KR20200140292A

KR20200140292A - Vero 세포에서 성장하도록 적응된 생약독화 황열병 바이러스 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물

Info

Publication number: KR20200140292A
Application number: KR1020207030059A
Authority: KR
Inventors: 마뉴엘 반게리스티; 나탈리 만텔; 이브스 지레르드-샴바즈; 파비엔 피라스
Original assignee: 사노피 파스퇴르
Priority date: 2018-04-06
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2020-12-15
Also published as: US11452772B2; US11471521B2; CO2020011984A2; AU2019249329A1; CA3095438A1; JP7370338B2; US20220047692A1; PE20210317A1; AR114471A1; EP3549603A1; TW202003028A; EP3773701A1; BR112020018879A2; SG11202009439YA; TWI835787B; RU2020136260A; WO2019192997A1; JP2021520384A; CN111918669A; ZA202006280B

Abstract

본 발명은, Vero 세포에서 성장하도록 적응되지 않은 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주로부터 Vero 세포에서 성장하도록 적응되고, 상기 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주보다 신경독성이 적은 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

Description

VERO 세포에서 성장하도록 적응된 생약독화 황열병 바이러스 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물

본 발명은 생약독화 황열병 바이러스(YFV) 균주 및 YFV 감염에 대한 백신 조성물의 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다.

특히, 생약독화 YFV 균주는 Vero 세포에서 성장하도록 적응된 것으로, Vero 세포에서 성장하도록 적응되지 않고 발육란에서 성장하도록 적응된 모체 생약독화 YFV 균주로부터 획득되었다. 생약독화 YFV 균주는 또한, 모체 생약독화 YFV 균주에 비해 감소된 신경독성을 특징으로 한다.

황열병은 아프리카, 중남미의 열대 지역의 50개국에 퍼져 있는 바이러스 매개성의 치명적인 질병이다.

황열병은 급성 바이러스 출혈성 질병으로, 일부 환자에서 황달이 발생하기 때문에 "황(yellow)"이라는 용어가 사용된다. 황열병의 특징적인 증상은 열, 두통, 황달, 근육통, 메스꺼움, 구토, 및 피로를 포함할 수 있다. 또한, 바이러스에 감염된 소수의 환자에서 심각한 증상이 나타나고, 이들 중 약 절반이 7~10일 내에 사망한다.

황열병 바이러스(YFV)는 플라비바이러스 계열에 속하며, 이 계열에 속하는 다른 바이러스로는 뎅기열 바이러스(DV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 진드기 매개 뇌염 바이러스(TBEV), 웨스트 나일 바이러스(WNV), 및 지카 바이러스(ZV)가 있다. YFV는 캡시드 단백질과 10862개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단일가닥 포지티브 센스 RNA로 구성된 뉴클레오캡시드를 둘러싸는 지단백질 외피로 이루어져 있다. 5' 비번역 영역(5' UTR)과 3' 비번역 영역(3' UTR) 사이에서, RNA는 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 3종의 구조 단백질, 즉 캡시드 단백질(C 단백질), 전막(premembrane)/막 단백질(prM/M 단백질), 및 외피 단백질(E 단백질), 그리고 8종의 비구조(NS) 단백질, 즉 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, P2k 펩티드, NS4B, 및 NS5 단백질을 인코딩한다.

야생형 YFV는 주로 아프리카에서 Aedes 종 모기에 의해, 남아메리카에서 Haemogogus 및 Sabethes 종에 의해 벡터화되며, 지역에 따라 차이가 있는 비인간 영장류 숙주가 존재한다. YFV 전염은 주로 두 가지 전염 패턴, 즉 (1) 도시 패턴 및 (2) 삼림 패턴(정글 또는 숲 순환형으로도 알려짐)에 따라 이루어진다. 두 가지 전염 패턴에도 불구하고, 하나의 임상 관련 질병만 확인되었으며, 이는 동일한 바이러스가 관련되어 있음을 나타낸다. 미국 대륙에서, YFV는 오늘날 매년 최대 수백 건의 비면역 삼림 노동자 감염 보고를 발생시키는 풍토병 삼림 패턴에 의해 순환된다. 동시에, 이 바이러스는 아프리카에서 도시 패턴과 삼림 패턴 모두에 의해 순환되며, 주기적으로 풍토병 패턴에서 벗어나 주요 전염병 과정에서 많은 수의 비면역자를 감염시킨다.

현재, 황열병에 대한 항바이러스제는 없으며, 백신접종이 질병 예방에 매우 중요하다. 이와 관련하여, 일찍이 1930년대에, 두 종류의 생약독화 YFV 백신이 개발되었다.

첫 번째 백신은, 야생형 프렌치 내장친화성 바이러스(FVV, 1928년 세네갈에서

Mayali로부터 분리)로부터 제조되어 마우스 뇌에서 계대된 프렌치 신경친화성 백신(FNV)에 해당한다. 그러나, FNV는 신경독성이 너무 강해 소아에서 백신접종후 뇌염의 발병 상황이 악화되는 것으로 빠르게 입증되었고, 1980년대 초에 폐기되었다(Barrett, 2017).

두 번째 접근법은, 야생형 균주 Asibi(1927년에 가나에서 경미한 인간 사례("Mr. Asibi")로부터 분리)로부터 제조되어 마우스와 닭 조직에서 계대된 "17D" 균주에 해당한다. 백신 균주 17D는 내장친화성 및 신경독성을 모두 잃었다(Monath, 2005).

현재, 6개국, 즉 브라질(17DD 하위균주), 중국(17D-204 하위균주), 프랑스(17D-204 하위균주 Stamaril®), 러시아(17D-213 하위균주), 세네갈(17D-204 하위균주), 및 미국(17D-204 하위균주 YF-VAX®)에서, 17D 균주에서 유래된 하위균주로부터 생약독화 YFV 백신 조성물을 생산하고 있다(Barrett, 2017).

지금까지, 현재 상용화된 모든 백신은 과거에 안정성 문제로 인해 복잡했던 생산 공정인 암탉 발육란에서 생산되고 있다(Barrett, 2017). 특히, 제조 문제로 인해 종종 YFV 백신이 부족하다. 실제로, 앙골라와 콩고 민주공화국에서 2016년 전염병 기간 동안, 이용 가능한 백신 로트의 부족으로 인해 비상 상황 대응을 위한 분할 용량이 처음으로 필요해졌다(Barrett, 2017). 또한, 암탉 발육란에서 생산된 YFV 백신은 계란 알레르기가 있는 사람에게는 사용이 금지되어 있다.

발육란을 기반으로 한 백신 생산에 대한 대안은 바이러스 계대에 적합한 세포주, 예컨대 포유류 세포주를 사용하는 것이다. 포유류 세포주 중에서, Vero 세포주는 바이러스 수율의 품질과 양에 있어서 안정성 및 문서에 의해 충분히 입증된 성능을 제공하면서 가장 많이 연구된 것 중 하나이다. Vero 세포는 FDA 승인을 받았고 전 세계적으로 사용되고 있다. 예를 들어, Vero 세포는 일본 뇌염에 대한 백신(IXIARO® 브랜드로 상용화됨)과 인플루엔자 바이러스, 폴리오바이러스, 및 광견병에 대한 백신의 제조에 사용되어 왔다.

Vero 세포를 이용해 YFV 백신을 제조하는 전략이 과거와 현재에 등장했지만, 이들 전략은 단지 비활성화 바이러스를 기반으로 YFV 백신을 제조할 수 있는 가능성에 집중되어 있다는 점을 언급할 필요가 있다(Hayes, 2010; Beasley et al., 2013; Pereira et al., 2015). 그럼에도 불구하고, 황열병 비활성화 백신이 이론적으로 더 안전해 보일 수 있지만, 현재의 생약독화 황열병 백신의 단회 용량에 의해 제공되는 장기간의 보호와 완전히 일치할 가능성은 적다(Hayes, 2010). 또한, 최근의 황열 전염병과 관련하여, 생약독화 백신은 풍토병 지역의 황열병에 대한 장기간 방어 면역의 인구 범위를 증가시키는 데 더 적합해 보인다.

백신에 사용하기 위한 생약독화 바이러스의 구체적인 제한은, 해당 질병으로부터 환자를 보호할 수 있을 만큼 면역원성을 유지하면서 약독화를 유지하는 것, 즉 황열병 바이러스가 신경독성 및 내장친화성 측면에서 적어도 현재 시판되고 있는 생약독화 황열병 백신만큼 약화되는 것이다. 이와 관련하여, 예를 들어 문헌[Monath, 2005]에서 볼 수 있듯이, 주어진 황열병 균주에 대해 두 가지 특성, 즉 약독화 및 면역원성을 모두 달성하는 것은 쉽지 않다.

따라서, 암탉 발육란을 기반으로 한 생약독화 YFV 백신 생산과 관련된 여러 단점으로 인해, 생약독화 YFV 백신을 제공하기 위한 대안적 제조 방법이 여전히 필요하다.

일 양태에서, 본 발명은, Vero 세포에서 성장하도록 적응되지 않은 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주로부터 Vero 세포에서 성장하도록 적응되고, 상기 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주보다 신경독성이 적은 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 또한, 하기 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

i) 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 또는

ii) 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이.

본 발명의 다른 양태는 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 480번 위치의 돌연변이를 포함하는 외피 단백질을 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 SEQ ID NO. 15의 480번 위치에 상응하는 단백질 내 위치에 류신 잔기를 포함하는 외피 단백질을 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 또한, 하기 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

(i) 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 480번 위치의 돌연변이를 포함하는 외피 단백질, 및

(ii) 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 65번 위치의 돌연변이를 포함하는 NS2a 단백질.

본 발명의 다른 양태는 하기 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

(i) SEQ ID NO. 15의 480번 위치에 상응하는 단백질 내 위치에 류신 잔기를 포함하는 외피 단백질, 및

(ii) SEQ ID NO. 16의 65번 위치에 상응하는 단백질 내 위치에 발린 잔기를 포함하는 NS2a 단백질.

본 발명의 다른 양태는 또한, 본 발명에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, Vero 세포에서 성장하도록 적응된 생약독화 황열병 바이러스 균주를 획득하는 방법으로서,

- a) Vero 세포에서 성장하도록 적응되지 않고, 선택적으로 계란에서 성장하도록 적응된 모체 생약독화 황열병 바이러스 균주의 바이러스 게놈 RNA를 정제하는 단계;

- b) 단계 a)에서 정제된 바이러스 게놈 RNA로 Vero 세포를 형질감염시켜 형질감염된 Vero 세포를 획득하는 단계;

- c) 단계 b)에서 획득한 형질감염된 Vero 세포를 배양 배지에서 성장시켜 제1 황열병 바이러스 개체군을 획득하고 추가로 회수하는 단계;

- d) 단계 c)의 마지막에 획득한 회수된 제1 황열병 바이러스 개체군을 새로운 Vero 세포에서 2회 이상 증폭하여 제2 황열병 바이러스 개체군을 획득하는 단계;

- e) 단계 d)에서 획득한 제2 황열병 바이러스 개체군을 Vero 세포에서 2회 이상의 연속 플라크 정제에 의해 클로닝하여 복수의 황열병 바이러스 클론을 획득하는 단계;

- f) 단계 e)의 마지막에 획득한 회수된 황열병 바이러스 클론 각각을 개별적으로 새로운 Vero 세포에서 2회 이상 증폭하여 복수의 황열병 바이러스 균주를 획득하는 단계; 및

- g) 단계 f)에서 회수된 상기 복수의 황열병 바이러스 균주로부터, 마우스 치사량 50(MLD₅₀) 시험에서 모체 생약독화 황열병 바이러스 균주보다 신경독성이 적은 하나 이상의 생약독화 황열병 바이러스 균주를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 획득 가능한 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 또한, 백신의 제조에 사용하기 위한 본 발명에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 황열병 바이러스 감염의 예방에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주를 포함하는 백신에 관한 것이다.

