JP7370338B2 - ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株およびそれを含むワクチン組成物 - Google Patents
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Description
i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の480位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、または
ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質2A(NS2a)の65位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
(i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる480位での突然変異を含むエンベロープタンパク質、および
(ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる65位での突然変異を含むNS2aタンパク質
をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
(i)配列番号15の480位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質、および
(ii)配列番号16の65位に対応するタンパク質内の位置でバリン残基を含むNS2aタンパク質
をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
- a)ベロ細胞での成長に適合していない、かつ場合により卵での成長に適合している、親弱毒生黄熱ウイルス株のウイルスゲノムRNAを精製する工程;
- b)工程a)で精製されたウイルスゲノムRNAをベロ細胞にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされたベロ細胞を得る工程;
- c)工程b)で得られたトランスフェクトされたベロ細胞を培養培地において成長させ、これによって、第1の黄熱ウイルス集団を得、さらに回収する工程;
- d)工程c)の最後で得られた回収された第1の黄熱ウイルス集団を、新鮮なベロ細胞で2回またはそれ以上増幅し、これによって、第2の黄熱ウイルス集団を得る工程;
- e)工程d)で得られた第2の黄熱ウイルス集団を、ベロ細胞での2回またはそれ以上の連続的なプラーク精製によってクローニングし、これによって、複数の黄熱ウイルスクローンを得る工程;
- f)工程e)の最後で得られた回収された黄熱ウイルスクローンのそれぞれを、新鮮なベロ細胞で2回またはそれ以上別個に増幅し、これによって、複数の黄熱ウイルス株を得る工程;および
- g)マウス50%致死量(MLD50)試験において、工程f)で回収された前記複数の黄熱ウイルス株から、親弱毒生黄熱ウイルス株ほどには神経毒性でない1つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択する工程
を含む、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株を得るための方法に関する。
本発明の範囲内では、「YFV」は「黄熱ウイルス」に関連し、その一方で、用語「vYF」は、ベロ細胞適合型黄熱ウイルス、すなわち、ベロ細胞での成長に適合している黄熱ウイルスを示す。
一態様において、本発明は、ベロ細胞での成長に適合していない親黄熱ウイルス17D亜株に由来する、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株に関する。様々な実施形態において、前記弱毒生黄熱ウイルス株は、前記親黄熱ウイルス17D亜株ほどには神経毒性でない。
- (i)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の2411位のヌクレオチドG(グアノシン)が、ヌクレオチドU(ウリジン)によって置き換えられている、かつ
- (ii)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の3701位のヌクレオチドA(アデノシン)が、ヌクレオチドG(グアノシン)によって置き換えられている。
- (i)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の2411位のヌクレオチドG(グアノシン)が、ヌクレオチドU(ウリジン)によって置き換えられている、かつ
(ii)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の6496位のヌクレオチドA(アデノシン)が、ヌクレオチドG(グアノシン)によって置き換えられている。
- (i)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の3701位のヌクレオチドA(アデノシン)が、ヌクレオチドG(グアノシン)によって置き換えられている、かつ
- (ii)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の6496位のヌクレオチドA(アデノシン)が、ヌクレオチドG(グアノシン)によって置き換えられている。
- (i)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の2411位のヌクレオチドG(グアノシン)が、ヌクレオチドU(ウリジン)によって置き換えられている、
- (ii)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の3701位のヌクレオチドA(アデノシン)が、ヌクレオチドG(グアノシン)によって置き換えられている;かつ
- (iii)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の6496位のヌクレオチドA(アデノシン)が、ヌクレオチドG(グアノシン)によって置き換えられている。
