CN111918669A - 适应在vero细胞上生长的减毒活黄热病病毒株及包含它的疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及适应在Vero细胞上生长的减毒活黄热病病毒株，该病毒株来自不适应在Vero细胞上生长的亲代黄热病病毒17D亚株，其中该减毒活黄热病病毒株的神经毒力小于该亲代黄热病病毒17D亚株。

Description

适应在VERO细胞上生长的减毒活黄热病病毒株及包含它的疫 苗组合物

发明领域

本发明涉及减毒活黄热病病毒(YFV)病毒株及其用于制备疫苗组合物对抗YFV感染的用途。

具体地，减毒活YFV株适应在Vero细胞上生长，且已由不适应在Vero细胞上生长但适应在含胚卵(embryonated eggs)上生长的亲代减毒活YFV株获得。减毒活YFV株通过与亲代减毒活YFV株相比降低的神经毒力进一步表征。

发明背景

黄热病是一种病毒介导的致命疾病，其在非洲，中美洲和南美洲的热带地区中传播超过50个国家。

黄热病是一种急性病毒性出血性疾病，一些患者受到黄疸的影响，这解释了使用术语“黄”的理由。黄热病的特征症状可包括发烧、头痛、黄疸、肌肉疼痛、恶心，呕吐和疲劳。此外，一小部分感染病毒的患者发生严重的症状，而他们中的大约一半在7至10天内死亡。

黄热病病毒(YFV)属于黄病毒科(Flaviviruses)，其中登革热病毒(DV)、日本脑炎病毒(JEV)、蜱传染脑炎病毒(TBEV)、西尼罗河病毒(WNV)和寨卡病毒(ZV)为其他成员。YFV由围绕核衣壳(由衣壳蛋白组成)的脂蛋白包膜和单链正义RNA(single-stranded,positive-sense RNA)组成，RNA长度为10862个核苷酸。在5'非翻译区(5'UTR)和3'非翻译区(3'UTR)之间，RNA从5'端至3'端编码三个结构蛋白(即衣壳蛋白(C蛋白)、前膜/膜蛋白(prM/M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白))以及八个非结构(NS)蛋白，即NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、P2k肽，NS4B和NS5蛋白。

野生型YFV在非洲主要以斑蚊属(Aedes spp.)蚊子作为载体，而在南美洲则以趋血蚊属(Haemogogus spp.)和煞蚊属(Sabethes spp.)作为载体，且因地理区域而异有非人灵长类宿主。YFV传播主要根据两种流行病学模式实现：(1)城市模式和(2)森林模式(也称为丛林或树林周期)。尽管有两种传播模式，但仅鉴定出一种涉及相同病毒的临床相关疾病。在美洲大陆，现今YFV通过一种流行的森林模式传播，这种模式导致每年多至数百则非免疫林业工人感染的报导。并行地，病毒通过城市模式和森林模式在非洲传播，并定期打破其流行模式，在重大流行病期间感染大量非免疫人员。

目前，黄热病没有抗病毒剂，疫苗接种对预防疾病来说至关重要。在这方面，早在1930年代，就开发出两种减毒活YFV疫苗。

第一者对应于法国亲神经性疫苗(FNV)，其由野生型法国亲内脏性病毒(FVV，在1928年从塞内加尔的

Mayali分离)制备，并在小鼠脑中传代。然而，很快地证明了FNV的神经毒力过高，儿童中接种后脑炎的发病率加剧，并在1980年代早期被放弃(Barrett,2017)。

第二种方法对应于「17D」株，其是从野生型株Asibi(分离自温和的人类病例-“Asibi先生”-1927年在加纳)制备，并在小鼠和鸡组织中传代。疫苗株17D已丧失亲内脏性和神经毒力(Monath,2005)。

目前，六个国家正在从有17D株(即，巴西(17DD亚株)、中国(17D-204亚株)、法国(17D-204亚株

)、俄罗斯(17D-213亚株)、塞内加尔(17D-204亚株)和美国(17D-204亚株

)衍生的亚株生产减毒活YFV疫苗组合物(Barrett,2017)。

迄今为止，所有目前已商业化的疫苗都是在含胚鸡蛋中生产的，这种生产过程过去曾因稳固性问题而变得复杂(Barrett,2017)。特别是，由于制造问题，常常会有YFV疫苗短缺。实际上，在安哥拉和刚果民主共和国的2016流行病期间，可用疫苗批次的短缺首次导致需要分次剂量以适应紧急情况(Barrett；2017)。此外，对于对卵过敏的人来说，在含胚鸡蛋上产生的YFV疫苗是禁忌的。

基于含胚卵的疫苗生产的替代方案是使用合适的细胞系来传代病毒，例如哺乳动物细胞系。在哺乳动物细胞系中，Vero细胞系是研究最多的细胞系之一，同时在病毒产量的质量和数量方面提供稳定性和充分证明的表现。Vero细胞已收到FDA批准，并在世界各地使用。例如，Vero细胞已被用于制备针对日本脑炎的疫苗(以商标

商业化)、针对流感病毒、针对脊髓灰质炎病毒和针对狂犬病的疫苗。

过去和现在已经出现了利用Vero细胞来制备YFV疫苗的策略，而值得一提的是，这些策略仅仅是面向在不活化病毒的基础上制备YFV疫苗的可行性(Hayes,2010；Beasley等,2013；Pereira等,2015)。尽管如此，虽然黄热病不活化疫苗可在理论上看起来更安全，但它不可能完全匹配有单剂量现有减毒活黄热病疫苗提供的长期保护(Hayes,2010)。此外，在近来黄热病疫情的背景下，减毒活疫苗看起来更适合在流行地区提供针对黄热病的长期保护性免疫力的高群体覆盖率。

减毒活病毒用于疫苗的具体限制是维持其减毒作用，即，黄热病病毒至少与目前上市的减毒活黄热病疫苗一样在神经毒力和亲内脏性方面为减弱的；同时具有足以保护患者免于相应疾病的免疫原性。在这方面，针对给定的黄热病株，实现两个特征(即减毒和免疫原性)并不容易，例如在Monath,2005中可以看出。

因此，由于与基于含胚鸡蛋生产减毒活YFV疫苗相关的多种缺点，仍然需要用于提供减毒活YFV疫苗的替代生产方法。

发明内容

在一个方面中，本发明涉及一种适应在Vero细胞上生长的减毒活黄热病病毒株，其来自不适应在Vero细胞上生长的亲代黄热病病毒17D亚株，其中所述减毒活黄热病病毒株的神经毒力小于亲代黄热病病毒17D亚株。

在另一个方面中，本发明进一步涉及一种减毒活黄热病病毒株，其包含含有下列的核酸：

在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸由缬氨酸变成亮氨酸，或

在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸由甲硫氨酸变成缬氨酸。

本发明的另一个方面涉及减毒活黄热病病毒株，其包含含有在位置480处的突变的包膜蛋白，所述突变造成氨基酸由缬氨酸变成亮氨酸。

本发明的另一个方面涉及减毒活黄热病病毒株，其包含含有亮氨酸残基的包膜蛋白，所述亮氨酸残基在所述蛋白质内对应于SEQ ID NO.15的位置480的位置处。

在另一个方面中，本发明进一步涉及一种减毒活黄热病病毒株，其包含编码下列的核酸分子：

(i)包膜蛋白，其包含在位置480处的突变，所述突变造成氨基酸由缬氨酸变成亮氨酸，和

(ii)NS2a蛋白，其包含在位置65处的突变，所述突变造成氨基酸由甲硫氨酸变成缬氨酸。

本发明的另一个方面涉及减毒活黄热病病毒株，其包含编码下列的核酸分子：

(i)含有亮氨酸残基的包膜蛋白，所述亮氨酸残基在所述蛋白质内对应于SEQ IDNO.15的位置480的位置处，和

(ii)包含缬氨酸残基的NS2a蛋白，所述缬氨酸残基在所述蛋白质内对应于SEQ IDNO.16的位置65的位置处。

本发明的另一个方面亦涉及一种免疫原性组合物，其包含根据本发明的减毒活黄热病病毒株以及药学上可接受的运载体。

在又一其他方面中，本发明进一步涉及一种用于获得适应在Vero细胞上生长的减毒活黄热病病毒株的方法，包括下列步骤：

-a)纯化亲代减毒活黄热病病毒株的病毒基因组RNA，所述亲代减毒活黄热病病毒株不适应在Vero细胞上生长，且任选地适应在卵上生长；

-b)用在步骤a)中纯化的病毒基因组RNA转染Vero细胞，从而获得经转染Vero细胞；

-c)使在步骤b)中获得的经转染Vero细胞在培养基中生长，从而获得并进一步回收第一黄热病病毒群；

-d)在新鲜Vero细胞上将在步骤c)结束时获得的回收的第一黄热病病毒群扩增2次或更多次，从而获得第二黄热病病毒群；

-e)在Vero细胞上通过两个或更多个连续菌斑纯化，对在步骤d)中获得的第二黄热病病毒群进行克隆，从而获得多个黄热病病毒克隆；

-f)在新鲜Vero细胞上将在步骤e)结束时获得的每一个回收的黄热病病毒克隆分别扩增2次或更多次，从而获得多个黄热病病毒株；和

-g)从在步骤f)中回收的该多个黄热病病毒株选择一个或多个减毒活黄热病病毒株，其在小鼠致死剂量50(MLD₅₀)测试中的神经毒力小于所述亲代减毒活黄热病病毒株。

本发明的另一个方面涉及一种可根据本发明方法所获得的减毒活黄热病病毒株。

在另一个方面中，本发明涉及一种根据本发明的减毒活黄热病病毒株，其用于制备疫苗。

本发明的又一个方面涉及一种包含根据本发明的减毒活黄热病病毒株的疫苗，其用于预防黄热病病毒的感染。

附图简述

图1：说明制备适应在Vero细胞上生长的减毒活黄热病病毒株(vYF)的图，其在前主要种批(pMSL)阶段。

图2：说明在A129小鼠模型上的亲内脏性测定法的图。

图3：说明从在D0用PBS(白色条)；

参考物(黑色条)或用衍生自

谱系的vYF pMSL候选物(TV2212、TV2232和TV2241；深灰色条)或衍生自

谱系的vYF pMSL候选物(TV3111、TV3112和TV4221；浅灰色条)免疫的A129小鼠，于D4和D6收集的血清中通过YF-NS5 qRT-PCR测量的病毒血症的图。

图4：说明从在D0用PBS(白色条)；

参考物(黑色条)或用衍生自

谱系的vYF pMSL候选物(TV2212、TV2232和TV2241；深灰色条)或衍生自

谱系的vYF pMSL候选物(TV3111、TV3112和TV4221；浅灰色条)免疫的A129小鼠，于D6和D11收集的肝脏样品中通过YF-NS5 qRT-PCR测量的病毒载量的图。

图5：说明从在D0用PBS(白色条)；

参考物(黑色条)或用衍生自

谱系的vYF pMSL候选物(TV2212、TV2232和TV2241；深灰色条)或衍生自

谱系的vYF pMSL候选物(TV3111、TV3112和TV4221；浅灰色条)免疫的A129小鼠，于D6和D11收集的脑样品中通过YF-NS5 qRT-PCR测量的病毒载量的图。

图6：说明从在D0用PBS(白色条)；

参考物(黑色条)或用衍生自

谱系的vYF pMSL候选物(TV2212、TV2232和TV2241；深灰色条)或衍生自

谱系的vYF pMSL候选物(TV3111、TV3112和TV4221；浅灰色条)免疫的A129小鼠，于D6和D11收集的脾脏样品中通过YF-NS5 qRT-PCR测量的病毒载量的图。

图7：说明用

vYF株TV221、TV2241、TV3111、TV3112、TV4221(虚线)或TV2232(实线)单次免疫A129小鼠后的Kaplan-Meier存活率曲线的图。

图8：说明依据仓鼠模型的免疫原性分析的图。

图9：说明在D26从在D0用2.5或5.5log₁₀ CCID₅₀/剂量的vYF株(TV2212、TV2232、TV2241、TV3111、TV3112和TV4221)或

参考疫苗免疫的仓鼠收集的血清中，通过在Vero细胞上的血清中和分析测量的对减毒活黄热病病毒株具有特异性的中和抗体效价的图。水平线表示反应者阈值。

图10：说明在D41从在D0与D26用2.5或5.5log₁₀ CCID₅₀/剂量的vYF株(TV2212、TV2232、TV2241、TV3111、TV3112和TV4221)或

参考疫苗免疫的仓鼠收集的血清中，通过在Vero细胞上的血清中和分析测量的对减毒活黄热病病毒株具有特异性的中和抗体效价的图。水平线表示反应者阈值。

图11：说明与用现有疫苗

和

相比，用vYF株TV3112免疫接种的猴子中的中和抗体反应的图。水平线表示检测极限。

图12：说明与用现有参考疫苗

和

相比，来自用减毒活vYF株TV3112免疫接种的猴子的外周血中，来自B记忆细胞的YF特异性IgM反应的图。结果表示为IgM抗体分泌细胞在总IgM群中的百分比。

图13：说明与用现有参考疫苗

和

相比，来自用减毒活vYF株TV3112免疫接种的猴子的外周血中，来自B记忆细胞的YF特异性IgG反应的图。结果表示为IgG抗体分泌细胞在总IgG群中的百分比。

图14：说明来自用包膜蛋白刺激(ENV；左图)或用非结构蛋白3(NS3；右图)刺激后，用vYF株TV3112免疫接种的猴子的外周血中，IFN-γ(上图面)和IL-2(下图面)特异性T细胞反应的图，并与现有疫苗

和

比较。

图15：说明与用现有参考疫苗

和

比较，用减毒活vYF株TV3112免疫接种的猴子的器官中的病毒载量的图。浅灰色条和圆圈代表用

免疫接种的猴子的结果；中灰色条和方块代表用

免疫接种的猴子的结果；深灰色条和三角形代表用减毒活vYF株TV3112免疫接种的猴子的结果。水平线表示检测极限。

发明详述

本发明提供适应在Vero细胞上生长的减毒活YFV株，其已经从适应在含胚卵上生长的亲代减毒活YFV株获得。与亲代减毒活YFV株相比，已在小鼠LD50测试(MLD50)中针对神经毒力降低选择该减毒活YFV株。

如本发明所示，通过在Vero细胞上传代产生YFV允许提供稳定的、高度可再现的、高标准质量和数量的减毒活YFV株，其随后适于制备抗YF感染的疫苗。

·杂项定义

在本发明的范围中，“YFV”涉及黄热病病毒“yellow fever virus”，而术语“vYF”表示适合Vero细胞的黄热病病毒，即适应在Vero细胞上生长的黄热病病毒。

因此，在本发明的范围中，“适合Vero细胞的黄热病病毒”(vYV)和“适应在Vero细胞上生长的黄热病病毒”意欲是可互换的表述。

在本发明的范围中，适合在Vero细胞上生长的病毒是已经在Vero细胞上经历至少3次连续传代的病毒。在一些实施方案中，病毒在Vero细胞上经历了约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次连续传代。

依据“传代”，可以理解病毒在Vero细胞中经历至少一个复制循环的任何步骤，特别是病毒在Vero细胞中的转染、扩增或克隆的任何步骤。

如本文所用，表述“减毒活黄热病病毒”具有本领域的技术人员熟知的常见含义。在一些实施方案中，这个表述是指具有神经毒力减弱和/或亲内脏性减弱的活黄热病病毒。

在本发明的范围内，术语“神经毒力”意欲指病毒穿过血脑屏障的能力(神经侵袭性)、在脑组织中复制的能力(亲神经性)，以及引起发炎、神经元损伤和脑炎的能力(严格来说为神经毒力)。

在本发明的范围内，术语“亲内脏性(viscerotropism)”指病毒在神经外组织中复制、引起病毒血症和损害重要器官(包括肝脏)的能力(Monath,2005)。

在一些实施方案中，所述减毒活黄热病病毒至少如现有商业化减毒活黄热病疫苗株(例如

或

)一样减弱。

在一些实施方案中，所述减毒活黄热病病毒具有至少如现有商业化减毒活黄热病疫苗株(例如

或

)之一一样减弱的神经毒力。

在一些实施方案中，所述减毒活黄热病病毒具有至少如现有商业化减毒活黄热病疫苗株(例如

或

)之一一样减弱的亲内脏性。

在一些实施方案中，所述减毒活黄热病病毒具有至少如现有商业化减毒活黄热病疫苗株(例如

或

)之一一样减弱的神经毒力和亲内脏性。

术语“包含(comprising/comprises/comprise/comprised)”分别涵盖“包括(including/includes/include/included)”以及“组成(consisting/consists/consist/consisted)”，例如“含有”组份X的组合物可仅由组份X组成，或可包括一个或多个额外组份，例如组份X与组份Y。

如本文所用，“CCID₅₀”指细胞培养物感染剂量50％，即，在50％的接种的复制细胞培养物中，足以导致细胞病变作用的病毒的量，如在单层细胞培养物中的终点稀释分析中所测定的。

遵循世界卫生组织(WHO)的标准定义，本发明引用下列定义(WHO技术报导系列，第872号，1998)。

“主要种批”(“MSL”)或“首要种批”，如本文所用，指病毒悬浮物的数量，其已在单次生产操作中被加工且具有均匀的组成。

“工作种批”(“WSL”)或“次要种批”，如本文所用，指病毒悬浮物的数量，其已在单次生产操作中被加工且组成上是均匀的、经充分表征且是来自MSL的仅一次传代。在本发明的范围内，取自WSL的材料在疫苗的制备中用于接种含胚卵，或合适的细胞系。

“菌斑形成单位”(PFU)如本文所用，指在单层细胞培养物中会产生菌斑的最少量病毒悬浮物。

“中位小鼠致死剂量”(小鼠LD₅₀或MLD₅₀)如本文所用，指会杀死注射它的小鼠的50％的病毒悬浮物的数量。

·适应在Vero细胞上生长的减毒活YFV(又称为适合Vero细胞的YF病毒“vYF病 毒”)

在一个方面中，本发明涉及一种适应在Vero细胞上生长的减毒活YFV株，其来自不适应在Vero细胞上生长的亲代黄热病病毒17D亚株。在不同实施方案中，所述减毒活黄热病病毒株的神经毒力小于所述亲代黄热病病毒17D亚株。

在一些实施方案中，亲代黄热病病毒株是适应在卵上生长的减毒活黄热病病毒株。

在一些实施方案中，卵为含胚鸡蛋。

“17D亚株”是在其祖先中具有17D株的黄热病株。

“17D株”具有本领域的技术人员所熟知的常见含意。在一些实施方案中，“17D株”意指从在1927年于加纳的温和人类病例“Asibi先生”分离的、并且如Monath(2005)中所述在碎小鼠胚胎组织中传代18次然后在碎鸡胚胎组织中传代58次的黄热病株。

在一些实施方案中，17D亚株涵盖如Monath(2005)中所述的17D-204亚株、17DD亚株，和/或17D-213亚株。在一个例示性实施方案中，YFV 17D-204株的RNA序列(Genbank登录号X03700)，如由Rice等在1985先前公开的，可由RNA序列SEQ ID NO.1表示。

在一些实施方案中，亲代黄热病病毒株为黄热病病毒17D-204亚株。

在一些实施方案中，亲代YFV病毒株为YFV 17D-204衍生的

株，其为用于商业化疫苗

中的参考YFV株。

在一个例示性实施方案中，YFV 17D-204衍生的

株的RNA序列可由RNA序列SEQ ID NO.2表示。

在一些实施方案中，亲代YFV病毒株为YFV 17D-204衍生的

株，其为用于商业化疫苗

中的参考YFV株。

在一个例示性实施方案中，YFV 17D-204衍生的

株的RNA序列可由RNA序列SEQ ID NO.3表示。

在一个例示性实施方案中，亲代黄热病病毒17D亚株包含SEQ ID NO.2的RNA序列。

在一个例示性实施方案中，亲代黄热病病毒17D亚株包含SEQ ID NO.3的RNA序列。

在一个例示性实施方案中，YFV 17D-213株的RNA序列(Genbank登录号U17067)，如Santos等在1995先前公开的，可由RNA序列SEQ ID NO.4表示，而YFV 17DD株的RNA序列(Genbank登录号U17066)，亦如由Dos Santos等在1995先前公开的，可由RNA序列SEQ IDNO.5表示。

在一个例示性实施方案中，Asibi株的RNA序列(Genbank登录号KF769016)可由RNA序列SEQ ID NO.6表示。

在一些实施方案中，减毒活黄热病病毒株在小鼠致死剂量50(MLD₅₀)测试中的神经毒力小于亲代黄热病病毒17D-亚株。

在一些实施方案中，依据WHO技术报导系列第872号1998的第68页(通过体述并入)中所公开的规程进行合适的小鼠致死剂量50(MLD₅₀)测试。

在本发明的范围内，MLD₅₀是估计在经脑内接种小鼠的50％中产生致命的、特异性脑炎的病毒悬浮物数量。

在一些实施方案中，经重构的疫苗的适当连续稀释是在磷酸盐缓冲液、0.75％血清白蛋白中进行的。

在一个例示性实施方案中，在麻醉下以即用疫苗稀释液脑内注射4-6周龄的小鼠。每个稀释度使用至少6只小鼠的组，且连续稀释应在接种后导致范围在0-100％的死亡率。在21天的时间段内纪录死亡发生。因不相关原因死亡的小鼠被从死亡率计算的分子以及分母移除。在第二十一天瘫痪的小鼠计为存活。

在某些实施方案中，在小鼠致死剂量50(MLD₅₀)测试中的神经毒力可通过参数log₁₀MLD₅₀/mL来测量。

在一些实施方案中，根据本发明的减毒活YFV株在小鼠致死剂量50(MLD₅₀)测试中达到低于或等于4、低于或等于3.5、低于或等于3，或低于或等于2.5的log₁₀MLD₅₀/mL。

在一个实施方案中，根据本发明的减毒活黄热病病毒株适应在Vero细胞上生长、神经毒力小于其亲代黄热病病毒17D亚株且亲内脏性至少与其亲代黄热病病毒17D亚株一样减弱。

在一个实施方案中，根据本发明的减毒活黄热病病毒株适应在Vero细胞上生长、神经毒力小于其亲代黄热病病毒17D亚株、亲内脏性至少与其亲代黄热病病毒17D亚株一样减弱，且免疫原性至少与其亲代黄热病病毒17D亚株一样。

在多个实施方案中，本发明提供减毒活YFV株，其包含RNA序列SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，或SEQ ID NO.5，其中一个或多个核苷酸被突变。

在本发明的范围内，表述“一个或多个核苷酸”意欲涵盖2、3、4、5或更多个核苷酸。

换言之，表述“一个或多个核苷酸”意欲涵盖1个核苷酸、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14与15或更多个核苷酸。

在一些实施方案中，突变为核苷酸取代。

在一些其他实施方案中，突变不涵盖核苷酸插入以及核苷酸缺失。

在一些实施方案中，核苷酸取代为沉默的。或者，核苷酸取代可促使氨基酸取代。

在一个实施方案中，RNA序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.5中的两个核苷酸被突变。

在另一个实施方案中，RNA序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.5中的三个核苷酸被突变。

在又一个实施方案中，RNA序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.5中的四个核苷酸被突变。

在又一个实施方案中，RNA序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.5中的五个核苷酸被突变。

本发明的另一个方面涉及减毒活黄热病病毒株，其包含选自SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的RNA序列，其中至少在位置2411、位置3701或位置6496处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的RNA序列，其中至少在位置2411处的核苷酸以及在位置3701处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的RNA序列，其中至少在位置2411处的核苷酸以及在位置6496处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的RNA序列，其中至少在位置3701处的核苷酸以及在位置6496处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的RNA序列，其中至少在位置2411处的核苷酸、在位置3701处的核苷酸以及在位置6496处的核苷酸被突变。

在某些实施方案中，在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置2411处的核苷酸G(鸟苷)被核苷酸U(尿苷)所替代。

在某些实施方案中，在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置3701处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)所替代。

在某些实施方案中，在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置6496处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)所替代。

在一些实施方案中，减毒活YFV株的特征如下：

-(i)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置2411处的核苷酸G(鸟苷)被核苷酸U(尿苷)所替代，以及

-(ii)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置3701处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)所替代。

在一些其他实施方案中，减毒活YFV株的特征如下：

-(i)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置2411处的核苷酸G(鸟苷)被核苷酸U(尿苷)所替代，和

-(ii)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置6496处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)所替代。

在一些其他实施方案中，减毒活YFV株的特征如下：

-(i)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置3701处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)所替代，和

-(ii)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置6496处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)所替代。

在某些实施方案中，减毒活YFV株的特征如下：

-(i)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置2411处的核苷酸G(鸟苷)被核苷酸U(尿苷)所替代，

-(ii)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置3701处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)所替代；和

-(iii)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置6496处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)所替代。

在一些实施方案中，减毒活YFV株进一步包含位于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置1408处的突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含在含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的组中选择的RNA序列，其中至少在位置1408处的核苷酸和在位置2411处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含在含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组中选择的RNA序列，其中至少在位置1408处的核苷酸和在位置3701处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含在含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组中选择的RNA序列，其中至少在位置1408处的核苷酸和在位置6496处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含在含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组中选择的RNA序列，其中至少在位置1408处的核苷酸、在位置2411处的核苷酸和在位置3701处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含在含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组中选择的RNA序列，其中至少在位置1408处的核苷酸、在位置2411处的核苷酸和在位置6496处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含在含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组中选择的RNA序列，其中至少在位置1408处的核苷酸、在位置3701处的核苷酸和在位置6496处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，减毒活YFV株包含在含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组中选择的RNA序列，其中至少在位置1408处的核苷酸、在位置2411处的核苷酸、在位置3701处的核苷酸和在位置6496处的核苷酸被突变。

在一些实施方案中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQID NO.5的位置1408处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸U(尿苷)所替代。

在某些实施方案中，减毒活YFV株的特征如下：

-(i)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置2411处的核苷酸G(鸟苷)被核苷酸U(尿苷)所替代，

-(ii)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置3701处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)所替代；

-(iii)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置6496处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)所替代；和

-(iv)在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的位置1408处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸U(尿苷)所替代。

在一些实施方案中，根据本发明的减毒活YFV株包含选自SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5的RNA序列，其中在位置2411、3701、6496以及任选地1408处的至少一个或多个核苷酸被突变，条件是没有核苷酸是以导致回复成Asibi基因型(其可由RNA序列SEQ ID NO.6表示)的方式被突变。换言之，如果SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5中的核苷酸不同于Asibi基因组中(SEQ ID NO.6中)相同位置处的核苷酸，则根据本发明的减毒活YFV株的RNA序列中的此核苷酸不以变为Asibi基因组中(SEQ ID NO.6中)相同位置处的核苷酸的方式被突变。来自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的不同于Asibi基因组中(SEQ ID NO.6中)相同位置处的核苷酸的核苷酸可通过在SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5与Asibi序列(SEQ ID NO.6)之间的序列比对来容易地鉴定(Needleman和Wunsch,(1970))。

在一些实施方案中，根据本发明的减毒活YFV株包含含有SEQ ID NO.2的RNA序列，其中在位置2411、3701、6496以及任选地1408处的至少一个或多个核苷酸被突变，条件是在SEQ ID NO.2中的下列位置处的核苷酸不以导致回复成Asibi基因型(SEQ ID NO.6)的方式被突变：304、370、854、883、1127、1140、1431、1482、1491、1572、1750、1819、1870、1887、1946、1965、2112、2193、2219、2356、2687、3371、3613、3817、3860、3925、4007、4013、4022、4054、4056、4289、4387、4505、4507、4612、4864、4873、5153、5194、5362、5431、5473、5926、6023、6448、6876、7171、7496、7571、7580、7642、7701、7945、8008、8629、10142、10285、10312、10338、10367、10418、10550以及10800。