도 1: 예비마스터 시드 로트(pMSL) 단계에서, Vero 세포에서 성장하도록 적응된 생약독화 황열병 바이러스(vYF) 균주의 제조를 보여주는 다이어그램.
도 2: A129 마우스 모델에서의 내장친화성 검정을 보여주는 다이어그램.
도 3: PBS(흰색 바), Stamaril® 기준백신(흑색 바), Stamaril® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신(TV2212, TV2232, 및 TV2241; 진회색 바), 또는 YF-VAX® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신(TV3111, TV3112, 및 TV4221; 연회색 바)으로 D0에 면역화한 A129 마우스로부터 D4 및 D6에 채취된 혈청에서 YF-NS5 qRT-PCR로 측정된 바이러스혈증을 보여주는 플롯.
도 4: PBS(흰색 바), Stamaril® 기준백신(흑색 바), Stamaril® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신(TV2212, TV2232, 및 TV2241; 진회색 바), 또는 YF-VAX® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신(TV3111, TV3112, 및 TV4221; 연회색 바)으로 D0에 면역화한 A129 마우스로부터 D6 및 D11에 채취된 간 샘플에서 YF-NS5 qRT-PCR로 측정된 바이러스 수치(viral load)를 보여주는 플롯.
도 5: PBS(흰색 바), Stamaril® 기준백신(흑색 바), Stamaril® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신(TV2212, TV2232, 및 TV2241; 진회색 바), 또는 YF-VAX® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신(TV3111, TV3112, 및 TV4221; 연회색 바)으로 D0에 면역화한 A129 마우스로부터 D6 및 D11에 채취된 뇌 샘플에서 YF-NS5 qRT-PCR로 측정된 바이러스 수치를 보여주는 플롯.
도 6: PBS(흰색 바), Stamaril® 기준백신(흑색 바), Stamaril® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신(TV2212, TV2232, 및 TV2241; 진회색 바), 또는 YF-VAX® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신(TV3111, TV3112, 및 TV4221; 연회색 바)으로 D0에 면역화한 A129 마우스로부터 D6 및 D11에 채취된 비장 샘플에서 YF-NS5 qRT-PCR로 측정된 바이러스 수치를 보여주는 플롯.
도 7: Stamaril®, vYF 균주 TV221, TV2241, TV3111, TV3112, TV4221(점선), 또는 TV2232(실선)로 A129 마우스를 단회 면역화한 후의 카플란-마이어 생존 곡선을 보여주는 플롯.
도 8: 햄스터 모델에서의 면역원성 검정을 보여주는 다이어그램.
도 9: vYF 균주(TV2212, TV2232, TV2241, TV3111, TV3112, 및 TV4221) 또는 Stamaril® 기준백신의 용량당 2.5 또는 5.5 log₁₀ CCID₅₀으로 D0에 면역화한 햄스터로부터 D26에 채취된 혈청에서 Vero 세포에 대한 혈청중화 검정으로 측정된 생약독화 황열병 바이러스 균주에 특이적인 중화 항체 역가를 보여주는 플롯. 수평선은 응답체 임계치를 나타낸다.
도 10: vYF 균주(TV2212, TV2232, TV2241, TV3111, TV3112, 및 TV4221) 또는 Stamaril® 기준백신의 용량당 2.5 또는 5.5 log₁₀ CCID₅₀으로 D0 및 D26에 면역화한 햄스터로부터 D41에 채취된 혈청에서 Vero 세포에 대한 혈청중화 검정으로 측정된 생약독화 황열병 바이러스 균주에 특이적인 중화 항체 역가를 보여주는 플롯. 수평선은 응답체 임계치를 나타낸다.
도 11: 현재의 백신 Stamaril® 및 YF-VAX®와 비교하여, vYF 균주 TV3112로 백신접종한 원숭이의 중화 항체 반응을 보여주는 플롯. 수평선은 검출 한계를 나타낸다.
도 12: 현재의 기준백신 Stamaril® 및 YF-VAX®와 비교하여, 생약독화 vYF 균주 TV3112로 백신접종한 원숭이의 말초혈액에서 B 기억세포로부터의 YF-특이적 IgM 반응을 보여주는 플롯. 결과는 전체 IgM 개체군에서의 IgM 항체-분비 세포의 백분율로 표시된다.
도 13: 현재의 기준백신 Stamaril® 및 YF-VAX®와 비교하여, 생약독화 vYF 균주 TV3112로 백신접종한 원숭이의 말초혈액에서 B 기억세포로부터의 YF-특이적 IgG 반응을 보여주는 플롯. 결과는 전체 IgG 개체군에서의 IgG 항체-분비 세포의 백분율로 표시된다.
도 14: 현재의 백신 Stamaril® 및 YF-VAX®와 비교하여, 외피 단백질로 자극시(ENV; 좌측 패널) 또는 비구조 단백질 3으로 자극시(NS3; 우측 패널) vYF 균주 TV3112로 백신접종한 원숭이의 말초혈액에서의 IFN-γ(상단 패널) 및 IL-2(하단 패널) 특이적 T세포 반응을 보여주는 플롯.
도 15: 현재의 기준백신 Stamaril® 및 VAX®와 비교하여, 생약독화 vYF 균주 TV3112로 백신접종한 원숭이의 기관의 바이러스 수치를 보여주는 플롯. 연회색 바 및 원은 Stamaril®로 백신접종한 원숭이로부터의 결과를 나타내고, 중간회색 바 및 정사각형은 YF-VAX®로 백신접종한 원숭이로부터의 결과를 나타내고, 진회색 바 및 삼각형은 생약독화 vYF 균주 TV3112로 백신접종한 원숭이로부터의 결과를 나타낸다. 수평선은 검출 한계를 나타낸다.

본 발명은, 발육란에서 성장하도록 적응된 모체 생약독화 YFV 균주로부터 획득되어, Vero 세포에서 성장하도록 적응된 생약독화 YFV 균주를 제공한다. 생약독화 YFV 균주는 모체 생약독화 YFV 균주와 비교하여, 마우스 LD₅₀ 시험(MLD₅₀)에서의 감소된 신경독성을 위해 선별되었다.

본 발명에서 나타나는 바와 같이, Vero 세포에서 계대하여 YFV를 생산함으로써, 후속적으로 YF 감염에 대한 백신을 제조하는 데 적합한, 안정적이고, 재현성이 높고, 표준 품질이 높은 다량의 생약독화 YFV 균주를 제공할 수 있다.

＊ 기타 정의

본 발명의 범위 내에서, "YFV"는 황열병 바이러스와 관련이 있는 반면, 용어 "vYF"는 Vero 세포 적응 황열병 바이러스, 즉 Vero 세포에서 성장하도록 적응된 황열병 바이러스를 나타낸다.

따라서, 본 발명의 범위 내에서, "Vero 세포 적응 황열병 바이러스"(vYV)와 "Vero 세포에서 성장하도록 적응된 황열병 바이러스"는 상호교환 가능한 표현이다.

본 발명의 범위 내에서, Vero 세포에서 성장하도록 적응된 바이러스는 Vero 세포에서 최소 3회의 연속 계대를 거친 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 Vero 세포에서 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15회의 연속 계대를 거쳤다.

"계대"는 바이러스가 Vero 세포에서 적어도 한 번의 복제 주기를 거치는 임의의 단계, 특히 Vero 세포에서 바이러스를 형질감염시키거나, 증폭하거나, 클로닝하는 임의의 단계로 이해될 수 있다.

본원에 사용된 표현 "생약독화 황열병 바이러스"는 당업자에게 알려진 일반적인 의미를 갖는다. 일부 구현예에서, 이 표현은 약화된 신경독성 및/또는 약화된 내장친화성을 갖는 황열병 생바이러스를 의미한다.

본 발명의 범위 내에서, 용어 "신경독성"은, 혈뇌 장벽을 통과하고(신경 침습성), 뇌 조직에서 복제하고(신경친화성), 염증, 신경 손상, 및 뇌염을 유발하는(협의로는 신경독성) 바이러스의 능력을 의미하는 것이다.

본 발명의 범위 내에서, 용어 "내장친화성"은, 신경외 조직에서 복제하고, 바이러스혈증을 유발하고, 간을 포함한 중요한 기관을 손상시키는 바이러스의 능력을 의미한다(Monath, 2005).

일부 구현예에서, 상기 생약독화 황열병 바이러스는 적어도 현재 상용화된 생약독화 황열병 백신 균주(예를 들어, Stamaril® 또는 YF-VAX®) 중 하나만큼 약화된다.

일부 구현예에서, 상기 생약독화 황열병 바이러스는 적어도 현재 상용화된 생약독화 황열병 백신 균주(예를 들어, Stamaril® 또는 YF-VAX®) 중 하나만큼 약화된 신경독성을 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 생약독화 황열병 바이러스는 적어도 현재 상용화된 생약독화 황열병 백신 균주(예를 들어, Stamaril® 또는 YF-VAX®) 중 하나만큼 약화된 내장친화성을 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 생약독화 황열병 바이러스는 적어도 현재 상용화된 생약독화 황열병 백신 균주(예를 들어, Stamaril® 또는 YF-VAX®) 중 하나만큼 약화된 신경독성 및 내장친화성을 갖는다.

"포함하는"/"포함한다"/"포함된"이란 용어는 각각 "~로 이루어진"/"~로 이루어진다"/"~로 이루어진"을 포괄한다. 예를 들어, 성분 X를 "포함하는" 조성물은 성분 X로만 이루어지거나, 하나 이상의 추가 성분, 예를 들어 성분 X 및 성분 Y를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "CCID₅₀"은 50% 세포 배양물 감염량, 즉 단층 세포 배양물에서 종점 희석 검정으로 측정시, 접종된 복제 세포 배양물의 50%에서 세포변성 효과를 유발하기에 충분한 바이러스의 양을 의미한다.

세계 보건 기구(WHO)의 표준 정의에 따라, 본 발명은 아래 정의를 참조한다(WHO Technical report series, No. 872, 1998).

본원에 사용된 "마스터 시드 로트"("MSL") 또는 "1차 시드 로트"는 단일 생산 과정으로 처리되어 균일한 조성을 갖는 바이러스 현탁액의 양을 의미한다.

본원에 사용된 "작업 시드 로트"("WSL") 또는 "2차 시드 로트"는 단일 생산 과정으로 처리되어, 조성물에 대해 균일하고, 완전히 특성화되고, MSL로부터 1회만 계대된 바이러스 현탁액의 양을 의미한다. 본 발명의 범위 내에서, WSL에서 추출한 물질이 백신의 제조에서 발육란 또는 적합한 세포주를 접종하는 데 사용된다.

본원에 사용된 "플라크 형성 단위"(PFU)는 단층 세포 배양물에서 플라크를 생성하는 최소량의 바이러스 현탁액을 의미한다.

본원에 사용된 "중위 마우스 치사량"(마우스 LD₅₀ 또는 MLD₅₀)은 주사된 마우스의 50%를 사망시킬 바이러스 현탁액의 양을 의미한다.

＊ Vero 세포에서 성장하도록 적응된 생약독화 YFV ( Vero 세포 적응 YF 바이러스의 경우 " vYF 바이러스"라고도 함)

일 양태에서, 본 발명은, Vero 세포에서 성장하도록 적응되지 않은 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주로부터 Vero 세포에서 성장하도록 적응된 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 상기 생약독화 황열병 바이러스 균주는 상기 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주보다 신경독성이 적다.

일부 구현예에서, 모체 황열병 바이러스 균주는 계란에서 성장하도록 적응된 생약독화 황열병 바이러스 균주이다.

일부 구현예에서, 계란은 암탉 발육란이다.

"17D 하위균주"는 조상 17D 균주를 가진 황열병 균주이다.

"17D 균주"는 당업자에게 알려진 일반적인 의미를 갖는다. 일부 구현예에서, "17D 균주"는 문헌[Monath (2005)]에 기재된 바와 같이, 1927년 가나에서 경미한 인간 사례("Mr. Asibi")로부터 분리되어, 잘게 썬 쥣과 배아 조직에서 18회 계대된 후 잘게 썬 닭 배아 조직에서 58회 계대된 황열병 균주를 의미한다.

일부 구현예에서, 17D 하위균주는 문헌[Monath (2005)]에 기재된 바와 같은 17D-204 하위균주, 17DD 하위균주, 및/또는 17D-213 하위균주를 포괄한다. 예시적인 구현예에서, 1985년에 Rice 등에 의해 이전에 개시된 바와 같은 YFV 17D-204 균주(Genbank 등록 번호 X03700)의 RNA 서열은 RNA 서열 SEQ ID NO. 1로 표시될 수 있다.

일부 구현예에서, 모체 황열병 바이러스 균주는 황열병 바이러스 17D-204 하위균주이다.

일부 구현예에서, 모체 YFV 바이러스 균주는, 상용화된 백신 YF-VAX®에 사용되는 기준 YFV 균주인, YFV 17D-204 유래 YF-VAX® 균주이다.

예시적인 구현예에서, YFV 17D-204 유래 YF-VAX® 균주의 RNA 서열은 RNA 서열 SEQ ID NO. 2로 표시될 수 있다.

일부 구현예에서, 모체 YFV 바이러스 균주는, 상용화된 백신 Stamaril®에 사용되는 기준 YFV 균주인, YFV 17D-204 유래 Stamaril® 균주이다.

예시적인 구현예에서, YFV 17D-204 유래 Stamaril® 균주의 RNA 서열은 RNA 서열 SEQ ID NO. 3으로 표시될 수 있다.

예시적인 구현예에서, 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주는 SEQ ID NO. 2의 RNA 서열을 포함한다.

예시적인 구현예에서, 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주는 SEQ ID NO. 3의 RNA 서열을 포함한다.

예시적인 구현예에서, 1995년에 Dos Santos 등에 의해 이전에 개시된 바와 같은 YFV 17D-213 균주(Genbank 등록 번호 U17067)의 RNA 서열은 RNA 서열 SEQ ID NO. 4로 표시될 수 있고, 1995년에 Dos Santos 등에 의해 또한 이전에 개시된 바와 같은 YFV 17DD 균주(Genbank 등록 번호 U17066)의 RNA 서열은 RNA 서열 SEQ ID NO. 5로 표시될 수 있다.

예시적인 구현예에서, Asibi 균주(Genbank 등록 번호 KF769016)의 RNA 서열은 RNA 서열 SEQ ID NO. 6으로 표시될 수 있다.

일부 구현예에서, 생약독화 황열병 바이러스 균주는 마우스 치사량 50(MLD₅₀) 시험에서 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주보다 신경독성이 적다.

일부 구현예에서, 적합한 마우스 치사량 50(MLD₅₀) 시험은 (참조로 포함되는) WHO 기술 보고서 제872호(1998년)의 68 페이지에 개시된 프로토콜에 따라 수행된다.

본 발명의 범위 내에서, MLD₅₀은 뇌내 접종된 마우스의 50%에서 치명적인 특정 뇌염을 일으키는 것으로 추정되는 바이러스 현탁액의 양이다.

일부 구현예에서, 재구성된 백신의 적절한 연속 희석은 인산염 버퍼, 0.75%의 혈청 알부민에서 수행된다.

예시적인 구현예에서, 4~6주령 마우스에게 즉석 백신 희석액을 마취하에 뇌내 주사한다. 최소 6마리 마우스로 구성된 그룹이 각각의 희석에 사용되고, 일련의 희석은 0~100% 범위에 걸친 접종 후 사망률을 초래할 것이다. 사망의 발생은 21일의 기간에 걸쳐 기록된다. 무관한 원인으로 사망하는 마우스는 사망률 계산의 분자와 분모 모두에서 제거된다. 21일차에 마비된 마우스는 살아있는 것으로 계산된다.

특정 구현예에서, 마우스 치사량 50(MLD₅₀) 시험에서의 신경독성은 파라미터 log₁₀ MLD₅₀/mL로 측정될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주는 마우스 치사량 50(MLD₅₀) 시험에서 4 이하, 3.5 이하, 3 이하, 또는 2.5 이하의 log₁₀ MLD₅₀/mL를 달성한다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주는 Vero 세포에서 성장하도록 적응되고, 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주보다 신경독성이 적고, 적어도 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주만큼 내장친화성이 약화된다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주는 Vero 세포에서 성장하도록 적응되고, 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주보다 신경독성이 적고, 적어도 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주만큼 내장친화성이 약화되고, 적어도 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주만큼 면역원성이 있다.

다양한 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 뉴클레오티드가 돌연변이된 RNA 서열 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5를 포함하는 생약독화 YFV 균주를 제공한다.

본 발명의 범위 내에서, 표현 "하나 이상의 뉴클레오티드"는 2, 3, 4, 5개 이상의 뉴클레오티드를 포괄하는 것이다.

다시 말해, 표현 "하나 이상의 뉴클레오티드"는 1개의 뉴클레오티드, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개, 및 15개 이상의 뉴클레오티드를 포괄하는 것이다.

일부 구현예에서, 돌연변이는 뉴클레오티드 치환이다.

일부 다른 구현예에서, 돌연변이는 뉴클레오티드 삽입 및 뉴클레오티드 결실을 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 뉴클레오티드 치환은 침묵 치환이다. 대안적으로, 뉴클레오티드 치환은 아미노산 치환을 촉진할 수 있다.