- (i)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の2411位のヌクレオチドG(グアノシン)が、ヌクレオチドU(ウリジン)によって置き換えられている、
- (ii)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の3701位のヌクレオチドA(アデノシン)が、ヌクレオチドG(グアノシン)によって置き換えられている;
- (iii)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の6496位のヌクレオチドA(アデノシン)が、ヌクレオチドG(グアノシン)によって置き換えられている;かつ
- (iv)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5の1408位のヌクレオチドA(アデニン)が、ヌクレオチドU(ウリジン)によって置き換えられている。
- 前駆体が121aa長であり、かつ成熟タンパク質が101aa長である、カプシドタンパク質(Cタンパク質)、
- 75aa長の膜タンパク質(Mタンパク質)の前駆体である、164aa長のプレ膜タンパク質(prMタンパク質)、
- 493aa長であるエンベロープタンパク質(Eタンパク質)、
- 352aa長である非構造タンパク質1(NS1)、
- 224aa長である非構造タンパク質2a(NS2a)、
- 130aa長である非構造タンパク質2b(NS2b)、
- 623aa長である非構造タンパク質3(NS3)、
- 126aa長である非構造タンパク質4a(NS4a)、
- 23aa長である非構造ペプチドP2k、
- 250aa長である非構造タンパク質4b(NS4b)、
- 905aa長である非構造タンパク質5(NS5)。
i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の480位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、または
ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質2A(NS2a)の65位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む。
i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の480位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および
ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質2A(NS2a)の65位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む。
i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の480位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異;
ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質2A(NS2a)の65位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異;および
iii)AAAからAAGへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質4A(NS4a)の19位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む。
i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の480位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異;
ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質2A(NS2a)の65位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異;
iii)AAAからAAGへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質4A(NS4a)の19位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異;および
iv)GUAからGUUへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の145位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む。
(i)480位での突然変異を含むエンベロープタンパク質、および
(ii)65位での突然変異を含むNS2aタンパク質
をコードする核酸分子を含む。
(i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる480位での突然変異を含むエンベロープタンパク質、および
(ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる65位での突然変異を含むNS2aタンパク質
をコードする核酸分子を含む。
(i)配列番号15の480位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質、および
(ii)配列番号16の65位に対応するタンパク質内の位置でバリン残基を含むNS2aタンパク質
をコードする核酸分子を含む。
別の態様において、本発明はまた、本発明に従った弱毒生YFV株を含む免疫原性組成物に関する。
本発明のさらなる態様は:
- a)ベロ細胞での成長に適合していない、かつ場合により卵での成長に適合している、親弱毒生黄熱ウイルス株のウイルスゲノムRNAを精製する工程;
- b)工程a)で精製されたウイルスゲノムRNAをベロ細胞にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされたベロ細胞を得る工程;
