo na vacina (até 250 μg de proteína degalinha por dose humana) e dificuldades relacionadascom a expansão da produção em larga escala.

Apesar de Lopes, O.S. ter citado o uso de célulasCEF como uma potencial solução dos problemas acimamencionados, um aspecto muito importante de produçãopermaneceu sem solução, especificamente o baixorendimento de vírus produzido com relação à quantidadede vírus semente usada. Essa é uma das razões pelasquais as vacinas de Febre Amarela ainda continuam a serproduzidas pela inoculação viral de embrião de galinhanos ovos.

Assim, estudos da replicação do vírus 17D de FebreAmarela em CEF foram realizados com o objetivo de seconhecer os fatores que causam a redução no rendimentodo vírus. Os fatores investigados foram: a presença departículas defectivas interferentes (Dl), a indução deinterferon, a sensibilidade do vírus à ação dointerferon e o efeito das taxas de semeadura dascélulas. As Tabelas I e II e figuras 2 e 3 mostram osresultados de experiências usando o vírus 17D-213 daFebre Amarela em CEF. Essa sub-linhagem da linhagem17D do vírus da Febre Amarela foi usada por ser o vírussemente da OMS (Organização Mundial de Saúde) econhecida por ser livre de complexo de vírus da leucoseaviária e devido a estarem bem caracterizados o seufenótipo atenuado e imunogenicidade tanto em primatasnão-humanos como em humanos. Além disso ela foirecomendada pela Organização Mundial de Saúde para serempregada no estabelecimento da produção de vacina 17Dda Febre Amarela em cultura de células e,consequentemente, foi o vírus usado por Lopes, O.S. nosestudos iniciais na produção de vacina de Febre Amarelaem células CEF as quais produziram vírus atenuado paraprimatas não-humanos em três lotes consecutivos deprodução. Sua história de passagem é mostrada na FiguraIA. Células Vero foram usadas como controles (Tabela1D) pois essas células são conhecidas por fornecermúltiplos ciclos de replicação, efeito citopáticocompleto e não serem produtores de interferon.TABELA I: REPLICAÇÃO DE VÍRUS 17D EM CULTURA DECÉLULAS CEF CONFLUENTES E DE CÉLULAS VERO

<table>table see original document page 21</column></row><table><table>table see original document page 22</column></row><table>Como mostrado na Tabela IA e Figura 2A, as célulasCEF forneceram os maiores valores de rendimento dovirus 17D após 2 dias de incubação, estando os log10 dosrendimentos linearmente relacionados com o logaritmo daconcentração inicial de vírus (r = 0,968, ρ < 0,01).Cada dez vezes de redução da concentração inicial devírus resultou em um decréscimo de 0,53 Iog norendimento de vírus. Não foram observados efeitos cito-patogênicos durante o período de 7 dias de incubação.

Como esperado, as células Vero apresentaram, comrelação ao tempo de incubação, rendimentos semelhantespara todas as concentrações iniciais de vírus, estandoo título máximo inversamente relacionado com o logio daconcentração do inóculo do vírus (Tabela 1D) . Noterceiro dia, por exemplo, o rendimento estádiretamente relacionado com a concentração inicial devírus (r = + 0,951, ρ < 0,1) enquanto que para o quintodia, essa relação fica invertida (r = - 0, 974, ρ <0,05). Os rendimentos de vírus em células Vero foramcerca de 200 vezes maiores do que aqueles obtidos emCEF, mesmo nas mais baixas concentrações iniciais devírus. Um efeito cito-patogênico quase total foiobservado em todas as culturas de células Veroinfectadas.

Os rendimentos de vírus em ambos os tipos decélulas não mostraram reduções significativas mesmo emelevadas concentrações iniciais de vírus. Em múltiplosensaios de vírus em células Vero, usando elevadasconcentrações de vírus, foi sempre observado efeitocitopático, ou seja, não tivesse ocorrido "destruição"celular. Rendimento reduzido e "destruição" celular emelevadas concentrações virais iniciais representam osindicadores básicos da existência de partículasdefectivas interferentes (DI(s)). Dessa forma, essesresultados constituem prova definitiva de que as DI(s)não desempenham papel significante na replicação dosvírus 17D.

No entanto, como mencionado acima, foi verificadoque o sistema interferon é um dos principais mecanismosque limitam a replicação do vírus 17D da Febre Amarelapois este, tanto é um bom indutor de interferon como ésensível à sua ação.

Na mesma experiência descrita acima, o interferonfoi induzido a alguns níveis (Tabela IB, Figura 2B) emtodas as culturas de CEF infectadas, sendo constatadoque os rendimentos estão diretamente relacionados àconcentração inicial de vírus (r = 0.987, ρ < 0.02).