表1：SEQ ID NO.2与Asibi基因组RNA序列(SEQ ID NO.6)之间的核苷酸差异

在一些实施方案中，根据本发明的减毒活YFV株包含RNA序列SEQ ID NO.7。有利地，根据本发明的减毒活YFV株包含与SEQ ID NO.7相差有限数目的突变(例如不多于5个、不多于4个、不多于3个或不多于2个突变)的RNA序列。有利地，根据本发明的减毒活YFV株包含与SEQ ID NO.7相差有限数目的突变(例如不多于5个、不多于4个、不多于3个或不多于2个突变)的RNA序列，条件是没有核苷酸以导致回复成Asibi基因型的方式被突变。在一个例示性实施方案中，根据本发明的减毒活YFV株的基因组RNA序列可由核苷酸序列SEQ IDNO.7组成。

在一些实施方案中，根据本发明的减毒活YFV株包含RNA序列SEQ ID NO.8。有利地，根据本发明的减毒活YFV株包含与SEQ ID NO.8相差有限数目的突变(例如不多于5个、不多于4个、不多于3个或不多于2个突变)的RNA序列。有利地，根据本发明的减毒活YFV株包含与SEQ ID NO.8相差有限数目的突变(例如不多于5个、不多于4个、不多于3个或不多于2个突变)的RNA序列，条件是没有核苷酸以导致回复成Asibi基因型的方式被突变。在一个例示性实施方案中，根据本发明的减毒活YFV株的基因组RNA序列可由核苷酸序列SEQ IDNO.8组成。

如上所述，YFV核酸编码11个蛋白质，如下：

-衣壳蛋白(C蛋白)，其前体的长度为121aa，而成熟蛋白质的长度为101aa，

-长度为164aa的前膜蛋白(prM蛋白)，其是长度为75aa的膜蛋白(M蛋白)的前体，

-包膜蛋白(E蛋白)，其长度为493aa，

-非结构蛋白1(NS1)，其长度为352aa，

-非结构蛋白2a(NS2a)，其长度为224aa，

-非结构蛋白2b(NS2b)，其长度为130aa，

-非结构蛋白3(NS3)，其长度为623aa，

-非结构蛋白4a(NS4a)，其长度为126aa，

-非结构肽P2k，其长度为23aa，

-非结构蛋白4b(NS4b)，且其长度为250aa，

-非结构蛋白5(NS5)，其长度为905aa。

在一些实施方案中，减毒活黄热病病毒株包含含有下列突变的核酸：在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变、在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变、在非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变，和/或包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中的突变。

在一些实施方案中，减毒活黄热病病毒株包含含有下列突变的核酸：在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变以及在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变。

在一些实施方案中，减毒活黄热病病毒株包含含有下列突变的核酸：在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变、在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变以及在非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变。

在一些实施方案中，减毒活黄热病病毒株包含含有下列突变的核酸：在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变、在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变、在非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变，和/或包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中的突变。

在一些实施方案中，减毒活黄热病病毒株包含含有下列的核酸：

i)在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸，或

ii)在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸。

在一些实施方案中，根据本发明的减毒活黄热病病毒株包含含有下列的核酸：

i)在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸，和

ii)在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸。

在一些实施方案中，核酸进一步包含在非结构蛋白2A(NS2a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变，其造成密码子从AAA变成AAG。

在一些实施方案中，包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变造成密码子从GUA变成UUA、UUG、CUU、CUC、CUA或CUG。在一个实施方案中，密码子从GUA变成UUA。

在一些实施方案中，非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变造成密码子从AUG变成GUG、GUU、GUC或GUA。在一个实施方案中，密码子从AUG变成GUG。

在一些实施方案中，核酸进一步包含在包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中的突变，其造成密码子从GUA变成GUU。

在一些实施方案中，根据本发明的减毒活黄热病病毒株包含含有下列的核酸：

i)在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸；

ii)在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸；和

iii)在非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变，其造成密码子从AAA变成AAG。

在一些实施方案中，根据本发明的减毒活黄热病病毒株包含含有下列的核酸：

i)在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸；

ii)在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸；

iii)在非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变，其造成密码子从AAA变成AAG；及

iv)在包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中的突变，其造成密码子从GUA变成GUU。

在一些实施方案中，减毒活黄热病病毒株包含含有在位置480处的突变的包膜蛋白。具体来说，根据本发明的减毒活黄热病病毒株包含在位置480处的突变的包膜蛋白，该突变造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸。

在一些实施方案中，减毒活黄热病病毒株包含包膜蛋白，所述包膜蛋白在所述蛋白质内对应于SEQ ID NO.15的位置480的位置处含有亮氨酸残基。具体来说，所述包膜蛋白包含与SEQ ID NO.15的序列至少90％、95％、98％或100％同一的序列。

具体来说，在本发明减毒活黄热病病毒株的核酸中，没有核苷酸是以导致回复成Asibi基因型(SEQ ID NO.6)的方式被突变。例如减毒活黄热病病毒株的核酸对于SEQ IDNO.2中的下列位置处的核苷酸不包含呈导致回复成Asibi基因型(SEQ ID NO.6)的方式的突变：304、370、854、883、1127、1140、1431、1482、1491、1572、1750、1819、1870、1887、1946、1965、2112、2193、2219、2356、2687、3371、3613、3817、3860、3925、4007、4013、4022、4054、4056、4289、4387、4505、4507、4612、4864、4873、5153、5194、5362、5431、5473、5926、6023、6448、6876、7171、7496、7571、7580、7642、7701、7945、8008、8629、10142、10285、10312、10338、10367、10418，10550以及10800。

在一些实施方案中，减毒活黄热病病毒株包含编码下列的核酸分子：

(i)在位置480处包含突变的包膜蛋白，以及

(ii)在位置65处包含突变的NS2a蛋白。

具体来说，减毒活黄热病病毒的核酸分子进一步包含在非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变和/或在包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中的突变。

在一些实施方案中，根据本发明的减毒活黄热病病毒株包含编码下列的核酸分子：

(i)在位置480处包含突变的包膜蛋白，该突变造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸，以及

(ii)在位置65处包含突变的NS2a蛋白，该突变造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸。

具体来说，核酸分子进一步包含在非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变(其造成密码子从AAA变成AAG)，和/或在包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中的突变(其造成密码子从GUA变成GUU)。

具体来说，在本发明减毒活黄热病病毒株的核酸中，没有核苷酸是以回导致复成Asibi基因型(SEQ ID NO.6)的方式被突变。例如减毒活黄热病病毒株的核酸在SEQ IDNO.2中的下列位置处不包含核苷酸以导致呈回复成Asibi基因型(SEQ ID NO.6)的方式的突变：304、370、854、883、1127、1140、1431、1482、1491、1572、1750、1819、1870、1887、1946、1965、2112、2193、2219、2356、2687、3371、3613、3817、3860、3925、4007、4013、4022、4054、4056、4289、4387、4505、4507、4612、4864、4873、5153、5194、5362、5431、5473、5926、6023、6448、6876、7171、7496、7571、7580、7642、7701、7945、8008、8629、10142、10285、10312、10338、10367、10418、10550及10800。

在一些实施方案中，根据本发明的减毒活黄热病病毒株包含编码下列的核酸分子：

(i)在对应于SEQ ID NO.15的位置480的蛋白质内的位置处包含亮氨酸残基的包膜蛋白，以及

(ii)在对应于SEQ ID NO.16的位置65的蛋白质内的位置处包含缬氨酸残基的NS2a蛋白。

具体来说，该包膜蛋白包含与SEQ ID NO.15的序列至少90％、95％、98％或100％同一的序列，而该NS2a蛋白包含与SEQ ID NO.16的序列至少90％、95％、98％或100％同一的序列。

在对应于SEQ ID NO.17的位置57的编码非结构蛋白4A(NS4a)的核酸内的位置处，本发明减毒活黄热病病毒株的核酸可进一步包含G核苷酸，和/或在对应于SEQ ID NO.18的位置435的编码包膜蛋白(E)的核酸内的位置处，本发明减毒活黄热病病毒株的核酸可进一步包含U核苷酸。具体来说，本发明减毒活黄热病病毒株可包含含有下列的核酸分子：编码非结构蛋白4A(NS4a)的核酸(其含有与SEQ ID NO.17的序列至少90％、95％、98％或100％同一的序列)，和/或编码包膜蛋白(E)的核酸(其含有与SEQ ID NO.18的序列至少90％、95％、98％或100％同一的序列)。

具体来说，在本发明减毒活黄热病病毒株的核酸中，没有核苷酸是以导致回复成Asibi基因型(SEQ ID NO.6)的方式被突变。例如，减毒活黄热病病毒株的核酸在SEQ IDNO.2中的下列位置处的核苷酸不包含核苷酸以导致回复成Asibi基因型(SEQ ID NO.6)方式的突变：304、370、854、883、1127、1140、1431、1482、1491、1572、1750、1819、1870、1887、1946、1965、2112、2193、2219、2356、2687、3371、3613、3817、3860、3925、4007、4013、4022、4054、4056、4289、4387、4505、4507、4612、4864、4873、5153、5194、5362、5431、5473、5926、6023、6448、6876、7171、7496、7571、7580、7642、7701、7945、8008、8629、10142、10285、10312、10338、10367、10418，10550及10800。

在一些实施方案中，核酸包含17D亚株的RNA序列，其包含如上文所述根据本发明的突变。

在一些实施方案中，核酸包含17D-204亚株的RNA序列，其包含如上文所述根据本发明的突变。

在一些实施方案中，核酸包含RNA序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5，其包含如上文所述根据本发明的突变。

在一个例示性实施方案中，核酸包含RNA序列SEQ ID NO.2，其包含如上文所述根据本发明的突变。

如同在下面实例部分中所示，上文定义的突变允许提供适应在VERO细胞上生长的YFV株，且具有与亲代YFV株相比减弱的毒力(如减弱的神经毒力)，且其毒力与使用这些株作为疫苗或疫苗组合物中使用相容。在一个实施方案中，上文定义的突变允许提供适应在VERO细胞上生长的YFV株，且其神经毒力与亲代YFV株相比更小，且亲内脏性与亲代YFV株相比至少是减弱的。在一个实施方案中，如上定义的突变允许提供适应在VERO细胞上生长的YFV株，且其神经毒力与亲代YFV株相比更小、其亲内脏性与亲代YFV株相比至少是减弱的，且其免疫原性与亲代YFV株相比至少相同。

免疫原性、疫苗和药物组合物

在另一个方面中，本发明还涉及一种免疫原性组合物，其包含根据本发明的减毒活YFV株。

在本发明的范围内，术语“免疫原性”指组合物促使抗体介导的和/或细胞介导的免疫性和/或免疫学记忆的能力。

在一些实施方案中，可采用免疫原性组合物以产生对抗黄热病病毒的中和抗体。

在另一个方面中，本发明进一步涉及一种免疫原性组合物，其包含根据本发明的减毒活黄热病病毒株以及药学上可接受的运载体。

在一些实施方案中，本发明还涉及包含根据本发明的减毒活黄热病病毒株的疫苗组合物，和/或包含根据本发明的免疫原性组合物的疫苗组合物。

在一些实施方案中，疫苗组合物可不包含任何佐剂。

在本发明的范围内，“佐剂”指意欲提高疫苗的相关免疫反应以及后续临床效力的任何物质。

或者，疫苗组合物可进一步包含一或多种佐剂。

在一些实施方案中，佐剂可包括矿物盐、乳液、微生物天然或合成衍生物、组合佐剂、细胞因子衍生的或辅助分子衍生的佐剂、颗粒配制物，等等。佐剂的制备和使用是本领域已知的。

在一些实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含如本文所述的减毒活YFV株和药学上可接受的载剂。

在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含如本文所述的减毒活YFV株和药学上可接受的载剂。

在本发明的上下文中，表述“药学上可接受的运载体”指对于施用于人类是生理学上可接受的、同时保持根据本发明的免疫原性组合物的生理学活性(即，其引起免疫反应的能力)的运载体。一个例示性药学上可接受的运载体为生理食盐水缓冲液。其他生理学上可接受的运载体是本领域技术人员已知的，且描述于例如Remington’s PharmaceuticalSciences(第18版),A.Gennaro编,1990,Mack Publishing Company,Easton,Pa.中。如本文所述的免疫原性组合物可根据需要任选地含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂，等等。此外，疫苗组合物可任选地包含药学上可接受的添加剂，包括，例如，稀释剂、粘合剂、稳定剂与防腐剂。

在不同实施方案中，免疫原性组合物的pH为5.5-8，如6.5-7.5(例如约7)。可通过使用缓冲剂来维持稳定的pH。因此，在一些实施方案中，免疫原性组合物包括缓冲剂。免疫原性组合物可对人类为等张的。免疫原性组合物也可包含一种或数种额外盐类，如NaCl。药学上可接受的载剂的制备和使用是本领域已知的。

在实践中，包含根据本发明的减毒活YFV株的免疫原性组合物和/或疫苗组合物和/或药物组合物可使用本领域中的常规和良好实践来制备。

在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物、疫苗组合物和/或药物组合物可包含一种或多种合适的稀释剂和/或赋形剂。

在不同实施方案中，药物组合物、免疫原性组合物以及疫苗组合物可通过常规灭菌技术而灭菌，或可经无菌过滤。所得水性溶液可以液体形式或经冻干来包装和储存，经冻干制备物可用无菌水性载剂在施用之前被重构。在一个例示性实施方案中，药物组合物、免疫原性组合物和疫苗组合物经由如WO 2009/109550中所述的制粒过程作为微丸粒包装和储存。在一个实施方案中，药物组合物、免疫原性组合物和/或疫苗组合物经冻干或喷雾冷冻干燥。

·用于获得减毒活YFV株的方法

本发明的又一个方面涉及一种用于获得适应在Vero细胞上生长的减毒活黄热病病毒株的方法，包括下列步骤：

-a)纯化亲代减毒活黄热病病毒株的病毒基因组RNA，该亲代减毒活黄热病病毒株不适应在Vero细胞上生长，且任选地适应在卵上生长；

-b)用步骤a)中纯化的病毒基因组RNA转染Vero细胞，从而获得经转染Vero细胞；

-c)在培养基中培养步骤b)中获得的经转染Vero细胞，从而获得并进一步回收第一黄热病病毒群；

-d)在新鲜Vero细胞上将在步骤c)结束时获得的经回收第一黄热病病毒群扩增2次或更多次，从而获得第二黄热病病毒群；

-e)在Vero细胞上通过两个或更多个连续菌斑纯化，对在步骤d)中获得的第二黄热病病毒群进行克隆，从而获得多个黄热病病毒克隆；

-f)在新鲜Vero细胞上将在步骤e)结束时获得的每个回收的黄热病病毒克隆分别扩增2次或更多次，从而获得多个黄热病病毒株；和

-g)从在步骤f)中回收的该多个黄热病病毒株选择一个或多个减毒活黄热病病毒株，其在小鼠致死剂量50(MLD₅₀)测试中的神经毒力小于亲代减毒活黄热病病毒株。

在一些实施方案中，上文本发明的方法的步骤d)进行2、3、4、5、6或更多次。在一些实施方案中，上文本发明的方法的步骤e)处的克隆在Vero细胞上进行2、3、4、5、6或更多次连续菌斑纯化。在一些实施方案中，上文本发明的方法的步骤f)进行2、3、4、5、6或更多次。

本发明的又一个方面涉及一种用于获得适应在Vero细胞上生长的减毒活黄热病病毒株的方法，包括下列步骤：

-a)纯化亲代减毒活黄热病病毒株的病毒基因组RNA，所述亲代减毒活黄热病病毒株不适应在Vero细胞上生长，且任选地适应在卵上生长；

-b)用在步骤a)中纯化的病毒基因组RNA转染Vero细胞，从而获得经转染Vero细胞；

-c)在培养基中培养步骤b)中获得的经转染Vero细胞，从而获得并进一步回收第一黄热病病毒群；

-d)在新鲜Vero细胞上将在步骤c)结束时获得的经回收的第一黄热病病毒群扩增2次或更多次，从而获得第二黄热病病毒群；

-e)在Vero细胞上通过两个或更多个连续菌斑纯化，对在步骤d)中获得的第二黄热病病毒群进行克隆，从而获得多个黄热病病毒克隆；

-f)在新鲜Vero细胞上将在步骤e)结束时获得的每个经回收的黄热病病毒分别扩增2次或更多次，从而获得多个黄热病病毒株；以及

-g)从在步骤f)中回收的所述多个黄热病病毒株选择一个或多个减毒活黄热病病毒株，所述一个或多个减毒活黄热病病毒株包含含有下列的核酸：

i)在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸，或

ii)在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸。此等选择用本领域中已知的测序方法来简单地进行。

在一些实施方案中，步骤g)可包含选择一个或多个减毒活黄热病病毒株，所述一个或多个减毒活黄热病病毒株包含含有下列的核酸：

i)在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸，和

ii)在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸。

在一些实施方案中，步骤g)可包含选择一个或多个如上文所述的减毒活黄热病病毒株，所述一个或多个减毒活黄热病病毒株包含进一步含有下列的核酸：非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变，其造成密码子从AAA变成AAG。

在一些实施方案中，步骤g)可包含选择一个或多个如上文所述的减毒活黄热病病毒株，所述一个或多个减毒活黄热病病毒株包含进一步含有下列的核酸：包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中的突变，其造成密码子从GUA变成GUU。

在一些实施方案中，步骤g)可包含选择一个或多个减毒活黄热病病毒株，所述一个或多个减毒活黄热病病毒株包含含有下列的核酸：

i)在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸，

ii)在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸，

iii)在非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变，其造成密码子从AAA变成AAG，和/或

iv)在包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中的突变，其造成密码子从GUA变成GUU。

在一个实施方案中，步骤a)的亲代减毒活黄热病病毒株是黄热病17D亚株，如黄热病17D-204亚株。

在实践上，Vero细胞可在细胞保藏中心如ATCC得到。适于在体外细胞培养中培养Vero细胞的方法(包括使用无血清培养基的方法)是本领域的技术人员已知的(Kolell K.等2007)。在一个实施方案中，在任何病毒培养之前，Vero细胞适于在无血清培养基上生长。

在一些实施方案中，用于培养Vero细胞的培养基是不含血清的，且任选地不含任何人类或动物衍生的物质。

在本发明的范围内，表述“人类或动物衍生的物质”指源自人类或非人动物的物质(如蛋白质、脂质、糖蛋白、脂蛋白、糖脂、单糖或多糖)，例如获得自(例如提取自)人类或非人动物的生长因子、激素。重组分子不被认为是人类或动物衍生的物质。此类不含血清的培养基和/或不含人类或动物衍生物质的培养基可容易在供应商目录(例如THERMOFISHER

目录)中得到。

在一些实施方案中，用来培养Vero细胞的培养基也不含抗生素。

在一些实施方案中，用来培养Vero细胞的培养基可包含源自细菌、酵母和/或植物的一种或多种提取物。

在一些实施方案中，不适应在Vero细胞上生长的亲代减毒活黄热病病毒株的基因组可为编码基因组RNA的cDNA的形式。

在某些实施方案中，cDNA是由适当载体(如质粒)携带。

在一些其他方面中，本发明涉及一种载体，其包含含有RNA序列SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的核酸，其中存在本文所述的(一个或多个)突变。

在一些其他方面中，本发明涉及一种载体，其包含含有对应于序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的cDNA序列的核酸，其中存在本文所述的(一个或多个)突变。

在又一个方面中，根据本发明的减毒活黄热病病毒株通过使黄热病病毒的基因组序列突变以在所述基因组序列中引入本发明中所述的突变而获得。在一些实施方案中，黄热病17D亚株的基因组序列可经突变，以在所述基因组序列中引入本发明中所述的突变。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5的RNA序列的核酸，或对应的cDNA序列可经突变，以引入在本发明中所述的突变。可通过定点诱变经由本领域技术人员已知的方法将突变引入基因组序列中，包括使用任何适当的基因编辑技术。引入本发明中所述突变的基因组序列可为编码黄热病病毒的基因组RNA的cDNA，如编码黄热病17D亚株的基因组RNA的cDNA，例如编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的cDNA。在一些实施方案中，cDNA是由适当的质粒携带。可被引入黄热病病毒的基因组序列中的本发明中所述突变选自下列位置处的核苷酸突变：基因组序列的位置2411、位置3701或位置6496；或其任何组合。在一些实施方案中，这些突变可包含基因组序列的位置2411处的核苷酸G(鸟苷)被核苷酸U(尿苷)替代、基因组序列的位置3701处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)替代；或基因组序列的位置6496处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸G(鸟苷)替代，或其任何组合。在一些实施方案中，引入位于基因组序列的位置1408处的进一步突变。在一些实施方案中，此进一步突变是基因组序列的位置1408处的核苷酸A(腺苷)被核苷酸U(尿苷)替代。在一些实施方案中，可将其他突变引入黄热病病毒的基因组序列，条件是没有核苷酸是以导致回复成Asibi基因型的方式被突变。在另一个方面中，可被引入黄热病病毒的基因组序列中的本发明所述突变选自：包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸；非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸；或非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变，其造成密码子从AAA变成AAG；或其任何组合。在一些实施方案中，在包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中引入进一步突变，其造成密码子从GUA变成GUU。在一些实施方案中，可将其他突变引入黄热病病毒的基因组序列，条件是没有核苷酸以导致回复成Asibi基因型的方式被突变。具体地，可被引入黄热病病毒的基因组序列中的本发明中所述突变为下列：包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变(其造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸)，和非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变(其造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸)。

在又一个方面中，本发明还涉及一种可通过根据本发明的方法获得的减毒活黄热病病毒株。

本文也公开了一种通过根据本发明的方法获得的减毒活黄热病病毒株。

·杂项方法和用途

本发明亦涉及一种用于免疫有需要的个体以对抗YFV感染的方法，其包括向所述个体施用根据本发明的疫苗组合物。

在本发明的范围内，表述“有需要的个体”意欲指处于被YFV感染的风险的个体。

本发明的又一个方面还涉及根据本发明的减毒活YFV株用于制备疫苗的用途。在一些实施方案中，本发明亦涉及根据本发明的减毒活YFV株作为pMSL、作为MSL或作为WSL的用途。具体地，本发明亦涉及根据本发明的减毒活YFV株作为pMSL、作为MSL或作为WSL在疫苗制备过程中的用途。

在另一个方面中，本发明涉及一种根据本发明的减毒活YFV株，其用于制备疫苗。

本发明的又再一个方面涉及一种根据本发明的疫苗组合物，其用于预防YFV感染。

在一些实施方案中，本发明涉及一种在个体内预防YFV感染的方法，其包括向该个体施用有效量的根据本发明的减毒活YFV、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗组合物。

在一些实施方案中，本发明涉及一种在个体内产生中和抗体对抗黄热病病毒的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据本发明的减毒活YFV、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗组合物。

在一些实施方案中，本发明涉及根据本发明的减毒活病毒用于制备药物的用途，所述药物用来预防YFV感染。

在一些实施方案中，本发明涉及根据本发明的减毒活病毒，其用于预防YFV感染。

在一些实施方案中，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物用于制备药物的用途，所述药物用来预防YFV感染。

在一些实施方案中，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物用于制备疫苗组合物的用途，所述疫苗组合物用来预防YFV感染。

在一些实施方案中，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物，其用于预防YFV感染。

根据本发明的疫苗组合物和免疫原性组合物可通过任何适当施用途径施用于有需要的个体。

根据本发明的免疫原性组合物或疫苗可经由任何适当途径施用，如通过粘膜施用(例如鼻内或舌下)、胃肠外施用(例如肌肉内、皮下、透皮或皮内途径)，或口服施用。如本领域的技术人员所理解的，本发明的疫苗适于配制成与预期施用途径相容。在例示性实施方案中，本发明的组合物是肌肉内或皮下施用的。

根据本发明的疫苗可在多个剂量中施用。例如，根据本发明的疫苗可在一个、两个或三个剂量中施用。在一个实施方案中，根据本发明的疫苗在单个剂量中施用。

根据本发明的疫苗可以这样的量施用，所述量可通过此领域的普通技术人员容易地确定。在一些实施方案中，疫苗剂量为4-6log₁₀CCID₅₀。

实施例

实施例1：通过在Vero细胞上适应制备减毒活YFV株(前主要种批(pMSL))

1.1/方法的选择/原则

前主要种批(pMSL)的总体策略显示于图1中。

和

疫苗均从未经克隆的YF17D-204株制备物开发，并含有如通过菌斑大小表型可视化的异源群。此外，这两种疫苗都是在卵上生产的。

为了产生适合在Vero细胞上生长的同质、界定明确的病毒株，并确保最终pMSL中的无菌且不存在外来剂：

-(1)纯化

和

病毒的病毒基因组RNA；

-(2)然后转染到Vero细胞中以回收黄热病病毒，然后将其在Vero细胞上扩增两次以使得病毒适应在此细胞底物上生长；

-(3)然后通过两个菌斑纯化循环来克隆病毒。为此目的，稀释病毒制品用于感染Vero细胞并在半固体覆层下生长以获得充分分离的病毒菌斑。对于每次转染，穿过覆层挑取2个个体菌斑，每个菌斑对应于单一个病毒群，稀释并用于第二个菌斑纯化循环，其导致生成病毒克隆；

-(4)然后扩增这些克隆以获得足够的病毒原液而构成pMSL。

用于pMSL生产的所有培养基和溶液均不含动物和人类组分。

1.2/方法

1.2.1/从

基因组cDNA的体外转录

根据供应商的推荐，用Message mMachine^TM SP6试剂盒(

参照AM1340)进行来自

(质粒pJSY2374.5，如WO 2014/016360中所揭示)的YFV的基因组cDNA的体外转录。从质粒pJSY2374.5，平行进行2次体外转录。

简言之，在室温解冻后，通过用限制酶NruI(30U/10μg)在37±2℃消化2小时将10μg质粒线性化。然后通过在65℃温育20分钟使酶失活。通过在0.5％琼脂糖凝胶上电泳验证了质粒的线性化。制备40μL反应混合物，其包含试剂盒的反应缓冲液、核糖核苷酸(ATP、CTP、UTP和GTP与7-甲基-GTP的混合物)、酶和1μg的质粒。将所得混合物在37±2℃温育2小时。

1.2.2/RNA纯化

a)来自

疫苗工作种批

平行进行两次病毒RNA纯化。

将四小瓶

疫苗的工作种批(批号FA238667，感染效价6.38log₁₀PFU/小瓶)各自悬浮于200μl的

试剂盒

的溶解缓冲液中，然后汇集。然后通过用酚/氯仿/异戊醇(125:24:1；pH 4.5)进行两系列提取来纯化RNA。

将2mL Phase Lock Gel Heavy管

以11,000x g离心30秒。将750μLRNA/裂解缓冲液混合物引入各管中。然后向每管加入等体积(750μl)的酚/氯仿/IAA溶液。在剧烈混合有机相和水相以形成均匀的瞬时悬浮液后，将管以11,000x g离心5分钟以分离各相。然后回收上层相(水相)。在新的Phase Lock Gel 2mL管上再次(renew)操作。然后用氯仿和异戊醇(24:1)的混合物再次进行操作以除去所有痕量的酚。然后根据供应商的推荐，通过用

试剂盒

在二氧化硅柱上纯化来浓缩RNA并清除任何痕量的有机溶剂。然后在无核酸酶的水中洗脱经纯化的RNA。

b)来自

基因组cDNA的体外转录

通过4U的DNase在37±2℃历时15分钟消除污染了通过体外转录获得的RNA的质粒DNA(见上文)。然后通过在70℃温育10分钟使SP6聚合酶失活。

通过体外转录获得的RNA与60μl不含RNase的水和来自

试剂盒

的350μl裂解缓冲液混合。然后通过用酚/氯仿/异戊醇(125:24:1；pH 4.5)进行两系列提取来纯化RNA。为此，将Phase Lock Gel Heavy 1.5mL管以11,000x g离心30秒。将750μL的RNA/裂解缓冲液混合物引入各管中。然后向各管中加入等体积(750μl)的酚/氯仿/异戊醇溶液。在剧烈混合有机相和水相以形成均匀的瞬时悬浮液后，将管以11,000xg离心5分钟以分离各相。然后回收上层相(水相)。在新的Phase Lock Gel 1.5mL管上再次操作。然后用氯仿和异戊醇(24:1)的混合物再次进行操作以除去所有痕量的酚。然后根据供应商的推荐，用