일 구현예에서, RNA 서열 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5에서 2개의 뉴클레오티드가 돌연변이된다.

다른 구현예에서, RNA 서열 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5에서 3개의 뉴클레오티드가 돌연변이된다.

다른 구현예에서, RNA 서열 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5에서 4개의 뉴클레오티드가 돌연변이된다.

다른 구현예에서, RNA 서열 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5에서 5개의 뉴클레오티드가 돌연변이된다.

본 발명의 다른 양태는 또한, 적어도 2411번 위치, 3701번 위치, 또는 6496번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5로부터 선택되는 RNA 서열을 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 2411번 위치의 뉴클레오티드 및 3701번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5로부터 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 2411번 위치의 뉴클레오티드 및 6496번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5로부터 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 3701번 위치의 뉴클레오티드 및 6496번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5로부터 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 2411번 위치의 뉴클레오티드, 3701번 위치의 뉴클레오티드, 및 6496번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5로부터 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 2411번 위치의 뉴클레오티드 G(구아노신)가 뉴클레오티드 U(우리딘)로 치환된다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 3701번 위치의 뉴클레오티드 A(아데노신)가 뉴클레오티드 G(구아노신)로 치환된다.

특정 구현예에서, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 6496번 위치의 뉴클레오티드 A(아데노신)가 뉴클레오티드 G(구아노신)로 치환된다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는 다음과 같은 특징을 갖는다.

- (i) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 2411번 위치의 뉴클레오티드 G(구아노신)가 뉴클레오티드 U(우리딘)로 치환되고,

- (ii) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 3701번 위치의 뉴클레오티드 A(아데노신)가 뉴클레오티드 G(구아노신)로 치환됨.

일부 다른 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는 다음과 같은 특징을 갖는다.

- (ii) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 6496번 위치의 뉴클레오티드 A(아데노신)가 뉴클레오티드 G(구아노신)로 치환됨.

- (i) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 3701번 위치의 뉴클레오티드 A(아데노신)가 뉴클레오티드 G(구아노신)로 치환되고,

특정 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는 다음과 같은 특징을 갖는다.

- (ii) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 3701번 위치의 뉴클레오티드 A(아데노신)가 뉴클레오티드 G(구아노신)로 치환되고,

- (iii) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 6496번 위치의 뉴클레오티드 A(아데노신)가 뉴클레오티드 G(구아노신)로 치환됨.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 1408번 위치에 위치한 돌연변이를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 1408번 위치의 뉴클레오티드 및 2411번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5를 포함하는 군에서 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 1408번 위치의 뉴클레오티드 및 3701번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5를 포함하는 군에서 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 1408번 위치의 뉴클레오티드 및 6496번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5를 포함하는 군에서 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 1408번 위치의 뉴클레오티드, 2411번 위치의 뉴클레오티드, 및 3701번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5를 포함하는 군에서 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 1408번 위치의 뉴클레오티드, 2411번 위치의 뉴클레오티드, 및 6496번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5를 포함하는 군에서 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 1408번 위치의 뉴클레오티드, 3701번 위치의 뉴클레오티드, 및 6496번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5를 포함하는 군에서 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 YFV 균주는, 적어도 1408번 위치의 뉴클레오티드, 2411번 위치의 뉴클레오티드, 3701번 위치의 뉴클레오티드, 및 6496번 위치의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5를 포함하는 군에서 선택되는 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 1408번 위치의 뉴클레오티드 A(아데닌)가 뉴클레오티드 U(우리딘)로 치환된다.

- (iii) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 6496번 위치의 뉴클레오티드 A(아데노신)가 뉴클레오티드 G(구아노신)로 치환되고,

- (iv) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 1408번 위치의 뉴클레오티드 A(아데닌)가 뉴클레오티드 U(우리딘)로 치환됨.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주는 적어도 2411, 3701, 6496, 및 선택적으로 1408번 위치의 하나 이상의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 5로부터 선택되는 RNA 서열을 포함하고, 단 어떠한 뉴클레오티드도 (RNA 서열 SEQ ID NO. 6으로 표시될 수 있는) Asibi 유전자형으로 복귀되는 방식으로 돌연변이되지는 않는다. 다시 말해, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 뉴클레오티드가 Asibi 게놈(SEQ ID NO. 6)의 동일 위치의 뉴클레오티드와 다른 경우, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주의 RNA 서열의 이러한 뉴클레오티드가 Asibi 게놈(SEQ ID NO. 6)의 동일 위치의 뉴클레오티드가 되는 방식으로 돌연변이되지는 않는다. Asibi 게놈의 동일 위치의 뉴클레오티드와는 다른 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5와 Asibi 서열(SEQ ID NO. 6) 간의 서열 정렬(Needleman and Wunsch, (1970))에 의해 쉽게 식별될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주는 적어도 2411, 3701, 6496, 및 선택적으로 1408번 위치의 하나 이상의 뉴클레오티드가 돌연변이된 SEQ ID NO. 2를 포함하는 RNA 서열을 포함하고, 단 SEQ ID NO. 2의 하기 위치의 뉴클레오티드가 Asibi 유전자형(SEQ ID NO. 6)으로 복귀되는 방식으로 돌연변이되지는 않는다: 304, 370, 854, 883, 1127, 1140, 1431, 1482, 1491, 1572, 1750, 1819, 1870, 1887, 1946, 1965, 2112, 2193, 2219, 2356, 2687, 3371, 3613, 3817, 3860, 3925, 4007, 4013, 4022, 4054, 4056, 4289, 4387, 4505, 4507, 4612, 4864, 4873, 5153, 5194, 5362, 5431, 5473, 5926, 6023, 6448, 6876, 7171, 7496, 7571, 7580, 7642, 7701, 7945, 8008, 8629, 10142, 10285, 10312, 10338, 10367, 10418, 10550 및 10800.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주는 RNA 서열 SEQ ID NO. 7을 포함한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주는 SEQ ID NO. 7과 제한된 수(예를 들어, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하)의 돌연변이가 상이한 RNA 서열을 포함한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주는 SEQ ID NO. 7과 제한된 수(예를 들어, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하)의 돌연변이가 상이한 RNA 서열을 포함하고, 단 어떠한 뉴클레오티드도 Asibi 유전자형으로 복귀되는 방식으로 돌연변이되지는 않는다. 예시적인 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주의 게놈 RNA 서열은 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO. 7로 이루어질 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주는 RNA 서열 SEQ ID NO. 8을 포함한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주는 SEQ ID NO. 8과 제한된 수(예를 들어, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하)의 돌연변이가 상이한 RNA 서열을 포함한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주는 SEQ ID NO. 8과 제한된 수(예를 들어, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하)의 돌연변이가 상이한 RNA 서열을 포함하고, 단 어떠한 뉴클레오티드도 Asibi 유전자형으로 복귀되는 방식으로 돌연변이되지는 않는다. 예시적인 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주의 게놈 RNA 서열은 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO. 8로 이루어질 수 있다.

앞서 언급한 바와 같이, YFV 핵산은 다음과 같은 11종의 단백질을 인코딩한다.

- 전구체의 길이가 121 aa이고 성숙 단백질의 길이가 101 aa인 캡시드 단백질(C 단백질),

- 길이가 75 aa인 막 단백질(M 단백질)의 전구체인 164 aa 길이의 전막 단백질(prM 단백질),

- 493 aa 길이의 외피 단백질(E 단백질),

- 352 aa 길이의 비구조 단백질 1(NS1),

- 224 aa 길이의 비구조 단백질 2a(NS2a),

- 130 aa 길이의 비구조 단백질 2b(NS2b),

- 623 aa 길이의 비구조 단백질 3(NS3),

- 126 aa 길이의 비구조 단백질 4a(NS4a),

- 23 aa 길이의 비구조 펩티드 P2k,

- 250 aa 길이의 비구조 단백질 4b(NS4b),

- 905 aa 길이의 비구조 단백질 5(NS5).

일부 구현예에서, 생약독화 황열병 바이러스 균주는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 및/또는 외피 단백질(E)의 145번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 황열병 바이러스 균주는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이 및 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 황열병 바이러스 균주는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 및 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 황열병 바이러스 균주는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 및 외피 단백질(E)의 145번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 황열병 바이러스 균주는 하기 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주는 하기 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함한다.

i) 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 및

일부 구현예에서, 핵산은 AAA에서 AAG로의 코돈 변화를 일으키는 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이는 GUA에서 UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, 또는 CUG로의 코돈 변화를 일으킨다. 일 구현예에서, 코돈 변화는 GUA에서 UUA로의 변화이다.

일부 구현예에서, 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이는 AUG에서 GUG, GUU, GUC, 또는 GUA로의 코돈 변화를 일으킨다. 일 구현예에서, 코돈 변화는 AUG에서 GUG로의 변화이다.

일부 구현예에서, 핵산은 GUA에서 GUU로의 코돈 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 145번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 추가로 포함한다.

i) 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이;

ii) 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이; 및

iii) AAA에서 AAG로의 코돈 변화를 일으키는 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이.

ii) 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이;

iii) AAA에서 AAG로의 코돈 변화를 일으키는 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이; 및

iv) GUA에서 GUU로의 코돈 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 145번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이.

일부 구현예에서, 생약독화 황열병 바이러스 균주는 480번 위치에 돌연변이를 포함하는 외피 단백질을 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주는 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 480번 위치의 돌연변이를 포함하는 외피 단백질을 포함한다.

일부 구현예에서, 생약독화 황열병 바이러스 균주는 SEQ ID NO. 15의 480번 위치에 상응하는 단백질 내 위치에 류신 잔기를 포함하는 외피 단백질을 포함한다. 특히, 상기 외피 단백질은 SEQ ID NO. 15의 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.

특히, 본 발명의 생약독화 황열병 바이러스 균주의 핵산에서, 어떠한 뉴클레오티드도 Asibi 유전자형(SEQ ID NO. 6)으로 복귀되는 방식으로 돌연변이되지는 않는다. 예를 들어, 생약독화 황열병 바이러스 균주의 핵산에서, SEQ ID NO. 2의 하기 위치의 뉴클레오티드가 Asibi 유전자형(SEQ ID NO. 6)으로 복귀되는 방식의 돌연변이는 포함되지 않는다: 304, 370, 854, 883, 1127, 1140, 1431, 1482, 1491, 1572, 1750, 1819, 1870, 1887, 1946, 1965, 2112, 2193, 2219, 2356, 2687, 3371, 3613, 3817, 3860, 3925, 4007, 4013, 4022, 4054, 4056, 4289, 4387, 4505, 4507, 4612, 4864, 4873, 5153, 5194, 5362, 5431, 5473, 5926, 6023, 6448, 6876, 7171, 7496, 7571, 7580, 7642, 7701, 7945, 8008, 8629, 10142, 10285, 10312, 10338, 10367, 10418, 10550, 및 10800.

일부 구현예에서, 생약독화 황열병 바이러스 균주는 하기 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

(i) 480번 위치에 돌연변이를 포함하는 외피 단백질, 및

(ii) 65번 위치에 돌연변이를 포함하는 NS2a 단백질.

특히, 생약독화 황열병 바이러스 균주의 핵산 분자는 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이 및/또는 외피 단백질(E)의 145번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주는 하기 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

특히, 핵산은 AAA에서 AAG로의 코돈 변화를 일으키는 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이 및/또는 GUA에서 GUU로의 코돈 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 145번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 추가로 포함한다.

특히, 상기 외피 단백질은 SEQ ID NO. 15의 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 상기 NS2a 단백질은 SEQ ID NO. 16의 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.

본 발명의 생약독화 황열병 바이러스 균주의 핵산은 SEQ ID NO. 17의 57번 위치에 상응하는 비구조 단백질 4A(NS4a)를 코딩하는 핵산 내 위치의 G 뉴클레오티드 및/또는 SEQ ID NO. 18의 435번 위치에 상응하는 외피 단백질(E)을 코딩하는 핵산 내 위치의 U 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 생약독화 황열병 바이러스 균주는 SEQ ID NO. 17의 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 비구조 단백질 4A(NS4a)를 코딩하는 핵산 및/또는 SEQ ID NO. 18의 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 외피 단백질(E)을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 핵산은 전술한 바와 같은 본 발명에 따른 돌연변이를 포함하는, 17D 하위균주의 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산은 전술한 바와 같은 본 발명에 따른 돌연변이를 포함하는, 17D-204 하위균주의 RNA 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산은 전술한 바와 같은 본 발명에 따른 돌연변이를 포함하는 RNA 서열 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO.5를 포함한다.

예시적인 구현예에서, 핵산은 전술한 바와 같은 본 발명에 따른 돌연변이를 포함하는 RNA 서열 SEQ ID NO. 2를 포함한다.

아래의 실시예 섹션에서 나타나는 바와 같이, 상기 정의된 바와 같은 돌연변이를 이용함으로써, Vero 세포에서 성장하도록 적응되고, 모체 YFV 균주에 비해 약화된 독성, 예컨대 약화된 신경독성을 가지며, 백신으로서 또는 백신 조성물에 사용하기에 적합한 독성을 갖는 YFV 균주를 제공할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 돌연변이를 이용함으로써, Vero 세포에서 성장하도록 적응되고, 모체 YFV 균주에 비해 신경독성이 적고, 적어도 모체 YFV 균주만큼 내장친화성이 약화된 YFV 균주를 제공할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 돌연변이를 이용함으로써, Vero 세포에서 성장하도록 적응되고, 모체 YFV 균주에 비해 신경독성이 적고, 적어도 모체 YFV 균주만큼 내장친화성이 약화되고, 적어도 모체 YFV 균주만큼 면역원성이 있는 YFV 균주를 제공할 수 있다.

＊ 면역원성, 백신 및 제약 조성물

다른 양태에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 범위 내에서, 용어 "면역원성"은 항체-매개 및/또는 세포-매개 면역 및/또는 면역 기억을 촉진하는 조성물의 능력을 의미한다.

일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 황열병 바이러스에 대한 중화 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 생약독화 바이러스 균주를 포함하는 백신 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 백신 조성물은 어떠한 애주번트도 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 범위 내에서, "애주번트"는 백신의 관련 면역 반응 및 후속 임상 효능을 향상시키기 위한 임의의 물질을 의미한다.