Foi, ainda, demonstrado que todas as culturas de CEFinfectadas com vírus 17D da Febre Amarela e que foram,posteriomente, durante períodos de tempo variados depós-infecção, submetidas à ação de vírus Sindbis (umvírus de conhecida sensibilidade ao interferon) (Tabela1C, Figuras 2C e 3) mostraram-se totalmente resistentesà infecção no terceiro dia e resistentes no segundo diaexceto para concentrações inicias de vírus mais baixas.Tal constatação levou à conclusão de que a indução deinterferon e a sensibilidade à sua ação são osprincipais fatores que influenciam o rendimento dovírus 17D em CEF.

Todas as sub-linhagens testadas do vírus 17D daFebre Amarela (DD, 5.2/VL e 5.2/DD) mostraram umcomportamento semelhante ao do vírus 17D-213 (discutidoacima) no que se refere à indução de interferon e àsensibilidade.

Esses resultados demonstram a necessidade de seinfectar as células com o vírus sob condições deprocesso específicas para escapar da ação do sistemainterferon. De acordo com esse raciocínio, o uso desubstâncias inibidoras de interferon seria uma possívelsolução para aumentar o rendimento de vírus. Noentanto, ditas substâncias ou são fracas inibidoras deinterferon ou podem ser tóxicas para as células e nãosão aceitáveis por serem contaminantes em vacinas. Emrelação a isto, estudos recentes mostraram que aactinomicina D, um conhecido inibidor irreversível dasíntese de DNA dependente de RNA, bloqueia a respostade interferon, permitindo múltiplos ciclos dereplicação e maiores rendimentos de vírus da FebreAmarela. A Figura 4 mostra a influência do pré-tratamento das células com actinomicina D e subsequenteinfecção com o vírus 17D da Febre Amarela. Esteprocedimento permitiu um aumento substancial norendimento de vírus quando comparado às culturascontrole. Este resultado, que pode ser atribuído àinibição da produção de interferon, confirma a tese deque o sistema interferon é responsável pelos baixosrendimentos. No entanto, a actinomicina D érelativamente tóxica para as células e, dessa forma,não é aceitável como contaminante em vacinas.

Com base em todas essas constatações, o últimoaspecto investigado para evitar a indução do sistemainterferon foi estudar a influência da densidadecelular no momento da infecção viral.

Os resultados de uma experiência típica paratestar o efeito da densidade de semeadura celular norendimento do vírus 17DD da Febre Amarela com CEF estãoapresentados na Tabela II.TABELA II: INFLUÊNCIA DA DENSIDADE DE SEMEADURA CELULARNO RENDIMENTO DE VÍRUS 17D DA FEBRE AMARELA EM CEF

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Esses resultados demonstram inequivocamente que ologio do rendimento de virus está inversa e linearmenterelacionada com o Iogi0 da concentração (r = 0, 994, ρ <0,001) de células semeadas na faixa de 3 χ IO4 a 2 χ IO5células/cm2. Nessa faixa, é obtido um aumento de 2,2logio no rendimento do vírus/ml para cada Iogi0 dedecréscimo na concentração de células. A 3 χ IO4célulàs/cm2, a densidade na qual é obtido o rendimentomáximo por mililitro, o rendimento por célula foi de251 pfu/célula ou 418 vezes mais que aquela obtida a 2χ IO5 células/cm2. Esses resultados provamdefinitivamente que o rendimento de vírus infeccioso/mle o rendimento/célula está inversamente relacionado coma densidade de semeadura celular. Desse modo, a ação dosistema de interferon pode ser evitada e,consequentemente, pode ser estabelecida uma eficienteprodução.

Em elevadas densidades de semeadura de células nãofoi observada citopatologia, enquanto que a baixasdensidades foi observada a morte de todas as células noprazo de cerca de 1 dia após os rendimentos de virusterem alcançado seu valor máximo. Em densidadesintermediárias, foi observada citopatologia parcial.

De acordo com a invenção, um dos maiores avançosconseguidos na produção de virus vacinai foi o deexecutar a semeadura de células com o virus em baixasdensidades de células, isto é, em densidades desemeadura de células mais baixas que 2 χ IO5células/cm2, preferencialmente em densidades na faixa de1 χ 10^4 - 2 χ 10^5 células/cm2 e mais preferencialmente 1χ 10^4 - 1 χ 10^5 células/cm2.

Outro aspecto relevante na produção de virusvacinai está relacionado com as substâncias usados nomeio de cultura, pois proteínas outras que não asvirais não são aceitáveis como componentes de vacinashumanas. Por exemplo, proteínas do soro fetal bovinonão são aceitáveis em produtos parenterais devido à suaimunogenicidade. Por outro lado, testes têm demonstradoque são obtidos mais baixos rendimentos de vírus emculturas de células, por exemplo CEF, na ausência desoro fetal bovino (FBS). Em estudos experimentais- foiconstatado que os rendimentos de virus 17D de FebreAmarela foram reduzidos em cerca de 100 vezes naausência de soro.