试剂盒

在二氧化硅柱上纯化RNA。然后用无核酸酶的水洗脱经纯化的RNA。

1.2.3/转染

对每个RNA纯化平行进行两次转染。

a)制备RNA/Lipofectamine^TM混合物

将10或15μL的Lipofectamine^TM 2000 CD(LIFE

)与1mL的OptiPro SFM培养基(LIFE

)混合，并在室温温育5分钟。然后添加约10log₁₀Geq(如Mantel等(2008)中所述，通过YF-NS5 qRT-PCR确定的基因组当量效价)的经纯化RNA。将这些混合物在室温温育10分钟。

b)Vero细胞制备

在转染之前，用每孔2mL的OptiPro SFM培养基冲洗先前在6孔板中接种的来自Sanofi Pasteur's GMP库的无血清Vero细胞(9.10⁵个细胞于每孔3mL的VP-SFM(THERMOFISHER SCIENTIFIC)中)。

c)转染反应

于6孔板中，在从细胞移除冲洗培养基后，对于每个制品将含有RNA的转染混合物沉积在两个孔(1mL/孔)中。使孔与不含RNA的OptiPro SFM/Lipofectamine^TM接触，并将最后的孔保留为在单独OptiPro SFM培养基中的细胞对照。平行制备两个板，一个为含有10μlLipofectamine^TM的混合物，而另一个为含有15μl Lipofectamine^TM的混合物。将含有Lipofectamine^TM和RNA的混合物与Vero细胞在37±2℃、5±2％CO₂接触4小时，然后向每孔添加2mL预热的VP-SFM培养基。将6孔板在37±2℃；5±2％CO₂温育16小时。然后更换培养基并将板于37±2℃、5±2％CO₂再温育。当细胞病变效应(细胞裂解)可见时且当通过YF-NS5qRT-PCR从培养物上清液确定的基因组效价(如Mantel等(2008)中所述)大于8.0log₁₀Geq/mL时，收集转染上清液。如果允许收获所需的培养时间大于这些时间，则在D5和D8进行用新鲜培养基替换培养基。将收获的上清液分成等分试样。

1.2.4/病毒的扩增

a)扩增n°1(病毒传代n°2)

病毒扩增n°1前的两天，将2.10⁵个Vero细胞接种于含有5mL VP-SFM培养基的25cm²烧瓶中。然后将由转染所得的病毒悬浮液在VP-SFM培养基中稀释以获得2的基因组倍数(m.o.g)(即每个细胞2个Geq，由通过qRT-PCR获得的RNA浓度估算)。消除先前接种的Vero细胞的培养基，并使细胞与1mL的经稀释病毒悬浮液或单独1mL VP-SFM培养基(细胞对照)接触。将烧瓶在37±2℃；5±2％CO₂温育2小时。然后除去病毒接种物并用10mL VP-SFM培养基替换，且将细胞在37±2℃；5±2％CO₂温育2天。接着用预热至37±2℃的新VP-SFM培养基更换培养基，并将烧瓶在37±2℃；5±2％CO₂再温育2至3天。在总共4至5天的温育后，回收含有病毒的培养物上清液。通过在4℃以1200rpm离心10分钟使病毒悬浮液澄清，然后以等分试样分配。使用140μl的此病毒悬浮液以用QiaAmp病毒微型试剂盒(

根据供应商的方案)提取总RNA，并通过YF-NS5 qRT-PCR定量病毒RNA(如Mantel等(2008)中所述)。

取决于病毒RNA效价，储存一个或多个等分试样以进行第二扩增步骤(如果其在同一天进行)，而其他等分试样则在10％最终山梨糖醇存在下在≤-70℃冷冻。

b)扩增n°2(病毒传代n°3)

病毒扩增n°2前的两天，将5.10⁵个Vero细胞接种在含有20mL VP-SFM培养基的75cm²烧瓶中。然后将来自第一次扩增的病毒悬浮液稀释于VP-SFM培养基中，从而以m.o.g.为2的比率(即每个细胞的Geq，由通过qRT-PCR获得的RNA浓度估算)感染Vero细胞。

进行扩增n°2的其他步骤，如对于扩增n°1(见上文部分a))所详述的。

c)病毒克隆-板纯化(病毒传代4和5)

转染和扩增后获得的每个病毒悬浮液需要两个6孔板。

将扩增n°2后获得的病毒悬浮液等分试样稀释，以获得约2.0log₁₀ PFU/mL的悬浮液和1.7log₁₀ PFU/mL的悬浮液。观察先前接种在6孔板中的Vero细胞(每孔3mL的VP-SFM中9.10⁵个细胞)以供验证细胞的完整性且没有污染，然后移除培养基。对于每次稀释，在每孔中用500μL经稀释病毒(2.0log₁₀ PFU/mL或1.7log₁₀ PFU/mL稀释液)感染板的5个孔，并且细胞对照孔仅含有500μL的VP-SFM。将板在37±2℃；5±2％CO₂温育2小时。然后移除接种物并将其替换为4mL覆层混合物，即预热至42℃并与2％琼脂糖溶液体积对体积临时混合的VP-SFM 2X的溶液。在覆层混合物固化后，将板以相反位置(盖子向下)在37±2℃；5±2％CO₂温育3至6天。每天观察板。一出现细胞病变效应，就将第二个覆层混合物(其与第一个相同，但进一步含有0.008％中性红)被添加至每个孔(2mL)，并将板在相反位置于37±2℃；5±2％CO₂温育1至2天。

用病毒颗粒(克隆)感染细胞在这些条件下仍然受限于紧邻周围细胞并引起局部裂解，在其他红色细胞单层上产生富含病毒的白斑(裂解菌斑)。关于每个经扩增的病毒稀释液，使用微量移液管和1000μL锥形体通过覆盖培养基回收两个克隆。将由此获得的病毒克隆悬浮于1mL的VP-SFM培养基中，然后剧烈混合。

将这些悬浮液中的每一者以1:2至1:200,000的级联步骤稀释，以进行第二系列的板纯化。在第二次克隆运行结束时，再次收获每个板两个克隆。获得每个谱系最多16个克隆，即来自

亲代株的16个克隆和来自

亲代株的16个克隆。

d)扩增n°3(病毒传代n°6)

对于每个克隆(至多32个)，通过再悬浮于琼脂糖中含有的病毒物质获得的病毒悬浮液在VP-SFM中稀释1/4或1/2(取决于收集的菌斑大小)。

根据与扩增n°1相同的方案(参见上文章节a))进行扩增n°3。当细胞病变效应可见且qRT-PCR中的基因组效价超过8.0log₁₀ Geq/mL时，收获经扩增的病毒。

在总共4至5天的温育后，回收含有病毒的培养物上清液并分成等分试样。根据供应商的方案，将140μL的此病毒悬浮液用于以QiaAmp病毒微型试剂盒(QIAGEN)提取总RNA，并通过YF-NS5 qRT-PCR定量RNA(如Mantel等(2008)中所述)。取决于病毒RNA效价，保留一个或多个等分试样以进行下一步扩增，而其他等分试样则在10％最终山梨糖醇存在下在≤-70℃冷冻。

e)扩增n°4(病毒传代n°7)

将由扩增n°3(参见上文部分d))得到的病毒悬浮液在VP-SFM培养基中稀释，从而感染先前以m.o.g.为2的比率接种的Vero细胞，并根据与扩增n°2(见上文部分b))相同的方案进一步处理。

当细胞病变效应可见且qRT-PCR中的基因组效价超过8.0log₁₀ Geq/mL时，收获经扩增病毒。在总共4至5天的温育后，回收上清液，通过在4℃以1200rpm离心10分钟来澄清病毒悬浮液，然后在10％最终山梨糖醇存在下在≤-70℃分成冷冻的等分试样。

将由此获得的病毒悬浮液用于进行感染滴定和病毒基因组的测序。

根据以下标准，从这些数据中选择来自每个谱系的三个株(即来自

亲代株的三个TV2212、TV2232和TV2241株，和来自

亲代株的三个TV3111、TV3112和TV4221株)：感染效价≥6log₁₀ CCID₅₀/mL和基因组序列不表现出回复成Asibi原有株序列。

使用CCID₅₀方法在Vero细胞上进行病毒悬浮感染滴定。简言之，将病毒悬浮液在96深孔板中在IMDM(THERMOFISHER SCIENTIFIC)+4％FCS中从-4.6log10开始至-8log10连续4倍稀释。每个测试中纳入对照病毒(在Vero细胞上扩增一次的

病毒，批次MLE-JPO-000089)作为阳性对照。将100微升的各个病毒稀释液加入10个孔中，所述孔含有在分析前3天接种在平底96孔板中的Vero细胞(8000个细胞/孔)。在+37℃、5％CO₂温育4天后，弃去上清液，将细胞在-20±3℃用150μL丙酮85％固定15分钟，然后在用泛-黄病毒E特异性4G2小鼠单克隆抗体(RD

批号130726-4G2)以2μg/mL(稀释度1/2,000)进行免疫染色前，用2.5％乳PBS-Tween缓冲液饱和。然后在用1/1000稀释的山羊抗小鼠IgG碱性磷酸酶缀合的抗体(

SA，参考编号1030-04，批号A7013-Z145)，接着以碱性磷酸酶底物(BCIP/NBT，SIGMA-ALDRICH，参考编号B5655，批号SLBN0689V和左旋咪唑(SIGMA-ALDRICH，参考编号L9756，批号091M1227V)温育后，揭示出用4G2抗体染色的感染灶。

计数阳性孔(即，含有至少一个染成黑色的菌斑的孔)，并使用最小二乘回归法计算最终效价。

f)扩增n°5(病毒传代n°8)-前主要候选物(pMSL)

将从选自扩增n°4(参见上文部分e))的6个株中的每一者的病毒悬浮液在VP-SFM培养基中稀释，从而以0.01的m.o.i.感染Vero细胞。

病毒扩增n°5前的两天，将12.10⁶个Vero细胞接种在含有30mL的VP-SFM培养基的175cm²烧瓶中。如先前进行的，移除培养基并用12mL的稀释的病毒悬浮液或单独VP-SFM(对照细胞)替代。将烧瓶在37±2℃；5±2％CO₂在2小时期间温育。然后移除病毒接种物并用50mL VP-SFM培养基替代。将烧瓶在37±2℃；5±2％CO₂温育2天。然后用预热至37±2℃的新鲜VP-SFM培养基更替培养基，并将烧瓶在37±2℃；5±2％CO₂再温育1至3天。当细胞病变效应可见且qRT-PCR中的基因组效价超过8.0log₁₀ Geq/mL时，收获经扩增的病毒。

在总共3至5天的温育后，回收上清液，通过在4℃以1200rpm离心10分钟澄清病毒悬浮液，然后以在10％最终山梨糖醇存在下在≤-70℃冷冻的等分试样分配。从6个选择的株中获得的经扩增的病毒构成6个候选pMSL。

实施例2：候选物在小鼠模型中的神经毒力

2.1/pMSL候选物在小鼠模型中的神经毒力

如WHO TRS 872，附件2(1998)中所述，通过测定小鼠致死剂量50％(MLD₅₀)来评估vYF(适应Vero细胞的黄热病病毒)前主要种批(pMSL)候选物的神经毒力。

对于pMSL候选物的神经毒力研究，将8只雌性OF1小鼠(接种时4周龄)的组通过脑内途径注射30μl的5-7种在0.4％NaCl 2.5％人类血清白蛋白(HSA)缓冲液中的病毒稀释液。评价四种vYF pMSL候选物TV2212、TV3111、TV3112和TV4221的神经毒力，并与

和

参考疫苗进行比较。监测小鼠21天，并在第21天记录存活小鼠的数目。用样品随机分布的方式进行三次独立实验。对于每个实验，在接种当天通过CCID₅₀反滴定检查注射的量。

每天进行临床监测以每天记录存活率。使用最小二乘回归计算诱导存活小鼠的50％的剂量作为MLD₅₀，并以log₁₀ MLD₅₀/mL表示。每个株的MLD₅₀被确定为3个测定值和95％置信区间的平衡的均值(pondered mean)，除了TV3111和TV3112没有MLD₅₀可计算以外，因为对于施用TV3111和TV3112株的组(甚至最高剂量，30μl的0.7log₁₀稀释度)记录了100％的存活小鼠。

结果呈现在下表2中。

表2：在pMSL阶段，vYF株在小鼠神经毒力测试(MLD₅₀测试)中的表征

关于由

谱系而来的vYF株TV2212，与

参考疫苗相比，它表现出类似的神经毒力。

与

参考疫苗相比，由

谱系而来的vYF株TV4221展现出类似的神经毒力。最后，与

参考疫苗相比，从

谱系而来的vYF株TV3111和TV3112均未展现出神经毒力效应。对于这2个vYF株，无法计算MLD₅₀效价(至少<2.2log₁₀MLD₅₀/mL)。

结果，2个vYF株TV2212和TV4221呈现与它们各自的亲代参考

和

相似的神经毒力概貌和MLD₅₀效价。另外两种由

谱系而来的vYF株TV3111和TV3112与它们的

亲代株相比，神经毒力明显减弱，无法评估其MLD₅₀效价。

2.2./ TV3112株MSL与WSL在小鼠模型中的神经毒力

2.2.1/TV3112株MSL和WSL

用于MSL和WSL生产的所有培养基和溶液均为不含动物和人类组分的。

在静止条件下进行Vero细胞扩增后，将细胞接种于生物反应器中。在生物反应器中细胞生长3天后，将培养基从细胞生长培养基变化为病毒生产培养基。通过在生物反应器中添加种批(TV3112 pMSL以产生TV3112 MSL，或TV3112 MSL以产生TV3112 WSL)来接种病毒。病毒扩增2天后，弃去病毒生产培养基并替换为相同体积的新鲜病毒生产培养基。病毒接种后4天，将生物反应器的内容物收获、澄清、稳定化，填充并冷冻储存。

2.2.2./TV3112株MSL与WSL的神经毒力

使用与上文实例2、子部分2.1中所述相同的程序。

表3：在MSL与WSL阶段，TV3112株在小鼠神经毒力测试(MLD₅₀测试)中的表征

YFV株	log<sub>10</sub>CCID<sub>50</sub>/mL	log<sub>10</sub>MLD<sub>50</sub>/mL
			TV3112MSL	7.0	<2.2
TV3112WSL	8.1	<2.2

对于TV3112 pMSL，TV3112 MSL和TV3112 WSL展现出无神经毒力效应。对于TV3112MSL和TV3112 WSL，无法计算MLD₅₀效价(至少<2.2log₁₀ MLD₅₀/mL)。

TV3112 MSL和TV3112 WSL与它们的

亲代株相比呈现神经毒力的明显减弱，且它们的MLD₅₀效价无法评估。

实施例3：vYF株候选物在小鼠模型中的亲内脏性以及亲神经性

在基于接种至I型IFN受体缺陷型小鼠的分析中评估了6个vYF(适应Vero细胞的黄热病病毒)前主要种批(pMSL)候选物的亲内脏性和亲神经性，所述小鼠被开发以允许区分病原性和减毒的疫苗株(Meier等,2009；Erickson和Pfeiffer,2015)。描述了用于I型IFN受体的A129免疫缺陷型小鼠KO以模拟在灵长类和人类中的野生型YF病毒感染(Meier等,2009)。因此，这样的小鼠模型看来适于研究由非减毒黄热病病毒引起的亲内脏性疾病。

3.1/方法

3.1.1/组定义

对15组(A组至O组)的6只4-8周龄雌性A129小鼠施用4个log₁₀CCID_CCID50/剂量的6种pMSL候选物的每一者或

参考疫苗，如下表4中所述(无佐剂；皮下施用途径；在D0为200μl)。

表4：组定义

3.1.2/研究时间表

研究时间表描述于图2中。

在D6对C、E、G、I、K、M、O组的6只小鼠实施安乐死并对它们的器官进行采样，并在D11对B、D、F、H、J、L、N组的6只小鼠实施安乐死并对它们的器官进行采样。在D4在A、B、D、F、H、J、L和N组中收集中间血液采样。关于PBS对照，仅包括6只小鼠并在D11采样(A组)。

3.1.3/小鼠临床观察和评分

根据下表5中所述的评分网格，在接种后11天期间每天观察动物。从D3到D11实验结束每天监测并记录体温。

表5：评分表

在实验过程期间，若有下列任一事件发生，将动物安乐死：

-痛苦的征象(恶病质、虚弱，难以移动或进食)

-化合物毒性(弓身、抽搐)

-一般方面评分＝3+对刺激的反应＝3

-体重减轻>20％

任何被发现死亡的动物都要进行尸检。

3.1.4-生物学采样

a)在d4，在麻醉的情况下从颌下静脉取得中间血液样品。将约200μL血液收集在含有凝块激活剂(clot activator)和血清分离器(serum separator)(BD Microtainer SST)的小瓶中。

b)在第6天和第11天，在麻醉的情况下通过切开颈动脉放血后取得来自所有动物的血液样品。将约1mL血液收集在含有凝块激活剂和血清分离器(BD Vacutainer SST)的小瓶中。

c)器官收集是在无菌条件下进行的。用于动物解剖的器械先前用RNaseZap^TM去污溶液冲洗。在放血后尽快对所有小鼠进行下列所有器官进行采样，然后在麻醉的情况下通过颈椎脱位进行动物安乐死：脑、肝脏和脾脏。

对于肝脏，将直径为7mm，专用于病毒载量检测的两个活检穿孔物放入含有1mLRNAlater^TM溶液的小瓶中。

对于脑和脾脏，将2个专门用于病毒载量检测的半切片置于含有1mL RNAlater^TM溶液的小瓶中。

3.1.7/分析测试

a)病毒血症

根据制造商的说明书，在Tecan Evoware自动化RNA提取工作站上用MachereyNagel

96病毒试剂盒从140μL每种单独的血清样品中提取总基因组RNA，并分两步洗脱至最终体积为140μL的无核酸酶的水中。

提取后立即通过YF-NS5 qRT-PCR进行RNA定量(如Mantel等(2008)中所述)。qRT-PCR靶向YF NS5基因的保守区以检测YF病毒基因组的存在。

b)器官内的病毒载量

在-80℃在RNA later^TM溶液中将活检穿孔物冷冻。在解冻时，对每个器官样本进行称重。

如通过供应商的推荐所规定的，使用组合的Trizol^TM

/RNeasy^TM

方法从器官的穿孔物提取总RNA。

然后使用如Mantel等(2008)中所述的YF-NS5 qRT-PCR分析来定量纯化的RNA样品中病毒RNA的存在。qRT-PCR靶向YF NS5基因的保守区以检测YF病毒基因组的存在。

每个qRT-PCR运行包括两个非模板对照(阴性qRT-PCR对照)和两个基于CYD-3病毒悬浮液的阳性对照。

为了要验证运行，所有阴性对照必须低于检测极限(LOD)，阳性对照必须纳入对照图表中。

由于稀释因子且对于器官的100mg的样品，检测极限以1Geq/mg器官计算。

3.2/结果

3.2.1/临床征象

根据上表5中描述的评分网格，在接种后每天观察所有动物：从第3天到第6天每天对来自A组至O组的所有小鼠进行评分，且对来自A、B、D、F、H、J、L和N组的所有小鼠每日进一步评分多至第11天。

对每个标准(即，一般方面(GA)、对刺激的反应(RS)、神经学征象(NS)和呼吸(B))对于每组在每个时间点从第3天至第11天计算平均分。如预期的，注射盐水对照的所有A129小鼠(PBS，A组)在整个监测期间对于任何动物没有记录到特定临床得分。

对于施用

参考疫苗或施用vYF pMSL候选物之一的所有A129组，临床征象轻微，每个标准的平均分低于1.5，无论时间点和标准为何(GA<1.5；RS、NS和B<1)。

对于第3、4和5天没有记录到特定的临床得分；然后到第6天和第7天对于几只小鼠记录到一些得分1/0/0/0或2/0/0/0(GA/RS/NS/B)。在第10天和第11天，施用

参考疫苗或vYF pMSL候选物之一的所有A129小鼠显示低得分(一些小鼠GA得分＝1或2，且RS、NS以及B得分＝1)，除了一只施用TV2232(F组)的小鼠在第10天呈现一些颤抖表型、运动并发症，虚脱和呼吸窘迫(得分3/2/3/2)，并因道德原因被安乐死以外。

3.2.2/体重监测

在第0、3、4、5和6天对所有小鼠(A至O组)称重；在第7、10和11天，对来自剩余组别(A、B、D、F、H、J、L和N)的所有小鼠称重。在每个时间点对每只个体小鼠计算与第0天相比的体重减轻的百分比。

用

参考疫苗免疫后，在11天监测期期间观察到轻微的体重减轻(在D11平均为少于5％体重减轻)。

用

谱系而来的vYF pMSL候选物免疫后，就Stamaril对照来说，除了在第10天用克隆TV2232免疫的一只小鼠丧失其体重的超过20％以外，没有观察到急剧的体重减轻。出于道德原因，必须对这只小鼠实施安乐死(见上文3.2.1)。

用来自

谱系的vYF pMSL候选物TV3111，TV3112和TV4221免疫后，观察到稳定的体重并记录到多至第5至6天，且多至监测期结束时观察到轻微的体重增加(在D11平均为少于5％体重增加)。

3.2.3/血清与器官中的病毒载量

a)血清中-图3

对于每组和时间点计算的个体病毒血症以及几何平均效价(GMT)和标准偏差描绘于图3中。

如预期的，在第0天施用PBS的A129小鼠中在第4天没有检测到病毒血症(<LOD为3log₁₀Geq/mL)，而在施用

参考疫苗的A129小鼠中在第4天和第6天检测到4-5log₁₀Geq/mL的几何平均病毒血症效价。

用vYF pMSL候选物免疫后，与用

对照免疫后诱导的病毒血症相比，没有观察到病毒血症的显著优势(无论时间点如何，对于TV2212、TV2232、TV2241、TV3111和TV3112，所有p值>0.2)，除了来自

谱系的TV4221在注射后第4天诱导比

对照显著更高的病毒血症以外(p值＝0.001)。

b)在肝脏中-图4

结果以log₁₀Geq/mg器官表示。对于每组和时间点计算的个体病毒载量以及几何平均值和标准偏差描绘于图4中。

如预期的，在第0天施用PBS的A129小鼠于第11天未检测到肝脏病毒载量(<LOD为1log₁₀Geq/mg)，类似地在施用

参考疫苗的A129小鼠中检测到无或低肝脏病毒载量(在第6天GMT＝0.8，在第11天<LOD)。

在用vYF pMSL候选物免疫后，与用

对照免疫后诱导的肝脏病毒载量相比，未观察到肝脏病毒载量的显著优势(在第6天，对于TV2212、TV2232、TV2241、TV3111、TV3112和TV4221，所有p值均>0.1，由于大量无反应者<LOD，因而在第11天未进行统计学分析)。

c)在脑中-图5

结果以log₁₀ Geq/mg器官表示。对于每组和时间点计算的个体病毒载量以及几何平均效价和标准偏差描绘于图5中。

如预期的，在第0天施用PBS的A129小鼠在第11天未检测到脑病毒载量(<LOD为1log₁₀Geq/mg)，而在施用

参考疫苗的A129小鼠中检测到脑病毒载量(在第6天GMT＝0.6，在第11天为3.7)。

用vYF pMSL候选物免疫后，与用

对照免疫后诱导的脑病毒载量相比，未观察到脑病毒载量的显著优势(对于TV2212和TV2232，p值>0.06)。此外，TV2241、TV3111、TV3112和TV4221在第11天诱导比

对照显著更低的脑病毒载量(p值≤0.003)。

d)在脾脏中-图6

结果以log₁₀ Geq/mg器官表示。对于每组和时间点计算的个体病毒载量以及几何平均效价和标准偏差描绘于图6中。

如预期的，在第0天施用PBS的A129小鼠在第11天未检测到脾脏病毒载量(<LOD为1log₁₀Geq/mg)，而在施用

参考疫苗的A129小鼠中检测到脾脏病毒载量(在第6天GMT＝4.1，在第11天为2)。

用vYF pMSL候选物免疫后，与用

对照免疫后诱导的脾脏病毒载量相比，未观察到脾脏病毒载量的显著优势(不论哪个时间点，对于TV2212、TV2232、TV2241、TV3111、TV3112和TV4221，所有p-值>0.09)。

3.2.4/存活率

为了计算每组的存活率(对于A、B、D、F、H、J，L和N组)，在用4log₁₀CCID₅₀/剂量的

或6个vYF pMSL候选物之一进行皮下免疫后，每天记录存活小鼠的数目历时11天。

如Kaplan Meir曲线所描绘的(图7)，当施用PBS缓冲液，

或五种vYF株(TV2212、TV2241、TV3111、TV3112和TV4221)之一时，100％(6只中的6只小鼠)的小鼠在整个研究过程中存活。

相反，在施用来自

谱系的TV2232株的F组中，只有80％的小鼠存活，因为在第10天，出于道德原因对一只小鼠实施安乐死(参见上文3.2.1)。

实施例4-vYF株候选物在仓鼠模型中的免疫原性

在仓鼠模型中评价了6个vYF pMSL候选物的免疫原性并且与

参考疫苗相比较。

4.1/方法

4.1.1/组定义

每组纳入15只5-6周龄雌性金色叙利亚仓鼠，并且对于6个pMSL候选物中的每一者施用2个剂量，即，2.5log₁₀CCID₅₀/剂量的低次优剂量和5.5log₁₀CCID₅₀/剂量的高剂量。

对于

参考，就上述2个测试剂量，仅纳入10只仓鼠每组。

总共200只雌性金色叙利亚仓鼠随机分配到下表6中所述的14个下列组别(A组至N组)之一(无佐剂；皮下给药途径；在D0和D26为200μl)。

表6：组定义

4.1.2/研究时间表

研究时间表总结在图8中。

干预计划以及干预细节在下表7中描述。

表7：研究时间表

4.1.3/生物学采样及血清中和测定

a)生物学采样

在D0、D26和D41，在麻醉的情况下从所有动物从眼眶后窦(ROS)取得中间血液样品。经由心内穿刺在麻醉的情况下进行最终血液采样。通过腹膜内途径通过以200μl的体积施用Imalgène(150mg/kg)和Rompun(10mg/kg)进行麻醉。

将血液收集在含有凝块激活剂和血清分离器(BD Microtainer SST)的小瓶中。在+4℃一夜或在37℃2小时后，将血液以2000x g在10分钟期间离心，收集血清并将其储存在-20℃直至分析。

b)血清中和测定

从第一次注射起，在D0，D26和D41滴定存在于经免疫的动物血清中的功能性中和抗体。

简言之，将热失活的血清在IMDM+4％胎牛血清(FCS)中从1:5开始连续2倍稀释。将在Vero细胞上生长的YF-17D

病毒稀释以在IMDM中获得4000μPFU/mL，并与2倍稀释的血清样品(v/v)一起温育90分钟。然后将病毒/血清混合物加入96孔板中的Vero细胞并温育45+/-2小时。在温育后，在免疫染色前用85％丙酮固定细胞。用PBS+0.05％Tween 20+2.5％脱脂乳阻断板，并首先与抗黄病毒单克隆抗体4G2，然后与山羊抗小鼠IgG HRP缀合物一起温育。最后，将板用Trueblue^TM生色团染色。用来自Microvision^TM的Viruscope读数器计数菌斑。