대안적으로, 백신 조성물은 하나 이상의 애주번트를 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 애주번트는 무기염, 에멀젼, 미생물 천연 또는 합성 유도체, 조합 애주번트, 사이토카인 유래 또는 보조 분자 유래의 애주번트, 미립자 제형 등을 포함할 수 있다. 애주번트의 제조 및 용도는 당업계에 잘 알려져 있다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 생약독화 YFV 균주 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 생약독화 YFV 균주 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 맥락에서, 표현 "제약상 허용되는 비히클"은, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 생리학적 활성을 유지하면서 인간에게 투여하는 것이 생리학적으로 허용되는 비히클을 의미한다. 하나의 예시적인 제약상 허용되는 비히클은 생리식염수 버퍼이다. 기타 제약상 허용되는 비히클은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18^th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa]에 기재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물은 생리학적 조건에 근접하는 데 필요한 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조절제, 버퍼, 긴장성 조절제, 습윤제 등을 임의로 함유할 수 있다. 또한, 백신 조성물은, 예를 들어 희석제, 결합제, 안정화제, 및 보존제를 포함하는 제약상 허용되는 첨가제를 임의로 포함할 수 있다.

다양한 구현예에서, 면역원성 조성물의 pH는 5.5 내지 8, 예컨대 6.5 내지 7.5(예를 들어, 약 7)이다. 안정적인 pH는 버퍼를 사용하여 유지될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 버퍼를 포함한다. 면역원성 조성물은 인간에 대해 등장성일 수 있다. 면역원성 조성물은 또한, NaCl과 같은 하나 또는 여러 개의 추가 염을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체의 제조 및 용도는 당업계에 잘 알려져 있다.

실제로, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주를 포함하는 면역원성 조성물 및/또는 백신 조성물 및/또는 제약 조성물은 해당 분야의 통상적이고 우수한 실시를 이용해 제조될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물, 백신 조성물, 및/또는 제약 조성물은 하나 이상의 적합한 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.

다양한 구현예에서, 제약 조성물, 면역원성 조성물, 및 백신 조성물은 통상적인 멸균 기술로 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 이렇게 생성된 수용액은 액체 형태로 포장 및 보관되거나 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 함께 재구성된다. 예시적인 구현예에서, 제약 조성물, 면역원성 조성물, 및 백신 조성물은 WO 2009/109550에 기재된 바와 같은 프릴링(prilling) 공정을 통해 마이크로펠릿으로서 포장되고 보관된다. 일 구현예에서, 제약 조성물, 면역원성 조성물, 및/또는 백신 조성물은 동결건조되거나 분무동결 건조된다.

＊ 생약독화 YFV 균주를 획득하는 방법

본 발명의 다른 양태는 Vero 세포에서 성장하도록 적응된 생약독화 황열병 바이러스 균주를 획득하는 방법으로서,

일부 구현예에서, 상기 본 발명의 방법의 단계 d)는 2, 3, 4, 5, 6회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 본 발명의 방법의 단계 e)의 클로닝은 Vero 세포에서 2, 3, 4, 5, 6회 이상의 연속 플라크 정제에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 본 발명의 방법의 단계 f)는 2, 3, 4, 5, 6회 이상 수행된다.

- g) 단계 f)에서 회수된 상기 복수의 황열병 바이러스 균주로부터,

ii) 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이

를 포함하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 생약독화 황열병 바이러스 균주를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 이러한 선별은 당업계에 잘 알려진 시퀀싱 방법으로 용이하게 수행된다.

일부 구현예에서, 단계 g)는 하기 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 생약독화 황열병 바이러스 균주를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 단계 g)는 AAA에서 AAG로의 코돈 변화를 일으키는 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산을 포함하는 전술한 바와 같은 하나 이상의 생약독화 황열병 바이러스 균주를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 단계 g)는 GUA에서 GUU로의 코돈 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 145번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산을 포함하는 전술한 바와 같은 하나 이상의 생약독화 황열병 바이러스 균주를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

i) 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이,

ii) 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이,

iii) AAA에서 AAG로의 코돈 변화를 일으키는 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 및/또는

일 구현예에서, 단계 a)의 모체 생약독화 황열병 바이러스 균주는 황열병 17D-204 하위균주와 같은 황열병 17D 하위균주이다.

실제로, Vero 세포는 ATCC와 같은 세포 기탁기관에서 입수할 수 있다. 무혈청 배지를 사용하는 방법을 비롯하여, 시험관내 세포 배양에서 Vero 세포를 성장시키는 데 적합한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(Kolell K. et al. 2007). 일 구현예에서, Vero 세포는 바이러스 배양 전에 무혈청 배지에서 성장하도록 적응된다.

일부 구현예에서, Vero 세포를 성장시키는 데 사용되는 배지는 무혈청이고, 선택적으로 인간 또는 동물 유래 물질을 함유하지 않는다.

본 발명의 범위 내에서, "인간 또는 동물 유래 물질"이란 표현은 인간 또는 비인간 동물에서 유래하는 단백질, 지질, 당단백질, 지단백질, 당지질, 단당류, 또는 다당류와 같은 물질(예: 인간 또는 비인간 동물로부터 얻은(예를 들어, 추출된) 성장인자, 호르몬)을 의미한다. 재조합 분자는 인간 또는 동물 유래 물질로 간주되지 않는다. 이러한 무혈청 배지 및/또는 인간 또는 동물 유래 물질이 없는 배지는 공급업체 카탈로그(예를 들어, THERMOFISHER SCIENTIFIC® 카탈로그)에서 쉽게 찾을 수 있다.

일부 구현예에서, Vero 세포를 성장시키는 데 사용되는 배양 배지에는 항생제도 없다.

일부 구현예에서, Vero 세포를 성장시키는 데 사용되는 배양 배지는 박테리아, 효모, 및/또는 식물에서 유래하는 하나 이상의 추출물을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, Vero 세포에서 성장하도록 적응되지 않은 모체 생약독화 황열병 바이러스 균주의 게놈은 게놈 RNA를 인코딩하는 cDNA의 형태일 수 있다.

특정 구현예에서, cDNA는, 예를 들어 플라스미드와 같은 적합한 벡터에 의해 운반된다.

일부 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 돌연변이(들)가 존재하는 RNA 서열 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5를 포함하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

일부 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 돌연변이(들)에 상응하는 돌연변이가 존재하는 서열 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5에 상응하는 cDNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주는 본 발명에 기재된 돌연변이를 황열병 바이러스의 게놈 서열에 도입하기 위해 상기 게놈 서열을 돌연변이시켜 획득된다. 일부 구현예에서, 황열병 17D 하위균주의 게놈 서열은 본 발명에 기재된 돌연변이를 상기 게놈 서열에 도입하기 위해 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5의 RNA 서열 또는 상응하는 cDNA 서열을 포함하는 핵산은 본 발명에 기재된 돌연변이를 도입하기 위해 돌연변이될 수 있다. 돌연변이는, 임의의 적합한 유전자 편집 기술의 사용을 비롯해 당업자에게 잘 알려진 방법을 통한 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 게놈 서열에 도입될 수 있다. 본 발명에 기재된 돌연변이가 도입되는 게놈 서열은 황열병 바이러스의 게놈 RNA를 인코딩하는 cDNA, 예컨대 황열병 17D 하위균주의 게놈 RNA를 인코딩하는 cDNA, 예를 들어 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, 또는 SEQ ID NO. 5를 인코딩하는 cDNA일 수 있다. 일부 구현예에서, cDNA는 적합한 플라스미드에 의해 운반된다. 황열병 바이러스의 게놈 서열에 도입될 수 있는 본 발명에 기재된 돌연변이는 게놈 서열의 2411번 위치, 3701번 위치, 또는 6496번 위치의 뉴클레오티드의 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이러한 돌연변이는 뉴클레오티드 U(우리딘)로 치환되는 게놈 서열의 2411번 위치의 뉴클레오티드 G(구아노신), 뉴클레오티드 G(구아노신)로 치환되는 게놈 서열의 3701번 위치의 뉴클레오티드 A(아데노신), 또는 뉴클레오티드 G(구아노신)로 치환되는 게놈 서열의 6496번 위치의 뉴클레오티드 A(아데노신), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 돌연변이가 게놈 서열의 1408번 위치에 도입된다. 일부 구현예에서, 이러한 추가 돌연변이는 뉴클레오티드 U(우리딘)로 치환되는 게놈 서열의 1408번 위치의 뉴클레오티드 A(아데닌)이다. 일부 구현예에서, 다른 돌연변이가 황열병 바이러스의 게놈 서열에 도입될 수 있고, 단 어떠한 뉴클레오티드도 Asibi 유전자형으로 복귀되는 방식으로 돌연변이되지는 않는다. 다른 양태에서, 황열병 바이러스의 게놈 서열에 도입될 수 있는 본 발명에 기재된 돌연변이는, 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 또는 AAA에서 AAG로의 코돈 변화를 일으키는 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이로부터 선택된다. 일부 구현예에서, GUA에서 GUU로의 코돈 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 145번 위치의 아미노산에 대한 코돈에 추가 돌연변이가 도입된다. 일부 구현예에서, 다른 돌연변이가 황열병 바이러스의 게놈 서열에 도입될 수 있고, 단 어떠한 뉴클레오티드도 Asibi 유전자형으로 복귀되는 방식으로 돌연변이되지는 않는다. 특히, 황열병 바이러스의 게놈 서열에 도입될 수 있는 본 발명에 기재된 돌연변이는, 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 및 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이이다.

다른 양태에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 획득 가능한 생약독화 황열병 바이러스 균주에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법에 의해 획득된 생약독화 황열병 바이러스 균주가 또한 본원에 개시된다.

＊ 기타 방법 및 용도

본 발명은 또한, YFV 감염에 대한 면역을 필요로 하는 개체를 면역화하는 방법으로서, 본 발명에 따른 백신 조성물을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 범위 내에서, "~을 필요로 하는 개체"란 표현은 YFV에 감염될 위험이 있는 개체를 의미하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 양태는 또한, 백신의 제조를 위한 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주의 pMSL, MSL, 또는 WSL로서의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 또한, 백신 제조 공정에 있어서 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주의 pMSL, MSL, 또는 WSL로서의 용도에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 백신의 제조에 사용하기 위한 본 발명에 따른 생약독화 YFV 균주에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 또한, YFV 감염의 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 백신 조성물에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 개체의 YFV 감염을 예방하는 방법으로서, 본 발명에 따른 생약독화 YFV, 면역원성 조성물, 제약 조성물, 또는 백신 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 개체에서 황열병 바이러스에 대한 중화 항체를 생성하는 방법으로서, 본 발명에 따른 생약독화 YFV, 면역원성 조성물, 제약 조성물, 또는 백신 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 YFV 감염 예방용 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 생약독화 바이러스의 용도에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 YFV 감염의 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 생약독화 바이러스에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 YFV 감염 예방용 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 YFV 감염 예방용 백신 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 YFV 감염의 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 백신 조성물 및 면역원성 조성물은 이를 필요로 하는 개체에게 임의의 적합한 투여 경로로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 면역원성 조성물 또는 백신은 임의의 적합한 경로를 통해, 예컨대 점막 투여(예: 비강내 또는 설하), 비경구 투여(예: 근육내, 피하, 경피, 또는 피내 경로), 또는 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 백신은 의도된 투여 경로에 적합하도록 적절히 제형화된다. 예시적인 구현예에서, 본 발명의 조성물은 근육내 또는 피하로 투여된다.

본 발명에 따른 백신은 다회 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 백신은 1회, 2회, 또는 3회 용량으로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 백신은 단회 용량으로 투여된다.

본 발명에 따른 백신은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 양으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신 용량은 4~6 log₁₀ CCID₅₀이다.

실시예

실시예 1: Vero 세포에서의 적응에 의한 생약독화 YFV 균주의 제조(예비마스터 시드 로트(pMSL))

1.1/ 방법의 선택 - 원칙

예비마스터 시드 로트(pMSL)에 대한 전반적인 전략은 도 1에 표시되어 있다.

YF-VAX® 및 Stamaril® 백신은 모두 비클로닝 YF17D-204 균주 제조로부터 개발되었고, 플라크 크기의 표현형으로 시각화시 바이러스의 이종 개체군을 포함한다. 또한, 두 백신은 모두 계란에서 생산되었다.

Vero 세포에서 성장하도록 적응된 균질의 잘 정의된 바이러스 균주를 생성하기 위해, 또한 최종 pMSL에서의 무균성 및 외래성 인자의 부재를 보장하기 위해:

- (1) YF-VAX® 및 Stamaril® 바이러스의 바이러스 게놈 RNA를 정제하고;

- (2) 이어서, Vero 세포에 형질감염시켜 황열병 바이러스를 회수한 후, 이 세포 기질에서 성장하도록 바이러스를 적응시키기 위해 Vero 세포에서 2회 증폭하고;

- (3) 이어서, 2회의 플라크 정제 사이클에 의해 바이러스를 클로닝하였다. 이를 위해, 바이러스 제제를 Vero 세포 감염을 위해 희석하고, 잘 분리된 바이러스 플라크를 얻기 위해 반고체 오버레이 아래에서 성장시켰다. 각각의 형질감염에 대해, 각각 단일 바이러스 개체군에 해당하는 2개의 개별 플라크를 오버레이를 통해 선택하여 희석하고 두 번째 플라크 정제 사이클에 사용하여 바이러스 클론을 생성하고;

- (4) 이어서, 이들 클론을 증폭하여 pMSL을 구성하기에 충분한 바이러스 원액을 획득하였다.

pMSL 제조에 사용된 모든 배지 및 용액에는 동물 성분 및 인간 성분이 없었다.

1.2/ 방법

1.2.1/ YF-VAX® 게놈 cDNA로부터의 시험관내 전사

YF-VAX®(WO 2014/016360에 개시된 바와 같은 플라스미드 pJSY2374.5)로부터의 YFV의 게놈 cDNA의 시험관내 전사를 공급업체의 권장 사항에 따라 mMessage mMachine^TM SP6 키트(AMBION®, 참조 번호 AM1340)로 수행하였다. 플라스미드 pJSY2374.5로부터, 2세트의 시험관내 전사를 동시에 수행하였다.

간단히 말해서, 실온에서 해동한 후, 10 μg의 플라스미드를 제한 효소 NruI(30 U/10 μg)로 37 ± 2℃에서 2시간 동안 분해하여 선형화하였다. 이어서, 효소를 60℃에서 20분 동안 인큐베이팅하여 비활성화시켰다. 플라스미드의 선형화는 0.5%의 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 확인되었다. 키트의 반응 버퍼, 리보뉴클레오티드(ATP, CTP, UTP, 및 GTP와 7-메틸-GTP의 혼합물), 효소, 및 1 μg의 플라스미드를 포함하는 40 μL의 반응 혼합물을 제조하였다. 생성된 혼합물을 37 ± 2℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다.