A Tabela III mostra a replicação de virus da FebreAmarela (sub-linhagem 17DD) e a resistência induzidapela ação do virus Sindbis na presença e ausência desoro.TABELA III: REPLICAÇÃO DO VÍRUS 17D DA FEBRE AMARELA ERESISTÊNCIA INDUZIDA PELA AÇÃO DO VÍRUS SINDBIS NAPRESENÇA E AUSÊNCIA DE SORO

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Os resultados demonstram claramente que o vírusreplica bem na ausência de soro e que nenhuma mudançasignificativa ocorre na indução de interferon. Naverdade, os baixos rendimentos de vírus de FebreAmarela em CEF na ausência de FBS pode ser atribuída aoefeito estabilizador de vírus produzido pela fração dealbumina contida no FBS.

Dessa forma, de acordo com a invenção, suplementosde meio aceitáveis como componentes em produtosparenterais, por exemplo albumina de soro humano (HSA),são usados em culturas de células para estabilizar ovírus com o objetivo de se obter elevados rendimentos.Outras substâncias aceitáveis como componentes emprodutos parenterais podem ser usados., tais comopeptídeos, amino ácidos, proteínas,

De acordo com a invenção, a cultura de células aser infectada pelo vírus pode ser qualquer uma na qualo vírus possa replicar e que seja aceitável comosubstrato para a produção de vacinas, em particularqualquer tipo de célula que produza interferon, na qualflavivirus ou recombinantes possam crescer e, para aqual o mesmo procedimento de redução da densidadecelular possa ser aplicado. Exemplos específicosincluem células de embrião de aves e células demamíferos, tais como, fibroblastos de embrião degalinha (CEF), células de embrião de galinha (CE) ,fibroblastos diplóides humanos (por exemplo, MRC-5),células de rim de macaco, células fetais de pulmão deRhesus (FRhL), etc.

A invenção é particularmente apropriada para aprodução de Flavivirus e produção de Flavivirusrecombinante.

De acordo com a invenção, vírus recombinante daFebre Amarela, como definido no Pedido de PatenteBrasileiro PI 9701774, pode ser produzido em umabiomassa consistindo de células certificadas defibroblastos de embrião de aves, em particular célulasde fibroblastos de embrião de galinha SPF (livre depatógeno específico). 0 Pedido de Patente Brasileiro PI9701774 é aqui citado apenas como referência.

O processo para produção de vacina 17D de FebreAmarela aqui descrito foi estabelecido com base no usode diversas sub-linhagens de vírus 17D.Consequentemente, é um procedimento para a propagaçãode vírus 17D em geral, seja ele um vírus 17D derivadopassagem posterior de quaisquer sub-linhagens 17D jáexistentes ou sejam vírus recombinantes derivados decDNA complementar clonado através da tecnologia doclone infeccioso.

Outros vírus recombinantes 17D de Febre Amarelapodem incluir:

1) vírus quimérico, para uso em preparação de vacinaapós propagação usando a metodologia da presenteinvenção, tendo um genoma que compreende seqüências deácidos nuclêicos codificante de pelo menos uma proteínaestrutural de um flavivirus (representado pelas áreasclaras na Figura 5) e seqüências de ácidos nuclêicoscodificantes do restante do genoma do vírus 17D daFebre Amarela para torná-lo funcional (representadopelas áreas escuras na Figura 5). A fonte de seqüênciasdo vírus 17D da Febre Amarela pode ser os plasmídeospYF5'3'IV/G1/2 and pYFM5.2/T3/27 ou quaisquer outrosplasmídeos que contenham as seqüências genômicas dovírus 17D da Febre Amarela.