使用最小二乘法计算最终的血清中和抗体效价，并且对应于显示中和50％的病毒菌斑的稀释度的倒数。测定的LOD为10，对应于最终体积中的第一倒数稀释度。

为了计算每组的平均值，将任意效价为5(LOD的一半)分配至低于10的所有效价。

4.2/结果-血清中和

在基线(D0)、一次免疫后四周(D26)和两次免疫后两周(D41)，通过从所有动物收集的个体血清样品中的血清中和测定来监测对抗在Vero细胞上的黄热病17D疫苗株的中和活性。几何平均效价(GMT)以及个体中和效价与95％置信区间(CI)在图9和图10中描绘。

如预期的，无论是pMSL vYF候选物还是

参考物，在组别GMT≤12的情况下在基线处(D0)的未给药

仓鼠中检测不到或检测到低的中和抗体效价(≤40)。通过对在D0获得的所有个体数据的统计分析，将反应者阈值定义为20.87(1.32log₁₀)(优越的容差区间，比例为0.99，风险α为5％)。

关于反应动力学，1次免疫后1个月(D26；图9)，对于所有经免疫的组观察到显著增加的中和反应，与D0基线相比，中和GMT增加至少10倍多至850倍。第二次免疫后两周(D41；图10)，中和GMT对于所有组进一步增加，具有与D26相比中和GMT的0.8-7.5倍增加。

对于2.5log₁₀ CCID₅₀剂量(分别在D26和D41为GMT 281和544)，由

参考物诱导的中和抗体反应比5.5log₁₀ CCID₅₀剂量(分别在D26和D41为GMT 5061和11714)显著更低(分别在D26和D41的p值＝0.007和0.023)。值得注意的是，第一次免疫(在D26)后，来自施用5.5log₁₀ CCID₅₀剂量组的100％仓鼠就被定义为反应者(>20.87阈值)，而施用2.5log₁₀CCID₅₀剂量组的仓鼠只有60％和70％分别在D26和D41发现反应者。

对于来自

谱系的vYF pMSL候选物TV2212、TV2232和TV2241，在两种测试剂量之间没有观察到显著差异(所有p值>0.07，无论vYF pMSL候选物和时间点为何)，对于2.5log₁₀ CCID₅₀剂量的GMT范围在D26为从144至505，在D41为从115至1159，相比于对于5.5log₁₀ CCID₅₀的GMT范围在D26为从115至373，在D41从465至955。无论测试剂量和免疫方案为何(1或2次免疫后)，来自

谱系的vYF pMSL候选物没有一者能在所有经免疫动物中诱导持续性中和抗体反应。在一次免疫后发现反应者仓鼠的百分比范围从53％至93％，在用TV2212，TV2232和TV2241两次免疫后，无论剂量如何，发现反应者仓鼠的百分比范围从43％至93％。

对于来自

谱系的vYF pMSL候选物TV3111，TV3112和TV4221，在两种测试剂量之间没有观察到显著差异(所有p值>0.06，无论vYF株和时间点为何)，除了TV3111以外，其2.5log₁₀ CCID₅₀剂量诱导显著高于5.5log₁₀ CCID₅₀的中和抗体效价(分别在D26和D41处p值＝0.04和0.003)。对于2.5log₁₀ CCID₅₀剂量，诱导的GMT较高，范围在D26为从3939至8898且在D41为从3771至13674，而对于5.5log₁₀ CCID₅₀剂量，GMT范围在D26为从2071至5145且在D41为从1821至6421。来自

谱系的vYF pMSL候选物在1次免疫后能够在大多数经免疫动物中诱导持续性中和抗体反应(对于2.5log₁₀ CCID₅₀剂量的TV3111为93％的反应者，而对于来自

谱系的所有其他vYF pMSL候选物为100％反应者，无论测试剂量为何)。在两次免疫后，来自

谱系的所有vYF pMSL候选物能够在100％的经免疫仓鼠中诱导持续性中和抗体反应，无论剂量为何。

关于vYF pMSL候选物的每一者与

参考物的比较，由

谱系而来的vYF pMSL候选物TV3111，TV3112和TV4221的2.5log₁₀ CCID₅₀剂量诱导的中和反应显著不逊于用

参考疫苗获得的那些(在D26和D41的p值分别为≤0.010和≤0.047)。对于从

谱系而来的vYF株(所有p值≥0.25，无论剂量和时间点为何)均未显示出显著的非劣效性，对于以5.5log₁₀ CCID₅₀施用的来自

谱系的vYF株也未显示出显著的非劣效性(p值≥0.49，无论时间点为何)。

实施例5-vYF TV3112株在猴子模型中的毒性和免疫原性

在非人类灵长类动物(NHP)中进行初步毒性研究和免疫原性研究。非人类灵长类动物，特别是恒河猴(rhesus macaques)或食蟹猴(cynomolgus macaques)，惯常用于通过病毒血症测量来评估安全性和感染性，以及疫苗候选物对抗黄病毒(登革热，黄热病.....)的免疫原性。在黄热病的情况下，猴子是天然宿主；病毒首先是在猴子中分离出来，并在本模型中评估了疫苗病毒株的减毒作用。自2000年代以来，已经描述过“小动物”模型，并可用来评估候选疫苗的某些性质，如对于vYF pMSL候选物选择而进行的。然而，这些模型(仓鼠，小鼠A129)具有局限性，而猕猴(macaque)与人类相比至今仍然是最具预测性的金标准模型，并且在文献中广泛描述，例如，Julander(2016)、Mason等(1973)、Monath等(2010)与Moulin等(2013)。此外，在监管指南中推荐这个模型。

5.1/方法

5.1.1/分组定义及目标

将从毛里求斯进口的3组9只2岁龄的雄性食蟹猴(Macaca fascicularis)通过SC途径用500μL的

(一个人类剂量对应于4.2log₁₀CCID₅₀/剂量)、一剂

(6.2log₁₀CCID₅₀)或4.2log₁₀CCID₅₀的vYF TV3112 WSL候选者进行免疫。

作为初级读数，将疫苗候选物与每种参考疫苗进行比较，用于评估i)疫苗安全性、ii)其诱导YF特异性病毒血症的能力以及在下列器官中的病毒载量：肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结和脑(通过依据YF-NS5 qRT-PCR的病毒RNA定量评估，如Mantel等(2008)中所述)，以及iii)诱导黄热病特异性血清中和抗体反应(通过μPRNT₅₀测定评估)，定义为保护相关性。

作为二级读数，为了鉴定疫苗性能的其他潜在生物标志，监测不同的参数。这些分析解决了：i)抗体反应的持续性，以及ii)B和T细胞免疫反应，包括记忆反应。

5.1.2/麻醉

关于免疫接种和在某些情况下(例如血液采样与适应期过程中的其他操作组合或如果猴子在没有麻醉的情况下对血液采样抗拒)，进行轻度麻醉。在大腿中以10mg/kg肌肉内注射氯胺酮(Imalgene 1000,

)。

5.1.3/监测

在D-29和D0将所有动物称重，每天观察临床征象直至D7，并且在D-17和在D0、D3、D4、D5，D6和D7期间的病毒血症预期期间记录它们的个体体温(反应者系统)。在D1、D3和D7的所有猴子中评估血液学，生物化学和血液病毒血症。然后在D7对每组中的三只猴子实施安乐死，并取其器官用于器官评估中的组织病理学和病毒载量。在D27、D60、D90、D122、D153和D181进一步称重每组中的其余6只猴子，并在D10和D14的病毒血症预期期间进一步记录它们的个体体温。每天还观察每组中的其余6只猴子的临床征象直至D221。在D27、D60、D90、D122、D153，D181和D221时从每组中的其余6只猴子收集血液样品用于血清中和、T细胞和记忆B细胞测定。

5.1.4/测试方法

在Vero细胞上，使用μPRNT50方法测定YF特异性血清中和抗体。简言之，将热失活的血清在IMDM(THERMOFISHER SCIENTIFIC)+4％FCS中从1:5开始连续2倍稀释。稀释在Vero细胞上生长的YF-17D

病毒以获得IMDM中的4000μFFU/mL，并与经2倍稀释的血清样品(v/v)一起温育90分钟。然后将病毒/血清混合物加入96孔板中的Vero细胞并温育45+/-2小时。温育后，在免疫染色前用85％丙酮固定细胞。用PBS+0.05％Tween 20+2.5％脱脂乳阻断板，首先与抗黄病毒单克隆抗体4G2，然后与山羊抗小鼠IgG HRP缀合物一起温育。最后，用Trueblue^TM生色团将板染色。用来自Microvision^TM的Viruscope读数器计数菌斑。使用最小二乘法计算最终效价，并且对应于显示中和50％的菌斑的稀释度的倒数。

当所测试血清的第一个稀释度为1:10时，μPRNT50测定的LOD为约20μPRNT50。为了计算每组的平均值，将LOD的一半的任意值分配给低于LOD(即，10μPRNT50)的所有样品。

通过ELISPOT测量记忆细胞反应。荧光连接的免疫点(FLUOROSPOT)用来检测和计数分泌抗体的个体记忆B细胞，不论抗原特异性为何(总IgM或总IgG)。

在D0，将冷冻的PBMC在补充有10％FBS和100μg/mL DNase的RPMI培养基(THERMOFISHER SCIENTIFICIC)中解冻，并在37℃；5％CO₂温育1小时。1小时后，将细胞以1百万个细胞/mL稀释，并通过在37℃；5％CO₂在补充有rIL2(10μg/mL)的RPMI 10％FBS中温育4天进行刺激。

在D3，将配备有低荧光PVDF膜(MERCK

)的96孔FluoroSpot微孔板的膜用35μL的35％乙醇预润湿1分钟。用200μL PBS 1X洗涤每个孔两次。然后将微孔板以1:80的稀释度用YF-17D感染的Vero细胞裂解物(SANOFI

)涂覆或以15μg/mL的稀释度用猴子IgG和IgM特异性单克隆抗体混合物涂覆，并在4℃温育过夜。

在D4，用PBS洗涤板，然后在37℃用RPMI 10％FBS阻断至少2小时。洗涤板后，在涂覆有YF-17D感染的Vero细胞裂解物的孔中加入2×10⁵或4×10⁵个经刺激PBMC。将经刺激细胞的范围稀释液(5×10³至6,2×10²)加入涂覆有抗-IgG和抗-IgM抗体的孔中。

5小时后，用PBS 1X洗涤板3次并当夜在4℃储存。

在D7，用PBS 1X-BSA 0.5％(150μL/孔)洗涤板6次。在洗涤步骤后，在室温、在黑暗中将100μL/孔的抗猴IgM-FITC和IgG-CY3抗体分别以1/500的稀释度加入PBS1X-BSA 0.5％中历时2小时。用PBS 1X-BSA 0.5％(150μL/孔)将板再洗涤6次。将板在5℃±3℃在黑暗中储存直至读数。

对应于抗体分泌细胞的每个点用自动FLUOROSPOT板读数器(Microvision^TM)计数。结果表示为每10⁶个细胞的ACS分泌细胞的数目。

在分离的PBMC上通过IFN-γIL-2反应Dual FluoroSpot(来自

的FS-2122-10猴IFN-γ/IL-2FluoroSpot试剂盒)测定T细胞反应。

简言之，配备FluoroSpot PVDF膜的微量板用35％乙醇预处理、洗涤，并在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在4℃以15μg/mL的浓度通过与针对猴IFN-γ(克隆GZ-4，

)和针对猴IL-2(克隆IL2M-I/249，

)的单克隆抗体一起温育过夜而被涂覆。将板用PBS洗涤3次，然后通过在37℃用补充有10％FCS的RPMI 1640培养基(Gibco)温育2小时来阻断。向每个有0.1μg/mL单克隆抗体CD28-A

的孔中添加PBMC(4×10⁵)。将YF-Env和YF-NS3肽汇集物(涵盖YF-Env和YF-NS3氨基酸序列的15元重叠肽)添加至培养基中每种肽的最终浓度为1μg/mL。抗CD3 mAb

以2.5μg/mL用作阳性对照。将板在37℃在含有5％CO₂的气氛中温育24小时。温育后，用PBS洗涤板6次。在0.5％BSA的PBS中分别以1:200和1μg/mL的浓度添加FITC抗-IFN-γ抗体(克隆7-B6-1-FS-FITC，

)和生物素化抗-IL-2抗体(IL2-生物素MT8G10，

)；将板在37℃温育2小时。用PBS洗涤3次后，用在0.5％BSA的PBS中稀释的链霉抗生物素蛋白SA-550(1:200，

)和抗-FITC-490(1:200，

)在室温下进行温育1小时，并用PBS洗涤6次。将板在5℃±3℃储存于黑暗中直至读数。对应于IFN-γ或IL-2分泌细胞(IFN-γSC或IL5 SC)以及分泌IFN-γ和IL-2细胞因子的多功能T细胞的荧光点用自动FLUOROSPOT板读取器(Microvision^TM)计数。结果表示为每10⁶个PBMC的IFN-γ或IL-2分泌细胞的数目。

通过YF-NS5 qRT-PCR(如Mantel等(2008)中所述)监测YF疫苗病毒血症和器官中的病毒载量。

5.2/结果

减毒活黄热病疫苗的保护相关性在WHO TRS 978附件5中定义为在先前血清阴性个体中诱导可测量到的中和抗体，例如，PRNT效价>检测极限。早在D14和至少9个月期间，所有猴子中检测到远高于预定保护阈值(LOD＝20)的中和抗体(参见图11)。中和抗体效价与用现有疫苗免疫后检测到的效价没有显著差异。

vYF TV3112疫苗接种后第14天多至第221天，在外周血中监测到的持续性B记忆细胞频率也支持此长期的中和抗体反应(参见图12和图13)。这些数据显示，IgM(图12)和IgG(图13)记忆B细胞早在疫苗接种后第14天产生并且在研究期间持续至少221天。关于vYFTV3112，诱导的记忆B细胞的动力学和百分率类似于由参考疫苗

和

所诱导的记忆B细胞的概貌。

而且，在vYF TV3112疫苗接种后诱导了对YF-ENV和YF-NS3的特异性Th1细胞反应(IFN-γ和IL-2分泌细胞)，并且与用

或

接种后观察到的细胞反应相似(参见图14)。

与对照疫苗相比，这个研究还证明了vYF TV3112的保守安全性概貌：没有临床征象、没有体重减轻、没有温度变化、没有血液学(白细胞和红细胞；嗜中性粒细胞；淋巴细胞；单核细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；网织红细胞；血小板；血红蛋白；红细胞比容；平均红细胞体积；平均红细胞血红蛋白含量)或生物化学(碱性磷酸酶；丙氨酸转移酶；天冬氨酸转移酶；γ-谷氨酰转移酶；C-反应蛋白；胆汁酸；总胆红素；白蛋白；血尿素氮；肌酐)病症(与

和

无统计学差异，经由PLS-DA统计分析)、无或极低病毒血症(9只猴子中有1只<4log₁₀Geq/mL)、在黄热病靶器官中检测不到或检测到非常低病毒RNA(为野生型Asibi感染后观察到的病毒负载量的1/100至1/10 000)(参见图15)、在黄热病靶器官中没有与疫苗相关的组织病理学发现。

实施例6-由vYV TV3112株在猕猴模型中诱导的对抗致死攻毒的保护

目的是评价用vYF TV3112疫苗候选物免疫的猕猴中对抗黄热病病毒攻毒的保护。

6.1/方法

6.1.1/动物

用

或vYF TV3112疫苗候选物免疫后9个月，对来自上述实施例5中研究的三个动物组中的每一组在D221的剩余的6只猴子用Asibi毒性株针对黄热病进行攻毒，以评价疫苗效力。另一组6只未给药对照猴子也被攻毒。

6.1.2/YFV以及缓冲液

用来自德州大学医学部(UTMB)的黄热病病毒株Asibi(YFV)进行攻毒。将YFV(批号19455，对VERO细胞的感染效价为7.7Log₁₀CCID₅₀/mL)在NaCl+HSA缓冲液(NaCl 0.4％+人血清白蛋白(HSA)2.5％)中稀释。每只动物在右上背部位用在1mL NaCl+HSA缓冲液中的10³CCID₅₀的YFV皮下攻毒。

6.1.3/监测

在Asibi攻毒后追踪动物历时28天。每天观察动物的摄食量和行为。在每个采样时间点记录直肠温度和体重。如下表8中所述进行血液采样。

表8：时间表

感染后的天数

-8

0

2

3

4

5

7

10

14

28

攻毒

X

安乐死

X

观察<sup>1</sup>

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

局部计分

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

血液学用的血液<sup>2</sup>

X

X

X

X

X

X

X

X

X

血浆用的血液

X

X

X

X

X

X

X

X

X

中和<sup>3</sup>与抗体结合用的血清

X

X

X

X

生物化学用的血清<sup>4</sup>

X

X

X

X

X

X

X

X

X

¹临床观察、体重、直肠温度。^2.白血球&红血球；嗜中性粒细胞；淋巴细胞；单核细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；网织红细胞；血小板；血红蛋白；红细胞比容；平均红细胞体积；平均红细胞血红蛋白含量。³中和测定。^4.碱性磷酸酶；丙氨酸转移酶；天冬氨酸转移酶；γ-谷氨酰转移酶；C-反应蛋白；胆汁酸；总胆红素；白蛋白；血尿素氮；肌酐。

6.1.4-一生观察

观察动物一周七天。在每次采血时，如下表9中所述实施检验。

表9：动物观察图表

死亡	每天
		疾病的明显征象，如腹泻、没有食欲以及嗜睡症	每天
体重	在采样日<sup>1</sup>
		体温(直肠)	在采样日<sup>1</sup>
食物与水消耗	每天评价

¹参见表8。

6.2/结果

所有接种疫苗的猴子都受到保护免受攻毒的影响：病毒血症(只有低病毒血症，即2/6只猴子中<3.6log₁₀GEq/mL历时仅一天，依据如Mantel等(2008)中所述的YF-NS5 qRT-PCR测量)、血液病症，血液生物化学病症以及死亡。

在此研究中，未接种疫苗对照组的6只NHP中有3只经历过攻毒而存活下来，但所有6只对照NHP均出现病毒血症(>8log₁₀Geq/mL)、淋巴细胞减少症、血小板减少症和血液生物化学病症，且转氨酶、CRP、胆红素和胆汁酸的水平的高增加。

因此，vYF TV3112疫苗候选物能够保护食蟹猴(黄热病疫苗的最佳预测动物模型之一)免于野生型Asibi感染，就像是目前可用的疫苗

和

那样。

实例7：测序分析

RNA病毒天然存在高度遗传变异水平，这是造成这些病毒的准物种固有性质(quasi-species intrinsic nature)的原因。即使将黄热病聚合酶的错误率就RNA病毒来说描述为低的，但聚合酶错误率也是每个感染周期每个基因组约10^-6个取代。

建立界定明确的病毒生产过程，从而通过总是维持相同的病毒生长条件而将这种现象限制在最低限度。但从统计学上说，每次病毒在细胞中复制时，病毒准物种就会不断产生，而且每当变体为病毒带来生长优势时，它就会长期保留下来并扩增，逐步取代初始群。

此外，由于新的病毒生长系统将从卵转移成Vero细胞培养物，预计可能会发生一些适应性突变。具体地，NS4B中的几个突变在不同黄病毒模型中被描述为病毒在Vero细胞中生长的正向适应(Blaney等,2003；Tang等,2005；Beasley等2013)。

此外，目前的种子从未被克隆过，因此准物种的混合物在现有的疫苗株中共存。首先通过

和

疫苗的基因组的高通量测序来建立参考序列，然后将新的pMSL候选物基因组与它们进行比较。

随着在2个克隆步骤后获得了新的pMSL候选物，它们代表同源病毒群。

7.3/方法

7.3.1/原则

在提取和纯化病毒RNA后进行黄热病病毒的测序。

接着将RNA逆转录成互补DNA，然后使用特异性引物通过PCR完整扩增基因组。接着由于

XT DNA样品制备试剂盒(llumina,Inc)将PCR产物用于形成库。库的形成在几个步骤中进行。首先，扩增子以等摩尔方式组装。然后使用转座体(Tagmentase)将它们分段。转座体切割DNA并添加适配子(adapter)。然后由于与适配子互补的引物进行通过PCR的扩增步骤。此步骤允许在片段的两侧添加索引(用于标记样品)并将片段连接至测序支持物(support)。最后，使用

珠(

XP,Beckman Coultern Genomics,Inc.)纯化库，并使用MiSeq测序仪(

Inc.)测序。

在获得序列后，接着使用CLC Genomics Workbench软件

的分析模块“基于质量的变体检测(遗留)”进行分析。

7.3.2)RNA提取

根据供应商的推荐，用Qiamp病毒试剂盒

从最小浓度为10⁸Geq/mL的140μl病毒悬浮液提取病毒RNA(通过YF-NS5 qRT-PCR定量)。纯化的经纯化病毒RNA在140μl的无核酸酶水中洗脱。

7.3.3)RT-PCR

首先，使用三种反义引物进行RNA到cDNA的特异性逆转录(RT)步骤，意欲与黄热病病毒的基因组重叠。然后使用表10中所述的三个引物对进行PCR扩增。

表10：引物序列

制备含有三种反义引物之一者(SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14)的三个混合物(参见下表11)。

表11：一个样品的混合物

反向引物的混合物(10μM)	1μL
		dNTP(10mM)	1μL
无核酸酶水	5μL
		提取的RNA	5μL

在温度循环仪中以+65℃加热样品历时5分钟，并通过将管在冰上温育3分钟立刻进行热休克。

接着如下表12中所述制备混合物。

表12：一个病毒RNA样品的混合物(4RT反应)：

向三个RNA/引物管的每一者添加12μl的此混合物，并如下表13中所述进行逆转录操作：

表13：RT程序

步骤	时间(分钟)	温度(℃)
			逆转录步骤	60分钟	+50℃
酶的失活	5分钟	+85℃
			维持	-	+10℃

将1μl的RNAse H加入各管中并将管在温度循环仪中在37℃温育20分钟。

进行扩增，从所获得的cDNA通过PCR成为三个扩增子。

如下表14中所述，制备含有三对引物中之一者(SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10；SEQID NO.11与SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)的三个PCR混合物。

表14：一个样品的PCR混合物

将20μl的各混合物添加至5μl的对应cDNA。

PCR程序如下表15中所述。

表15：PCR程序

7.3.5)分析和纯化扩增子

在1.2％琼脂糖凝胶上分析所有扩增子，以检查扩增的质量。根据供应商的推荐，使用

PCR纯化试剂盒

手动纯化扩增子。

7.3.6)使用

XT试剂盒(Illumina,Inc.)形成库

根据供应商的推荐，使用

dsDNA HS测定试剂盒用

2.0荧光计(LIFE

)定量纯化的扩增子。

在测定之后，将扩增子在无核酸酶水中连续稀释以获得0.2ng/μL的最终浓度。然后，对于各样品，混合三个扩增子以获得0.6ng/μL的单个浓缩PCR汇集物。

PCR程序如下表16中所述。

表16：PCR程序

根据供应商的推荐，通过

XP试剂盒(BECKMAN

)的方式来纯化并校正扩增子。使库在-20℃稳定一周。

7.3.7)分析库

根据供应商的推荐，使用

dsDNA HS Assay试剂盒用

2.0荧光计(LIFE

)来进行库的定量。

7.3.8)库的测序

根据供应商的推荐，通过MiSeq系统

对库进行测序。根据供应商的推荐，通过

Sequencing Analysis Viewer(Illumina,Inc.)分析序列。

根据供应商的推荐，利用CLC Genomics Workbenck 7.5.2软件

对所产生的序列进行分析。

7.4/结果

7.4.1)

与

疫苗的参考序列

疫苗的参考序列表示为SEQ ID NO.2。

疫苗的参考序列发现为SEQ ID NO.3。

7.4.1.1)

衍生的pMSL

pMSL候选物基因组(传代n°8)经测序并与其亲代株基因组相比较。下表17提供来自

谱系的三个株的高通量测序结果。

表17：来自

谱系的株的测序结果

¹ 自5’第一个核苷酸起的核苷酸位置。²

参考基因组的核苷酸。³ 相较于

参考基因组的对应核苷酸有突变的核苷酸。⁴对应YFV蛋白及蛋白质中的对应氨基酸位置。

TV2241与TV2212存在相较于用作参考物的

亲代株的单个突变(核苷酸2524，位在NS1编码区中，在氨基酸水平为沉默的)。TV2232显示一个不同的概貌，在NS3与NS5中有五个突变，全为沉默的。

7.4.1.2)

衍生的pMSL

下表18提供来自

谱系的三个pMSL候选物(传代n°8)的高通量测序结果。

表18：

衍生的株的测序结果

¹ 自5’第一个核苷酸起的核苷酸位置。²

参考基因组的核苷酸。³ 相较于

参考基因组的对应核苷酸有突变的核苷酸。⁴ 对应YFV蛋白及蛋白质中的对应氨基酸位置。⁵ 相较于

参考物的对应氨基酸，蛋白质中有突变的氨基酸和位置。

TV4221与

疫苗株的参考序列同一。

TV3111有3个突变，在位置2411(E-480，Val至Leu)、3701(NS2a-65，Met至Val)以及6496(NS4a-19，沉默)。

TV3112具有与TV3111相同的突变，加上在位置1408处的一个额外的突变(E-145，沉默)。

TV3112和TV3111株包含由SEQ ID NO 15(在位置480处有亮氨酸残基)表示的包膜蛋白。SEQ ID NO 16(在位置65处有缬氨酸残基)是来自TV3112和TV3111株的NS2a蛋白的序列。SEQ ID NO 17(在位置57处有G核苷酸)是编码TV3112株的NS4a蛋白的RNA序列。SEQ IDNO 18(在位置435处有U核苷酸)是编码来自TV3112株的包膜蛋白的RNA序列。

本领域的技术人员已知，基因组的角色在于成为信息的支持而蛋白质通过其功能在病毒表型上发挥作用。沉默突变对于蛋白质功能没有影响。因此，TV3112与TV3111株可描述为包含编码下列的核酸分子的减毒活黄热病病毒株：

(i)包膜蛋白，其在位置480处包含突变，所述突变造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸，和

(ii)NS2a蛋白，其在位置65处包含突变，所述突变造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸。或TV3112与TV3111株可描述为包含编码下列的核酸分子的减毒活黄热病病毒株：

(i)包膜蛋白，其在所述蛋白内对应SEQ ID NO.15的位置480的位置处包含亮氨酸残基，和

(ii)NS2a蛋白，其在所述蛋白内对应SEQ ID NO.16的位置65的位置处包含缬氨酸残基。

7.4.2)

衍生的TV3112株，在MSL和WSL阶段

TV3112 MSL的共有序列与其pMSL亲代(TV3112 pMSL)保持同一。TV3112 WSL的共有序列与其MSL亲代(TV3112 MSL)保持同一。TV3112株在遗传上是稳定的，且从pMSL至WSL阶段在其共有序列中保留在核苷酸位置1408、2411、3701和6496处的突变。

参考文献

·非专利参考文献

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·专利参考文献

-WO 2009/109550

-WO 2014/016360

序列表

<110> 赛诺菲巴斯德(SANOFI PASTEUR)