- c)工程b)で得られたトランスフェクトされたベロ細胞を培養培地において成長させ、これによって、第1の黄熱ウイルス集団を得、さらに回収する工程;
- d)工程c)の最後で得られた回収された第1の黄熱ウイルス集団を、新鮮なベロ細胞で2回またはそれ以上増幅し、これによって、第2の黄熱ウイルス集団を得る工程;
- e)工程d)で得られた第2の黄熱ウイルス集団を、ベロ細胞での2回またはそれ以上の連続的なプラーク精製によってクローニングし、これによって、複数の黄熱ウイルスクローンを得る工程;
- f)工程e)の最後で得られた回収された黄熱ウイルスクローンのそれぞれを、新鮮なベロ細胞で2回またはそれ以上別個に増幅し、これによって、複数の黄熱ウイルス株を得る工程;および
- g)マウス50%致死量(MLD50)試験において、工程f)で回収された前記複数の黄熱ウイルス株から、親弱毒生黄熱ウイルス株ほどには神経毒性でない1つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択する工程
を含む、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株を得る方法に関する。
- a)ベロ細胞での成長に適合していない、かつ場合により卵での成長に適合している、親弱毒生黄熱ウイルス株のウイルスゲノムRNAを精製する工程;
- b)工程a)で精製されたウイルスゲノムRNAをベロ細胞にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされたベロ細胞を得る工程;
- c)工程b)で得られたトランスフェクトされたベロ細胞を培養培地において成長させ、これによって、第1の黄熱ウイルス集団を得、さらに回収する工程;
- d)工程c)の最後で得られた回収された第1の黄熱ウイルス集団を、新鮮なベロ細胞で2回またはそれ以上増幅し、これによって、第2の黄熱ウイルス集団を得る工程;
- e)工程d)で得られた第2の黄熱ウイルス集団を、ベロ細胞での2回またはそれ以上の連続的なプラーク精製によってクローニングし、これによって、複数の黄熱ウイルスクローンを得る工程;
- f)工程e)の最後で得られた回収された黄熱ウイルスクローンのそれぞれを、新鮮なベロ細胞で2回またはそれ以上別個に増幅し、これによって、複数の黄熱ウイルス株を得る工程;および
- g)工程f)で回収された前記複数の黄熱ウイルス株から:
i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の480位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、または
ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質2A(NS2a)の65位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む、1つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択する(このような選択は、当技術分野において周知のシーケンシング方法で容易に行われる)工程
を含む、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株を得る方法に関する。
i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の480位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および
ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質2A(NS2a)の65位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む、1つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択することを含み得る。
i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の480位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、
ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質2A(NS2a)の65位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、
iii)AAAからAAGへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質4A(NS4a)の19位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および/または
iv)GUAからGUUへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の145位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む、1つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択することを含み得る。
本発明はまた、それを必要とする個体への本発明に従ったワクチン組成物の投与を含む、YFVによる感染に対して前記個体を免疫化するための方法に関する。
1.1/方法の選択-原理
プレマスターシードロット(pMSL)のための全体的な戦略を図1に示す。
- (1)YF-VAX(登録商標)ウイルスおよびStamaril(登録商標)ウイルスのウイルスゲノムRNAを精製し;
- (2)次いで、ベロ細胞にトランスフェクトして黄熱ウイルスを回収し、これを次いで、ベロ細胞で2回増幅して、ウイルスをこの細胞基質での成長に適合させた;
- (3)ウイルスを次いで、2回のプラーク精製サイクルによってクローニングした。この目的のために、ウイルス調製物を、ベロ細胞の感染のために希釈し、半固体のオーバーレイの下で成長させて、良く分離されたウイルスプラークを得た。各トランスフェクションで、それぞれ単一のウイルス集団に対応する2つの個別のプラークを、オーバーレイを通ってかき取り、希釈し、プラーク精製の第2のサイクルに使用し、ウイルスクローンを生成させた;