0 esquema da Figura 5 mostra, no topo, a estruturado protótipo do genoma do flavivirus. A partir daextremidade 5', a ordem das proteínas codificadas é aseguinte: C-prM/M; E, NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B,NS5. As 3 primeiras proteínas constituem as proteínasestruturais, isto é, formam o vírus juntamente com amolécula de RNA encapsulada e foram denominadas decapsídeo (C, 12-14kDa), membrana (M, e seu precursorprM, 18-22 kDa) e envelope (E,52-54 kDa), todas sendocodificadas no primeiro quarto do genoma. 0 restantedo genoma codifica as proteínas não-estruturais (NS)numeradas na ordem em que ocorre a síntese de 1 a 5.Três grandes proteínas não-estruturais possuemseqüências altamente conservadas dentre os flavivirus,NSl (38-41 kDa), NS 3 (68-70 kDa) e NS5 (100-103 kDa).Até hoje, ainda não foi determinado qual seria o papeldesempenhado pela NSl, mas a NS3 tem mostrado serbifuncional com uma atividade de protease necessária aoprocessamento da poliproteína nos sítios em que asproteases celulares não atuam e uma atividadenucleotídica da trifosfatase/helicase estando,portanto, também associada à replicação do RNA viral.NS5, a maior e mais conservada das proteínas, contémdiversos padrões de seqüência que acredita-se ser comumàs polimerases do RNA viral. As 4 proteínas menoresNS2A, NS2B, NS4A e NS4B são pouco conservadas em suasseqüências de amino ácidos mas não no seu padrão demúltiplas ligações hidrofóbicas. Tem sido verificadoque a proteína NS2A é necessária para o processamentoapropriado da proteína NSl e, NS2B estando associadacom a atividade proteolítica da NS3 e com a produção daNS4B. Na medida em que a síntese do RNA ocorre nocitosol em associação com membranas RER ("RoughEndoplasmic Reticulum") tem sido afirmado que essasproteínas hidrofóbicas estariam inseridas nas membranase, dessa forma, as interações proteína-proteínaparticipam nos complexos da replicação viral juntamentecom NS3 e NS5. As curtas regiões não-traduzidas 5'(118 nucleotídeos) e 3' (511 nucleotídeos) contémelementos de seqüência nucleotídica, alguns dos quaissão conservados dentre os flavivirus e, acredita-se,estarem envolvidos na replicação da fita positiva enegativa do RNA e do encapsulamento da fita positiva doRNA. Flavivirus quiméricos podem incluir o capsídeo Caté a proteína envelope E, prM-E ou E somente, de umdos flavivirus e o restante derivado de um segundoflavivirus como indicado nas duas partes inferiores daFigura 5. A fusão entre as proteínas C e prM dequaisquer dois flavivirus, incluindo o da FebreAmarela, pode ser feita através da extremidade carboxide C (seus últimos 20 amino ácidos), no sítio declivagem da protease viral ou no sítio de clivagem dasignalase. Adjacente ao primeiro nucleotídeo do genomaviral, na forma de cDNA clonado em plasmídeobacteriano, encontra-se uma seqüência do promotorpolimerase do fago bacteriano (SP6, T7 ou T3) quepermite a eficiente síntese in vitro dos transcritosinfecciosos. Esses, por sua vez, originam o vírus apósa transfecção do RNA em cultura de células.2) vírus 17D da Febre Amarela expressando epítoposdefinidos, domínios de proteínas ou proteínas inteirasde outros patógenos relacionados a aspectos específicosda resposta humoral ou imuno-celular que possa serusada como vacina contra dita doença inseridos nosgenes das proteínas estruturais e não-estruturais ounas regiões não codificantes do genoma do vírus 17D daFebre Amarela.

3) vírus 17D da Febre Amarela expressando, a partir deepítopos definidos do RNA sub-genômico, domínios deproteínas ou proteínas inteiras de outros patógenosrelacionados a aspectos específicos da resposta humoralou imuno-celular que possa ser usada como vacina contradita doença.

Em todos os casos acima (1-3), o vírusrecombinante ainda contém a maior parte se não todo cgenoma do vírus 17D da Febre Amarela e,consequentemente, todas as etapas principais para areplicação viral na célula hospedeira serão as mesmasque aquelas para o vírus original 17D. Isso incluireplicação citoplásmica, a participação das proteínasvirais do 17D da Febre Amarela na síntese do RNA viral(fita positiva e negativa), processamento dapoliproteína, formação do capsídeo com o encapsulamentodo RNA, montagem e saída do vírus da célula. Na medidaem que todos os aspectos principais que levam a umainfecção produtiva são mantidos, independentemente daextensão da modificação genética em todos os casosespecificados acima a metodologia da invenção seráaplicada.

Dessa maneira, de acordo com uma dasconcretizações da presente invenção, o vírus vacinai daFebre Amarela é produzido segundo normas de altaqualidade ("Good Manufacturing Practices" - GMP), porinfecção de células certificadas para a produção devacina humana e recuperação do vírus.

Em uma das concretizações preferidas da invenção,a propagação do vírus é feita em células certificadaspara a produção de vacinas humanas, sendo que culturasprimárias de fibroblastos de embrião de galinha (CEF)usadas em todas as etapas de produção. Células comessas características estão disponíveis e sãopreparadas de acordo com as instruções da OrganizaçãoMundial da Saúde (WHO (World Health Organi ζ a L-ionGuidelines), como descrito em diversos ProcedimentosOperacionais Padrão (POPs). Particularmente no caso dovírus da Febre Amarela, a produção da vacina 17D daFebre Amarela em culturas de CEF, forneceu 3 lotes devacina experimental que passou em todos os testesincluindo os de neurovirulência em macacos.