1.2.2/ RNA 정제

a) Stamaril ® 백신 작업 시드 로트로부터

2세트의 바이러스 RNA 정제를 동시에 수행하였다.

Stamaril® 백신(로트 # FA238667, 감염 역가 6.38 log₁₀ PFU/바이알)의 작업 시드 로트의 4개의 바이알을 각각 RNeasy® 키트(QIAGEN®)의 용해 버퍼 200 μl에 현탁시킨 후 취합했다. 이어서, RNA를 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(125:24:1; pH 4.5)로 2회 연속 추출하여 정제하였다.

2 mL의 Phase Lock Gel Heavy 튜브(5PRIME®)를 11,000 x g로 30초 동안 원심분리하였다. 750 μL의 RNA/용해 버퍼 혼합물을 각각의 튜브에 도입하였다. 이어서 동일 부피(750 μl)의 페놀/클로로포름/IAA 용액을 각각의 튜브에 첨가하였다. 유기상과 수상을 격렬하게 혼합하여 균질한 일시적 현탁액을 형성한 후, 튜브를 11,000 x g로 5분 동안 원심분리하여 상들을 분리하였다. 이어서, 상층의 상(수상)을 회수하였다. 새로운 Phase Lock Gel 2 mL 튜브에서 작업을 다시 시작하였다. 이어서, 클로로포름과 이소아밀 알코올(24:1)의 혼합물로 작업을 다시 수행하여 미량의 페놀을 모두 제거하였다. 이어서, RNA를 농축시키고, 공급업체의 권장 사항에 따라 RNeasy® 키트(QIAGEN®)로 실리카 컬럼에서 정제하여 미량의 유기 용매를 모두 제거하였다. 이어서, 정제 RNA를 뉴클레아제가 없는 물에 용리시켰다.

b) YF -VAX® 게놈 cDNA의 시험관내 전사로부터

시험관내 전사(상기 참조)에 의해 얻은 RNA를 오염시키는 플라스미드 DNA를 37 ± 2℃에서 15분 동안 4 U의 DNase로 제거하였다. 이어서, SP6 중합효소를 70℃에서 10분 동안 인큐베이팅하여 비활성화시켰다.

시험관내 전사에 의해 얻은 RNA를, RNase가 없는 물 60 μl 및 RNeasy® 키트(QIAGEN®)의 용해 버퍼 350 μl와 혼합하였다. 이어서, RNA를 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(125:24:1; pH 4.5)로 2회 연속 추출하여 정제하였다. 이를 위해, Phase Lock Gel Heavy 1.5 mL 튜브를 11,000 x g로 30초 동안 원심분리하였다. 750 μL의 RNA/용해 버퍼 혼합물을 각각의 튜브에 도입하였다. 이어서 동일 부피(750 μl)의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 용액을 각각의 튜브에 첨가하였다. 유기상과 수상을 격렬하게 혼합하여 균질한 일시적 현탁액을 형성한 후, 상들을 분리하기 위해 11,000 x g로 5분 동안 튜브를 원심분리하였다. 이어서, 상층의 상(수상)을 회수하였다. 새로운 Phase Lock Gel 1.5 mL 튜브에서 작업을 다시 시작하였다. 이어서, 클로로포름과 이소아밀 알코올(24:1)의 혼합물로 작업을 다시 수행하여 미량의 페놀을 모두 제거하였다. 이어서, RNA를 공급업체의 권장 사항에 따라 RNeasy® 키트(QIAGEN®)로 실리카 컬럼에서 정제하였다. 이어서, 정제 RNA를 뉴클레아제가 없는 물로 용리시켰다.

1.2.3/ 형질감염

각각의 RNA 정제에 대해 2세트의 형질감염을 수행하였다.

a) RNA/ Lipofectamine ^TM 혼합물의 제조

10 또는 15 μL의 Lipofectamine^TM 2000 CD(LIFE TECHNOLOGIES®)를 1 mL의 OptiPro SFM 배지(LIFE TECHNOLOGIES®)와 혼합하고 실온에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 약 10 log₁₀ Geq(문헌[Mantel et al. (2008)]에 기재된 바와 같이 YF-NS5 qRT-PCR로 측정된 게놈 당량 역가)의 정제 RNA를 첨가하였다. 이들 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이팅하였다.

b) Vero 세포 제조

형질감염 전에, 6-웰 플레이트(웰당 3 mL의 VP-SFM(THERMOFISHER SCIENTIFIC) 중의 9.10⁵개 세포)에서 이전에 시딩된 Sanofi Pasteur GMP 은행의 무혈청 Vero 세포를 OptiPro SFM 배지의 웰당 2 mL로 세정하였다.

c) 형질감염 반응

6-웰 플레이트에서, 세포에서 세정 배지를 제거한 후, RNA를 함유한 형질감염 혼합물을 각각의 제제에 대해 2개의 웰(1 mL/웰)에 넣었다. 웰을 RNA를 함유하지 않은 OptiPro SFM/Lipofectamine^TM과 접촉시키고, 마지막 웰은 OptiPro SFM 배지에서만 세포 대조군으로서 보관하였다. 2개의 플레이트 즉, 10 μl의 Lipofectamine^TM을 함유한 혼합물이 있는 플레이트와 15 μl의 Lipofectamine^TM을 함유한 혼합물이 있는 플레이트를 동시에 준비하였다. Lipofectamine^TM과 RNA를 함유한 혼합물은 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 4시간 동안 Vero 세포와 접촉된 상태로 두었고, 이어서 2 mL의 예열된 VP-SFM 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 6-웰 플레이트를 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 16시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 배지를 교체하고 플레이트를 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 다시 인큐베이팅하였다. 세포변성 효과(세포 용해)가 나타날 때, 그리고 (문헌[Mantel et al. (2008)]에 기재된 바와 같이) 배양 상청액으로부터 YF-NS5 qRT-PCR로 측정된 게놈 역가가 8.0 log₁₀ Geq/mL보다 클 때 형질감염 상청액을 회수하였다. D5 및 D8에, 회수 가능하려면 배양 시간이 더 필요한 경우, 배양 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 회수된 상청액을 분액으로 나누었다.

1.2.4/ 바이러스의 증폭

a) 증폭 n°1 (바이러스 계대 n°2 )

바이러스 증폭 n°1의 2일 전에, 5 mL의 VP-SFM 배지가 들어있는 25 cm²의 플라스크에 2.10⁵개의 Vero 세포를 시딩하였다. 이어서, 2의 게놈 다중도(m.o.g)(즉, qRT-PCR에 의해 얻은 RNA 농도로부터 추정된, 세포당 2 Geq)를 얻기 위해, 형질감염으로부터 얻은 바이러스 현탁액을 VP-SFM 배지에 희석하였다. 이전에 시딩된 Vero 세포의 배양 배지를 제거하고, 세포를 1 mL의 희석된 바이러스 현탁액 또는 1 mL의 VP-SFM 배지 단독(세포 대조군)과 접촉시켰다. 플라스크를 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 바이러스 접종물을 제거하고 10 mL의 VP-SFM 배지로 교체하고, 세포를 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 2일 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 배양 배지를 37 ± 2℃로 예열된 새로운 VP-SFM 배지로 교체하고, 플라스크를 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 2 내지 3일 동안 다시 인큐베이팅하였다. 총 4 내지 5일간의 인큐베이션 후, 바이러스를 함유한 배양 상청액을 회수하였다. 바이러스 현탁액을 4℃에서 1200 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 맑게 한 후 분액으로 분배하였다. 이 바이러스 현탁액 140 μl를 사용하여 QiaAmp 바이러스 미니 키트(QIAGEN®; 공급업체의 프로토콜에 따름)로 전체 RNA를 추출하고, (문헌[Mantel et al. (2008)]에 기재된 바와 같이) YF-NS5 qRT-PCR로 바이러스 RNA를 정량화하였다.

두 번째 증폭 단계를 같은 날에 수행할 경우 이를 위해 바이러스 RNA 역가에 따라 하나 이상의 분액을 보관하고, 나머지는 10%의 최종 소르비톨의 존재하에 -70℃ 이하에서 동결시켰다.

b) 증폭 n°2 (바이러스 계대 n°3 )

바이러스 증폭 n°2의 2일 전에, 20 mL의 VP-SFM 배지가 들어있는 75 cm²의 플라스크에 5.10⁵개의 Vero 세포를 시딩하였다. 이어서, 첫 번째 증폭으로부터 얻은 바이러스 현탁액을 VP-SFM 배지에 희석하여 2의 m.o.g 비(즉, qRT-PCR에 의해 얻은 RNA 농도로부터 추정된, 세포당 Geq)로 Vero 세포를 감염시켰다.

증폭 n°2의 다른 단계들을 증폭 n°1(상기 섹션 a) 참조)에 대해 상술된 바와 같이 수행하였다.

c) 바이러스 클로닝 - 플레이트 정제(바이러스 계대 4 및 5)

형질감염 및 증폭 후 얻은 바이러스 현탁액당 2개의 6-웰 플레이트가 필요했다.

증폭 n°2 후에 얻은 바이러스 현탁액의 분액을 희석하여 약 2.0 log₁₀ PFU/mL의 현탁액 및 1.7 log₁₀ PFU/mL의 현탁액을 얻었다. 세포의 무결성과 오염의 부재를 확인하기 위해, 6-웰 플레이트(웰당 3 mL의 VP-SFM 중의 9.10⁵개 세포)에서 이전에 시딩된 Vero 세포를 관찰한 후, 배양 배지를 제거하였다. 각각의 희석에 대해, 플레이트의 5개 웰은 각각의 웰 내의 500 μL의 희석된 바이러스(2.0 log₁₀ PFU/mL 또는 1.7 log₁₀ PFU/mL 희석)로 감염되었고, 세포 대조군 웰은 500 μL의 VP-SFM만 포함하였다. 플레이트를 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 접종물을 제거하고 4 mL의 오버레이 혼합물, 즉 42℃로 예열된 VP-SFM 2X 용액으로 교체하고, 2%의 아가로스 용액과 부피 대 부피로 즉석 혼합하였다. 오버레이 혼합물의 고체화 후, 플레이트를 반대 위치로(덮개를 아래로 하여) 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 3 내지 6일 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트는 매일 관찰되었다. 세포변성 효과가 나타나면, 첫 번째와 동일하지만 0.008%의 중성 레드를 추가로 함유한 두 번째 오버레이 혼합물을 각각의 웰에 첨가하고(2 mL), 플레이트를 반대 위치로 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 1 내지 2일 동안 인큐베이팅하였다.

바이러스 입자(클론)에 의한 세포의 감염은 바로 주변 세포에 국한된 이러한 조건에 남아 국소 용해를 일으켜, 다른 적색의 세포 단층 위에 바이러스가 풍부한 흰 반점(용해 플라크)을 생성하였다. 각각의 증폭된 바이러스 희석에 대해, 마이크로피펫과 1000 μL 콘을 이용하여 커버 배지를 통해 2종의 클론을 회수하였다. 이렇게 얻은 바이러스 클론을 1 mL의 VP-SFM 배지에 현탁시킨 후 격렬하게 혼합하였다.

이들 현탁액 각각을 1:2에서 1:200,000까지 연속 단계로 희석하여 두 번째 일련의 플레이트 정제를 수행하였다. 이 두 번째 클로닝 실행의 종료시, 플레이트당 2종의 클론을 다시 회수하였다. 계통당 최대 16종의 클론을 획득하였다(즉, Stamaril® 모균주로부터 16종의 클론 및 YF-VAX® 모균주로부터 16종의 클론).

d) 증폭 n°3 (바이러스 계대 n°6 )

각각의 클론(최대 32종)에 대해, 아가로스에 함유된 바이러스 물질의 재현탁에 의해 얻은 바이러스 현탁액을 VP-SFM에 (회수된 플라크의 크기에 따라) 1/4 또는 1/2로 희석하였다.

증폭 n°3을 증폭 n°1(상기 섹션 a) 참조)과 동일한 프로토콜에 따라 수행하였다. 증폭된 바이러스는, 세포변성 효과가 나타나고 qRT-PCR에서의 게놈 역가가 8.0 log₁₀ Geq/mL를 초과할 때 회수되었다.

총 4 내지 5일간의 인큐베이션 후, 바이러스를 함유한 배양 상청액을 회수하고 분액으로 나누었다. 이 바이러스 현탁액 140 μL를 사용하여, 공급업체의 프로토콜에 따라 QiaAmp 바이러스 미니 키트(QIAGEN®)로 전체 RNA를 추출하고, (문헌[Mantel et al. (2008)]에 기재된 바와 같이) YF-NS5 qRT-PCR로 RNA를 정량화하였다. 바이러스 RNA 역가에 따라 하나 이상의 분액을 다음 단계의 증폭을 수행하기 위해 보관하고, 나머지는 10%의 최종 소르비톨의 존재하에 -70℃ 이하에서 동결시켰다.

e) 증폭 n°4 (바이러스 계대 n°7 )

증폭 n°3(상기 섹션 d) 참조)으로부터 얻은 바이러스 현탁액을 VP-SFM 배지에 희석하여, 2의 m.o.g 비로 이전에 시딩된 Vero 세포를 감염시키고, 증폭 n°2(상기 섹션 b) 참조)와 동일한 프로토콜에 따라 추가로 처리하였다.

증폭된 바이러스는, 세포변성 효과가 나타나고 qRT-PCR에서의 게놈 역가가 8.0 log₁₀ Geq/mL를 초과할 때 회수되었다. 총 4 내지 5일간의 인큐베이션 후, 상청액을 회수하고, 바이러스 현탁액을 4℃에서 1200 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 맑게 한 후, 10%의 최종 소르비톨의 존재하에 -70℃ 이하에서 동결 분액으로 나누었다.

이렇게 얻은 바이러스 현탁액을 사용하여 바이러스 게놈의 감염 적정 및 시퀀싱을 수행하였다.

이들 데이터로부터, 각각의 계통에서 3종의 균주(즉, Stamaril® 모균주로부터 3종의 TV2212, TV2232, 및 TV2241 균주, 및 YF-VAX® 모균주로부터 3종의 TV3111, TV3112, 및 TV4221 균주)를 다음 기준에 따라 선별하였다: 6 log₁₀ CCID₅₀/mL 이상의 감염 역가 및 원래의 Asibi 균주 서열로의 복귀를 나타내지 않는 게놈 서열.