- (4)これらのクローンを次いで増幅して、pMSLを構成するための十分なウイルスストックを得た。
1.2.1/YF-VAX(登録商標)ゲノムcDNAからのインビトロでの転写
YF-VAX(登録商標)(WO2014/016360において開示されているプラスミドpJSY2374.5)のYFVのゲノムcDNAのインビトロでの転写を、供給業者の推奨に従って、mMessage mMachine(商標)SP6キット(AMBION(登録商標)、参照AM1340)で行った。プラスミドpJSY2374.5から、2回のインビトロでの転写を並行して行った。
a)Stamaril(登録商標)ワクチンのワーキングシードロットから
ウイルスRNAの2回の精製を並行して行った。
インビトロでの転写によって得られたRNA(上記を参照されたい)に混入しているプラスミドDNAを、4UのDNaseによって、37±2℃で15分間除去した。SP6ポリメラーゼを次いで、70℃で10分間のインキュベーションによって不活化した。
2回のトランスフェクションを、各RNA精製と並行して行った。
リポフェクタミン(商標)2000 CD(LIFE TECHNOLOGIES(登録商標))10または15μLを、OptiPro SFM培地(LIFE TECHNOLOGIES(登録商標))1mLと混合し、室温で5分間インキュベートした。約10log10Geq(Mantelら(2008)において記載されているようにYF-NS5 qRT-PCRによって決定されるゲノム当量力価)の精製されたRNAを次いで添加した。これらの混合物を、室温で10分間、インキュベートした。
トランスフェクションの前に、6ウェルプレートに事前に播種された(ウェル当たり3mLのVP-SFM(THERMOFISHER SCIENTIFIC)中に9・105個細胞)Sanofi Pasteur’s GMPバンクの無血清のベロ細胞を、ウェル当たり2mLのOptiPro SFM培地ですすいだ。
6ウェルプレートにおいて、細胞からすすぎ用培地を除去した後、RNAを含有するトランスフェクション混合物を、各調製物につき2つのウェルに置いた(1mL/ウェル)。ウェルを、RNAを含有しないOptiPro SFM/リポフェクタミン(商標)と接触させ、最後のウェルを、OptiPro SFM培地のみにおいて細胞コントロールとして維持した。2つのプレートを並行して調製し、一方は、リポフェクタミン(商標)10μlを含有する混合物を有し、一方は、リポフェクタミン(商標)15μlを含有する混合物を有していた。リポフェクタミン(商標)およびRNAを含有する混合物を、37±2℃、5±2%CO2で4時間、ベロ細胞と接触させたままとし、次いで、事前に加熱したVP-SFM培地2mLを各ウェルに添加した。6ウェルプレートを、37±2℃;5±2%CO2で16時間、インキュベートした。培地を次いで交換し、プレートを、37±2℃、5±2%CO2で再びインキュベートした。細胞変性効果(細胞溶解)が肉眼で確認できる場合、および培養上清からYF-NS5 qRT-PCRによって決定されるゲノム力価(Mantelら(2008)において記載されているように)が8.0log10Geq/mLよりも高い場合には、トランスフェクション上清を回収した。採取が可能になるために必要な培養時間がこれらの時間よりも長い場合には、新鮮な培地による培養培地の置き換えを5日目および8日目に行った。採取した上清をアリコートに分けた。
a)増幅番号1(ウイルス継代番号2)
ウイルス増幅番号1の2日前に、ベロ細胞2・105個を、VP-SFM培地5mLを含有する25cm2のフラスコに播種した。次いで、トランスフェクションから得られたウイルス懸濁液をVP-SFM培地中で希釈して、ゲノム多重度(m.o.g)2(すなわち、細胞当たり2Geq、qRT-PCRによって得られるRNA濃度から推定される)を得た。事前に播種されたベロ細胞の培養培地を除去し、細胞を、希釈されたウイルス懸濁液1mLまたはVP-SFM培地のみ1mL(細胞コントロール)と接触させた。フラスコを、37±2℃;5±2%CO2で2時間、インキュベートした。ウイルス接種物を次いで除去し、VP-SFM培地10mLで置き換え、細胞を、37±2℃;5±2%CO2で2日間、インキュベートした。培養培地を次いで、37±2℃に事前に加熱した新たなVP-SFM培地で交換し、フラスコを、37±2℃;5±2%CO2で2から3日間、再びインキュベートした。全部で4から5日間インキュベートした後、ウイルスを含有する培養上清を回収した。ウイルス懸濁液を、1200rpmで、4℃で10分間遠心分離することによって清澄化し、次いで、アリコートに分配した。このウイルス懸濁液140μlを使用して、全RNAをQiaAmpウイルスミニキット(QIAGEN(登録商標);供給業者のプロトコルに従って)で抽出し、ウイルスRNAを、YF-NS5 qRT-PCRによって定量した(Mantelら(2008)において記載されているように)。
ウイルス増幅番号2の2日前に、ベロ細胞5・105個を、VP-SFM培地20mLを含有する75cm2のフラスコに播種した。次いで、第1の増幅から得られたウイルス懸濁液を、m.o.g2(すなわち、細胞当たりGeq、qRT-PCRによって得られるRNA濃度から推定される)の割合でベロ細胞に感染するように、VP-SFM培地中で希釈した。
トランスフェクションおよび増幅の後に得られるウイルス懸濁液当たり、2つの6ウェルプレートが必要であった。
各クローン(最大32)について、アガロースに含有されるウイルス物質の再懸濁によって得られたウイルス懸濁液を、VP-SFM中に1/4または1/2(回収されたプラークのサイズに応じて)で希釈した。
増幅番号3で得られたウイルス懸濁液(上記のd)の節を参照されたい)を、m.o.g2の割合で事前に播種されたベロ細胞に感染するように、VP-SFM培地中で希釈し、増幅番号2と同一のプロトコルに従ってさらに処理した(上記のb)の節を参照されたい)。
増幅番号4から選択された6つの株のそれぞれのウイルス懸濁液(上記のe)の節を参照されたい)を、m.o.i0.01でベロ細胞に感染するように、VP-SFM培地に希釈した。