O vírus é preparado em culturas primárias defibroblastos de embrião de galinha (CEF) usando ovosderivados de granjas livres de patógeno específico(SPF, "Specific Pathogen Free"). As culturas de célulasde fibroblastos de embrião de galinha (CEF) podem serpreparadas em diferentes formas, por exemplo,monocamadas; em suspensão, em um bioreactor apropriado;adsorvida em microcarreadores. A preparação de célulasCEF é bem conhecida dos especialistas na técnica. Aaculturas de células são fixadas em um meio apropriado esão, mais tarde, infectadas. Os virus, após incubacão,são recuperados por centrifugação ou filtração para aremoção dos restos celulares. Ao sobrenadante contendoo virus é adicionado um estabilizador, o qual, sabem osespecialistas na técnica, melhora a estabilidade dainfecciosidade viral durante o congelamento,descongelamento e manipulações subsequentes. Os virussão armazenados a -45°C ou a temperaturas mais baixas.

Os exemplos a seguir são ilustrativos da invençãoe representam concretizações preferidas. Osespecialistas na técnica têm o conhecimento suficiente,ou são capazes através de experiências rotineiras, paraempregar outros materiais e técnicas apropriados, taiscomo as células acima mencionadas e os métodos deprodução de virus.

EXEMPLO 1

A finalidade deste exemplo é obter-se Flavivirus,em particular o virus 17D da Febre Amarela, em culturasde células de fibroblastos de embrião de galinha (CEF)dispostas em monocamadas, como a seguir:

(1) tecido embrionário de galinha SPF é convertido emuma suspensão de células por tratamento enzimático (Dia0). Esta preparação é bem conhecida dos especialistasna técnica;

(2) as células são recuperadas e suspensas em um meioapropriado seguido de semeadura em recipientes(frascos,reator/propagador de multisuperficie, etc)contendo a monocamada de cultura a 0,1 até 1,2 ml/cmpara fornecer ICT até IO5"' células/cm^;

(3) a cultura é incubada por 12 a 72 horas emtemperatura de 30 a 40 0C;

(4) o meio é removido das monocamadas e o vírus éadicionado em um pequeno volume de meio apropriado auma taxa de 0, 2 - 0, 0001 unidades infecciosas porcélula (CCID50/ LD50/ pfu) ;

(5) o vírus é adsorvido por 0.5 a 4 horas a temperaturade 20 a 40°C (Dia 1);

(6) um meio de manutenção apropriado é adicionado a 0,1a 1,0 ml/cm" com ou sem a remoção da preparação sementee re-incubação a 30 - 40°C por 15 a 30 horas;

(7) o meio de manutenção é removido e as monocamadassão lavadas uma ou mais vezes e substituído com meio demanutenção livre de soro;

(8) as monocamadas são re-incubadas a 30 - 40°C (Dia2). Após um tempo de incubação apropriado (por exemplo,36 a 72 horas após a inoculação, a 37° C) , o meio demanutenção contendo o vírus é colhido (Dia 3) e;

(9) o vírus é armazenado a -45 a -196°C.

Múltiplas coletas, em intervalo de tempo desejado,do meio contendo o vírus podem ser feitas por remoçãoparcial ou completa do meio.

EXEMPLO 2

A finalidade deste exemplo é demonstrar o efeitoestabilizante da albumina sobre o vírus.

0 processo foi executado da mesma maneira queaquela do exemplo 1 no qual é incorporada albumina desoro humano ao meio de manutenção a 0,01 a 10 μς/πιΐ nasetapas 6, 7 e 9. As Tabelas IV e V mostram osresultados.TABELA IV: ESTABILIDADE DO VÍRUS DA FEBRE AMARELA EMMEIO CONTENDO CONCENTRAÇÕES VARIADAS DE ALBUMINA DESORO HUMANO

Concentração Logi0 pfn/inl Mcia-vidade albumina Horasa37°C Perda/hora Horas

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- Muito numeroso para contar ("Too Numbered to Count").

Esses resultados são aproximações mas pode-seperceber uma forte indicação de que 0,03125% w/v HSA éinsuficiente para proteger a infectividade do virus. Ataxa média de perda na presença de 0,0625 a 0,2500" w/vde albumina é 0,15 log-/hora equivalente a uma meia-vida de 2 horas.TABELA V: INFLUÊNCIA DA ALBUMINA DE SORO HUMANO (HSA)ETEMPO DE COLETA NO RENDIMENTO DO VÍRUS 17D DE FEBREAMARELA EM CEF.