바이러스 현탁액 감염 적정은 Vero 세포에서 CCID₅₀ 방법을 이용해 수행되었다. 간단히 말해서, 바이러스 현탁액을 96-딥 웰 플레이트에서 -4.6 log10에서 시작해서 -8 log10까지 IMDM(THERMOFISHER SCIENTIFIC) + 4% FCS에 연속적으로 4배 희석하였다. 대조군 바이러스(Vero 세포에서 한 번 증폭된 Stamaril® 바이러스, 배치 MLE-JPO-000089)는 각각의 시험에서 양성 기준으로서 포함되었다. 검정하기 3일 전에 바닥이 평평한 96-웰 플레이트에서 시딩된 Vero 세포가 들어있는 10개의 웰(8000개 세포/웰)에 각각의 바이러스 희석액 100 마이크로리터를 첨가하였다. +37℃, 5% CO₂에서 4일간의 인큐베이션 후, 상청액을 버리고, 세포를 150 μL의 85% 아세톤으로 -20±3℃에서 15분 동안 고정시키고 나서, 2.5%의 밀크 PBS-Tween 버퍼 용액으로 포화시킨 후, 2 μg/mL(희석 1/2,000)의 팬-플라비바이러스 E-특이적 4G2 마우스 단클론 항체(RD BIOTECH®, 로트 #130726-4G2)로 면역염색하였다. 이어서, 4G2 항체로 염색된 감염 병소가, 1/1000으로 희석된 염소 항마우스 IgG 알칼리-포스파타제 접합 항체(CLINISCIENCES® SA, 참조 #1030-04, 로트 #A7013-Z145)와의 인큐베이션에 이어 알칼리-포스파타제 기질(BCIP/NBT, SIGMA-ALDRICH®, 참조 # B5655, 로트 #SLBN0689V 및 레바미졸, SIGMA-ALDRICH®, 참조 # L9756, 로트 #091M1227V)와의 인큐베이션 후 드러났다.

양성 웰, 즉 검은색으로 염색된 적어도 하나의 플라크를 포함하는 웰을 계수하고, 최소 제곱 회귀법을 이용해 최종 역가를 계산하였다.

f) 증폭 n°5 (바이러스 계대 n°8 ) - 예비마스터 후보백신 ( pMSL )

증폭 n°4(상기 섹션 e) 참조)로부터 선택된 6종의 균주 각각으로부터 얻은 바이러스 현탁액을 VP-SFM 배지에 희석하여 0.01의 m.o.i로 Vero 세포를 감염시켰다.

바이러스 증폭 n°5의 2일 전에, 30 mL의 VP-SFM 배지가 들어있는 175 cm²의 플라스크에 12.10⁶개의 Vero 세포를 시딩하였다. 앞서 수행된 바와 같이, 배양 배지를 제거하고 12 mL의 희석된 바이러스 현탁액 또는 VP-SFM 단독(대조군 세포)으로 교체하였다. 플라스크를 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 바이러스 접종물을 제거하고 50 mL의 VP-SFM 배지로 교체하였다. 플라스크를 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 2일 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 배양 배지를 37 ± 2℃로 예열된 새로운 VP-SFM 배지로 교체하고, 플라스크를 37 ± 2℃, 5 ± 2% CO₂에서 1 내지 3일 동안 다시 인큐베이팅하였다. 증폭된 바이러스는, 세포변성 효과가 나타나고 qRT-PCR에서의 게놈 역가가 8.0 log₁₀ Geq/mL를 초과할 때 회수되었다.

총 3 내지 5일간의 인큐베이션 후, 상청액을 회수하고, 바이러스 현탁액을 4℃에서 1200 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 맑게 한 후, 10%의 최종 소르비톨의 존재하에 -70℃ 이하에서 동결된 분액으로 분배하였다. 6종의 선별된 균주로부터 얻은 증폭된 바이러스는 6종의 후보백신 pMSL을 구성하였다.

실시예 2: 마우스 모델에서 후보백신의 신경독성

2.1/ 마우스 모델에서 pMSL 후보백신의 신경독성

WHO TRS 872 부록 2(1998)에 기재된 바와 같은 마우스 치사량 50%(MLD₅₀)의 측정을 통해 vYF(Vero 세포 적응 황열병 바이러스) 예비마스터 시드 로트(pMSL) 후보백신의 신경독성을 평가하였다.

pMSL 후보백신의 신경독성 연구를 위해, 8마리 암컷 OF1 마우스(접종시 4주령)의 그룹에게 0.4% NaCl 2.5% 인간 혈청 알부민(HSA) 버퍼 중의 5 내지 7개 바이러스 희석액 30 μl를 뇌내 경로로 주사하였다. 4종의 vYF pMSL 후보백신 TV2212, TV3111, TV3112, 및 TV4221의 신경독성을 평가하고, Stamaril® 및 YF-VAX® 기준백신과 비교하였다. 마우스를 21일 동안 모니터링하고, 생존 마우스의 수를 21일차에 기록하였다. 샘플을 무작위로 분포시켜 3회의 독립적인 실험을 수행하였다. 각각의 실험에 대해 접종 당일에 CCID₅₀ 역적정으로 주사량을 확인하였다.

매일 생존율을 기록하기 위해 임상 모니터링은 매일 수행되었다. 최소 제곱 회귀법을 이용해 50%의 생존 마우스를 유도하는 용량으로서 MLD₅₀을 계산하고 log₁₀ MLD₅₀/mL로 표시하였다. TV3111과 TV3112를 제외하고(이 경우, 최고 용량(30 μl의 0.7 log₁₀ 희석액)의 TV3111 및 TV3112 균주를 투여한 그룹에서도 100%의 생존 마우스가 기록되었기 때문에 MLD₅₀을 계산할 수 없었음), 각각의 균주의 MLD₅₀은 3회 측정의 가중 평균 및 95% 신뢰 구간으로서 결정되었다.

결과를 아래 표 2에 나타냈다.

Stamaril® 계통에서 유래된 vYF 균주 TV2212는 Stamaril® 기준백신과 비교하여 유사한 신경독성을 나타냈다.

YF-VAX® 계통에서 유래된 vYF 균주 TV4221은 YF-VAX® 기준백신과 비교하여 유사한 신경독성을 나타냈다. 마지막으로, YF-VAX® 계통에서 유래된 vYF 균주 TV3111 및 TV3112는 모두 YF-VAX® 기준백신과 비교하여 신경독성 효과를 나타내지 않았다. 이들 2종의 vYF 균주에 대한 MLD₅₀ 역가는 계산될 수 없다(최소 2.2 log₁₀ MLD₅₀/mL 미만).

그 결과, 2종의 vYF 균주 TV2212 및 TV4221은 각각의 모체 기준백신 Stamaril® 및 YF-VAX®와 유사한 신경독성 프로파일 및 MLD₅₀ 역가를 나타냈다. YF-VAX® 계통에서 유래된 2종의 다른 vYF 균주 TV3111 및 TV3112는 모두 YF-VAX® 모균주에 비해 현저하게 약화된 신경독성을 나타냈고, 이들의 MLD₅₀ 역가는 평가될 수 없었다.

2.2/ 마우스 모델에서 TV3112 균주 MSL 및 WSL의 신경독성

2.2.1/ TV3112 균주 MSL 및 WSL

MSL 및 WSL 제조에 사용된 모든 배지 및 용액에는 동물 성분 및 인간 성분이 없었다.

정적 조건에서의 Vero 세포 증폭 후, 세포를 생물 반응기에 시딩하였다. 생물 반응기에서 3일간의 세포 성장 후, 배지를 세포 성장 배지에서 바이러스 생성 배지로 변경하였다. 생물 반응기에 시드 로트(TV3112 MSL을 제조하기 위한 TV3112 pMSL 또는 TV3112 WSL을 제조하기 위한 TV3112 MSL)를 추가하여 바이러스를 접종하였다. 2일간의 바이러스 증식 후, 바이러스 생성 배지를 폐기하고, 동일 부피의 새로운 바이러스 생성 배지로 교체하였다. 바이러스 접종 4일 후, 생물 반응기의 내용물을 회수하고, 정화하고, 안정화하고, 충전하고, 동결 보관하였다.

2.2.2/ TV3112 균주 MSL 및 WSL의 신경독성

상기 실시예 2의 하위 섹션 2.1에 기재된 것과 동일한 프로토콜을 사용하였다.

TV3112 pMSL의 경우처럼, TV3112 MSL 및 TV3112 WSL은 신경독성 효과를 나타내지 않았다. TV3112 MSL 및 TV3112 WSL에 대한 MLD₅₀ 역가는 계산될 수 없다(최소 2.2 log₁₀ MLD₅₀/mL 미만).

TV3112 MSL 및 TV3112 WSL은 YF-VAX® 모균주에 비해 현저하게 약화된 신경독성을 나타냈고, 이들의 MLD₅₀ 역가는 평가될 수 없었다.

실시예 3: 마우스 모델에서 vYF 균주 후보백신의 내장친화성 및 신경친화성

병원성 백신 균주와 약독화 백신 균주를 차별화할 수 있도록 개발된 I형 IFN 수용체 결핍 마우스에 대한 접종을 기반으로 한 검정(Meier et al., 2009; Erickson and Pfeiffer, 2015)으로 6종의 vYF(Vero 세포 적응 황열병 바이러스) 예비마스터 시드 로트(pMSL) 후보백신의 내장친화성 및 신경친화성을 평가하였다. I형 IFN 수용체에 대한 A129 면역결핍 마우스 KO는 영장류 및 인간의 야생형 YF 바이러스 감염을 모방하는 것으로 설명된다(Meier et al., 2009). 따라서, 이러한 마우스 모델은 약독화되지 않은 황열병 바이러스로 인한 내장친화성 질병을 연구하는 데 적합한 것으로 여겨진다.

3.1/ 방법

3.1.1/ 그룹 정의

6마리의 4~8주령 암컷 A129 마우스의 15개 그룹(A 내지 O 그룹)에게 아래 표 4에 기재된 바와 같은 4 log₁₀ CCID_CCID50/용량의 6종의 pMSL 후보백신 각각 또는 Stamaril® 기준백신을 투여하였다(애주번트 없음; 피하 투여 경로; D0에 200 μl).

3.1.2/ 연구 일정

연구 일정은 도 2에 설명되어 있다.

D6에 C, E, G, I, K, M, O 그룹의 6마리 마우스를 안락사시키고 이들의 기관을 샘플링하고, D11에 B, D, F, H, J, L, N 그룹의 6마리 마우스를 안락사시키고 이들의 기관을 샘플링하였다. D4에 A, B, D, F, H, J, L, 및 N 그룹에서 중간 혈액 샘플을 채취하였다. PBS 대조군의 경우, 6마리의 마우스만 포함되었고 D11에 샘플링되었다(A 그룹).

3.1.3/ 마우스 임상 관찰 및 채점

아래 표 5에 기재된 채점표에 따라, 접종 후 11일 동안 매일 동물을 관찰하였다. D3에서 실험 마지막 날인 D11까지 매일 체온을 모니터링하고 기록하였다.

실험 과정에서, 다음과 같은 사건이 발생할 경우 동물을 안락사시켰다.

- 고통의 징후(악액질, 약화, 움직이거나 먹기 어려움)

- 복합 독성(혹, 경련)

- 일반 양태 점수 = 3 + 자극에 대한 반응 = 3

- 20% 초과의 체중 감소

죽은 채 발견된 모든 동물은 부검되었다.

3.1.4/ 생물학적 샘플링

a) D4에, 턱밑 정맥에서 중간 혈액 샘플을 마취하에 채취하였다. 응고 활성화제 및 혈청 분리제가 들어있는 바이알(BD Microtainer SST)에 약 200 μL의 혈액을 수집하였다.

b) D6 및 D11에, 마취하에 모든 동물에서 경동맥 부위의 방혈 후 혈액 샘플을 채취하였다. 응고 활성화제 및 혈청 분리제가 들어있는 바이알(BD Vacutainer SST)에 약 1 mL의 혈액을 수집하였다.

c) 기관 채취는 멸균 조건에서 수행되었다. 동물의 해부에 사용된 기구는 RNaseZap^TM 오염제거 용액으로 미리 세정하였다. 방혈 후 가능한 한 빨리 모든 마우스의 기관, 즉 뇌, 간, 및 비장을 모두 샘플링한 다음, 마취하에 경추 탈골로 동물을 안락사시켰다.

간의 경우, 1 mL의 RNA later^TM 용액이 들어있는 바이알에 바이러스 수치 검출 전용 직경 7 mm의 생검 펀치 2개를 넣었다.

뇌와 비장의 경우, 1 mL의 RNA later^TM 용액이 들어있는 바이알에 바이러스 수치 검출 전용 2개의 절반부를 넣었다.

3.1.7/ 분석 시험

a) 바이러스혈증

제조업체의 지침에 따라 Tecan Evoware 자동화 RNA 추출 워크스테이션에서 Macherey Nagel NucleoSpin® 96 바이러스 키트로 140 μL의 각각의 개별 혈청 샘플로부터 전체 게놈 RNA를 추출하고, 최종 부피 140 μL의 뉴클레아제가 없는 물에 두 단계로 용리시켰다.

추출 직후, (문헌[Mantel et al. (2008)]에 기재된 바와 같이) YF-NS5 qRT-PCR로 RNA 정량화를 수행하였다. qRT-PCR은 YF NS5 유전자의 보존 영역을 표적화하여 YF 바이러스 게놈의 존재를 검출한다.

b) 기관의 바이러스 수치

생검 펀치를 RNA later^TM 용액에서 -80℃로 동결시켰다. 해동시, 각각의 기관 샘플의 무게를 측정하였다.

공급업체의 권장 사항에 규정된 바와 같이 Trizol^TM(Invitrogen®)/RNeasy^TM(Qiagen®) 결합 방법을 이용해 기관 펀치로부터 전체 RNA를 추출하였다.

이어서, 정제 RNA 샘플에서의 바이러스 RNA의 존재를 문헌[Mantel et al. (2008)]에 기재된 바와 같이 YF-NS5 qRT-PCR 검정을 이용해 정량화하였다. qRT-PCR은 YF NS5 유전자의 보존 영역을 표적화하여 YF 바이러스 게놈의 존재를 검출한다.

각각의 qRT-PCR 실행은 2개의 비주형 대조군(음성 qRT-PCR 대조군) 및 CYD-3 바이러스 현탁액에 기반한 2개의 양성 대조군을 포함하였다.

실행을 검증하기 위해서는, 모든 음성 대조군이 검출 한계(LOD) 미만이어야 하고 양성 대조군은 대조군 차트에 포함되어야 했다.

희석 인자로 인해 100 mg의 기관 샘플에 대해, 검출 한계는 기관 1 mg당 1 Geq로 계산되었다.