2.1/マウスモデルにおけるpMSL候補の神経毒性
vYF(ベロ細胞適合型黄熱ウイルス)のプレマスターシードロット(pMSL)候補の神経毒性を、WHO TRS 872、付録2(1998)において記載されている、マウス50%致死量(MLD50)の決定を介して評価した。
2.2.1/TV3112株のMSLおよびWSL
MSLおよびWSLの生産に使用した全ての培地および溶液は、動物成分およびヒト成分を有していなかった。
上記の実施例2、2.1項において記載されているものと同一のプロトコルを使用した。
6つのvYF(ベロ細胞適合型黄熱ウイルス)のプレマスターシードロット(pMSL)候補の内臓向性および神経向性を、病原性ワクチン株と弱毒化ワクチン株との間の区別を可能にするように開発されたI型IFN受容体欠損マウスへの接種に基づくアッセイにおいて評価した(Meierら、2009;EricksonおよびPfeiffer、2015)。I型IFN受容体がKOされたA129免疫欠損マウスは、霊長類およびヒトにおける野生型YFウイルスの感染を模倣することが記載されている(Meierら、2009)。したがって、このようなマウスモデルは、非弱毒化黄熱ウイルスによって生じる内臓向性疾患を研究するために適切であると考えられる。
3.1.1/群の定義
6頭の4~8週齢のメスA129マウスからなる15の群(群AからO)に、以下の表4に記載するように、6つのpMSL候補のそれぞれまたはStamaril(登録商標)参照ワクチン4log10CCIDCCID50/用量を投与した(アジュバントなし;皮下投与経路;0日目で200μl)。
研究スケジュールを図2に記載する。
動物を、接種後11日間、毎日、以下の表5に記載するスコアリンググリッドに従って観察した。体温を、3日目から実験の最後の11日目まで毎日モニタリングし、記録した。
- 罹患の徴候(悪液質、衰弱、運動の困難性、または飼料摂取の困難性)
- 化合物毒性(こぶ、けいれん)
- 全身状態スコア=3+刺激に対する反応=3
- 体重減少>20%
a)4日目に、中間血液サンプルを麻酔下で顎下静脈から採取した。血液およそ200μLを、血栓活性化剤および血清分離剤(BD Microtainer SST)を含有するバイアルに回収した。
a)ウイルス血症
全ゲノムRNAを、各個体の血清サンプル140μLから、製造者の指示に従って、Tecan Evoware自動RNA抽出ワークステーションでMacherey Nagel NucleoSpin(登録商標)96ウイルスキットを用いて抽出し、最終容積が140μLのヌクレアーゼを有さない水の中に、2工程で溶出した。
生検パンチをRNA later(商標)溶液中で、-80℃で凍結した。解凍時に、器官の各サンプルを秤量した。
3.2.1/臨床的徴候
全ての動物を、上記の表5に記載されているスコアリンググリッドに従って、接種後に毎日観察した:群AからOの全てのマウスは、3日目から6日目まで、毎日スコアリングし、群A、B、D、F、H、J、L、およびNの全てのマウスは、11日目まで毎日、さらにスコアリングした。
全てのマウス(群AからO)を、0日目、3日目、4日目、5日目、および6日目に秤量し;7日目、10日目、および11日目に、残っている群(A、B、D、F、H、J、L、およびN)の全てのマウスを秤量した。0日目と比較した体重減少のパーセンテージを、各時点で、それぞれの個々のマウスについて計算した。
a)血清中-図3
個々のウイルス血症、ならびに各群および各時点で計算された幾何平均力価(GMT)および標準偏差を、図3に示す。
結果は、器官1mg当たりのlog10Geqで表す。個々のウイルス負荷、ならびに各群および各時点で計算された幾何平均および標準偏差を、図4に示す。
結果は、器官1mg当たりのlog10Geqで表す。個々のウイルス負荷、ならびに各群および各時点で計算された幾何平均力価および標準偏差を、図5に示す。
結果は、器官1mg当たりのlog10Geqで表す。個々のウイルス負荷、ならびに各群および各時点で計算された幾何平均力価および標準偏差を、図6に示す。
各群(群A、B、D、F、H、J、L、およびN)の生存率を計算するために、生存しているマウスの数を、4log10CCID50/用量のStamaril(登録商標)または6つのvYF pMSL候補の1つで皮下免疫化した後11日間にわたり、毎日記録した。
ハムスターモデルにおける6つのvYF pMSL候補の免疫原性を評価し、Stamaril(登録商標)参照ワクチンと比較した。
4.1.1/群の定義
15頭の5~6週齢のメスゴールデンシリアンハムスターを各群に含め、2つの用量、すなわち、最適用量以下の低用量である2.5log10CCID50/用量、および高用量である5.5log10CCID50/用量を、6つのpMSL候補のそれぞれについて投与した。
研究スケジュールを図8にまとめる。
a)生物学的サンプリング
中間血液サンプルを、麻酔下で、眼窩後静脈叢(ROS)から、0日目、26日目、および41日目に、全ての動物から行った。最後の血液サンプリングを、麻酔下で、心臓穿刺を介して行った。麻酔は、Imalgene(150mg/kg)およびRompun(10mg/kg)を腹腔内経路によって200μlの容積で投与することによって行った。
免疫化された動物の血清中に存在する機能的な中和抗体を、最初の注射から0日目、26日目、および41日目に力価測定した。
ベロ細胞での黄熱17Dワクチン株に対する中和活性を、ベースライン(0日目)、1回の免疫化の4週間後(26日目)、および2回の免疫化の2週間後(41日目)に全ての動物から回収された個々の血清サンプルにおける血清中和アッセイによってモニタリングした。幾何平均力価(GMT)、ならびに個々の中和力価および95%信頼区間(CI)を、図9および図10に示す。