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Como mostrado na Tabela V, os títulos maiselevados foram observados a 48 horas na presença de0,06 e 0,2-i w/v. 0 rendimento por célula é altamentesatisfatório, ou seja, valores na faixa de 100pfu/célula. Assim, fica demonstrado que o HSA, que é umcomponente de vacina totalmente aceitável, forneceexcelentes rendimentos de vírus. Esses valorescertamente devem ser maiores pois as amostras estãodiluídas à metade (0.3 Iogi0) no estabilizador, tendo osensaios sido realizados em um sistema que é 0,2 a 0,3Iog-. menos sensível do que aquele usado para o víruscontrole que é o produto final produzido pelo métodotradicional, ou seja com o uso de embrião total degalinha. Com base nesses dados, a correção dos títulosapresentados nas Tabelas IV e V dá valores log: pfu/mlda ordem de cerca de 7.0, os quais são iguais àquelesobtidos na produção de vacina com o embrião completo degalinha.

EXEMPLO 3

O propósito deste exemplo é ilustrar a produção deFlavivirus, em particular de vírus 17D da FebreAmarela, produzido segundo normas de alta qualidade("Good Manufacturing Practices" - GMP) por infecção decélulas certificadas para a preparação de vacinahumana:

Um total de 21 garrafas de cultura rotativa comuma área superficial de 680 cnr cada foram usadas paracada lote. As instruções da Organização Mundial daSaúde (WHO (World Health Organization) Guidelines)estabelecem que 10% dos frascos ou um volume mínimo de500 ml de cultura seja usado como controle. Para estafinalidade, a cada lote, foram separados 7 frascos deárea superficial de 175 cm' cada um com culturasestacionárias.

A preparação de cada lote foi realizada seguindo omesmo procedimento do Exemplo 1.

Células primárias CEF obtidas de ovos derivados degranja SPF (Specific Pathogen Free) foram usados emtodos os lotes. 0 vírus semente 17DD-L0T 102/84 foiusado para inocular todas as culturas de células.Os vírus foram recuperados pela transferência domeio presente em 3 garrafas de cultura rotativa para 1frasco de centrífuga seguido de centrifugação a baixavelocidade para remover os restos celulares. Csobrenadante foi aspirado para dentro de frascoscontendo estabilizador na proporção de 1:1 seguindo-secongelamento por rotação em banho de gelo seco contendoetanol após a remoção de todas as alíquotas para ocontrole de qualidade. Todos os vírus são estocadoscomo indicado no Exemplo 1.

Os dados de produção são apresentados na Tabela VIabaixo.

TABELA VI: DADOS DE PRODUÇÃO E CONTROLE DE QUALIDADE DEVACINA DE FEBRE AMARELA PRODUZIDA EM FIBROBLASTOS DEEMBRIÃO DE GALINHA (CEF) DE ACORDO COM AS GMP

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Cada lote foi testado quanto à esterilidade,potência e presença de agentes adventícios, tendo sidoobtidos resultados satisfatórios.

EXEMPLO 4

A finalidade deste exemplo é a de descrever apreparação de vírus recombinante da Febre Amarela,incluindo vírus quiméricos usando o processo dapresente invenção:

0 vírus 17D da Febre Amarela do Pedido de PatenteBrasileiro PI 9701774 foi regenerado a partir dosplasmídeos pYF5'3'IV/Gl/2 e pYFM5.2/T3/27 e serão aquireferenciados como YFiv5.2/DD. O depósito dosplasmídeos pYF5'3'IV/Gl/2 e pYFM5.2/T3/27 foi feitojunto à American Type Culture Collection, estando osmesmos identificados pelos números de acesso ATCC No.97771 e No. 97772, respectivamente,

a) Transfecção do RNA:

A transfecção das células CEF é feita comLipofectAMINE® (Life Technologies catalogue # 18324-012). Esse produto é uma formulação lipossômica 3:1(p/p) de lipídio policatiônico (2, 3-dioleiloxi-N-[2(sperminocarboxiamido)etil]-N-N,dimetil-2,3-bis (9-octadeceniloxi)-1-propanaminium trifluoro acetato) e aetanolamina dioleoilfosfatidil (DOPE) neutra em águafiltrada em membrana) a uma concentração de 20 μς/πιΐ emPBS livre-de-RNase. PBS - tampão fosfato salino- épreparado e esterilizado em autoclave a 121°C por 20minutos. A Lipof ectAMINE® é pipetada em um tubo depoliestireno de 5 ml contendo PBS. Células primáriasCEF são semeadas e usadas 24 horas após a semeadura.