<120> 适应在VERO细胞上生长的减毒活黄热病病毒株及包含它的疫苗组合物

<130> PM1801-WO-PCT

<160> 18

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 10862

<212> RNA

<213> 黄热病病毒

<220>

<223> YFV 17D204株的RNA序列

<400> 1

aguaaauccu gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa 60

acacauuugg auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau 120

gucuggucgu aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg 180

cuccuuguca aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc 240

aagagguguu caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau 300

cacagcccac cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu 360

aaggaaaguc aagagagugg uggccaguuu gaugagagga uuguccucaa ggaaacgccg 420

uucccaugau guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg 480

agugaccuug gugcggaaaa acagaugguu gcuccuaaau gugacaucug aggaccucgg 540

gaaaacauuc ucugugggca caggcaacug cacaacaaac auuuuggaag ccaaguacug 600

gugcccagac ucaauggaau acaacugucc caaucucagu ccaagagagg agccagauga 660

cauugauugc uggugcuaug ggguggaaaa cguuagaguc gcauauggua agugugacuc 720

agcaggcagg ucuaggaggu caagaagggc cauugacuug ccuacgcaug aaaaccaugg 780

uuugaagacc cggcaagaaa aauggaugac uggaagaaug ggugaaaggc aacuccaaaa 840

gauugagaga ugguucguga ggaaccccuu uuuugcagug acggcucuga ccauugccua 900

ccuuguggga agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg 960

uccggccuac ucagcucacu gcauuggaau uacugacagg gauuucauug agggggugca 1020

uggaggaacu uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc 1080

ugacaagccu ucauuggaca ucucacuaga gacaguagcc auugauagac cugcugaggu 1140

gaggaaagug uguuacaaug caguucucac ucaugugaag auuaaugaca agugccccag 1200

cacuggagag gcccaccuag cugaagagaa cgaaggggac aaugcgugca agcgcacuua 1260

uucugauaga ggcuggggca auggcugugg ccuauuuggg aaagggagca uuguggcaug 1320

cgccaaauuc acuugugcca aauccaugag uuuguuugag guugaucaga ccaaaauuca 1380

guaugucauc agagcacaau ugcauguagg ggccaagcag gaaaauugga auaccgacau 1440

uaagacucuc aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gucgaguuca uuggguaugg 1500

aaaagcuaca cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacaucgc 1560

ugagauggaa acagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc 1620

auggcagagu ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc 1680

uccgcaugcc gccacuauca gaguacuggc ccugggaaac caggaaggcu ccuugaaaac 1740

agcucuuacu ggcgcaauga ggguuacaaa ggacacaaau gacaacaacc uuuacaaacu 1800

acauggugga cauguuucuu gcagagugaa auugucagcu uugacacuca aggggacauc 1860

cuacaaaaua ugcacugaca aaauguuuuu ugucaagaac ccaacugaca cuggccaugg 1920

cacuguugug augcagguga aagugucaaa aggagccccc ugcaggauuc cagugauagu 1980

agcugaugau cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc 2040

cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100

uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160

aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220

cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280

gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340

caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400

caugaucuug guaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460

augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520

agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580

aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640

ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700

gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760

auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820

guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880

cccguuuuca aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu 2940

caccacacgc guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau 3000

cuugggugca gcggugaacg gaaaaaagag ugcccauggc ucuccaacau uuuggauggg 3060

aagucaugaa guaaauggga cauggaugau ccacaccuug gaggcauuag auuacaagga 3120

gugugagugg ccacugacac auacgauugg aacaucaguu gaagagagug aaauguucau 3180

gccgagauca aucggaggcc caguuagcuc ucacaaucau aucccuggau acaagguuca 3240

gacgaacgga ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac 3300

uagcgugauc auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga 3360

uagcgggaaa guuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu 3420

ccaugguagu gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag 3480

ccaucuggug cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu 3540

gagcaugaug auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaauguu 3600

gguuggagga guagugcucu ugggagcaau gcuggucggg caaguaacuc uccuugauuu 3660

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cauguauaug gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg 3780

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ggagauugcc uuggguggcg ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu 3900

cugcauccug acaauaaaug cuguugcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu 3960

cauggcucug uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccgcaa uguucuuuug 4020

ugccgugguu aucauagggg uccuucacca gaauuucaag gacaccucca ugcagaagac 4080

uauaccucug guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg 4140

ccugugugca uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc 4200

acucgcagca gcuggucuag ugggagugcu ggcaggacug gcuuuucagg agauggagaa 4260

cuuccuuggu ccgauugcag uuggaggacu ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag 4320

gguggauggg cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau 4380

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uucugaagag aaagugccau gggaccaggu ugugaugacc ucgcuggccu ugguuggggc 4500

ugcccuccau ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg 4560

agcuaggaga aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca ucgaggaaug 4620

ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca 4680

gcgaggagug ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg 4740

agcuuuccuu gucaggaaug gcaagaaguu gauuccaucu ugggcuucag uaaaggaaga 4800

ccuugucgcc uaugguggcu cauggaaguu ggaaggcaga ugggauggag aggaagaggu 4860

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guucaaagug aggaaugggg gagaaaucgg ggcugucgcu cuugacuauc cgaguggcac 4980

uucaggaucu ccuauuguua acaggaacgg agaggugauu gggcuguacg gcaauggcau 5040

ccuugucggu gacaacuccu ucguguccgc cauaucccag acugagguga aggaagaagg 5100

aaaggaggag cuccaagaga ucccgacaau gcuaaagaaa ggaaugacaa cuguccuuga 5160

uuuucauccu ggagcuggga agacaagacg uuuccuccca cagaucuugg ccgagugcgc 5220

acggagacgc uugcgcacuc uuguguuggc ccccaccagg guuguucuuu cugaaaugaa 5280

ggaggcuuuu cacggccugg acgugaaauu ccacacacag gcuuuuuccg cucacggcag 5340

cgggagagaa gucauugaug ccaugugcca ugccacccua acuuacagga uguuggaacc 5400

aacuaggguu guuaacuggg aagugaucau uauggaugaa gcccauuuuu uggauccagc 5460

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ugccucuuug cguaaggcug gaaagagugu ggugguccug aacaggaaaa ccuuugagag 5760

agaauacccc acgauaaagc agaagaaacc ugacuuuaua uuggccacug acauagcuga 5820

aaugggagcc aaccuuugcg uggagcgagu gcuggauugc aggacggcuu uuaagccugu 5880

gcuuguggau gaagggagga agguggcaau aaaagggcca cuucguaucu ccgcauccuc 5940

ugcugcucaa aggagggggc gcauugggag aaaucccaac agagauggag acucauacua 6000

cuauucugag ccuacaagug aaaauaaugc ccaccacguc ugcugguugg aggccucaau 6060

gcucuuggac aacauggagg ugaggggugg aauggucgcc ccacucuaug gcguugaagg 6120

aacuaaaaca ccaguuuccc cuggugaaau gagacugagg gaugaccaga ggaaagucuu 6180

cagagaacua gugaggaauu gugaccugcc cguuuggcuu ucguggcaag uggccaaggc 6240

ugguuugaag acgaaugauc guaaguggug uuuugaaggc ccugaggaac augagaucuu 6300

gaaugacagc ggugaaacag ugaagugcag ggcuccugga ggagcaaaga agccucugcg 6360

cccaaggugg ugugaugaaa gggugucauc ugaccagagu gcgcugucug aauuuauuaa 6420

guuugcugaa gguaggaggg gagcugcuga agugcuaguu gugcugagug aacucccuga 6480

uuuccuggcu aaaaaaggug gagaggcaau ggauaccauc aguguguucc uccacucuga 6540

ggaaggcucu agggcuuacc gcaaugcacu aucaaugaug ccugaggcaa ugacaauagu 6600

caugcuguuu auacuggcug gacuacugac aucgggaaug gucaucuuuu ucaugucucc 6660

caaaggcauc aguagaaugu cuauggcgau gggcacaaug gccggcugug gauaucucau 6720

guuccuugga ggcgucaaac ccacucacau cuccuauguc augcucauau ucuuuguccu 6780

gauggugguu gugauccccg agccagggca acaaaggucc auccaagaca accaaguggc 6840

auaccucauu auuggcaucc ugacgcuggu uucagcggug gcagccaacg agcuaggcau 6900

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acccuggagu uggccggauc uugaccugaa gccaggagcu gccuggacag uguacguugg 7020

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gucucugucu ggaauagccc agucagccuc aguccuuucu uucauggaca aggggauacc 7140

auucaugaag augaauaucu cggucauaau gcugcugguc aguggcugga auucaauaac 7200

agugaugccu cugcucugug gcauagggug cgccaugcuc cacuggucuc ucauuuuacc 7260

uggaaucaaa gcgcagcagu caaagcuugc acagagaagg guguuccaug gcguugccga 7320

gaacccugug guugauggga auccaacagu ugacauugag gaagcuccug aaaugccugc 7380

ccuuuaugag aagaaacugg cucuauaucu ccuucuugcu cucagccuag cuucuguugc 7440

caugugcaga acgcccuuuu cauuggcuga aggcauuguc cuagcaucag cugccuuagg 7500

gccgcucaua gagggaaaca ccagccuucu uuggaaugga cccauggcug ucuccaugac 7560

aggagucaug agggggaauc acuaugcuuu ugugggaguc auguacaauc uauggaagau 7620

gaaaacugga cgccggggga gcgcgaaugg aaaaacuuug ggugaagucu ggaagaggga 7680

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ggaucgugau acggcacgca ggcauuuggc cgaagggaag guggacaccg ggguggcggu 7800

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uagggugauu gaccuggggu guggccgcgg aggcuggugu uacuacgcug cugcgcaaaa 7920

ggaagugagu ggggucaaag gauuuacucu uggaagagac ggccaugaga aacccaugaa 7980

ugugcaaagu cugggaugga acaucaucac cuucaaggac aaaacugaua uccaccgccu 8040

agaaccagug aaaugugaca cccuuuugug ugacauugga gagucaucau cgucaucggu 8100

cacagagggg gaaaggaccg ugagaguucu ugauacugua gaaaaauggc uggcuugugg 8160

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ggaauugcuc caaaggaggu uuggcggaac agugaucagg aacccucucu ccaggaauuc 8280

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agaggccaua gaagaaaggg uugagaggau aaaaucugag uacaugaccu cuugguuuua 8520

ugacaaugac aaccccuaca ggaccuggca cuacuguggc uccuauguca caaaaaccuc 8580

aggaagugcg gcgagcaugg uaaauggugu uauuaaaauu cugacauauc caugggacag 8640

gauagaggag gucacaagaa uggcaaugac ugacacaacc ccuuuuggac agcaaagagu 8700

guuuaaagaa aaaguugaca ccagagcaaa ggauccacca gcgggaacua ggaagaucau 8760

gaaaguuguc aacagguggc uguuccgcca ccuggccaga gaaaagaacc ccagacugug 8820

cacaaaggaa gaauuuauug caaaaguccg aagucaugca gccauuggag cuuaccugga 8880

agaacaagaa caguggaaga cugccaauga ggcuguccaa gacccaaagu ucugggaacu 8940

gguggaugaa gaaaggaagc ugcaccaaca aggcaggugu cggacuugug uguacaacau 9000

gauggggaaa agagagaaga agcugucaga guuugggaaa gcaaagggaa gccgugccau 9060

augguauaug uggcugggag cgcgguaucu ugaguuugag gcccugggau uccugaauga 9120

ggaccauugg gcuuccaggg aaaacucagg aggaggagug gaaggcauug gcuuacaaua 9180

ccuaggauau gugaucagag accuggcugc aauggauggu gguggauucu acgcggauga 9240

caccgcugga ugggacacgc gcaucacaga ggcagaccuu gaugaugaac aggagaucuu 9300

gaacuacaug agcccacauc acaaaaaacu ggcacaagca gugauggaaa ugacauacaa 9360

gaacaaagug gugaaagugu ugagaccagc cccaggaggg aaagccuaca uggaugucau 9420

aagucgacga gaccagagag gauccgggca gguagugacu uaugcucuga acaccaucac 9480

caacuugaaa guccaauuga ucagaauggc agaagcagag auggugauac aucaccaaca 9540

uguucaagau ugugaugaau caguucugac caggcuggag gcauggcuca cugagcacgg 9600

augugacaga cugaagagga uggcggugag uggagacgac uguguggucc ggcccaucga 9660

ugacagguuc ggccuggccc ugucccaucu caacgccaug uccaagguua gaaaggacau 9720

aucugaaugg cagccaucaa aaggguggaa ugauugggag aaugugcccu ucuguuccca 9780

ccacuuccau gaacuacagc ugaaggaugg caggaggauu guggugccuu gccgagaaca 9840

ggacgagcuc auugggagag gaaggguguc uccaggaaac ggcuggauga ucaaggaaac 9900

agcuugccuc agcaaagccu augccaacau guggucacug auguauuuuc acaaaaggga 9960

caugaggcua cugucauugg cuguuuccuc agcuguuccc accucauggg uuccacaagg 10020

acgcacaaca uggucgauuc augggaaagg ggaguggaug accacggaag acaugcuuga 10080

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aaaauggaga gaugucccuu aucuaaccaa gagacaagac aagcugugcg gaucacugau 10200

uggaaugacc aauagggcca ccugggccuc ccacauccau uuagucaucc aucguauccg 10260

aacgcugauu ggacaggaga aauacacuga cuaccuaaca gucauggaca gguauucugu 10320

ggaugcugac cugcaacugg gugagcuuau cugaaacacc aucuaacagg aauaaccggg 10380

auacaaacca cggguggaga accggacucc ccacaaccug aaaccgggau auaaaccacg 10440

gcuggagaac cgggcuccgc acuuaaaaug aaacagaaac cgggauaaaa acuacggaug 10500

gagaaccgga cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacc ccacacgagu 10560

uuugccacug cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa 10620

aaaccugguu ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc 10680

cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740

auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800

ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860

cu 10862

<210> 2

<211> 10862

<212> RNA

<213> 黄热病病毒

<220>

<223> YFV YF-Vax®株的RNA序列

<400> 2

aguaaauccu gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa 60

acacauuugg auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau 120

gucuggucgu aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg 180

cuccuuguca aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc 240

aagagguguu caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau 300

cacagcccac cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu 360

aaggaaaguc aagagagugg uggccaguuu gaugagagga uuguccucaa ggaaacgccg 420

uucccaugau guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg 480

agugaccuug gugcggaaaa acagaugguu gcuccuaaau gugacaucug aggaccucgg 540

gaaaacauuc ucugugggca caggcaacug cacaacaaac auuuuggaag ccaaguacug 600

gugcccagac ucaauggaau acaacugucc caaucucagu ccaagagagg agccagauga 660

cauugauugc uggugcuaug ggguggaaaa cguuagaguc gcauauggua agugugacuc 720

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uuugaagacc cggcaagaaa aauggaugac uggaagaaug ggugaaaggc aacuccaaaa 840

gauugagaga ugguucguga ggaaccccuu uuuugcagug acggcucuga ccauugccua 900

ccuuguggga agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg 960

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uggaggaacu uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc 1080

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cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100

uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160

aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220

cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280

gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340

caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400

caugaucuug guaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460

augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520

agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580

aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640

ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700

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caccacacgc guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau 3000

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gacgaacgga ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac 3300

uagcgugauc auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga 3360

uagcgggaaa guuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu 3420

ccaugguagu gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag 3480

ccaucuggug cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu 3540

gagcaugaug auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaauguu 3600

gguuggagga guagugcucu ugggagcaau gcuggucggg caaguaacuc uccuugauuu 3660

gcugaaacuc acaguggcug ugggauugca uuuccaugag augaacaaug gaggagacgc 3720

cauguauaug gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg 3780

gcucaggacc cuauggagcc cucgggaacg ccuugugcug acccuaggag cagccauggu 3840

ggagauugcc uuggguggcg ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu 3900

cugcauccug acaauaaaug cuguugcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu 3960

cauggcucug uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccgcaa uguucuuuug 4020

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uauaccucug guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg 4140

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cuuccuuggu ccgauugcag uuggaggacu ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag 4320

gguggauggg cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau 4380

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ugcccuccau ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg 4560

agcuaggaga aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca ucgaggaaug 4620

ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca 4680

gcgaggagug ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg 4740

agcuuuccuu gucaggaaug gcaagaaguu gauuccaucu ugggcuucag uaaaggaaga 4800

ccuugucgcc uaugguggcu cauggaaguu ggaaggcaga ugggauggag aggaagaggu 4860

ccaguugauc gcggcuguuc caggaaagaa cguggucaac guccagacaa aaccgagcuu 4920

guucaaagug aggaaugggg gagaaaucgg ggcugucgcu cuugacuauc cgaguggcac 4980

uucaggaucu ccuauuguua acaggaacgg agaggugauu gggcuguacg gcaauggcau 5040

ccuugucggu gacaacuccu ucguguccgc cauaucccag acugagguga aggaagaagg 5100

aaaggaggag cuccaagaga ucccgacaau gcuaaagaaa ggaaugacaa cuguccuuga 5160

uuuucauccu ggagcuggga agacaagacg uuuccuccca cagaucuugg ccgagugcgc 5220

acggagacgc uugcgcacuc uuguguuggc ccccaccagg guuguucuuu cugaaaugaa 5280

ggaggcuuuu cacggccugg acgugaaauu ccacacacag gcuuuuuccg cucacggcag 5340

cgggagagaa gucauugaug cuaugugcca ugccacccua acuuacagga uguuggaacc 5400

aacuaggguu guuaacuggg aagugaucau uauggaugaa gcccauuuuu uggauccagc 5460

uagcauagcc gcuagagguu gggcagcgca cagagcuagg gcaaaugaaa gugcaacaau 5520

cuugaugaca gccacaccgc cugggacuag ugaugaauuu ccacauucaa auggugaaau 5580

agaagauguu caaacggaca uacccaguga gcccuggaac acagggcaug acuggauccu 5640

ggcugacaaa aggcccacgg caugguuccu uccauccauc agagcugcaa augucauggc 5700

ugccucuuug cguaaggcug gaaagagugu ggugguccug aacaggaaaa ccuuugagag 5760

agaauacccc acgauaaagc agaagaaacc ugacuuuaua uuggccacug acauagcuga 5820

aaugggagcc aaccuuugcg uggagcgagu gcuggauugc aggacggcuu uuaagccugu 5880

gcuuguggau gaagggagga agguggcaau aaaagggcca cuucguaucu ccgcauccuc 5940

ugcugcucaa aggagggggc gcauugggag aaaucccaac agagauggag acucauacua 6000

cuauucugag ccuacaagug aaaauaaugc ccaccacguc ugcugguugg aggccucaau 6060

gcucuuggac aacauggagg ugaggggugg aauggucgcc ccacucuaug gcguugaagg 6120

aacuaaaaca ccaguuuccc cuggugaaau gagacugagg gaugaccaga ggaaagucuu 6180

cagagaacua gugaggaauu gugaccugcc cguuuggcuu ucguggcaag uggccaaggc 6240

ugguuugaag acgaaugauc guaaguggug uuuugaaggc ccugaggaac augagaucuu 6300

gaaugacagc ggugaaacag ugaagugcag ggcuccugga ggagcaaaga agccucugcg 6360

cccaaggugg ugugaugaaa gggugucauc ugaccagagu gcgcugucug aauuuauuaa 6420

guuugcugaa gguaggaggg gagcugcuga agugcuaguu gugcugagug aacucccuga 6480

uuuccuggcu aaaaaaggug gagaggcaau ggauaccauc aguguguuuc uccacucuga 6540

ggaaggcucu agggcuuacc gcaaugcacu aucaaugaug ccugaggcaa ugacaauagu 6600

caugcuguuu auacuggcug gacuacugac aucgggaaug gucaucuuuu ucaugucucc 6660

caaaggcauc aguagaaugu cuauggcgau gggcacaaug gccggcugug gauaucucau 6720

guuccuugga ggcgucaaac ccacucacau cuccuauauc augcucauau ucuuuguccu 6780

gauggugguu gugauccccg agccagggca acaaaggucc auccaagaca accaaguggc 6840

auaccucauu auuggcaucc ugacgcuggu uucagcggug gcagccaacg agcuaggcau 6900

gcuggagaaa accaaagagg accucuuugg gaagaagaac uuaauuccau cuagugcuuc 6960

acccuggagu uggccggauc uugaccugaa gccaggagcu gccuggacag uguacguugg 7020

cauuguuaca augcucucuc caauguugca ccacuggauc aaagucgaau auggcaaccu 7080

gucucugucu ggaauagccc agucagccuc aguccuuucu uucauggaca aggggauacc 7140

auucaugaag augaauaucu cggucauaau gcugcugguc aguggcugga auucaauaac 7200

agugaugccu cugcucugug gcauagggug cgccaugcuc cacuggucuc ucauuuuacc 7260

uggaaucaaa gcgcagcagu caaagcuugc acagagaagg guguuccaug gcguugccaa 7320

gaacccugug guugauggga auccaacagu ugacauugag gaagcuccug aaaugccugc 7380

ccuuuaugag aagaaacugg cucuauaucu ccuucuugcu cucagccuag cuucuguugc 7440

caugugcaga acgcccuuuu cauuggcuga aggcauuguc cuagcaucag cugcccuagg 7500

gccgcucaua gagggaaaca ccagccuucu uuggaaugga cccauggcug ucuccaugac 7560

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gaaaacugga cgccggggga gcgcgaaugg aaaaacuuug ggugaagucu ggaagaggga 7680

acugaaucug uuggacaagc gacaguuuga guuguauaaa aggaccgaca uuguggaggu 7740

ggaucgugau acggcacgca ggcauuuggc cgaagggaag guggacaccg ggguggcggu 7800

cuccaggggg accgcaaagu uaaggugguu ccaugagcgu ggcuauguca agcuggaagg 7860

uagggugauu gaccuggggu guggccgcgg aggcuggugu uacuacgcug cugcgcaaaa 7920

ggaagugagu ggggucaaag gauuuacucu uggaagagac ggccaugaga aacccaugaa 7980

ugugcaaagu cugggaugga acaucaucac cuucaaggac aaaacugaua uccaccgccu 8040

agaaccagug aaaugugaca cccuuuugug ugacauugga gagucaucau cgucaucggu 8100

cacagagggg gaaaggaccg ugagaguucu ugauacugua gaaaaauggc uggcuugugg 8160

gguugacaac uucuguguga agguguuagc uccauacaug ccagauguuc ucgagaaacu 8220

ggaauugcuc caaaggaggu uuggcggaac agugaucagg aacccucucu ccaggaauuc 8280

cacucaugaa auguacuacg ugucuggagc ccgcagcaau gucacauuua cugugaacca 8340

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ugacgucauc cucccaauug ggacacgcag uguugagaca gacaagggac cccuggacaa 8460

agaggccaua gaagaaaggg uugagaggau aaaaucugag uacaugaccu cuugguuuua 8520

ugacaaugac aaccccuaca ggaccuggca cuacuguggc uccuauguca caaaaaccuc 8580

aggaagugcg gcgagcaugg uaaauggugu uauuaaaauu cugacauauc caugggacag 8640

gauagaggag gucacaagaa uggcaaugac ugacacaacc ccuuuuggac agcaaagagu 8700

guuuaaagaa aaaguugaca ccagagcaaa ggauccacca gcgggaacua ggaagaucau 8760

gaaaguuguc aacagguggc uguuccgcca ccuggccaga gaaaagaacc ccagacugug 8820

cacaaaggaa gaauuuauug caaaaguccg aagucaugca gccauuggag cuuaccugga 8880

agaacaagaa caguggaaga cugccaauga ggcuguccaa gacccaaagu ucugggaacu 8940

gguggaugaa gaaaggaagc ugcaccaaca aggcaggugu cggacuugug uguacaacau 9000

gauggggaaa agagagaaga agcugucaga guuugggaaa gcaaagggaa gccgugccau 9060

augguauaug uggcugggag cgcgguaucu ugaguuugag gcccugggau uccugaauga 9120

ggaccauugg gcuuccaggg aaaacucagg aggaggagug gaaggcauug gcuuacaaua 9180

ccuaggauau gugaucagag accuggcugc aauggauggu gguggauucu acgcggauga 9240

caccgcugga ugggacacgc gcaucacaga ggcagaccuu gaugaugaac aggagaucuu 9300

gaacuacaug agcccacauc acaaaaaacu ggcacaagca gugauggaaa ugacauacaa 9360

gaacaaagug gugaaagugu ugagaccagc cccaggaggg aaagccuaca uggaugucau 9420

aagucgacga gaccagagag gauccgggca gguagugacu uaugcucuga acaccaucac 9480

caacuugaaa guccaauuga ucagaauggc agaagcagag auggugauac aucaccaaca 9540

uguucaagau ugugaugaau caguucugac caggcuggag gcauggcuca cugagcacgg 9600

auguaacaga cugaagagga uggcggugag uggagacgac uguguggucc ggcccaucga 9660

ugacagguuc ggccuggccc ugucccaucu caacgccaug uccaagguua gaaaggacau 9720

aucugaaugg cagccaucaa aaggguggaa ugauugggag aaugugcccu ucuguuccca 9780

ccacuuccau gaacuacagc ugaaggaugg caggaggauu guggugccuu gccgagaaca 9840

ggacgagcuc auugggagag gaaggguguc uccaggaaac ggcuggauga ucaaggaaac 9900

agcuugccuc agcaaagccu augccaacau guggucacug auguauuuuc acaaaaggga 9960

caugaggcua cugucauugg cuguuuccuc agcuguuccc accucauggg uuccacaagg 10020

acgcacaaca uggucgauuc augggaaagg ggaguggaug accacggaag acaugcuuga 10080

gguguggaac agaguaugga uaaccaacaa cccacacaug caggacaaga caauggugaa 10140

aaaauggaga gaugucccuu aucuaaccaa gagacaagac aagcugugcg gaucacugau 10200

uggaaugacc aauagggcca ccugggccuc ccacauccau uuggucaucc aucguauccg 10260

aacgcugauu ggacaggaga aauacacuga cuaccuaaca gucauggaca gguauucugu 10320

ggaugcugac cugcaacugg gugagcuuau cugaaacacc aucuaacagg aauaaccggg 10380

auacaaacca cggguggaga accggacucc ccacaaccug aaaccgggau auaaaccacg 10440

gcuggagaac cggacuccgc acuuaaaaug aaacagaaac cgggauaaaa acuacggaug 10500

gagaaccgga cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacc ccacacgagu 10560

uuugccacug cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa 10620

aaaccugguu ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc 10680

cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740

auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800

ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860

cu 10862

<210> 3

<211> 10862

<212> RNA

<213> 黄热病病毒

<220>

<223> YFV Stamaril®株的RNA序列

<400> 3

aguaaauccu gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa 60

acacauuugg auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau 120

gucuggucgu aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg 180

cuccuuguca aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc 240

aagagguguu caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau 300

cacagcccac cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu 360

aaggaaaguc aagagagugg uggccaguuu gaugagagga uuguccucaa ggaaacgccg 420

uucccaugau guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg 480

agugaccuug gugcggaaaa acagaugguu gcuccuaaau gugacaucug aggaccucgg 540

gaaaacauuc ucugugggca caggcaacug cacaacaaac auuuuggaag ccaaguacug 600

gugcccagac ucaauggaau acaacugucc caaucucagu ccaagagagg agccagauga 660

cauugauugc uggugcuaug ggguggaaaa cguuagaguc gcauauggua agugugacuc 720

agcaggcagg ucuaggaggu caagaagggc cauugacuug ccuacgcaug aaaaccaugg 780

uuugaagacc cggcaagaaa aauggaugac uggaagaaug ggugaaaggc aacuccaaaa 840

gauugagaga ugguucguga ggaaccccuu uuuugcagug acggcucuga ccauugccua 900

ccuuguggga agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg 960

uccggccuac ucagcucacu gcauuggaau uacugacagg gauuucauug agggggugca 1020

uggaggaacu uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc 1080

ugacaagccu ucauuggaca ucucacuaga gacaguagcc auugauagac cugcugaggu 1140

gaggaaagug uguuacaaug caguucucac ucaugugaag auuaaugaca agugccccag 1200

cacuggagag gcccaccuag cugaagagaa cgaaggggac aaugcgugca agcgcacuua 1260

uucugauaga ggcuggggca auggcugugg ccuauuuggg aaagggagca uuguggcaug 1320

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guaugucauc agagcacaau ugcauguagg ggccaagcag gaaaauugga auaccgacau 1440

uaagacucuc aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gucgaguuca uuggguaugg 1500

aaaagcuaca cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacaucgc 1560

ugagauggaa acagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc 1620

auggcagagu ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc 1680

uccgcaugcc gccacuauca gaguacuggc ccugggaaac caggaaggcu ccuugaaaac 1740

agcucuuacu ggcgcaauga ggguuacaaa ggacacaaau gacaacaacc uuuacaaacu 1800

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cacuguugug augcagguga aagugucaaa aggagccccc ugcaggauuc cagugauagu 1980

agcugaugau cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc 2040

cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100

uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160

aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220

cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280

gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340

caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400

caugaucuug guaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460

augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520

agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580

aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640

ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700

gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760

auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820

guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880

cccguuuuca aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu 2940

caccacacgc guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau 3000

cuugggugca gcggugaacg gaaaaaagag ugcccauggc ucuccaacau uuuggauggg 3060

aagucaugaa guaaauggga cauggaugau ccacaccuug gaggcauuag auuacaagga 3120

gugugagugg ccacugacac auacgauugg aacaucaguu gaagagagug aaauguucau 3180

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gacgaacgga ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac 3300

uagcgugauc auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga 3360

uagcgggaaa guuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu 3420

ccaugguagu gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag 3480

ccaucuggug cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu 3540

gagcaugaug auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaauguu 3600

gguuggagga guagugcucu ugggagcaau gcuggucggg caaguaacuc uccuugauuu 3660

gcugaaacuc acaguggcug ugggauugca uuuccaugag augaacaaug gaggagacgc 3720

cauguauaug gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg 3780

gcucaggacc cuauggagcc cucgggaacg ccuugugcug acccuaggag cagccauggu 3840

ggagauugcc uuggguggcg ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu 3900

cugcauccug acaauaaaug cuguugcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu 3960

cauggcucug uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccgcaa uguucuuuug 4020

ugccgugguu aucauagggg uccuucacca gaacuucaag gacaccucca ugcagaagac 4080

uauaccucug guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg 4140

ccugugugca uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc 4200

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ugcccuccau ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg 4560

agcuaggaga aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca ucgaggaaug 4620

ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca 4680

gcgaggagug ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg 4740

agcuuuccuu gucaggaaug gcaagaaguu gauuccaucu ugggcuucag uaaaggaaga 4800

ccuugucgcc uaugguggcu cauggaaguu ggaaggcaga ugggauggag aggaagaggu 4860

ccaguugauc gcggcuguuc caggaaagaa cguggucaac guccagacaa aaccgagcuu 4920

guucaaagug aggaaugggg gagaaaucgg ggcugucgcu cuugacuauc cgaguggcac 4980

uucaggaucu ccuauuguua acaggaacgg agaggugauu gggcuguacg gcaauggcau 5040

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aaaggaggag cuccaagaga ucccgacaau gcuaaagaaa ggaaugacaa cuguccuuga 5160

uuuucauccu ggagcuggga agacaagacg uuuccuccca cagaucuugg ccgagugcgc 5220

acggagacgc uugcgcacuc uuguguuggc ccccaccagg guuguucuuu cugaaaugaa 5280

ggaggcuuuu cacggccugg acgugaaauu ccacacacag gcuuuuuccg cucacggcag 5340

cgggagagaa gucauugaug ccaugugcca ugccacccua acuuacagga uguuggaacc 5400

aacuaggguu guuaacuggg aagugaucau uauggaugaa gcccauuuuu uggauccagc 5460

uagcauagcc gcuagagguu gggcagcgca cagagcuagg gcaaaugaaa gugcaacaau 5520

cuugaugaca gccacaccgc cugggacuag ugaugaauuu ccacauucaa auggugaaau 5580

agaagauguu caaacggaca uacccaguga gcccuggaac acagggcaug acuggauccu 5640

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ugccucuuug cguaaggcug gaaagagugu ggugguccug aacaggaaaa ccuuugagag 5760

agaauacccc acgauaaagc agaagaaacc ugacuuuaua uuggccacug acauagcuga 5820

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gcucuuggac aacauggagg ugaggggugg aauggucgcc ccacucuaug gcguugaagg 6120

aacuaaaaca ccaguuuccc cuggugaaau gagacugagg gaugaccaga ggaaagucuu 6180

cagagaacua gugaggaauu gugaccugcc cguuuggcuu ucguggcaag uggccaaggc 6240

ugguuugaag acgaaugauc guaaguggug uuuugaaggc ccugaggaac augagaucuu 6300

gaaugacagc ggugaaacag ugaagugcag ggcuccugga ggagcaaaga agccucugcg 6360

cccaaggugg ugugaugaaa gggugucauc ugaccagagu gcgcugucug aauuuauuaa 6420

guuugcugaa gguaggaggg gagcugcuga agugcuaguu gugcugagug aacucccuga 6480

uuuccuggcu aaaaaaggug gagaggcaau ggauaccauc aguguguuuc uccacucuga 6540

ggaaggcucu agggcuuacc gcaaugcacu aucaaugaug ccugaggcaa ugacaauagu 6600

caugcuguuu auacuggcug gacuacugac aucgggaaug gucaucuuuu ucaugucucc 6660

caaaggcauc aguagaaugu cuauggcgau gggcacaaug gccggcugug gauaucucau 6720

guuccuugga ggcgucaaac ccacucacau cuccuauauc augcucauau ucuuuguccu 6780

gauggugguu gugauccccg agccagggca acaaaggucc auccaagaca accaaguggc 6840

auaccucauu auuggcaucc ugacgcuggu uucagcggug gcagccaacg agcuaggcau 6900

gcuggagaaa accaaagagg accucuuugg gaagaagaac uuaauuccau cuagugcuuc 6960

acccuggagu uggccggauc uugaccugaa gccaggagcu gccuggacag uguacguugg 7020

cauuguuaca augcucucuc caauguugca ccacuggauc aaagucgaau auggcaaccu 7080

gucucugucu ggaauagccc agucagccuc aguccuuucu uucauggaca aggggauacc 7140

auucaugaag augaauaucu cggucauaau gcugcugguc aguggcugga auucaauaac 7200

agugaugccu cugcucugug gcauagggug cgccaugcuc cacuggucuc ucauuuuacc 7260

uggaaucaaa gcgcagcagu caaagcuugc acagagaagg guguuccaug gcguugccaa 7320

gaacccugug guugauggga auccaacagu ugacauugag gaagcuccug aaaugccugc 7380

ccuuuaugag aagaaacugg cucuauaucu ccuucuugcu cucagccuag cuucuguugc 7440

caugugcaga acgcccuuuu cauuggcuga aggcauuguc cuagcaucag cugccuuagg 7500

gccgcucaua gagggaaaca ccagccuucu uuggaaugga cccauggcug ucuccaugac 7560

aggagucaug agggggaauc acuaugcuuu ugugggaguc auguacaauc uauggaagau 7620

gaaaacugga cgccggggga gcgcgaaugg aaaaacuuug ggugaagucu ggaagaggga 7680

acugaaucug uuggacaagc gacaguuuga guuguauaaa aggaccgaca uuguggaggu 7740

ggaucgugau acggcacgca ggcauuuggc cgaagggaag guggacaccg ggguggcggu 7800

cuccaggggg accgcaaagu uaaggugguu ccaugagcgu ggcuauguca agcuggaagg 7860

uagggugauu gaccuggggu guggccgcgg aggcuggugu uacuacgcug cugcgcaaaa 7920

ggaagugagu ggggucaaag gauuuacucu uggaagagac ggccaugaga aacccaugaa 7980

ugugcaaagu cugggaugga acaucaucac cuucaaggac aaaacugaua uccaccgccu 8040

agaaccagug aaaugugaca cccuuuugug ugacauugga gagucaucau cgucaucggu 8100

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cacucaugaa auguacuacg ugucuggagc ccgcagcaau gucacauuua cugugaacca 8340

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ugacaaugac aaccccuaca ggaccuggca cuacuguggc uccuauguca caaaaaccuc 8580

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gauagaggag gucacaagaa uggcaaugac ugacacaacc ccuuuuggac agcaaagagu 8700

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<213> 黄热病病毒

<220>

<223> YFV 17D-213株的RNA序列

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<211> 10862

<212> RNA

<213> 黄热病病毒

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<223> YFV 17DD株的RNA序列

<400> 5

aguaaauccu gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa 60

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gauugagaga ugguucguga ggaaccccuu uuuugcagug acagcucuga ccauugccua 900

ccuuguggga agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg 960

uccggccuac ucagcucacu gcauuggaau uacugacagg gauuucauug agggggugca 1020

uggaggaacu uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc 1080

ugacaagccu ucauuggaca ucucacuaga gacaguagcc auugauagac cugcugaggc 1140

gaggaaagug uguuacaaug caguucucac ucaugugaag auuaaugaca agugccccag 1200

cacuggagag gcccaccuag cugaagagaa cgaaggggac aaugcgugca agcgcacuua 1260

uucugauaga ggcuggggca auggcugugg ccuauuuggg aaagggagca uuguggcaug 1320

cgccaaauuc acuugugcca aauccaugag uuuguuugag guugaucaga ccaaaauuca 1380

guaugucauc agagcacaau ugcauguagg ggccaagcag gaaaauugga auaccagcau 1440

uaagacucuc aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gucgaguuca uuggguaugg 1500

aaaagcuaca cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacauagc 1560

ugagauggaa acagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc 1620

auggcagagu ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc 1680

uccgcaugcc gccacuauca gaguacuggc ccugggaaac caggaaggcu ccuugaaaac 1740

agcucuuacu ggcgcaauga ggguuacaaa ggacacaaau gacaacaacc uuuacaaacu 1800

acauggugga cauguuucuu gcagagugaa auugucagcu uugacacuca aggggacauc 1860

cuacaaaaua ugcacugaca aaauguuuuu ugucaagaac ccaacugaca cuggccaugg 1920

cacuguugug augcagguga aagugccaaa aggagccccc ugcaggauuc cagugauagu 1980

agcugaugau cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc 2040

cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100

uaucguugga agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160

aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacgu 2220

cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280

gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340

caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400

caugaucuug guaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460

augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520

agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580

aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640

ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700

gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760

auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820

guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880

cccguuuuca aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu 2940

caccacacgc guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau 3000

cuugggugca gcggugaacg gaaaaaagag ugcccauggc ucuccaacau uuuggauggg 3060

aagucaugaa guaaauggga cauggaugau ccacaccuug gaggcauuag auuacaagga 3120

gugugagugg ccacugacac auacgauugg aacaucaguu gaagagagug aaauguucau 3180

gccgagauca aucggaggcc caguuagcuc ucacaaucau aucccuggau acaagguuca 3240

gacgaacgga ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac 3300

uagcgugauc auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga 3360

uagcgggaaa guuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu 3420

ccaugguagu gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag 3480

ccaucuggug cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu 3540

gagcaugaug auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaaugcu 3600

gguuggagga guagugcucu ugggagcaau gcugguuggg caaguaacuc uccuugauuu 3660

gcugaaacuc acaguggcug ugggauugca uuuccaugag augaacaaug gaggagacgc 3720

cauguauaug gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg 3780

gcucaggacc cuauggagcc cucgggaacg ccuugugcug acccuaggag cagccauggu 3840

ggagauugcc uuggguggcg ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu 3900

cugcauccug acaauaaaug cuguugcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu 3960

cauggcucug uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccgcaa ugcucuuuug 4020

ugccgugguu aucauagggg uccuucacca gaacuucaag gacaccucca ugcagaagac 4080

uauaccucug guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg 4140

ccugugugca uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc 4200

acuugcagca gcuggucuag ugggagugcu ggcaggacug gcuuuucagg agauggagaa 4260

cuuccuuggu ccgauugcag uuggaggacu ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag 4320

gguggauggg cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau 4380

cagcgggagu uccgcccgcu augauguggc acucagugaa caaggggagu ucaagcugcu 4440

uucugaagag aaagugccau gggaccaggu ugugaugacc ucgcuggccu ugguuggggc 4500

ugcccuccau ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg 4560

agcuaggaga aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca uugaggaaug 4620

ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca 4680

gcgaggagug ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg 4740

agcuuuccuu gucaggaaug gcaagaaguu gauuccaucu ugggcuucag uaaaggaaga 4800

ccuugucgcc uaugguggcu cauggaaguu ggaaggcaga ugggauggag aggaagaggu 4860

ccaguugauc gcugcuguuc caggaaagaa cguggucaac guccagacaa aaccgagcuu 4920

guucaaagug aggaaugggg gggaaaucgg ggcuguugcu cuugacuauc caaguggcac 4980

uucaggaucu ccuauuguua acaggaacgg agaggugauu gggcuguacg gcaauggcau 5040

ccuugucggu gacaacuccu ucguguccgc cauaucccag acugagguga aggaagaagg 5100

aaaggaggag cuccgagaga ucccgacaau gcuaaagaaa ggaaugacaa cuauccuuga 5160

uuuucauccu ggagcuggga agacaagacg uuuccuccca cagaucuugg ccgagugcgc 5220

acggcgacgc uugcgcacuc uuguguuggc ccccaccagg guuguucuuu cugaaaugaa 5280

ggaggcuuuu cacggccugg acgugaaauu ccacacacag gcuuuuuccg cucacggcag 5340

cgggagagaa gucauugaug caaugugcca ugccacccua acuuacagga uguuggaacc 5400

aacuaggguu guuaacuggg aagugaucau uauggaugaa gcccauuuuu uggauccagc 5460

uagcauagcc gcuagagguu gggcagcgca cagagcuagg gcaaaugaaa gugcaacaau 5520

cuugaugaca gccacaccgc cugggacuag ugaugaauuu ccacauucaa auggugaaau 5580

agaagauguu caaacggaca uacccaguga gcccuggaac acagggcaug acuggauccu 5640

ggcugacaaa aggcccacgg caugguuccu uccauccauc agagcugcaa augucauggc 5700

ugccucuuug cguaaggcug gaaagagugu ggugguccug aacaggaaaa ccuuugagag 5760

agaauacccc acgauaaagc agaagaaacc ugacuuuaua uuggccacug acauagcuga 5820

aaugggagcc aaccuuugcg uggagcgagu gcuggauugc aggacggcuu uuaagccugu 5880

gcuuguggau gaagggagga agguggcaau aaaagggcca cuucguaucu ccgcauccuc 5940

ugcugcucaa aggagggggc gcauugggag aaaucccaac agagauggag acucauacua 6000

cuauucugag ccuacaagug aaaauaaugc ccaccacguc ugcugguugg aggccucaau 6060

gcucuuggau aacauggagg ugaggggugg aauggucgcc ccacucuaug gcguugaagg 6120

aacuaaaaca ccaguuuccc cuggugaaau gagacugagg gaugaccaga ggaaagucuu 6180

cagagaacua gugaggaauu gugaccugcc cguuuggcuu ucguggcaag uggccaaggc 6240

ugguuugaag acgaaugauc guaaguggug uuuugaaggc ccugaggaac augagaucuu 6300

gaaugacagc ggugaaacag ugaagugcag ggcuccugga ggagcaaaga agccucugcg 6360

cccaaggugg ugugaugaaa gggugucauc ugaccagagu gcgcugucug aauuuauuaa 6420

guuugcugaa gguaggaggg gagcugcuga agugcuaguu gugcugagug aacucccuga 6480

uuuccuggcu aaaaaaggug gagaggcaau ggacaccauc aguguguuuc uccacucuga 6540

ggaaggcucu agggcuuacc gcaaugcacu aucaaugaug ccugaggcaa ugacaauagu 6600

caugcuguuu auacuggcug gacuccugac aucgggaaug gucaucuuuu ucaugucucc 6660

caaaggcauc aguagaaugu cuauggcgau gggcacaaug gccggcugug gauaucucau 6720

guuccuugga ggcgucaaac ccacucacau cuccuauauc augcucauau ucuuuguccu 6780

gauggugguu gugauccccg agccagggca acaaaggucc auccaagaca accaaguggc 6840

auaccucauu auuggcaucc ugacgcuggu uucagcggug gcagccaacg agcuaggcau 6900

gcuggagaaa accaaagagg accucuuugg gaagaagaac uuaauuccau cuagugcuuc 6960

acccuggagu uggccggauc uugaccugaa gccaggagcu gccuggacag uguacguugg 7020

cauuguuaca augcucucuc caauguugca ccacuggauc aaagucgaau auggcaaccu 7080

gucucugucu ggaauagccc agucagccuc aguccuuucu uucauggaca aggggauacc 7140

auucaugaag augaauaucu cggucauaau gcugcugguc aguggcugga auucaauaac 7200

agugaugccu cugcucugug gcauagggug cgccaugcuc cacuggucuc ucauuuuacc 7260

uggaaucaaa gcgcagcagu caaagcuugc acagagaagg guguuccaug gcguugccaa 7320

gaacccugug guugauggga auccaacagu ugacauugag gaagcuccug aaaugccugc 7380

ccuuuaugag aagaaacugg cucuauaucu ccuucuugcu cucagccuag cuucuguugc 7440

caugugcaga acgcccuuuu cauuggcuga aggcauuguc cuagcaucag cugccuuagg 7500

gccgcucaua gagggaaaca ccagccuucu uuggaaugga cccauggcug ucuccaugac 7560

aggagucaug cgggggaauc acuaugcuuu ugugggaguc auguacaauc uauggaagau 7620

gaaaacugga cgccggggga gcgcgaaugg aaaaacuuug ggugaagucu ggaagaggga 7680

acugaaucug uuggacaagc aacaguuuga guuguauaaa aggaccgaca uuguggaggu 7740

ggaucgugau acggcacgca ggcauuuggc cgaagggaag guggacaccg ggguggcggu 7800

cuccaggggg accgcaaagu uaaggugguu ccaugagcgu ggcuauguca agcuggaagg 7860

uagggugauu gaccuggggu guggccgcgg aggcuggugu uacuacgcug cugcgcaaaa 7920

ggaagugagu ggggucaaag gauuuacucu uggaagagac ggccaugaga aaccuaugaa 7980

ugugcaaagu cugggaugga acaucaucac cuucaaggac aaaacugaca uccaccgccu 8040

agaaccagug aaaugugaca cccuuuugug ugacauugga gagucaucau cgucaucggu 8100

cacagagggg gaaaggaccg ugagaguucu ugauacugua gaaaaauggc uggcuugugg 8160

gguugacaac uucuguguga agguguuagc uccauacaug ccagauguuc ucgagaaacu 8220

ggaauugcuc caaaggaggu uuggcggaac agugaucagg aacccucucu ccaggaauuc 8280

cacucaugaa auguacuacg ugucuggagc ccgcagcaau gucacauuua cugugaacca 8340

aacaucccgc cuccugauga ggagaaugag gcguccaacu ggaaaaguga cccuggaggc 8400

ugacgucauc cucccaauug ggacacgcag uguugagaca gacaagggac cccuggacaa 8460

agaggccaua gaagaaaggg uugagaggau aaaaucugag uacaugaccu cuugguuuua 8520

ugacaaugac aaccccuaca ggaccuggca cuacuguggc uccuauguca caaaaaccuc 8580

aggaagugcg gcgagcaugg uaaauggugu uauuaaaauu cugacauauc caugggacag 8640

gauagaggag gucacaagaa uggcaaugac ugacacaacc ccuuuuggac agcaaagagu 8700

guuuaaagaa aaaguugaca ccagagcaaa ggauccacca gcgggaacua ggaagaucau 8760

gaaaguuguc aacagguggc uguuccgcca ccuggccaga gaaaagagcc ccagacugug 8820

cacaaaggaa gaauuuauug caaaaguccg aagucaugca gccauuggag cuuaccugga 8880

agaacaagaa caguggaaga cugccaauga ggcuguccaa gacccaaagu ucugggaacu 8940

gguggaugaa gaaaggaagc ugcaccaaca aggcaggugu cggacuugug uguacaacau 9000

gauggggaaa agagagaaga agcugucaga guuugggaaa gcaaagggaa gccgugccau 9060

augguauaug uggcugggag cgcgguaucu ugaguuugag gcccugggau uccugaauga 9120

ggaccauugg gcuuccaggg aaaacucagg aggaggagug gaaggcauug gcuuacaaua 9180

ccuaggauau gugaucagag accuggcugc aauggauggu gguggauucu acgcggauga 9240

caccgcugga ugggacacgc gcaucacaga ggcagaccuu gaugaugaac aggagaucuu 9300

gaacuacaug agcccacauc acaaaaaacu ggcacaagca gugauggaaa ugacauacaa 9360

gaacaaagug gugaaagugu ugagaccagc cccagggggg aaagccuaca uggaugucau 9420

aagucgacga gaccagagag gauccgggca gguagugacu uaugcucuga acaccaucac 9480

caacuugaaa guccaauuga ucagaauggc agaagcagag auggugauac aucaccaaca 9540

uguucaagau ugugaugaau caguucugac caggcuggag gcauggcuca cugagcacgg 9600

auguaacaga cugaagagga uggcggugag uggagacgac uguguggucc ggcccaucga 9660

ugacagguuc ggccuggccc ugucccaucu caacgccaug uccaagguua gaaaggacau 9720

aucugaaugg cagccaucaa aaggguggaa ugauugggag aaugugcccu ucuguuccca 9780

ccacuuccau gaacuacagc ugaaggaugg caggaggauu guggugccuu gccgagaaca 9840

ggacgagcuc auugggagag gaaggguguc uccaggaaac ggcuggauga ucaaggaaac 9900

agcuugccuc agcaaagccu augccaacau guggucacug auguauuuuc acaaaaggga 9960

caugaggcua cugucauugg cuguuuccuc agcuguuccc accucauggg uuccacaagg 10020

acgcacaaca uggucgauuc augggaaagg ggaguggaug accacggaag acaugcuuga 10080

gguguggaac agaguaugga uaaccaacaa cccacacaug caggacaaga caauggugaa 10140

aaaauggaga gaugucccuu aucuaaccaa gagacaagac aagcugugcg gaucacugau 10200

uggaaugacc aauagggcca ccugggccuc ccacauccau uuagucaucc aucguauccg 10260

aacgcugauu ggacaggaga aauacacuga cuaccuaaca gucauggaca gguauucugu 10320

ggaugcugac cugcaacugg gugagcuuau cugaaacacc aucuaacagg aauaaccggg 10380

auacaaacca cggguggaga accggacucc ccacaaccug aaaccgggau auaaaccacg 10440

gcuggagaac cggacuccgc acuuaaaaug aaacagaaac cgggauaaaa acuacggaug 10500

gagaaccgga cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacu ccacacgagu 10560

uuugccacug cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa 10620

aaaccugguu ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc 10680

cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740

auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800

ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860

cu 10862

<210> 6

<211> 10833

<212> RNA

<213> 黄热病病毒

<220>

<223> YFV Asibi株的RNA序列

<400> 6

gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa acacauuugg 60

auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau gucuggucgu 120

aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg cuccuuguca 180

aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc aagagguguu 240

caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau cacggcccac 300

cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu aaggaaaguu 360

aagagagugg uggccaguuu gaugagagga uuguccucaa ggaaacgccg uucccaugau 420

guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg agugaccuug 480

gugcggaaaa acagaugguu gcuccuaaau gugacaucug aggaccucgg gaaaacauuc 540

ucugugggca caggcaacug cacaacaaac auuuuggaag ccaaguacug gugcccagac 600

ucaauggaau acaacugucc caaucucagu ccaagagagg agccagauga cauugauugc 660

uggugcuaug ggguggaaaa cguuagaguc gcauauggua agugugacuc agcaggcagg 720

ucuaggaggu caagaagggc cauugacuug ccuacgcaug aaaaccaugg uuugaagacc 780

cggcaagaaa aauggaugac uggaagaaug ggugaaaggc aacuccaaaa gauugagaga 840

uggcucguga ggaaccccuu uuuugcagug acagcucuga ccauugccua ccuuguggga 900

agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg uccggccuac 960

ucagcucacu gcauuggaau uacugacagg gauuucauug agggggugca uggaggaacu 1020

uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc ugacaagccu 1080

ucauuggaca ucucacuaga gacaguagcc auugauggac cugcugaggc gaggaaagug 1140

uguuacaaug caguucucac ucaugugaag auuaaugaca agugccccag cacuggagag 1200

gcccaccuag cugaagagaa cgaaggggac aaugcgugca agcgcacuua uucugauaga 1260

ggcuggggca auggcugugg ccuauuuggg aaagggagca uuguggcaug cgccaaauuc 1320

acuugugcca aauccaugag uuuguuugag guugaucaga ccaaaauuca guaugucauc 1380

agagcacaau ugcauguagg ggccaagcag gaaaauugga auaccgacau uaagacucuc 1440

aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gccgaguuca cuggguaugg aaaagcuaca 1500

cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacaucgc ugagauggaa 1560

aaagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc auggcagagu 1620

ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc uccgcaugcc 1680

gccacuauca gaguacuggc ccugggaaac caggaaggcu ccuugaaaac agcucuuacc 1740

ggcgcaauga ggguuacaaa ggacacaaau gacaacaacc uuuacaaacu acauggugga 1800

cauguuuccu gcagagugaa auugucagcu uugacacuca aggggacauc cuacaaaaug 1860

ugcacugaca aaaugucuuu ugucaagaac ccaacugaca cuggccaugg cacuguugug 1920

augcagguga aagugccaaa aggagccccc ugcaagauuc cagugauagu agcugaugau 1980

cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc cucaaccaau 2040

gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau uaucguuggg 2100

acaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau aggaaaguug 2160

uucacucaga ccaugaaagg cgcggaacgc cuggccguca ugggagacgc cgccugggau 2220

uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac gguguuuggc 2280

ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau caugggggcg 2340

guacucauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag caugaucuug 2400

guaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg augcgccauc 2460

aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag agacucugau 2520

gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc aucaauagug 2580

aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu ugagcaugag 2640

auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauucuug aggaaaacga gguggacauu 2700

ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc auuuuccaga 2760

auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu guucucccca 2820

gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug cccguuuuca 2880

aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu caccacacgc 2940

guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau cuugggugca 3000

gcggugaacg gaaaaaagag ugcccauggc ucuccaacau uuuggauggg aagucaugaa 3060

guaaauggga cauggaugau ccacaccuug gaggcauuag auuacaagga gugugagugg 3120

ccacugacac auacgauugg aacaucaguu gaagagagug aaauguucau gccgagauca 3180

aucggaggcc caguuagcuc ucacaaucau aucccuggau acaagguuca gacgaacgga 3240

ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac uagcgugauc 3300

auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga uagcgggaaa 3360

auuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu ccaugguagu 3420

gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag ccaucuggug 3480

cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu gagcaugaug 3540

auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaauguu gguuggagga 3600

guggugcucu ugggagcaau gcuggucggg caaguaacuc uccuugauuu gcugaaacuc 3660

acaguggcug ugggauugca uuuccaugag augaacaaug gaggagacgc cauguauaug 3720

gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg gcucaggacc 3780

cuauggagcc cucgggaacg ccuuguacug acccuaggag cagccauggu ggagauugcc 3840

uuggguggca ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu cugcauccug 3900

acaauaaaug cuguagcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu cauggcucug 3960

uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccacaa ugcucuuuug uaccgugguu 4020

aucauagggg uccuucacca gaacuccaag gacaccucca ugcagaagac uauaccucug 4080

guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg ccugugugca 4140

uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc acucgcagca 4200

gcuggucuag ugggagugcu ggcaggacug gcuuuucagg agauggagaa cuuccuuggu 4260

ccgauugcag uuggaggaau ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag gguggauggg 4320

cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau cagcggaagu 4380

uccgcccgcu augauguggc acucagugaa caaggggagu ucaagcugcu uucugaagag 4440

aaagugccau gggaccaggu ugugaugacc ucgcuggccu ugguuggggc ugccauucau 4500

ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg agcuaggaga 4560

aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca uugaggaaug ugaacaucug 4620

gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca gcgaggagug 4680

ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg agcuuuccuu 4740

gucaggaaug gcaagaaguu gauuccaucu ugggcuucag uaaaggaaga ccuugucgcc 4800

uaugguggcu cauggaaguu ggaaggcaga ugggauggag aggaagaggu ccaauugauc 4860

gcugcuguuc caggaaagaa cguggucaac guccagacaa aaccgagcuu guucaaagug 4920

aggaaugggg gagaaaucgg ggcugucgcu cuugacuauc cgaguggcac uucaggaucu 4980

ccuauuguua acaggaacgg agaggugauu gggcuguacg gcaauggcau ccuugucggu 5040

gacaacuccu ucguguccgc cauaucccag acugagguga aggaagaagg aaaggaggag 5100

cuccaagaga ucccgacaau gcuaaagaaa ggaaugacaa cuauccuuga uuuucauccu 5160

ggagcuggga agacaagacg uuuucuccca cagaucuugg ccgagugcgc acggagacgc 5220

uugcgcacuc uuguguuggc ccccaccagg guuguucuuu cugaaaugaa ggaggcuuuu 5280

cacggccugg acgugaaauu ccacacacag gcuuuuuccg cucacggcag cgggagagaa 5340

gucauugaug ccaugugcca ugccacccua acuuacagga uguuggaacc aacuaggguu 5400

guuaacuggg aagugaucau cauggaugaa gcccauuuuu uggauccagc uagcauagcc 5460

gccagagguu gggcagcgca cagagcuagg gcaaaugaaa gugcaacaau cuugaugaca 5520

gccacaccgc cugggacuag ugaugaauuu ccacauucaa auggugaaau agaagauguu 5580

caaacggaca uacccaguga gcccuggaac acagggcaug acuggauccu ggcugacaaa 5640

aggcccacgg caugguuccu uccauccauc agagcugcaa augucauggc ugccucuuug 5700

cguaaggcug gaaagagugu ggugguccug aacaggaaaa ccuuugagag agaauacccc 5760

acgauaaagc agaagaaacc ugacuuuaua uuggccacug acauagcuga aaugggagcc 5820

aaccuuugcg uggagcgagu gcuggauugc aggacggcuu uuaagccugu gcuuguggau 5880

gaagggagga agguggcaau aaaagggcca cuucgcaucu ccgcauccuc ugcugcucaa 5940

aggagggggc gcauugggag aaaucccaac agagauggag acucauacua cuauucugag 6000

ccuacaagug aagauaaugc ccaccacguc ugcugguugg aggccucaau gcucuuggac 6060

aacauggagg ugaggggugg aauggucgcc ccacucuaug gcguugaagg aacuaaaaca 6120

ccaguuuccc cuggugaaau gagacugagg gaugaccaga ggaaagucuu cagagaacua 6180

gugaggaauu gugaccugcc cguuuggcuu ucguggcaag uggccaaggc ugguuugaag 6240

acgaaugauc guaaguggug uuuugaaggc ccugaggaac augagaucuu gaaugacagc 6300

ggugaaacag ugaagugcag ggcuccugga ggagcaaaga agccucugcg cccaaggugg 6360

ugugaugaaa gggugucauc ugaccagagu gcgcugucug aauuuauuaa guuugcugaa 6420

gguaggaggg gagcugcgga agugcuaguu gugcugagug aacucccuga uuuccuggcu 6480

aaaaaaggug gagaggcaau ggauaccauc aguguguuuc uccacucuga ggaaggcucu 6540

agggcuuacc gcaaugcacu aucaaugaug ccugaggcaa ugacaauagu caugcuguuu 6600

auacuggcug gacuacugac aucgggaaug gucaucuuuu ucaugucucc caaaggcauc 6660

aguagaaugu cuauggcgau gggcacaaug gccggcugug gauaucucau guuccuugga 6720

ggcgucaaac ccacucacau cuccuauauc augcucauau ucuuuguccu gauggugguu 6780

gugauccccg agccagggca acaaaggucc auccaagaca accaaguggc auaccucauu 6840

auuggcaucc ugacgcuggu uucaguggug gcagccaacg agcuaggcau gcuggagaaa 6900

accaaagagg accucuuugg gaagaagaac uuaauuccau cuagugcuuc acccuggagu 6960

uggccggauc uugaccugaa gccaggagcu gccuggacag uguacguugg cauuguuaca 7020

augcucucuc caauguugca ccacuggauc aaagucgaau auggcaaccu gucucugucu 7080

ggaauagccc agucagccuc aguccuuucu uucauggaca aggggauacc auucaugaag 7140

augaauaucu cggucauaau acugcugguc aguggcugga auucaauaac agugaugccu 7200

cugcucugug gcauagggug cgccaugcuc cacuggucuc ucauuuuacc uggaaucaaa 7260

gcgcagcagu caaagcuugc acagagaagg guguuccaug gcguugccaa gaacccugug 7320

guugauggga auccaacagu ugacauugag gaagcuccug aaaugccugc ccuuuaugag 7380

aagaaacugg cucuauaucu ccuucuugcu cucagccuag cuucuguugc caugugcaga 7440

acgcccuuuu cauuggcuga aggcauuguc cuagcaucag cugccuuagg gccgcucaua 7500

gagggaaaca ccagccuucu uuggaaugga cccauggcug ucuccaugac aggagucaug 7560

cgggggaauu acuaugcuuu ugugggaguc auguacaauc uauggaagau gaaaacugga 7620

cgccggggga gugcgaaugg aaaaacuuug ggugaagucu ggaagaggga acugaaucug 7680

uuggacaagc aacaguuuga guuguauaaa aggaccgaca uuguggaggu ggaucgugau 7740

acggcacgca ggcauuuggc cgaagggaag guggacaccg ggguggcggu cuccaggggg 7800

accgcaaagu uaaggugguu ccaugagcgu ggcuauguca agcuggaagg uagggugauu 7860

gaccuggggu guggccgcgg aggcuggugu uacuacgcug cugcgcaaaa ggaagugagu 7920

ggggucaaag gauucacucu uggaagagac ggccaugaga aacccaugaa ugugcaaagu 7980

cugggaugga acaucauuac cuucaaggac aaaacugaua uccaccgccu agaaccagug 8040

aaaugugaca cccuuuugug ugacauugga gagucaucau cgucaucggu cacagagggg 8100

gaaaggaccg ugagaguucu ugauacugua gaaaaauggc uggcuugugg gguugacaac 8160

uucuguguga agguguuagc uccauacaug ccagauguuc ucgagaaacu ggaauugcuc 8220

caaaggaggu uuggcggaac agugaucagg aacccucucu ccaggaauuc cacucaugaa 8280

auguacuacg ugucuggagc ccgcagcaau gucacauuua cugugaacca aacaucccgc 8340

cuccugauga ggagaaugag gcguccaacu ggaaaaguga cccuggaggc ugacgucauc 8400

cucccaauug ggacacgcag uguugagaca gacaagggac cccuggacaa agaggccaua 8460

gaagaaaggg uugagaggau aaaaucugag uacaugaccu cuugguuuua ugacaaugac 8520

aaccccuaca ggaccuggca cuacuguggc uccuauguca caaaaaccuc aggaagugcg 8580

gcgagcaugg uaaauggugu uauuaaaauu cugacauacc caugggacag gauagaggag 8640

gucacaagaa uggcaaugac ugacacaacc ccuuuuggac agcaaagagu guuuaaagaa 8700

aaaguugaca ccagagcaaa ggauccacca gcgggaacua ggaagaucau gaaaguuguc 8760

aacagguggc uguuccgcca ccuggccaga gaaaagaacc ccagacugug cacaaaggaa 8820

gaauuuauug caaaaguccg aagucaugca gccauuggag cuuaccugga agaacaagaa 8880

caguggaaga cugccaauga ggcuguccaa gacccaaagu ucugggaacu gguggaugaa 8940

gaaaggaagc ugcaccaaca aggcaggugu cggacuugug uguacaacau gauggggaaa 9000

agagagaaga agcugucaga guuugggaaa gcaaagggaa gccgugccau augguauaug 9060

uggcugggag cgcgguaucu ugaguuugag gcccugggau uccugaauga ggaccauugg 9120

gcuuccaggg aaaacucagg aggaggagug gaaggcauug gcuuacaaua ccuaggauau 9180

gugaucagag accuggcugc aauggauggu gguggauucu acgcggauga caccgcugga 9240

ugggacacgc gcaucacaga ggcagaccuu gaugaugaac aggagaucuu gaacuacaug 9300

agcccacauc acaaaaaacu ggcacaagca gugauggaaa ugacauacaa gaacaaagug 9360

gugaaagugu ugagaccagc cccaggaggg aaagccuaca uggaugucau aagucgacga 9420

gaccagagag gauccgggca gguagugacu uaugcucuga acaccaucac caacuugaaa 9480

guccaauuga ucagaauggc agaagcagag auggugauac aucaccaaca uguucaagau 9540

ugugaugaau caguucugac caggcuggag gcauggcuca cugagcacgg auguaacaga 9600

cugaagagga uggcggugag uggagacgac uguguggucc ggcccaucga ugacagguuc 9660

ggccuggccc ugucccaucu caacgccaug uccaagguua gaaaggacau aucugaaugg 9720

cagccaucaa aaggguggaa ugauugggag aaugugcccu ucuguuccca ccacuuccau 9780

gaacuacagc ugaaggaugg caggaggauu guggugccuu gccgagaaca ggacgagcuc 9840

auugggagag gaaggguguc uccaggaaac ggcuggauga ucaaggaaac agcuugccuc 9900

agcaaagccu augccaacau guggucacug auguauuuuc acaaaaggga caugaggcua 9960

cugucauugg cuguuuccuc agcuguuccc accucauggg uuccacaagg acgcacaaca 10020

uggucgauuc augggaaagg ggaguggaug accacggaag acaugcuuga gguguggaac 10080

agaguaugga uaaccaacaa cccacacaug caggacaaga caauggugaa agaauggaga 10140

gaugucccuu aucuaaccaa gagacaagac aagcugugcg gaucacugau uggaaugacc 10200

aauagggcca ccugggccuc ccacauccau uuggucaucc aucguauccg aacgcugauu 10260

ggacaggaga aauauacuga cuaccuaaca gucauggaca gauauucugu ggaugcugac 10320

cugcaaccgg gugagcuuau cugaaacacc aucuaauagg aauaaccggg auacaaacca 10380

cggguggaga accggacucc ccacaacuug aaaccgggau auaaaccacg gcuggagaac 10440

cggacuccgc acuuaaaaug aaacagaaac cgggauaaaa acuacggaug gagaaccgga 10500

cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacu ccacacgagu uuugccacug 10560

cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa aaaccugguu 10620

ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc cucccacgug 10680

gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa auagugggac 10740

cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccagg ggucugugag 10800

cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu gga 10833

<210> 7

<211> 10862

<212> RNA

<213> 黄热病病毒

<220>

<223> YFV TV3112株的RNA序列

<400> 7

aguaaauccu gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa 60

acacauuugg auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau 120

gucuggucgu aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg 180

cuccuuguca aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc 240

aagagguguu caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau 300

cacagcccac cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu 360

aaggaaaguc aagagagugg uggccaguuu gaugagagga uuguccucaa ggaaacgccg 420

uucccaugau guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg 480

agugaccuug gugcggaaaa acagaugguu gcuccuaaau gugacaucug aggaccucgg 540

gaaaacauuc ucugugggca caggcaacug cacaacaaac auuuuggaag ccaaguacug 600

gugcccagac ucaauggaau acaacugucc caaucucagu ccaagagagg agccagauga 660

cauugauugc uggugcuaug ggguggaaaa cguuagaguc gcauauggua agugugacuc 720

agcaggcagg ucuaggaggu caagaagggc cauugacuug ccuacgcaug aaaaccaugg 780

uuugaagacc cggcaagaaa aauggaugac uggaagaaug ggugaaaggc aacuccaaaa 840

gauugagaga ugguucguga ggaaccccuu uuuugcagug acggcucuga ccauugccua 900

ccuuguggga agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg 960

uccggccuac ucagcucacu gcauuggaau uacugacagg gauuucauug agggggugca 1020

uggaggaacu uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc 1080

ugacaagccu ucauuggaca ucucacuaga gacaguagcc auugauagac cugcugaggu 1140

gaggaaagug uguuacaaug caguucucac ucaugugaag auuaaugaca agugccccag 1200

cacuggagag gcccaccuag cugaagagaa cgaaggggac aaugcgugca agcgcacuua 1260

uucugauaga ggcuggggca auggcugugg ccuauuuggg aaagggagca uuguggcaug 1320

cgccaaauuc acuugugcca aauccaugag uuuguuugag guugaucaga ccaaaauuca 1380

guaugucauc agagcacaau ugcauguugg ggccaagcag gaaaauugga cuaccgacau 1440

uaagacucuc aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gucgaguuca uuggguaugg 1500

aaaagcuaca cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacaucgc 1560

ugagauggaa acagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc 1620

auggcagagu ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc 1680

uccgcaugcc gccacuauca gaguacuggc ccugggaaac caggaaggcu ccuugaaaac 1740

agcucuuacu ggcgcaauga ggguuacaaa ggacacaaau gacaacaacc uuuacaaacu 1800

acauggugga cauguuucuu gcagagugaa auugucagcu uugacacuca aggggacauc 1860

cuacaaaaua ugcacugaca aaauguuuuu ugucaagaac ccaacugaca cuggccaugg 1920

cacuguugug augcagguga aagugucaaa aggagccccc ugcaggauuc cagugauagu 1980

agcugaugau cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc 2040

cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100

uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160

aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220

cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280

gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340

caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400

caugaucuug uuaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460

augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520

agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580

aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640

ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700

gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760

auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820

guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880

cccguuuuca aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu 2940

caccacacgc guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau 3000

cuugggugca gcggugaacg gaaaaaagag ugcccauggc ucuccaacau uuuggauggg 3060

aagucaugaa guaaauggga cauggaugau ccacaccuug gaggcauuag auuacaagga 3120

gugugagugg ccacugacac auacgauugg aacaucaguu gaagagagug aaauguucau 3180

gccgagauca aucggaggcc caguuagcuc ucacaaucau aucccuggau acaagguuca 3240

gacgaacgga ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac 3300

uagcgugauc auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga 3360

uagcgggaaa guuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu 3420

ccaugguagu gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag 3480

ccaucuggug cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu 3540

gagcaugaug auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaauguu 3600

gguuggagga guagugcucu ugggagcaau gcuggucggg caaguaacuc uccuugauuu 3660

gcugaaacuc acaguggcug ugggauugca uuuccaugag gugaacaaug gaggagacgc 3720

cauguauaug gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg 3780

gcucaggacc cuauggagcc cucgggaacg ccuugugcug acccuaggag cagccauggu 3840

ggagauugcc uuggguggcg ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu 3900

cugcauccug acaauaaaug cuguugcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu 3960

cauggcucug uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccgcaa uguucuuuug 4020

ugccgugguu aucauagggg uccuucacca gaauuucaag gacaccucca ugcagaagac 4080

uauaccucug guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg 4140

ccugugugca uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc 4200

acucgcagca gcuggucuag ugggagugcu ggcaggacug gcuuuucagg agauggagaa 4260

cuuccuuggu ccgauugcag uuggaggacu ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag 4320

gguggauggg cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau 4380

cagcgggagu uccgcccgcu augauguggc acucagugaa caaggggagu ucaagcugcu 4440

uucugaagag aaagugccau gggaccaggu ugugaugacc ucgcuggccu ugguuggggc 4500

ugcccuccau ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg 4560

agcuaggaga aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca ucgaggaaug 4620

ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca 4680

gcgaggagug ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg 4740

agcuuuccuu gucaggaaug gcaagaaguu gauuccaucu ugggcuucag uaaaggaaga 4800

ccuugucgcc uaugguggcu cauggaaguu ggaaggcaga ugggauggag aggaagaggu 4860

ccaguugauc gcggcuguuc caggaaagaa cguggucaac guccagacaa aaccgagcuu 4920

guucaaagug aggaaugggg gagaaaucgg ggcugucgcu cuugacuauc cgaguggcac 4980

uucaggaucu ccuauuguua acaggaacgg agaggugauu gggcuguacg gcaauggcau 5040

ccuugucggu gacaacuccu ucguguccgc cauaucccag acugagguga aggaagaagg 5100

aaaggaggag cuccaagaga ucccgacaau gcuaaagaaa ggaaugacaa cuguccuuga 5160

uuuucauccu ggagcuggga agacaagacg uuuccuccca cagaucuugg ccgagugcgc 5220

acggagacgc uugcgcacuc uuguguuggc ccccaccagg guuguucuuu cugaaaugaa 5280

ggaggcuuuu cacggccugg acgugaaauu ccacacacag gcuuuuuccg cucacggcag 5340

cgggagagaa gucauugaug cuaugugcca ugccacccua acuuacagga uguuggaacc 5400

aacuaggguu guuaacuggg aagugaucau uauggaugaa gcccauuuuu uggauccagc 5460

uagcauagcc gcuagagguu gggcagcgca cagagcuagg gcaaaugaaa gugcaacaau 5520

cuugaugaca gccacaccgc cugggacuag ugaugaauuu ccacauucaa auggugaaau 5580

agaagauguu caaacggaca uacccaguga gcccuggaac acagggcaug acuggauccu 5640

ggcugacaaa aggcccacgg caugguuccu uccauccauc agagcugcaa augucauggc 5700

ugccucuuug cguaaggcug gaaagagugu ggugguccug aacaggaaaa ccuuugagag 5760

agaauacccc acgauaaagc agaagaaacc ugacuuuaua uuggccacug acauagcuga 5820

aaugggagcc aaccuuugcg uggagcgagu gcuggauugc aggacggcuu uuaagccugu 5880

gcuuguggau gaagggagga agguggcaau aaaagggcca cuucguaucu ccgcauccuc 5940

ugcugcucaa aggagggggc gcauugggag aaaucccaac agagauggag acucauacua 6000

cuauucugag ccuacaagug aaaauaaugc ccaccacguc ugcugguugg aggccucaau 6060

gcucuuggac aacauggagg ugaggggugg aauggucgcc ccacucuaug gcguugaagg 6120

aacuaaaaca ccaguuuccc cuggugaaau gagacugagg gaugaccaga ggaaagucuu 6180

cagagaacua gugaggaauu gugaccugcc cguuuggcuu ucguggcaag uggccaaggc 6240

ugguuugaag acgaaugauc guaaguggug uuuugaaggc ccugaggaac augagaucuu 6300

gaaugacagc ggugaaacag ugaagugcag ggcuccugga ggagcaaaga agccucugcg 6360

cccaaggugg ugugaugaaa gggugucauc ugaccagagu gcgcugucug aauuuauuaa 6420

guuugcugaa gguaggaggg gagcugcuga agugcuaguu gugcugagug aacucccuga 6480

uuuccuggcu aaaaagggug gagaggcaau ggauaccauc aguguguuuc uccacucuga 6540

ggaaggcucu agggcuuacc gcaaugcacu aucaaugaug ccugaggcaa ugacaauagu 6600

caugcuguuu auacuggcug gacuacugac aucgggaaug gucaucuuuu ucaugucucc 6660

caaaggcauc aguagaaugu cuauggcgau gggcacaaug gccggcugug gauaucucau 6720

guuccuugga ggcgucaaac ccacucacau cuccuauauc augcucauau ucuuuguccu 6780

gauggugguu gugauccccg agccagggca acaaaggucc auccaagaca accaaguggc 6840

auaccucauu auuggcaucc ugacgcuggu uucagcggug gcagccaacg agcuaggcau 6900

gcuggagaaa accaaagagg accucuuugg gaagaagaac uuaauuccau cuagugcuuc 6960

acccuggagu uggccggauc uugaccugaa gccaggagcu gccuggacag uguacguugg 7020

cauuguuaca augcucucuc caauguugca ccacuggauc aaagucgaau auggcaaccu 7080

gucucugucu ggaauagccc agucagccuc aguccuuucu uucauggaca aggggauacc 7140

auucaugaag augaauaucu cggucauaau gcugcugguc aguggcugga auucaauaac 7200

agugaugccu cugcucugug gcauagggug cgccaugcuc cacuggucuc ucauuuuacc 7260

uggaaucaaa gcgcagcagu caaagcuugc acagagaagg guguuccaug gcguugccaa 7320

gaacccugug guugauggga auccaacagu ugacauugag gaagcuccug aaaugccugc 7380

ccuuuaugag aagaaacugg cucuauaucu ccuucuugcu cucagccuag cuucuguugc 7440

caugugcaga acgcccuuuu cauuggcuga aggcauuguc cuagcaucag cugcccuagg 7500

gccgcucaua gagggaaaca ccagccuucu uuggaaugga cccauggcug ucuccaugac 7560

aggagucaug agggggaauc acuaugcuuu ugugggaguc auguacaauc uauggaagau 7620

gaaaacugga cgccggggga gcgcgaaugg aaaaacuuug ggugaagucu ggaagaggga 7680

acugaaucug uuggacaagc gacaguuuga guuguauaaa aggaccgaca uuguggaggu 7740

ggaucgugau acggcacgca ggcauuuggc cgaagggaag guggacaccg ggguggcggu 7800

cuccaggggg accgcaaagu uaaggugguu ccaugagcgu ggcuauguca agcuggaagg 7860

uagggugauu gaccuggggu guggccgcgg aggcuggugu uacuacgcug cugcgcaaaa 7920

ggaagugagu ggggucaaag gauuuacucu uggaagagac ggccaugaga aacccaugaa 7980

ugugcaaagu cugggaugga acaucaucac cuucaaggac aaaacugaua uccaccgccu 8040

agaaccagug aaaugugaca cccuuuugug ugacauugga gagucaucau cgucaucggu 8100

cacagagggg gaaaggaccg ugagaguucu ugauacugua gaaaaauggc uggcuugugg 8160

gguugacaac uucuguguga agguguuagc uccauacaug ccagauguuc ucgagaaacu 8220

ggaauugcuc caaaggaggu uuggcggaac agugaucagg aacccucucu ccaggaauuc 8280

cacucaugaa auguacuacg ugucuggagc ccgcagcaau gucacauuua cugugaacca 8340

aacaucccgc cuccugauga ggagaaugag gcguccaacu ggaaaaguga cccuggaggc 8400

ugacgucauc cucccaauug ggacacgcag uguugagaca gacaagggac cccuggacaa 8460

agaggccaua gaagaaaggg uugagaggau aaaaucugag uacaugaccu cuugguuuua 8520

ugacaaugac aaccccuaca ggaccuggca cuacuguggc uccuauguca caaaaaccuc 8580

aggaagugcg gcgagcaugg uaaauggugu uauuaaaauu cugacauauc caugggacag 8640

gauagaggag gucacaagaa uggcaaugac ugacacaacc ccuuuuggac agcaaagagu 8700

guuuaaagaa aaaguugaca ccagagcaaa ggauccacca gcgggaacua ggaagaucau 8760

gaaaguuguc aacagguggc uguuccgcca ccuggccaga gaaaagaacc ccagacugug 8820

cacaaaggaa gaauuuauug caaaaguccg aagucaugca gccauuggag cuuaccugga 8880

agaacaagaa caguggaaga cugccaauga ggcuguccaa gacccaaagu ucugggaacu 8940

gguggaugaa gaaaggaagc ugcaccaaca aggcaggugu cggacuugug uguacaacau 9000

gauggggaaa agagagaaga agcugucaga guuugggaaa gcaaagggaa gccgugccau 9060

augguauaug uggcugggag cgcgguaucu ugaguuugag gcccugggau uccugaauga 9120

ggaccauugg gcuuccaggg aaaacucagg aggaggagug gaaggcauug gcuuacaaua 9180

ccuaggauau gugaucagag accuggcugc aauggauggu gguggauucu acgcggauga 9240

caccgcugga ugggacacgc gcaucacaga ggcagaccuu gaugaugaac aggagaucuu 9300

gaacuacaug agcccacauc acaaaaaacu ggcacaagca gugauggaaa ugacauacaa 9360

gaacaaagug gugaaagugu ugagaccagc cccaggaggg aaagccuaca uggaugucau 9420

aagucgacga gaccagagag gauccgggca gguagugacu uaugcucuga acaccaucac 9480

caacuugaaa guccaauuga ucagaauggc agaagcagag auggugauac aucaccaaca 9540

uguucaagau ugugaugaau caguucugac caggcuggag gcauggcuca cugagcacgg 9600

auguaacaga cugaagagga uggcggugag uggagacgac uguguggucc ggcccaucga 9660

ugacagguuc ggccuggccc ugucccaucu caacgccaug uccaagguua gaaaggacau 9720

aucugaaugg cagccaucaa aaggguggaa ugauugggag aaugugcccu ucuguuccca 9780

ccacuuccau gaacuacagc ugaaggaugg caggaggauu guggugccuu gccgagaaca 9840

ggacgagcuc auugggagag gaaggguguc uccaggaaac ggcuggauga ucaaggaaac 9900

agcuugccuc agcaaagccu augccaacau guggucacug auguauuuuc acaaaaggga 9960

caugaggcua cugucauugg cuguuuccuc agcuguuccc accucauggg uuccacaagg 10020

acgcacaaca uggucgauuc augggaaagg ggaguggaug accacggaag acaugcuuga 10080

gguguggaac agaguaugga uaaccaacaa cccacacaug caggacaaga caauggugaa 10140

aaaauggaga gaugucccuu aucuaaccaa gagacaagac aagcugugcg gaucacugau 10200

uggaaugacc aauagggcca ccugggccuc ccacauccau uuggucaucc aucguauccg 10260

aacgcugauu ggacaggaga aauacacuga cuaccuaaca gucauggaca gguauucugu 10320

ggaugcugac cugcaacugg gugagcuuau cugaaacacc aucuaacagg aauaaccggg 10380

auacaaacca cggguggaga accggacucc ccacaaccug aaaccgggau auaaaccacg 10440

gcuggagaac cggacuccgc acuuaaaaug aaacagaaac cgggauaaaa acuacggaug 10500

gagaaccgga cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacc ccacacgagu 10560

uuugccacug cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa 10620

aaaccugguu ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc 10680

cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740

auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800

ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860

cu 10862

<210> 8

<211> 10862

<212> RNA

<213> 黄热病病毒

<220>

<223> YFV TV3111株的RNA序列

<400> 8

aguaaauccu gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa 60

acacauuugg auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau 120

gucuggucgu aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg 180

cuccuuguca aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc 240

aagagguguu caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau 300

cacagcccac cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu 360

aaggaaaguc aagagagugg uggccaguuu gaugagagga uuguccucaa ggaaacgccg 420

uucccaugau guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg 480

agugaccuug gugcggaaaa acagaugguu gcuccuaaau gugacaucug aggaccucgg 540

gaaaacauuc ucugugggca caggcaacug cacaacaaac auuuuggaag ccaaguacug 600

gugcccagac ucaauggaau acaacugucc caaucucagu ccaagagagg agccagauga 660

cauugauugc uggugcuaug ggguggaaaa cguuagaguc gcauauggua agugugacuc 720

agcaggcagg ucuaggaggu caagaagggc cauugacuug ccuacgcaug aaaaccaugg 780

uuugaagacc cggcaagaaa aauggaugac uggaagaaug ggugaaaggc aacuccaaaa 840

gauugagaga ugguucguga ggaaccccuu uuuugcagug acggcucuga ccauugccua 900

ccuuguggga agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg 960

uccggccuac ucagcucacu gcauuggaau uacugacagg gauuucauug agggggugca 1020

uggaggaacu uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc 1080

ugacaagccu ucauuggaca ucucacuaga gacaguagcc auugauagac cugcugaggu 1140

gaggaaagug uguuacaaug caguucucac ucaugugaag auuaaugaca agugccccag 1200

cacuggagag gcccaccuag cugaagagaa cgaaggggac aaugcgugca agcgcacuua 1260

uucugauaga ggcuggggca auggcugugg ccuauuuggg aaagggagca uuguggcaug 1320

cgccaaauuc acuugugcca aauccaugag uuuguuugag guugaucaga ccaaaauuca 1380

guaugucauc agagcacaau ugcauguagg ggccaagcag gaaaauugga cuaccgacau 1440

uaagacucuc aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gucgaguuca uuggguaugg 1500

aaaagcuaca cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacaucgc 1560

ugagauggaa acagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc 1620

auggcagagu ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc 1680

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cuacaaaaua ugcacugaca aaauguuuuu ugucaagaac ccaacugaca cuggccaugg 1920

cacuguugug augcagguga aagugucaaa aggagccccc ugcaggauuc cagugauagu 1980

agcugaugau cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc 2040

cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100

uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160

aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220

cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280

gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340

caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400

caugaucuug uuaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460

augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520

agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580

aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640

ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700

gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760

auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820

guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880

cccguuuuca aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu 2940

caccacacgc guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau 3000

cuugggugca gcggugaacg gaaaaaagag ugcccauggc ucuccaacau uuuggauggg 3060

aagucaugaa guaaauggga cauggaugau ccacaccuug gaggcauuag auuacaagga 3120

gugugagugg ccacugacac auacgauugg aacaucaguu gaagagagug aaauguucau 3180

gccgagauca aucggaggcc caguuagcuc ucacaaucau aucccuggau acaagguuca 3240

gacgaacgga ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac 3300

uagcgugauc auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga 3360

uagcgggaaa guuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu 3420

ccaugguagu gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag 3480

ccaucuggug cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu 3540

gagcaugaug auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaauguu 3600

gguuggagga guagugcucu ugggagcaau gcuggucggg caaguaacuc uccuugauuu 3660

gcugaaacuc acaguggcug ugggauugca uuuccaugag gugaacaaug gaggagacgc 3720

cauguauaug gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg 3780

gcucaggacc cuauggagcc cucgggaacg ccuugugcug acccuaggag cagccauggu 3840

ggagauugcc uuggguggcg ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu 3900

cugcauccug acaauaaaug cuguugcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu 3960

cauggcucug uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccgcaa uguucuuuug 4020

ugccgugguu aucauagggg uccuucacca gaauuucaag gacaccucca ugcagaagac 4080

uauaccucug guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg 4140

ccugugugca uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc 4200

acucgcagca gcuggucuag ugggagugcu ggcaggacug gcuuuucagg agauggagaa 4260

cuuccuuggu ccgauugcag uuggaggacu ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag 4320

gguggauggg cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau 4380

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uucugaagag aaagugccau gggaccaggu ugugaugacc ucgcuggccu ugguuggggc 4500

ugcccuccau ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg 4560

agcuaggaga aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca ucgaggaaug 4620

ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca 4680

gcgaggagug ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg 4740

agcuuuccuu gucaggaaug gcaagaaguu gauuccaucu ugggcuucag uaaaggaaga 4800

ccuugucgcc uaugguggcu cauggaaguu ggaaggcaga ugggauggag aggaagaggu 4860

ccaguugauc gcggcuguuc caggaaagaa cguggucaac guccagacaa aaccgagcuu 4920

guucaaagug aggaaugggg gagaaaucgg ggcugucgcu cuugacuauc cgaguggcac 4980

uucaggaucu ccuauuguua acaggaacgg agaggugauu gggcuguacg gcaauggcau 5040

ccuugucggu gacaacuccu ucguguccgc cauaucccag acugagguga aggaagaagg 5100

aaaggaggag cuccaagaga ucccgacaau gcuaaagaaa ggaaugacaa cuguccuuga 5160

uuuucauccu ggagcuggga agacaagacg uuuccuccca cagaucuugg ccgagugcgc 5220

acggagacgc uugcgcacuc uuguguuggc ccccaccagg guuguucuuu cugaaaugaa 5280

ggaggcuuuu cacggccugg acgugaaauu ccacacacag gcuuuuuccg cucacggcag 5340

cgggagagaa gucauugaug cuaugugcca ugccacccua acuuacagga uguuggaacc 5400

aacuaggguu guuaacuggg aagugaucau uauggaugaa gcccauuuuu uggauccagc 5460

uagcauagcc gcuagagguu gggcagcgca cagagcuagg gcaaaugaaa gugcaacaau 5520

cuugaugaca gccacaccgc cugggacuag ugaugaauuu ccacauucaa auggugaaau 5580

agaagauguu caaacggaca uacccaguga gcccuggaac acagggcaug acuggauccu 5640

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ugccucuuug cguaaggcug gaaagagugu ggugguccug aacaggaaaa ccuuugagag 5760

agaauacccc acgauaaagc agaagaaacc ugacuuuaua uuggccacug acauagcuga 5820

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gcuuguggau gaagggagga agguggcaau aaaagggcca cuucguaucu ccgcauccuc 5940

ugcugcucaa aggagggggc gcauugggag aaaucccaac agagauggag acucauacua 6000

cuauucugag ccuacaagug aaaauaaugc ccaccacguc ugcugguugg aggccucaau 6060

gcucuuggac aacauggagg ugaggggugg aauggucgcc ccacucuaug gcguugaagg 6120

aacuaaaaca ccaguuuccc cuggugaaau gagacugagg gaugaccaga ggaaagucuu 6180

cagagaacua gugaggaauu gugaccugcc cguuuggcuu ucguggcaag uggccaaggc 6240

ugguuugaag acgaaugauc guaaguggug uuuugaaggc ccugaggaac augagaucuu 6300

gaaugacagc ggugaaacag ugaagugcag ggcuccugga ggagcaaaga agccucugcg 6360

cccaaggugg ugugaugaaa gggugucauc ugaccagagu gcgcugucug aauuuauuaa 6420

guuugcugaa gguaggaggg gagcugcuga agugcuaguu gugcugagug aacucccuga 6480

uuuccuggcu aaaaagggug gagaggcaau ggauaccauc aguguguuuc uccacucuga 6540

ggaaggcucu agggcuuacc gcaaugcacu aucaaugaug ccugaggcaa ugacaauagu 6600

caugcuguuu auacuggcug gacuacugac aucgggaaug gucaucuuuu ucaugucucc 6660

caaaggcauc aguagaaugu cuauggcgau gggcacaaug gccggcugug gauaucucau 6720

guuccuugga ggcgucaaac ccacucacau cuccuauauc augcucauau ucuuuguccu 6780

gauggugguu gugauccccg agccagggca acaaaggucc auccaagaca accaaguggc 6840

auaccucauu auuggcaucc ugacgcuggu uucagcggug gcagccaacg agcuaggcau 6900

gcuggagaaa accaaagagg accucuuugg gaagaagaac uuaauuccau cuagugcuuc 6960

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gucucugucu ggaauagccc agucagccuc aguccuuucu uucauggaca aggggauacc 7140

auucaugaag augaauaucu cggucauaau gcugcugguc aguggcugga auucaauaac 7200

agugaugccu cugcucugug gcauagggug cgccaugcuc cacuggucuc ucauuuuacc 7260

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gaacccugug guugauggga auccaacagu ugacauugag gaagcuccug aaaugccugc 7380

ccuuuaugag aagaaacugg cucuauaucu ccuucuugcu cucagccuag cuucuguugc 7440

caugugcaga acgcccuuuu cauuggcuga aggcauuguc cuagcaucag cugcccuagg 7500

gccgcucaua gagggaaaca ccagccuucu uuggaaugga cccauggcug ucuccaugac 7560

aggagucaug agggggaauc acuaugcuuu ugugggaguc auguacaauc uauggaagau 7620

gaaaacugga cgccggggga gcgcgaaugg aaaaacuuug ggugaagucu ggaagaggga 7680

acugaaucug uuggacaagc gacaguuuga guuguauaaa aggaccgaca uuguggaggu 7740

ggaucgugau acggcacgca ggcauuuggc cgaagggaag guggacaccg ggguggcggu 7800

cuccaggggg accgcaaagu uaaggugguu ccaugagcgu ggcuauguca agcuggaagg 7860

uagggugauu gaccuggggu guggccgcgg aggcuggugu uacuacgcug cugcgcaaaa 7920

ggaagugagu ggggucaaag gauuuacucu uggaagagac ggccaugaga aacccaugaa 7980

ugugcaaagu cugggaugga acaucaucac cuucaaggac aaaacugaua uccaccgccu 8040

agaaccagug aaaugugaca cccuuuugug ugacauugga gagucaucau cgucaucggu 8100

cacagagggg gaaaggaccg ugagaguucu ugauacugua gaaaaauggc uggcuugugg 8160

gguugacaac uucuguguga agguguuagc uccauacaug ccagauguuc ucgagaaacu 8220

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cacucaugaa auguacuacg ugucuggagc ccgcagcaau gucacauuua cugugaacca 8340

aacaucccgc cuccugauga ggagaaugag gcguccaacu ggaaaaguga cccuggaggc 8400

ugacgucauc cucccaauug ggacacgcag uguugagaca gacaagggac cccuggacaa 8460

agaggccaua gaagaaaggg uugagaggau aaaaucugag uacaugaccu cuugguuuua 8520

ugacaaugac aaccccuaca ggaccuggca cuacuguggc uccuauguca caaaaaccuc 8580

aggaagugcg gcgagcaugg uaaauggugu uauuaaaauu cugacauauc caugggacag 8640

gauagaggag gucacaagaa uggcaaugac ugacacaacc ccuuuuggac agcaaagagu 8700

guuuaaagaa aaaguugaca ccagagcaaa ggauccacca gcgggaacua ggaagaucau 8760

gaaaguuguc aacagguggc uguuccgcca ccuggccaga gaaaagaacc ccagacugug 8820

cacaaaggaa gaauuuauug caaaaguccg aagucaugca gccauuggag cuuaccugga 8880

agaacaagaa caguggaaga cugccaauga ggcuguccaa gacccaaagu ucugggaacu 8940

gguggaugaa gaaaggaagc ugcaccaaca aggcaggugu cggacuugug uguacaacau 9000

gauggggaaa agagagaaga agcugucaga guuugggaaa gcaaagggaa gccgugccau 9060

augguauaug uggcugggag cgcgguaucu ugaguuugag gcccugggau uccugaauga 9120

ggaccauugg gcuuccaggg aaaacucagg aggaggagug gaaggcauug gcuuacaaua 9180

ccuaggauau gugaucagag accuggcugc aauggauggu gguggauucu acgcggauga 9240

caccgcugga ugggacacgc gcaucacaga ggcagaccuu gaugaugaac aggagaucuu 9300

gaacuacaug agcccacauc acaaaaaacu ggcacaagca gugauggaaa ugacauacaa 9360

gaacaaagug gugaaagugu ugagaccagc cccaggaggg aaagccuaca uggaugucau 9420

aagucgacga gaccagagag gauccgggca gguagugacu uaugcucuga acaccaucac 9480

caacuugaaa guccaauuga ucagaauggc agaagcagag auggugauac aucaccaaca 9540

uguucaagau ugugaugaau caguucugac caggcuggag gcauggcuca cugagcacgg 9600

auguaacaga cugaagagga uggcggugag uggagacgac uguguggucc ggcccaucga 9660

ugacagguuc ggccuggccc ugucccaucu caacgccaug uccaagguua gaaaggacau 9720

aucugaaugg cagccaucaa aaggguggaa ugauugggag aaugugcccu ucuguuccca 9780

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caugaggcua cugucauugg cuguuuccuc agcuguuccc accucauggg uuccacaagg 10020

acgcacaaca uggucgauuc augggaaagg ggaguggaug accacggaag acaugcuuga 10080

gguguggaac agaguaugga uaaccaacaa cccacacaug caggacaaga caauggugaa 10140

aaaauggaga gaugucccuu aucuaaccaa gagacaagac aagcugugcg gaucacugau 10200

uggaaugacc aauagggcca ccugggccuc ccacauccau uuggucaucc aucguauccg 10260

aacgcugauu ggacaggaga aauacacuga cuaccuaaca gucauggaca gguauucugu 10320

ggaugcugac cugcaacugg gugagcuuau cugaaacacc aucuaacagg aauaaccggg 10380

auacaaacca cggguggaga accggacucc ccacaaccug aaaccgggau auaaaccacg 10440

gcuggagaac cggacuccgc acuuaaaaug aaacagaaac cgggauaaaa acuacggaug 10500

gagaaccgga cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacc ccacacgagu 10560

uuugccacug cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa 10620

aaaccugguu ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc 10680

cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740

auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800

ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860

cu 10862

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA引物

<400> 9

gctaggcaat aaacacattt gga 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA引物

<400> 10

ttcactggga tactccttcg c 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA引物

<400> 11

atcaaatacc atcttgcccc tc 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA引物

<400> 12

agtaaatcct ttgaccccac t 21

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA引物

<400> 13

ggcttaccgc aatgcact 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA引物

<400> 14

cagagaacca ctccggtc 18

<210> 15

<211> 493

<212> PRT

<213> 黄热病病毒

<220>

<223> YFV TV3111或TV3112株的包膜蛋白的序列

<400> 15

Ala His Cys Ile Gly Ile Thr Asp Arg Asp Phe Ile Glu Gly Val His

1 5 10 15

Gly Gly Thr Trp Val Ser Ala Thr Leu Glu Gln Asp Lys Cys Val Thr

20 25 30

Val Met Ala Pro Asp Lys Pro Ser Leu Asp Ile Ser Leu Glu Thr Val

35 40 45

Ala Ile Asp Arg Pro Ala Glu Val Arg Lys Val Cys Tyr Asn Ala Val

50 55 60

Leu Thr His Val Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr Gly Glu Ala

65 70 75 80

His Leu Ala Glu Glu Asn Glu Gly Asp Asn Ala Cys Lys Arg Thr Tyr

85 90 95

Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser

100 105 110

Ile Val Ala Cys Ala Lys Phe Thr Cys Ala Lys Ser Met Ser Leu Phe

115 120 125

Glu Val Asp Gln Thr Lys Ile Gln Tyr Val Ile Arg Ala Gln Leu His

130 135 140

Val Gly Ala Lys Gln Glu Asn Trp Thr Thr Asp Ile Lys Thr Leu Lys

145 150 155 160

Phe Asp Ala Leu Ser Gly Ser Gln Glu Val Glu Phe Ile Gly Tyr Gly

165 170 175

Lys Ala Thr Leu Glu Cys Gln Val Gln Thr Ala Val Asp Phe Gly Asn

180 185 190

Ser Tyr Ile Ala Glu Met Glu Thr Glu Ser Trp Ile Val Asp Arg Gln

195 200 205

Trp Ala Gln Asp Leu Thr Leu Pro Trp Gln Ser Gly Ser Gly Gly Val

210 215 220

Trp Arg Glu Met His His Leu Val Glu Phe Glu Pro Pro His Ala Ala

225 230 235 240

Thr Ile Arg Val Leu Ala Leu Gly Asn Gln Glu Gly Ser Leu Lys Thr

245 250 255

Ala Leu Thr Gly Ala Met Arg Val Thr Lys Asp Thr Asn Asp Asn Asn

260 265 270

Leu Tyr Lys Leu His Gly Gly His Val Ser Cys Arg Val Lys Leu Ser

275 280 285

Ala Leu Thr Leu Lys Gly Thr Ser Tyr Lys Ile Cys Thr Asp Lys Met

290 295 300

Phe Phe Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met

305 310 315 320

Gln Val Lys Val Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile Val

325 330 335

Ala Asp Asp Leu Thr Ala Ala Ile Asn Lys Gly Ile Leu Val Thr Val

340 345 350

Asn Pro Ile Ala Ser Thr Asn Asp Asp Glu Val Leu Ile Glu Val Asn

355 360 365

Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly Arg Gly Asp Ser Arg

370 375 380

Leu Thr Tyr Gln Trp His Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys Leu Phe

385 390 395 400

Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val Met Gly Asp Thr

405 410 415

Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr Ser Val Gly Lys

420 425 430

Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly Leu Phe Gly Gly

435 440 445

Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile Trp Val

450 455 460

Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Leu

465 470 475 480

Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala

485 490

<210> 16

<211> 224

<212> PRT

<213> 黄热病病毒

<220>

<223> YFV TV3111或TV3112株的NS2a蛋白的序列

<400> 16

Gly Glu Ile His Ala Val Pro Phe Gly Leu Val Ser Met Met Ile Ala

1 5 10 15

Met Glu Val Val Leu Arg Lys Arg Gln Gly Pro Lys Gln Met Leu Val

20 25 30

Gly Gly Val Val Leu Leu Gly Ala Met Leu Val Gly Gln Val Thr Leu

35 40 45

Leu Asp Leu Leu Lys Leu Thr Val Ala Val Gly Leu His Phe His Glu

50 55 60

Val Asn Asn Gly Gly Asp Ala Met Tyr Met Ala Leu Ile Ala Ala Phe

65 70 75 80

Ser Ile Arg Pro Gly Leu Leu Ile Gly Phe Gly Leu Arg Thr Leu Trp

85 90 95

Ser Pro Arg Glu Arg Leu Val Leu Thr Leu Gly Ala Ala Met Val Glu

100 105 110

Ile Ala Leu Gly Gly Val Met Gly Gly Leu Trp Lys Tyr Leu Asn Ala

115 120 125

Val Ser Leu Cys Ile Leu Thr Ile Asn Ala Val Ala Ser Arg Lys Ala

130 135 140

Ser Asn Thr Ile Leu Pro Leu Met Ala Leu Leu Thr Pro Val Thr Met

145 150 155 160

Ala Glu Val Arg Leu Ala Ala Met Phe Phe Cys Ala Val Val Ile Ile

165 170 175

Gly Val Leu His Gln Asn Phe Lys Asp Thr Ser Met Gln Lys Thr Ile

180 185 190

Pro Leu Val Ala Leu Thr Leu Thr Ser Tyr Leu Gly Leu Thr Gln Pro

195 200 205

Phe Leu Gly Leu Cys Ala Phe Leu Ala Thr Arg Ile Phe Gly Arg Arg

210 215 220

<210> 17

<211> 378

<212> RNA

<213> 黄热病病毒

<220>

<223> 编码YFV TV3112株的NS4a蛋白的RNA序列

<400> 17

ggagcugcug aagugcuagu ugugcugagu gaacucccug auuuccuggc uaaaaagggu 60

ggagaggcaa uggauaccau caguguguuu cuccacucug aggaaggcuc uagggcuuac 120

cgcaaugcac uaucaaugau gccugaggca augacaauag ucaugcuguu uauacuggcu 180

ggacuacuga caucgggaau ggucaucuuu uucaugucuc ccaaaggcau caguagaaug 240

ucuauggcga ugggcacaau ggccggcugu ggauaucuca uguuccuugg aggcgucaaa 300

cccacucaca ucuccuauau caugcucaua uucuuugucc ugaugguggu ugugaucccc 360

gagccagggc aacaaagg 378

<210> 18

<211> 1479

<212> RNA

<213> 黄热病病毒

<220>

<223> 编码YFV TV3112株的包膜蛋白的RNA序列

<400> 18

gcucacugca uuggaauuac ugacagggau uucauugagg gggugcaugg aggaacuugg 60

guuucagcua cccuggagca agacaagugu gucacuguua uggccccuga caagccuuca 120

uuggacaucu cacuagagac aguagccauu gauagaccug cugaggugag gaaagugugu 180

uacaaugcag uucucacuca ugugaagauu aaugacaagu gccccagcac uggagaggcc 240

caccuagcug aagagaacga aggggacaau gcgugcaagc gcacuuauuc ugauagaggc 300

uggggcaaug gcuguggccu auuugggaaa gggagcauug uggcaugcgc caaauucacu 360

ugugccaaau ccaugaguuu guuugagguu gaucagacca aaauucagua ugucaucaga 420

gcacaauugc auguuggggc caagcaggaa aauuggacua ccgacauuaa gacucucaag 480

uuugaugccc ugucaggcuc ccaggaaguc gaguucauug gguauggaaa agcuacacug 540

gaaugccagg ugcaaacugc gguggacuuu gguaacaguu acaucgcuga gauggaaaca 600

gagagcugga uaguggacag acagugggcc caggacuuga cccugccaug gcagagugga 660

aguggcgggg uguggagaga gaugcaucau cuugucgaau uugaaccucc gcaugccgcc 720

acuaucagag uacuggcccu gggaaaccag gaaggcuccu ugaaaacagc ucuuacuggc 780

gcaaugaggg uuacaaagga cacaaaugac aacaaccuuu acaaacuaca ugguggacau 840

guuucuugca gagugaaauu gucagcuuug acacucaagg ggacauccua caaaauaugc 900

acugacaaaa uguuuuuugu caagaaccca acugacacug gccauggcac uguugugaug 960

caggugaaag ugucaaaagg agcccccugc aggauuccag ugauaguagc ugaugaucuu 1020

acagcggcaa ucaauaaagg cauuuugguu acaguuaacc ccaucgccuc aaccaaugau 1080

gaugaagugc ugauugaggu gaacccaccu uuuggagaca gcuacauuau cguugggaga 1140

ggagauucac gucucacuua ccaguggcac aaagagggaa gcucaauagg aaaguuguuc 1200

acucagacca ugaaaggcgu ggaacgccug gccgucaugg gagacaccgc cugggauuuc 1260

agcuccgcug gaggguucuu cacuucgguu gggaaaggaa uucauacggu guuuggcucu 1320

gccuuucagg ggcuauuugg cggcuugaac uggauaacaa aggucaucau gggggcggua 1380

cuuauauggg uuggcaucaa cacaagaaac augacaaugu ccaugagcau gaucuuguua 1440

ggagugauca ugauguuuuu gucucuagga guuggggcg 1479

Claims (25)

1.一种适应在Vero细胞上生长的减毒活黄热病病毒株，其来自不适应在Vero细胞上生长的亲代黄热病病毒17D亚株，其中所述减毒活黄热病病毒株的神经毒力小于所述亲代黄热病病毒17D亚株。

2.根据权利要求1所述的减毒活黄热病病毒株，其中所述亲代黄热病病毒株是适应在卵上生长的减毒活黄热病病毒株。

3.根据权利要求1或2所述的减毒活黄热病病毒株，其中所述亲代黄热病病毒株是黄热病病毒17D-204亚株。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的减毒活黄热病病毒株，其中所述亲代黄热病病毒17D亚株包含SEQ ID NO.2的RNA序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的减毒活黄热病病毒株，其中所述减毒活黄热病病毒株在小鼠致死剂量50(MLD₅₀)测试中的神经毒力小于所述亲代黄热病病毒17D亚株。

6.一种减毒活黄热病病毒株，其包含含有下列的核酸：

i)在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸由缬氨酸变成亮氨酸，或

ii)在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸由甲硫氨酸变成缬氨酸。

7.根据权利要求6所述的减毒活黄热病病毒株，其包含含有下列的核酸：

i)在包膜蛋白(E)的位置480处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸由缬氨酸变成亮氨酸，和

ii)在非结构蛋白2A(NS2a)的位置65处的氨基酸的密码子中的突变，其造成氨基酸由甲硫氨酸变成缬氨酸。

8.根据权利要求6或7所述的减毒活黄热病病毒株，其中该核酸进一步包含在非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变，该突变造成密码子从AAA变成AAG。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的减毒活黄热病病毒株，其中该核酸进一步包含在包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中的突变，该突变造成密码子从GUA变成GUU。

10.一种减毒活黄热病病毒株，其包含含有在位置480处的突变的包膜蛋白，该突变造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸。

11.一种减毒活黄热病病毒株，其包含在对应于SEQ ID NO.15的位置480的蛋白质内的位置处含有亮氨酸残基的包膜蛋白。

12.根据权利要求11所述的减毒活黄热病病毒株，其中该包膜蛋白包含与SEQ IDNO.15的序列至少90％、95％、98％或100％同一的序列。

13.一种减毒活黄热病病毒株，其包含编码下列的核酸分子：

(i)在位置480处包含突变的包膜蛋白，所述突变造成氨基酸从缬氨酸变成亮氨酸，和

(ii)在位置65处包含突变的NS2a蛋白，所述突变造成氨基酸从甲硫氨酸变成缬氨酸。

14.根据权利要求13所述的减毒活黄热病病毒株，其中所述核酸进一步包含在非结构蛋白4A(NS4a)的位置19处的氨基酸的密码子中的突变，所述突变造成密码子从AAA变成AAG。

15.根据权利要求13或14所述的减毒活黄热病病毒株，其中所述核酸进一步包含在包膜蛋白(E)的位置145处的氨基酸的密码子中的突变，所述突变造成密码子从GUA变成GUU。

16.一种减毒活黄热病病毒株，其包含编码下列的核酸分子：

(i)在对应于SEQ ID NO.15的位置480的蛋白质内的位置处包含亮氨酸残基的包膜蛋白；和

(ii)在对应于SEQ ID NO.16的位置65的蛋白质内的位置处包含缬氨酸残基的NS2a蛋白。

17.根据权利要求16所述的减毒活黄热病病毒株，其中所述包膜蛋白包含与SEQ IDNO.15的序列至少90％、95％、98％或100％同一的序列，而所述NS2a蛋白包含与SEQ IDNO.16的序列至少90％、95％、98％或100％同一的序列。

18.根据权利要求16或17所述的减毒活黄热病病毒株，其中在对应于SEQ ID NO.17的位置57的编码非结构蛋白4A(NS4a)的核酸内的位置处，所述核酸进一步包含G核苷酸。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的减毒活黄热病病毒株，其中在对应于SEQ IDNO.18的位置435的编码包膜蛋白(E)的核酸内的位置处，所述核酸进一步包含U核苷酸。

20.一种免疫原性组合物，包含根据权利要求1至19中任一项所述的减毒活黄热病病毒株及药学上可接受的运载体。

21.一种用于获得适应在Vero细胞上生长的减毒活黄热病病毒株的方法，其包括下列步骤：

-a)纯化亲代减毒活黄热病病毒株的病毒基因组RNA，所述亲代减毒活黄热病病毒株不适应在Vero细胞上生长，且任选地适应在卵上生长；

-b)用步骤a)中纯化的病毒基因组RNA转染Vero细胞，从而获得经转染Vero细胞；

-c)在培养基中培养步骤b)中获得的经转染Vero细胞，从而获得并进一步回收第一黄热病病毒群；

-d)在新鲜Vero细胞上将在步骤c)结束时获得的经回收第一黄热病病毒群扩增2次或更多次，从而获得第二黄热病病毒群；

-e)在Vero细胞上通过两个或更多个连续菌斑纯化，对在步骤d)中获得的第二黄热病病毒群进行克隆，从而获得多个黄热病病毒克隆；

-f)在新鲜Vero细胞上将在步骤e)结束时获得的每一个回收的黄热病病毒克隆分别扩增2次或更多次，从而获得多个黄热病病毒株；以及

-g)从在步骤f)中回收的所述多个黄热病病毒株选择一个或多个减毒活黄热病病毒株，其在小鼠致死剂量50(MLD₅₀)测试中的神经毒力小于亲代减毒活黄热病病毒株。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述培养基是无血清的，且任选地不含任何人类或动物衍生的物质。

23.一种可通过根据权利要求21或22中任一项所述的方法获得的减毒活黄热病病毒株。

24.一种根据权利要求1至19中任一项或权利要求23所述的减毒活黄热病病毒株，其用于制备疫苗。

25.一种包含根据权利要求1至19中任一项或权利要求23所述的减毒活黄热病病毒株的疫苗，其用于预防黄热病病毒感染。

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