予備的な毒性研究および免疫原性研究を、非ヒト霊長類(NHP)において行った。非ヒト霊長類、特にアカゲザルまたはカニクイザルは、ウイルス血症によって測定される安全性および感染性、ならびにフラビウイルス(デング、黄熱など)に対するワクチン候補の免疫原性を評価するために、従来使用されている。黄熱の背景では、サルは天然の宿主であり;ウイルスはサルにおいて最初に単離され、このモデルにおいて、ワクチン株の弱毒化が評価された。2000年代から、「小動物」モデルが記載されており、vYF pMSL候補の選択のために行われるように、候補ワクチンのある特定の特性を評価するために使用される。しかし、これらのモデル(ハムスター、マウスA129)には限界があり、マカクは、今日まで、ヒトと比較して最も予測可能なゴールドスタンダートモデルであり続け、文献、例えば、Julander(2016)、Masonら(1973)、Monathら(2010)、およびMoulinら(2013)において広く記載されている。さらに、このモデルは、規制ガイドラインにおいて推奨されている。
5.1.1/群の定義および目的
モーリシャスから輸入された9頭の2歳齢のオスのカニクイザル(Macaca fascicularis)からなる3つの群を、SC経路によって、Stamaril(登録商標)500μL(4.2log10CCID50/用量に対応する1ヒト用量)、1用量のYF-VAX(登録商標)(6.2log10CCID50)、または4.2log10CCID50のvYF TV3112 WSL候補で免疫化した。
免疫化では、およびある特定の場合で(例えば、馴化期間の間に他の操作と組み合わされた血液サンプリング、またはサルが麻酔なしの血液サンプリングを受けられない場合)、軽い麻酔を行った。10mg/kgのケタミン(Imalgene 1000、MERIAL(登録商標))を、大腿部に筋肉内注射した。
全ての動物を-29日目および0日目に秤量し、7日目まで臨床的徴候について毎日観察し、その個々の体温(トランスポンダーシステム)を、-17日目、ならびにウイルス血症予想期間の間の0日目、3日目、4日目、5日目、6日目、および7日目に記録した。血液学、生化学、および血中ウイルス血症を、全てのサルにおいて、1日目、3日目、および7日目に評価した。各群の3頭のサルを、次いで安楽死させ、その器官を、器官における病理組織学およびウイルス負荷の評価のために、7日目にサンプリングした。各群における6頭の残っているサルをさらに、27日目、60日目、90日目、122日目、153日目、および181日目に秤量し、その個々の体温を、ウイルス血症予想期間の間の10日目および14日目に、さらに記録した。各群における6頭の残っているサルはまた、臨床的徴候についても221日目まで毎日観察した。血清中和、T細胞、およびメモリーB細胞のアッセイのための血液サンプルを、27日目、60日目、90日目、122日目、153日目、181日目、および221日目に、各群における6頭の残っているサルから回収した。
YF特異的な血清中和抗体を、ベロ細胞でμPRNT50方法を使用して力価測定した。簡潔に述べると、加熱不活化した血清を、IMDM(THERMOFISHER SCIENTIFIC)+4%FCS中に、1:5から開始して連続的に2倍希釈した。ベロ細胞で成長させたYF-17D Stamaril(登録商標)ウイルスを希釈して、IMDM中で4000μPFU/mLとし、2倍希釈した血清サンプル(v/v)と90分間インキュベートした。次いで、ウイルス/血清混合物を、96ウェルプレート内のベロ細胞に添加し、45+/-2時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を85%アセトンで固定し、その後、免疫染色した。プレートを、PBS+0.05% Tween 20+2.5%脱脂乳でブロックし、まず抗フラビウイルスモノクローナル抗体4G2と、次にヤギ抗マウスIgG HRPコンジュゲートとインキュベートした。最後に、プレートをTrueblue(商標)クロモゲンで染色した。プラークを、Microvision(商標)のViruscopeリーダーで計数した。最終的な力価は、最小二乗法を使用して計算され、50%のプラークの中和を示す希釈の逆数に対応する。
弱毒生黄熱ワクチンについて、防御と相関するものは、WHO TRS 978、付録5において、事前に血清反応陰性であった個体における測定可能な中和抗体の誘発、例えば、PRNT力価>検出限界と定義されている。事前に確立された防御閾値(LOD=20)を大きく超える中和抗体が、早くも14日目に、および少なくとも9ヶ月の間に、全てのサルにおいて検出された(図11を参照されたい)。中和抗体力価は、現行のワクチンで免疫化した後に検出される力価と有意に異ならなかった。
目的は、vYF TV3112ワクチン候補で免疫化されたマカクにおける黄熱ウイルスでのチャレンジに対する防御を評価することであった。
6.1.1/動物
Stamaril(登録商標)、YF-VAX(登録商標)、またはvYF TV3112ワクチン候補で免疫化した9ヶ月後、上記の実施例5において研究された3つの動物群のそれぞれの、221日目に残っている6頭のサルを、Asibi毒性株で黄熱に対してチャレンジして、ワクチン効能を評価した。6頭のナイーブコントロールサルからなる別の群もチャレンジした。
チャレンジは、テキサス大学医学部(UTMB)から入手した黄熱ウイルス株Asibi(YFV)で行った。YFV(ロット19455、ベロ細胞で感染力価7.7log10CCID50/mL)を、NaCl+HSAバッファー(NaCl 0.4%+ヒト血清アルブミン(HSA)2.5%)中に希釈した。各動物を、NaCl+HSAバッファー1mL中で103 CCID50のYFVで、上部右背側の部位に、皮下でチャレンジした。
動物を、Asibiチャレンジ後28日間にわたり追跡した。動物を、飼料の消費および挙動について、毎日観察した。直腸体温および体重を各サンプリング時点で記録した。血液サンプリングを、以下の表8に記載するように行った。
動物を週に7日観察した。採血の各時点で、臨床試験を以下の表9に記載するように行った。
全てのワクチン接種されたサルは、チャレンジの影響:ウイルス血症(低レベルのウイルス血症のみ、すなわち、Mantelら(2008)において記載されているようにYF-NS5 qRT-PCRによって測定すると、2/6頭のサルにおいてわずか1日にわたり<3.6log10GEq/mL)、血液学的障害、血液の生化学的障害、および死亡、から防御された。
RNAウイルスは、高い遺伝的多様性レベルを天然に示し、これは、これらのウイルスの疑似種固有の性質の理由である。黄熱ポリメラーゼのエラー率がRNAウイルスであることを理由に低いと記載されていても、ポリメラーゼのエラー率は、感染サイクル当たりゲノム当たり約10-6個置換である。