A mistura de transcrição é gotejada sobre amonocamada de cultura de células. As células sãoincubadas por 20 minutos à temperatura.ambiente Emseguida, a mistura é removida por aspiração, lavada comPBS e incubada por 72 horas no meio 199.

O sobrenadante da cultura constitui o estoqueviral após a adição de estabilizador. O estoque viral étestado quanto à esterilidade, toxicidade, potência equanto à presença de agentes adventicios. O estoqueviral é o lote semente original.

A infecciosidade especifica dos transcritos édeterminada a partir de ensaios nos quais as diluiçõesseriadas do RNA são tranfectadas em células Vero eestas são recobertas com meio semi-sólido. A coloraçãocom cristal violeta para a contagem de placas edeterminação da quantidade de RNA, utilizando a medidade densidade óptica (DO) a 260 nm, permite adeterminação da infecciosidade especifica dostranscritos (PFU^g RNA total).

Essa determinação é relevante para estabelecer amultiplicidade de infecção que leva ao estoqueoriginal. Ela assegura um número aceitável de eventosequivalentes à infecção com o virus vivo de maneira areduzir a probabilidade de acumulação de mutações nogenoma viral dado o elevado número de ciclos dereplicação devido ao baixo fornecimento de RNA.

b) Preparação dos lotes semente:

Todos os lotes foram preparados em culturasprimárias de células CEF usando ovos derivados degranjas SPF (NNSpecific Pathogen Free") . Os virus foramrecuperados pela transferência do sobrenadante em cadafrasco de cultura para frascos de centrífuga seguido decentrifugação a baixa velocidade para remover os restoscelulares. O sobrenadante foi aspirado para dentro defrascos contendo estabilizador na proporção de 1:1 econgelamento por rotação em banho de gelo secocontendo etanol após a remoção de todas as alíquotaspara o controle de qualidade. Todos os vírus foramestocados como indicado acima,

b.1) Preparação do lote semente original:

O lote semente original consiste do materialproveniente de 3 ensaios separados detranscrição/transfecção realizados em dias diferentescom diferentes lotes de culturas primárias de célulasCEF.

CEF primárias foram semeadas. Um total de 3frascos de cultura descartáveis de 175 cnr, contendo RNAin vitro transcrito foram transfectados em células CEFusando LipofectAminet"'. Cada frasco de cultura forneceuum total de 80 ml de sobrenadante de cultura. Nas trêstransfeccões separadas realizadas em dias diferentes e,portanto com diferentes lotes de células CEF, ostítulos dos lotes semente originais foram: TI, 1(T'':':4, 66 Log.,. pfu/ml); T2, IO4-a^ (4,87 Log., pfu/ml) e T3,10'4b (5,46 Log; pfu/ml). Cada lote forneceu um volumetotal de 480 ml de vírus original. Oitenta ml foramusados no controle de qualidade e os restantes 400 mlpara a preparação do(s) lote(s) semente primário(s).

b.2) Preparação do lote semente primário:

Dois lotes semente primários foram preparados eidentificados como LPl and LP2. LPl deriva dc lotesemente original T3 enquanto LP2 deriva do T2. Cada umfoi testado quanto à esterilidade, potência e presençade agentes adventicios, tendo sido obtidos resultadossatisfatórios.

Os volumes e títulos obtidos foram:

b.3) Lotes semente secundários:

Três lotes semente secundários foram preparados eidentificados como LSI, LS2 e LS3. LSl e LS2 derivamdo lote semente primário LPl enquanto que LS3 deriva doLP2. Cada um foi testado quanto à esterilidade,potência e presença de agentes adventicios, tendo sidoobtidos resultados satisfatórios.

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pfu = unidade formadora de placaOs volumes e títulos obtidos foram:

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Cada um desses lotes semente é suficiente para aprodução de vacina de Febre Amarela, usando a atualmetodologia de fabricação (ovos embrionados) ou osistema celular (células CEF), para cerca de 50 anos auma taxa de pelo menos 50 milhões de doses/ano.

Claims (24)

1. Processo para a produção de Flavivirus em baixadensidade de células em cultura caracterizado porcompreender as etapas de:(a) preparar uma cultura de células de fibroblastos deembrião de galinha, permissiveis ao virus e aceitáveis comosubstrato para a produção de vacinas;(b) suspender as células em um meio adequado seguidode semeadura das células a uma densidade menor do que 2xl05células/cm2;(c) incubar a cultura de células em uma faixa detemperatura de 30°C a 40°C por um período de tempo de 12 a-72 horas;(d) remover o meio da cultura de células da etapa (c)e inoculação das células com o vírus semente;(e) incubar a cultura de células da etapa (d) em umafaixa de temperatura de 20°C a 40°C por um período de tempode 12 a 144 horas;(f) remover o meio, lavar as células uma ou mais vezese repor o meio;(g) incubar a cultura de células da etapa (f) em umafaixa de temperatura de 30°C a 40°C por um período de tempoentre 12 a 144 horas;(h) coletar ao menos parcialmente o sobrenadante dacultura contendo o vírus; e,(i) estocar o vírus em uma temperatura de -4 5°C ouinferior.