3.2/ 결과

3.2.1/ 임상 징후

상기 표 5에 기재된 채점표에 따라, 접종 후 매일 모든 동물을 관찰하였다: A 내지 O 그룹의 모든 마우스는 3일차부터 6일차까지 매일 점수를 매기고, A, B, D, F, H, J, L, 및 N 그룹의 모든 마우스는 추가로 11일차까지 매일 점수를 매겼다.

각 시점에서 각 그룹에 대해 3일차부터 11일차까지 각각의 기준, 즉 일반 양태(GA), 자극에 대한 반응(RS), 신경학적 징후(NS), 및 호흡(B)에 대해 평균 점수를 계산하였다. 예상대로, 식염수 대조군(PBS, A 그룹)을 주사한 모든 A129 마우스의 경우, 모든 모니터링 기간 동안 어떤 동물에 대해서도 특이적 임상 점수는 기록되지 않았다.

Stamaril® 기준백신 또는 vYF pMSL 후보백신들 중 하나를 투여한 모든 A129 마우스의 경우, 시점 및 기준에 관계없이 각각의 기준에 대한 평균 점수가 1.5 미만으로 임상 징후는 경미하였다(GA < 1.5; RS, NS, 및 B <1).

3일, 4일, 및 5일차 동안 특이적 임상 점수는 기록되지 않았고, 이어서 6일 및 7일차까지 소수의 마우스에 대해 1/0/0/0 또는 2/0/0/0(GA/RS/NS/B)의 일부 점수가 기록되었다. 10일 및 11일차에, Stamaril® 기준백신 또는 vYF pMSL 후보백신들 중 하나를 투여한 모든 A129 마우스는 낮은 점수를 나타냈고(일부 마우스의 GA 점수 = 1 또는 2, RS, NS, 및 B 점수 = 1), 예외적으로 TV2232를 투여한 1마리의 마우스(F 그룹)가 10일차에 약간의 떨림 표현형, 운동 합병증, 부복, 및 호흡 곤란(점수 3/2/3/2)를 나타내어 윤리적 이유로 안락사시켰다.

3.2.2/ 체중 모니터링

0일, 3일, 4일, 5일, 및 6일차에 모든 마우스(A 내지 O 그룹)의 체중을 측정하고, 7일, 10일, 및 11일차에 나머지 그룹(A, B, D, F, H, J, L, 및 N)의 모든 마우스의 체중을 측정하였다. 각 시점에서 각각의 개별 마우스에 대해 0일차 대비 체중 감소 백분율을 계산하였다.

Stamaril® 기준백신으로 면역화한 후, 11일의 모니터링 기간 동안 약간의 체중 감소가 관찰되었다(D11에 5% 미만의 체중 감소를 의미).

Stamaril® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신으로 면역화한 후, Stamaril 대조군의 경우와 마찬가지로, 급격한 체중 감소는 관찰되지 않았고, 예외적으로 클론 TV2232로 면역화한 1마리의 마우스가 10일차에 20% 초과의 체중 감소를 나타냈다. 이 마우스는 윤리적 이유로 안락사되어야 했다(상기 3.2.1 참조).

YFVAX® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신인 TV3111, TV3112, 및 TV4221로 면역화한 후, 5일 내지 6일차까지 안정적인 체중이 관찰되고 기록되었고, 모니터링 기간이 끝날 때까지 약간의 체중 증가가 관찰되었다(D11에 5% 미만의 체중 증가를 의미).

3.2.3/ 혈청 및 기관의 바이러스 수치

a) 혈청에서 - 도 3

각각의 그룹 및 시점에 대해 계산된 개별 바이러스혈증뿐만 아니라 기하 평균 역가(GMT) 및 표준 편차가 도 3에 도시되어 있다.

예상대로, 0일차에 PBS를 투여한 A129 마우스에서는 4일차에 바이러스혈증이 검출되지 않은 반면(3 log₁₀ Geq/mL의 LOD 미만), Stamaril® 기준백신을 투여한 A129 마우스에서는 4일 및 6일차에 4 내지 5 log₁₀ Geq/mL의 기하 평균 바이러스혈증 역가가 검출되었다.

vYF pMSL 후보백신으로 면역화한 후, Stamaril® 대조군으로 면역화한 후 유도된 바이러스혈증에 비해 유의한 바이러스혈증의 우세는 관찰되지 않았고(시점에 관계없이 TV2212, TV2232, TV2241, TV3111, 및 TV3112에 대한 p-값은 모두 0.2 초과), 예외적으로 YF-VAX® 계통에서 유래된 TV4221이 주사 후 4일차에 Stamaril® 대조군보다 훨씬 더 높은 바이러스혈증을 유도했다(p-값 = 0.001).

b) 간에서 - 도 4

결과는 기관 1 mg당의 log₁₀ Geq로 표시된다. 각각의 그룹 및 시점에 대해 계산된 개별 바이러스 수치뿐만 아니라 기하 평균 및 표준 편차가 도 4에 도시되어 있다.

예상대로, 0일차에 PBS를 투여한 A129 마우스에서는 11일차에 간 바이러스 수치가 검출되지 않았고(1 log₁₀ Geq/mg의 LOD 미만), Stamaril® 기준백신을 투여한 A129 마우스에서는 유사하게 간 바이러스 수치가 검출되지 않거나 낮게 검출되었다(6일차에 GMT = 0.8, 11일차에는 LOD 미만).

vYF pMSL 후보백신으로 면역화한 후, Stamaril® 대조군으로 면역화한 후 유도된 간 바이러스 수치에 비해 유의한 간 바이러스 수치의 우세는 관찰되지 않았다(6일차에 TV2212, TV2232, TV2241, TV3111, TV3112, 및 TV4221에 대한 p-값은 모두 0.1 초과, 11일차에는 LOD 미만의 비응답체 수가 많기 때문에 통계 분석을 수행하지 않았음).

c) 뇌에서 - 도 5

결과는 기관 1 mg당의 log₁₀ Geq로 표시된다. 각각의 그룹 및 시점에 대해 계산된 개별 바이러스 수치뿐만 아니라 기하 평균 역가 및 표준 편차가 도 5에 도시되어 있다.

예상대로, 0일차에 PBS를 투여한 A129 마우스에서는 11일차에 뇌 바이러스 수치가 검출되지 않은 반면(1 log₁₀ Geq/mg의 LOD 미만), Stamaril® 기준백신을 투여한 A129 마우스에서는 뇌 바이러스 수치가 검출되었다(6일차에 GMT = 0.6, 11일차에는 3.7).

vYF pMSL 후보백신으로 면역화한 후, Stamaril® 대조군으로 면역화한 후 유도된 뇌 바이러스 수치에 비해 유의한 뇌 바이러스 수치의 우세는 관찰되지 않았다(TV2212 및 TV2232에 대한 p-값은 0.06 초과). 또한, TV2241, TV3111, TV3112, 및 TV4221은 Stamaril® 대조군보다 훨씬 더 낮은 뇌 바이러스 수치를 유도했다(p-값은 0.003 이하).

d) 비장에서 - 도 6

결과는 기관 1 mg당의 log₁₀ Geq로 표시된다. 각각의 그룹 및 시점에 대해 계산된 개별 바이러스 수치뿐만 아니라 기하 평균 역가 및 표준 편차가 도 6에 도시되어 있다.

예상대로, 0일차에 PBS를 투여한 A129 마우스에서는 11일차에 비장 바이러스 수치가 검출되지 않은 반면(1 log₁₀ Geq/mg의 LOD 미만), Stamaril® 기준백신을 투여한 A129 마우스에서는 비장 바이러스 수치가 검출되었다(6일차에 GMT = 4.1, 11일차에는 2).

vYF pMSL 후보백신으로 면역화한 후, Stamaril® 대조군으로 면역화한 후 유도된 비장 바이러스 수치에 비해 유의한 비장 바이러스 수치의 우세는 관찰되지 않았다(시점에 관계없이 TV2212, TV2232, TV2241, TV3111, TV3112, 및 TV4221에 대한 p-값은 모두 0.09 초과).

3.2.4/ 생존율

각 그룹(A, B, D, F, H, J, L, 및 N 그룹)에 대한 생존율을 계산하기 위해, 4 log₁₀ CCID₅₀/용량의 Stamaril® 또는 6종의 vYF pMSL 후보백신 중 하나로 피하 면역화한 후 생존 마우스의 수를 11일 동안 매일 기록하였다.

카플란-마이어 곡선으로 도시된 바와 같이(도 7), PBS 버퍼, Stamaril®, 또는 5종의 vYF 균주 TV2212, TV2241, TV3111, TV3112, 및 TV4221 중 하나를 투여한 경우, 연구 과정 내내 100%(6마리 마우스 중 6마리)의 마우스가 생존했다.

반대로, Stamaril® 계통에서 유래된 TV2232 균주를 투여한 F 그룹에서는 10일차에 1마리의 마우스가 윤리적 이유로 안락사되었으므로(상기 3.2.1 참조) 80%의 마우스만이 생존했다.

실시예 4 - 햄스터 모델에서 vYF 균주 후보백신의 면역원성

햄스터 모델에서의 6종의 vYF pMSL 후보백신의 면역원성을 평가하고 Stamaril® 기준백신과 비교하였다.

4.1/ 방법

4.1.1/ 그룹 정의

각 그룹에는 15마리의 5~6주령 암컷 골든 시리아 햄스터가 포함되었고, 6종의 pMSL 후보백신 각각에 대해 두 가지 용량, 즉 2.5 log₁₀ CCID₅₀/용량의 낮은 차선적 용량 및 5.5 log₁₀ CCID₅₀/용량의 고용량을 투여하였다.

Stamaril® 기준백신의 경우, 상기 두 가지 시험 용량에 대해 그룹당 10마리의 햄스터만 포함되었다.

총 200마리의 암컷 골든 시리아 햄스터를 아래 표 6에 기재된 14개의 하기 그룹(A 내지 N 그룹) 중 하나에 무작위로 할당하였다(애주번트 없음; 피하 투여 경로; D0 및 D26에 200 μl).

4.1.2/ 연구 일정

연구 일정은 도 8에 요약되어 있다.

중재 계획 및 중재 세부 사항은 아래 표 7에 기재되어 있다.

4.1.3/ 생물학적 샘플링 및 혈청중화 검정

a) 생물학적 샘플링

D0, D26, 및 D41에 모든 동물의 후안구동(ROS)에서 중간 혈액 샘플을 마취하에 채취하였다. 최종 혈액 샘플링은 심장내 천자를 통해 마취하에 수행되었다. 마취는

(150 mg/kg) 및 Rompun(10 mg/kg)을 복강내 경로로 200 μl의 양으로 투여하여 수행되었다.

응고 활성화제 및 혈청 분리제가 들어있는 바이알(BD Microtainer SST)에 혈액을 수집하였다. +4℃에서 하룻밤 또는 37℃에서 2시간 후, 혈액을 10분 동안 2000 x g로 원심분리하고, 혈청을 수집하여 분석할 때까지 -20℃에 보관하였다.

b) 혈청중화 검정

면역화한 동물의 혈청에 존재하는 기능적 중화 항체를 첫 번째 주사로부터 D0, D26, 및 D41에 적정하였다.

간단히 말해서, 열-비활성화된 혈청을 1:5부터 시작하여 IMDM + 4% 소태아 혈청에서 연속적으로 2배 희석하였다. IMDM 중의 4000 μPFU/mL를 얻기 위해, Vero 세포에서 성장한 YF-17D Stamaril® 바이러스를 희석하고, 2배 희석된 혈청 샘플(v/v)과 함께 90분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 바이러스/혈청 혼합물을 96-웰 플레이트 내 Vero 세포에 첨가하고 45 +/- 2시간동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, 면역염색 전에 세포를 85% 아세톤으로 고정시켰다. 플레이트를 PBS + 0.05% Tween 20 + 2.5% 탈지유로 차단하고, 먼저 항플라비바이러스 단클론 항체 4G2와 함께 인큐베이팅하고, 두 번째로 염소 항마우스 IgG-HRP 접합체와 함께 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 플레이트를 Trueblue^TM 발색 물질로 염색하였다. Microvision^TM의 Viruscope 리더로 플라크를 계수하였다.

최종 혈청중화 항체 역가는 최소 제곱법을 이용해 계산되며, 바이러스 플라크의 50% 중화를 나타내는 희석의 역수에 해당한다. 검정의 LOD는 10이었고, 이는 최종 부피의 첫 번째 역 희석에 해당한다.

그룹당 평균을 계산하기 위해, 10 미만의 모든 역가에 임의의 역가 5(LOD의 절반)를 할당하였다.

4.2/ 결과 - 혈청중화

기준선(D0), 제1 면역화 4주 후(D26), 및 제2 면역화 2주 후(D41)에 모든 동물에서 채취한 개별 혈청 샘플을 혈청중화 검정하여 Vero 세포에서의 황열병 17D 백신 균주에 대한 중화 활성을 모니터링하였다. 기하 평균 역가(GMT) 뿐만 아니라 개별 중화 역가 및 95% 신뢰 구간(CI)이 도 9 및 도 10에 도시되어 있다.

예상대로, 기준선(D0)에 비투여 햄스터에서 중화 항체 역가는 검출되지 않거나 낮게 검출되었고(40 이하), pMSL vYF 후보백신 또는 Stamaril® 기준백신에 관계없이 그룹 GMT는 12 이하였다. D0에 얻은 모든 개별 데이터의 통계 분석에 의해 응답체 임계치는 20.87(1.32 log₁₀)로 정의되었다(비율이 0.99이고 위험 알파가 5%인 우수한 허용 구간).

반응 역학과 관련하여, 제1 면역화 1개월 후(D26; 도 9), 면역화한 모든 그룹에서 현저하게 증가된 중화 반응이 관찰되었고, 중화 GMT의 증가는 D0 기준선에 비해 최소 10배 내지 850배였다. 제2 면역화 2주 후(D41; 도 10), 중화 GMT는 모든 그룹에서 더 증가했고, 중화 GMT의 증가는 D26에 비해 0.8배 내지 7.5배였다.

Stamaril® 기준백신에 의해 유도된 중화 항체 반응은 5.5 log₁₀ CCID₅₀ 용량(GMT는 D26 및 D41에 각각 5061 및 11714)의 경우보다 2.5 log₁₀ CCID₅₀ 용량(GMT는 D26 및 D41에 각각 281 및 544)의 경우 훨씬 더 낮았다(p-값은 D26 및 D41에 각각 0.007 및 0.023). 참고로, 5.5 log₁₀ CCID₅₀ 용량을 투여한 그룹의 햄스터는 100%가 제1 면역화(D26)에 바로 응답체로 정의된 반면(20.87 임계치 초과), 2.5 log₁₀ CCID₅₀ 용량을 투여한 그룹의 햄스터는 60% 및 70%만 각각 D26 및 D41에 응답체로 확인되었다.