7.3.1/原理
黄熱ウイルスのシーケンシングは、ウイルスRNAの抽出および精製の後に行った。
ウイルスRNAを、Qiamp Viralキット(QIAGEN(登録商標))で、供給業者の推奨に従って、ウイルス懸濁液140μlから、108Geq/mLの最小濃度(YF-NS5 qRT-PCRによる定量)で抽出した。精製されたウイルスRNAを、ヌクレアーゼを有さない水140μlの中に溶出した。
まず、RNAからcDNAへの特異的逆転写(RT)工程を、黄熱ウイルスのゲノムをオーバーラップさせることを目的として、3つのアンチセンスプライマーを使用して行った。次いで、PCR増幅を、表10に記載する3つのプライマー対を使用して行った。
全てのアンプリコンを1.2%アガロースゲル上で分析して、増幅の質をチェックした。QIAQuick(登録商標)PCR精製キット(QIAGEN(登録商標))を供給業者の推奨に従って使用して、アンプリコンを手動で精製した。
精製されたアンプリコンを、Qubit(登録商標)dsDNA HSアッセイキットを供給業者の推奨に従って使用して、Qubit(登録商標)2.0蛍光光度計(LIFE TECHNOLOGIES(登録商標))で定量した。
ライブラリーの定量を、Qubit(登録商標)dsDNA HSアッセイキットを供給業者の推奨に従って使用して、Qubit(登録商標)2.0蛍光光度計(LIFE TECHNOLOGIES(登録商標))で行った。
ライブラリーを、MiSeqシステム(ILLUMINA(登録商標))によって、供給業者の推奨に従ってシーケンシングした。配列を、ILLUMINA(登録商標)Sequencing Analysis Viewer(Illumina,Inc.)によって、供給業者の推奨に従って分析した。
7.4.1)YF-VAX(登録商標)ワクチンおよびStamaril(登録商標)ワクチンの参照配列
YF-VAX(登録商標)ワクチンの参照配列を、配列番号2で表した。Stamaril(登録商標)ワクチンの参照配列は配列番号3で見ることができる。
pMSL候補のゲノム(継代番号8)をシーケンシングし、これらの親株のゲノムと比較した。以下の表17は、Stamaril(登録商標)系統からの3つの株についてのハイスループットシーケンシングの結果を示す。
以下の表18は、YF-VAX(登録商標)系統からの3つのpMSL候補(継代番号8)についてのハイスループットシーケンシングの結果を示す。
(i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる480位での突然変異を含むエンベロープタンパク質、および
(ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる65位での突然変異を含むNS2aタンパク質。
または、TV3112株およびTV3111株は、以下をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株として記載することができる:
(i)配列番号15の480位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質;および
(ii)配列番号16の65位に対応するタンパク質内の位置でバリン残基を含むNS2aタンパク質。
TV3112 MSLのコンセンサス配列は、そのpMSL親(TV3112 pMSL)のコンセンサス配列と同一なままであった。TV3112 WSLのコンセンサス配列は、そのMSL親(TV3112 MSL)と同一なままであった。TV3112株は遺伝的に安定であり、pMSLステージからWSLステージで、そのコンセンサス配列において、ヌクレオチド位置1408、2411、3701および6496での突然変異を維持している。
非特許文献
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特許文献
- WO2009/109550
- WO2014/016360
Claims (21)
- ベロ細胞での成長に適合していない親黄熱ウイルス17D亜株に由来する、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株であって、前記親黄熱ウイルス17D亜株ほどには神経毒性でなく、前記親黄熱ウイルス17D亜株が配列番号2のRNA配列を含む、前記弱毒生黄熱ウイルス株。
- 前記弱毒生黄熱ウイルス株は、マウス50%致死量(MLD50)試験において、親黄熱ウイルス17D亜株ほどには神経毒性でない、請求項1に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
- i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の480位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および任意にii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質2A(NS2a)の65位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異を含む核酸を含む、弱毒生黄熱ウイルス株。
- 核酸は、AAAからAAGへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質4A(NS4a)の19位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む、請求項3に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
- 核酸は、GUAからGUUへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の145位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む、請求項3または4に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
- バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる480位での突然変異を含むエンベロープタンパク質を含む、弱毒生黄熱ウイルス株。
- 配列番号15の480位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質を含む、弱毒生黄熱ウイルス株。
- 前記エンベロープタンパク質は、配列番号15の配列に少なくとも90%、95%、98%、または100%同一な配列を含む、請求項7に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
- (i)バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる480位での突然変異を含むエンベロープタンパク質、および
(ii)メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる65位での突然変異を含むNS2aタンパク質
をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株。 - 核酸は、AAAからAAGへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質4A(NS4a)の19位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む、請求項9に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
- 核酸は、GUAからGUUへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質(E)の145位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む、請求項9または10に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
- (i)配列番号15の480位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質;および
(ii)配列番号16の65位に対応するタンパク質内の位置でバリン残基を含むNS2aタンパク質
をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株。 - 前記エンベロープタンパク質は、配列番号15の配列に少なくとも90%、95%、98%、または100%同一な配列を含み、かつ前記NS2aタンパク質は、配列番号16の配列に少なくとも90%、95%、98%、または100%同一な配列を含む、請求項12に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
- 核酸は、配列番号17の57位に対応する、非構造タンパク質4A(NS4a)をコードする核酸内の位置にあるGヌクレオチドをさらに含む、請求項12または13に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
- 核酸は、配列番号18の435位に対応する、エンベロープタンパク質(E)をコードする核酸内の位置にあるUヌクレオチドをさらに含む、請求項12~14のいずれか1項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
- 請求項1~15のいずれか1項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株および薬学的に許容可能な媒体を含む、免疫原性組成物。
- - a)ベロ細胞での成長に適合していない、かつ場合により卵での成長に適合している、親弱毒生黄熱ウイルス株のウイルスゲノムRNAを精製する工程;
- b)工程a)で精製されたウイルスゲノムRNAをベロ細胞にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされたベロ細胞を得る工程;
- c)工程b)で得られたトランスフェクトされたベロ細胞を培養培地において成長させ、これによって、第1の黄熱ウイルス集団を得、さらに回収する工程;
- d)工程c)の最後で得られた回収された第1の黄熱ウイルス集団を、新鮮なベロ細胞で2回またはそれ以上増幅し、これによって、第2の黄熱ウイルス集団を得る工程;
- e)工程d)で得られた第2の黄熱ウイルス集団を、ベロ細胞での2回またはそれ以上の連続的なプラーク精製によってクローニングし、これによって、複数の黄熱ウイルスクローンを得る工程;
- f)工程e)の最後で得られた回収された黄熱ウイルスクローンのそれぞれを、新鮮なベロ細胞で2回またはそれ以上別個に増幅し、これによって、複数の黄熱ウイルス株を
得る工程;および
- g)マウス50%致死量(MLD50)試験において、工程f)で回収された前記複数の黄熱ウイルス株から、親弱毒生黄熱ウイルス株ほどには神経毒性でない1つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択する工程
を含む、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株を得るための方法。 - 前記培養培地は無血清であり、場合により、いかなるヒトまたは動物由来の物質も含まない、請求項17に記載の方法。
- 請求項17または18に記載の方法によって得られ、配列番号2のRNA配列を含む黄熱ウイルス17D亜株ほどには神経毒性ではない、弱毒生黄熱ウイルス株。
- ワクチンの製造において使用するための、請求項1~15または請求項19のいずれか1項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
- 黄熱ウイルスによる感染の予防において使用するための、請求項1~15または請求項19のいずれか1項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株を含むワクチン。
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