2. Processo de acordo com uma das reivindicações 1caracterizado por a cultura de células ser incubada nasetapas (e) e (g) por um período de tempo entre 12 a 72horas.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1caracterizado por serem realizadas múltiplas coletas domeio contendo o Flavivirus, em qualquer intervalo desejado,através da reposição do meio removido e re-incubação dacultura por um período de tempo de 12 a 144 horas.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3caracterizado por a re-incubação da cultura ser por umperíodo de tempo de 12 a 72 horas.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1caracterizado por os restos celulares e as células íntegrasserem removidos do vírus coletado.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1caracterizado por o vírus ser inativado.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1caracterizado por a semeadura das células ser realizada emdensidades na faixa de IxlO4 - 2xl05 células/cm2.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por a semeadura das células ser realizada emdensidades na faixa de IxlO4 - IxlO5 células/cm2.

9. Processo de acordo com uma das reivindicações 1caracterizado por um estabilizador ser adicionado aosobrenadante da etapa (h).

10. Processo de acordo com a reivindicação 3caracterizado por o estabilizador ser uma substânciaaceitável como componente em produtos parenterais e serselecionado do grupo consistindo de albumina de soro humano(HSA), peptídeos, aminoácidos ou proteínas e suas misturas.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1caracterizado por o Flavivirus ser o virus da febre amarelada linhagem 17D ou de suas sub-linhagens do tipo selvagemou virus atenuado.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por as células serem células primárias oucélulas derivadas de qualquer passagem posterior dasmesmas.

13. Processo para a produção de Flavivirusrecombinante em baixa densidade de células em culturacaracterizado por compreender as etapas de:(a) preparar uma cultura de células de fibroblastos deembrião de galinha, permissivas ao virus e aceitáveis comoum substrato na produção de vacinas;(b) semear as células a densidades menores que 2xl05células/cm2;(c) transfectar as células com ácidos nucléicos portratamento com lipideos sintéticos ou eletroporação;(d) incubar a cultura de células a 30 até 40°C por umperíodo de tempo entre 12 a 72 horas;(e) remover o meio da cultura de células da etapa (d)e inocular as células com o vírus semente;(f) incubar a cultura de células da etapa (e) a 20 até-40°C por um período de tempo entre 12 a 144 horas;(g) remover o meio seguido de lavagem das células umaou mais vezes e reposição do meio;(h) incubar a cultura de células da etapa (g) a 30 até-40°C por um período de tempo entre 12 a 144 horas;(i) coletar ao menos parcialmente o sobrenadante dacultura que contem o vírus; e,(j) estocar o vírus a -45°C ou temperaturas maisbaixas.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13caracterizado por a cultura de células ser incubada nasetapas (f) e (h) por um período de tempo entre 12 a 72horas.

15. Processo de acordo com a reivindicação 13caracterizado por serem realizadas múltiplas coletas domeio contendo o vírus, em qualquer intervalo desejado,através da reposição do meio removido e re-incubação dacultura por um período de tempo de 12 a 144 horas.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15caracterizado por a re-incubação da cultura ser por umperíodo de tempo de 12 a 72 horas.

17. Processo de acordo com a reivindicação 13caracterizado por restos celulares e células íntegras seremremovidos do vírus coletado.

18. Processo de acordo com a reivindicação 13caracterizado por o vírus ser inativado.

19. Processo de acordo com a reivindicação 13caracterizado por a semeadura das células ser realizada emdensidades na faixa de IxlO4 - 2xl05 células/cm2.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19caracterizado por a semeadura das células ser realizada emdensidades na faixa de IxlO4 - IxlO5 células/cm2.

21. Processo de acordo com a reivindicação 13caracterizado por um estabilizador ser adicionado aosobrenadante da etapa (h).

22. Processo de acordo com a reivindicação 21caracterizado por o estabilizador ser uma substânciaaceitável como componente em produtos parenterais e serselecionado do grupo consistindo de albumina de soro humano(HSA), peptídeos, aminoácidos ou proteínas e suas misturas.

23. Processo de acordo com a reivindicação 13caracterizado por o Flavivirus recombinante ser o vírus daFebre Amarela da linhagem 17D ou de suas sub-linhagens.

24. Processo de acordo com a reivindicação 13,caracterizado por as células serem células primárias oucélulas derivadas de qualquer passagem posterior das mesmas.