Stamaril® 계통 TV2212, TV2232, 및 TV2241에서 유래된 vYF pMSL 후보백신의 경우, 5.5 log₁₀ CCID₅₀에 대한 GMT의 범위가 D26에 115 내지 373이고 D41에 465 내지 955인 것과 비교하여 2.5 log₁₀ CCID₅₀ 용량에 대한 GMT의 범위는 D26에 144 내지 505이고 D41에 115 내지 1159로, 두 시험 용량 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(vYF pMSL 후보백신 및 시점에 관계없이 p-값은 모두 0.07 초과). Stamaril® 계통에서 유래된 어떤 vYF pMSL 후보백신도 시험 용량 및 면역화 일정(제1 또는 제2 면역화 후)에 관계없이, 면역화한 모든 동물에서 지속적인 중화 항체 반응을 유도할 수 없었다. TV2212, TV2232, 및 TV2241로 면역화한 경우, 응답체 햄스터의 비율은 용량에 관계없이 1차 면역화 후 53% 내지 93%, 2차 면역화 후 43% 내지 93%의 범위로 확인되었다.

YF-VAX® 계통 TV3111, TV3112, 및 TV4221에서 유래된 vYF pMSL 후보백신의 경우, 두 시험 용량 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았고(vYF 균주 및 시점에 관계없이 p-값은 모두 0.06 초과), 예외적으로 TV3111의 경우, 2.5 log₁₀ CCID₅₀ 용량은 5.5 log₁₀ CCID₅₀보다 훨씬 더 높은 중화 항체 역가를 유도하였다(p-값은 D26 및 D41에 각각 0.04 및 0.003). 2.5 log₁₀ CCID₅₀ 용량의 경우, 유도된 GMT는 높았고 D26에 3939 내지 8898, D41에 3771 내지 13674의 범위인 반면, 5.5 log₁₀ CCID₅₀ 용량의 경우, GMT는 D26에 2071 내지 5145, D41에 1821 내지 6421의 범위였다. YF-VAX® 계통에서 유래된 vYF pMSL 후보백신은 1차 면역화 후 면역화한 대부분의 동물에서 지속적인 중화 항체 반응을 유도할 수 있었다(2.5 log₁₀ CCID₅₀ 용량의 TV3111의 경우 응답체의 93% 및 YF-VAX® 계통에서 유래된 다른 모든 vYF pMSL 후보백신의 경우 시험 용량에 관계없이 응답체의 100%). 2차 면역화 후, YF-VAX® 계통에서 유래된 모든 vYF pMSL 후보백신은 용량에 관계없이, 면역화한 햄스터의 100%에서 지속적인 중화 항체 반응을 유도할 수 있었다.

각각의 vYF pMSL 후보백신과 Stamaril® 기준백신의 비교와 관련하여, YF-VAX® 계통 TV3111, TV3112, 및 TV4221에서 유래된 vYF pMSL 후보백신 2.5 log₁₀ CCID₅₀ 용량에 의해 유도된 중화 반응은 Stamaril® 기준백신으로 얻은 것보다 유의하게 비열등성이었다(p-값은 D26 및 D41에 각각 0.010 이하 및 0.047 이하). 유의한 비열등성은 Stamaril® 계통에서 유래된 vYF 균주에서도 나타나지 않았고(용량 및 시점에 관계없이 p-값은 모두 0.25 이상), 5.5 log₁₀ CCID₅₀으로 투여된 YF-VAX® 계통에서 유래된 vYF 균주에서도 나타나지 않았다(시점에 관계없이 p-값은 0.49 이상).

실시예 5 - 원숭이 모델에서 vYF TV3112 균주의 독성 및 면역원성

비인간 영장류(NHP)에서 예비 독성 연구 및 면역원성 연구를 수행하였다. 비인간 영장류, 특히 히말라야 원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이는 바이러스혈증으로 측정되는 안전성과 감염성, 및 플라비바이러스(뎅기열, 황열병 등)에 대한 후보백신의 면역원성을 평가하는 데 통상적으로 사용된다. 황열병과 관련하여, 원숭이가 천연 숙주이고, 바이러스는 원숭이에서 처음 분리되었으며, 이 모델에서 백신 균주의 약독화가 평가되었다. 2000년대부터 "작은 동물" 모델이 설명되었으며, vYF pMSL 후보백신 선택을 위해 수행되는 후보백신의 특정 특성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 이 모델(햄스터, 마우스 A129)은 한계가 있으며, 원숭이는 오늘날까지 여전히 인간에 비해 가장 예측 가능한 최고의 표준 모델로서 문헌(예를 들어, Julander (2016), Mason et al. (1973), Monath et al. (2010), 및 Moulin et al. (2013))에 널리 설명되어 있다. 또한, 이 모델은 규제 지침에서 권장된다.

5.1/ 방법

5.1.1/ 그룹 정의 및 목적

모리셔스에서 수입한 9마리의 2년령 수컷 사이노몰거스 원숭이(Macaca fascicularis)의 3개 그룹을 500 μL의 Stamaril®(4.2 log₁₀ CCID₅₀/용량에 해당하는 1회 인간 용량), 1회 용량의 YF-VAX®(6.2 log₁₀ CCID₅₀), 또는 4.2 log₁₀ CCID₅₀의 vYF TV3112 WSL 후보백신으로 SC 경로를 통해 면역화하였다.

1차 판독값으로서, i) 백신 안전성, ii) YF-특이적 바이러스혈증 및 기관(간, 비장, 신장, 림프절, 및 뇌)의 바이러스 수치(문헌[Mantel et al. (2008)]에 기재된 바와 같이 YF-NS5 qRT-PCR에 의한 바이러스 RNA 정량화로 평가)를 유도하는 능력, 및 iii) 보호의 상관관계로서 정의된 황열병-특이적 혈청중화 항체 반응(μPRNT₅₀ 검정으로 평가)의 유도를 평가하기 위해 후보백신을 각각의 기준백신과 비교하였다.

2차 판독값으로서, 백신 성능의 다른 잠재적 바이오마커를 식별하기 위해, 다양한 파라미터를 모니터링하였다. 이러한 분석은 i) 항체 반응의 지속성, 및 ii) 기억 반응을 포함한 B세포 및 T세포 면역 반응을 다룬다.

5.1.2/ 마취

면역화를 위해 특정 경우(예를 들어, 적응 기간 중에 다른 조작과 결합된 혈액 샘플링의 경우 또는 마취 없이 원숭이 혈액을 샘플링하기 어려운 경우)에 가벼운 마취를 수행하였다. 10 mg/kg의 케타민(Imalgene 1000, MERIAL®)을 허벅지에 근육내 주사하였다.

5.1.3/ 모니터링

모든 동물은 D-29 및 D0에 체중이 측정되었고, D7까지 임상 징후에 대해 매일 관찰되었으며, D-17에 그리고 D0, D3, D4, D5, D6, 및 D7의 바이러스혈증 예상 기간 중에 개별 체온(트랜스폰더 시스템)이 기록되었다. D1, D3, 및 D7에 모든 원숭이에서 혈액분석, 생화학, 및 혈액 바이러스혈증을 평가하였다 이어서, 각 그룹의 3마리 원숭이를 안락사시키고, D7에 기관 평가에서의 조직병리학 및 바이러스 수치를 위해 기관을 샘플링하였다. 각 그룹의 남은 6마리 원숭이의 체중을 D27, D60, D90, D122, D153, 및 D181에 측정하고, D10 및 D14의 바이러스혈증 예상 기간 중에 개별 체온을 추가로 기록하였다. 각 그룹의 남은 6마리 원숭이는 또한, D221까지 임상 징후에 대해 매일 관찰되었다. D27, D60, D90, D122, D153, D181, 및 D221에 각 그룹의 남은 6마리 원숭이에서 혈청중화, T세포 및 기억 B세포 검정을 위한 혈액 샘플을 채취하였다.

5.1.4/ 시험 방법

Vero 세포에서 μPRNT50 방법을 이용해 YF-특이적 혈청중화 항체를 적정하였다. 간단히 말해서, 열-비활성화된 혈청을 1:5부터 시작하여 IMDM(THERMOFISHER SCIENTIFIC) + 4% FCS에서 연속적으로 2배 희석하였다. IMDM 중의 4000 μPFU/mL를 얻기 위해, Vero 세포에서 성장한 YF-17D Stamaril® 바이러스를 희석하고, 2배 희석된 혈청 샘플(v/v)과 함께 90분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 바이러스/혈청 혼합물을 96-웰 플레이트 내 Vero 세포에 첨가하고 45 +/- 2시간동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, 면역염색 전에 세포를 85% 아세톤으로 고정시켰다. 플레이트를 PBS + 0.05% Tween 20 + 2.5% 탈지유로 차단하고, 먼저 항플라비바이러스 단클론 항체 4G2와 함께 인큐베이팅하고, 두 번째로 염소 항마우스 IgG-HRP 접합체와 함께 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 플레이트를 Trueblue^TM 발색 물질로 염색하였다. Microvision^TM의 Viruscope 리더로 플라크를 계수하였다. 최종 역가는 최소 제곱법을 이용해 계산되며, 플라크의 50% 중화를 나타내는 희석의 역수에 해당한다.

μPRNT50 검정의 LOD는 시험된 혈청의 첫 희석이 1:10이었을 때 약 20 μPRNT50이었다. 그룹당 평균을 계산하기 위해, LOD 미만의 모든 샘플에 LOD의 절반의 임의의 값(즉, 10 μPRNT50)을 할당하였다.

기억세포 반응은 ELISPOT로 측정되었다. 형광 결합 면역스팟(FLUOROSPOT)은 항원 특이성에 관계없이(총 IgM 또는 총 IgG) 항체를 분비하는 개별 기억 B세포를 검출하고 계수하는 데 사용된다.

D0에, 동결된 PBMC를 10% FBS 및 100 μg/mL의 DNase가 보충된 RPMI 배지(THERMOFISHER SCIENTIFIC®)에서 해동하고 37℃, 5% CO₂에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 1시간 후, 세포를 10⁶개 세포/mL로 희석하고, rIL2(10 μg/mL)가 보충된 RPMI 10% FBS에서 37℃, 5% CO₂로 4일 동안 인큐베이팅하여 자극하였다.

D3에, 저형광 PVDF 멤브레인(MERCK Millipore)이 장착된 96-웰 FluoroSpot 마이크로플레이트의 멤브레인을 35 μL의 35% 에탄올로 1분 동안 미리 습윤시켰다. 각각의 웰을 200 μL의 PBS 1X로 2회 세척하였다. 이어서, 마이크로플레이트를 1:80으로 희석된 YF-17D 감염 Vero 세포 용해물(SANOFI PASTEUR®) 또는 15 μg/mL로 희석된 원숭이 IgG 및 IgM에 특이적인 단클론 항체의 혼합물로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다.

D4에, 플레이트를 PBS로 세척한 후, RPMI 10% FBS로 37℃에서 2시간 이상 차단하였다. 플레이트 세척 후, 2x10⁵ 또는 4x10⁵개의 자극된 PBMC를 YF-17D 감염 Vero 세포 용해물로 코팅된 웰에 첨가하였다. 다양한 범위로 희석된 자극된 세포(5x10³ 내지 6,2x10²)를 항IgG 및 항IgM 항체로 코팅된 웰에 첨가하였다.

5시간 후, 플레이트를 PBS 1X로 3회 세척하고, 밤새 4℃에 보관하였다.

D7에, 플레이트를 PBS 1X-BSA 0.5%(150 μL/웰)로 6회 세척하였다. 세척 단계 후, 100 μL/웰의 항원숭이 IgM-FITC 및 IgG-CY3 항체를 각각 실온의 암실에서 2시간 동안 PBS1X-BSA 0.5%에 1/500의 희석으로 첨가하였다. 플레이트를 PBS 1X-BSA 0.5%(150 μL/웰)로 다시 6회 세척하였다. 판독할 때까지 플레이트를 암실에서 5℃±3℃에 보관하였다.

항체 분비 세포에 해당하는 각각의 스팟을 자동 FLUOROSPOT 플레이트 리더(Microvision^TM)로 계수하였다. 결과를 10⁶개 세포당 ACS 분비 세포의 수로 표시하였다.

T세포 반응은 분리된 PBMC에서 IFN-γ IL-2 반응 Dual FluoroSpot(Mabtech®의 FS-2122-10 원숭이 IFN-γ/IL-2 FluoroSpot 키트)으로 측정되었다.

간단히 말해서, FluoroSpot PVDF 멤브레인 장착 마이크로플레이트를 35% 에탄올로 전처리하고, 세척하고, 4℃에서 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 15 μg/mL 농도의 원숭이 IFN-γ(클론 GZ-4, Mabtech®) 및 원숭이 IL-2(클론 IL2M-I/249, Mabtech®)에 대한 단클론 항체와 함께 인큐베이팅하여 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척한 후, 10% FCS가 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco®)로 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하여 차단하였다. PBMC(4 × 10⁵)를 0.1 μg/mL의 단클론 항체 CD28-A(Mabtech®)와 함께 각각의 웰에 첨가하였다. YF-Env 및 YF-NS3 펩티드 풀(YF-Env 및 YF-NS3 아미노산 서열을 포함하는 15량체 중첩 펩티드)을 1 μg/mL의 배양 배지 중의 각 펩티드의 최종 농도로 첨가하였다. 항CD3 mAb(Mabtech®)를 2.5 μg/mL의 양성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 5% CO₂를 함유한 분위기 중의 37℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS로 6회 세척하였다. FITC 항IFN-γ 항체(클론 7-B6-1-FS-FITC, Mabtech®) 및 비오틴화 항IL-2 항체(IL2-비오틴 MT8G10, Mabtech®)를 PBS 중의 0.5% BSA에 각각 1:200 및 1 μg/mL의 농도로 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. PBS로 3회 세척한 후, PBS 중의 0.5% BSA에 희석된 항FITC-490(1:200, Mabtech®) 및 스트렙타비딘 SA-550(1:200, Mabtech®)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션을 수행하고 PBS로 6회 세척하였다. 판독할 때까지 플레이트를 암실에서 5℃±3℃에 보관하였다. IFN-γ 또는 IL-2 분비 세포(IFN-γ SC 또는 IL5 SC)뿐만 아니라 IFN-γ 및 IL-2를 모두 분비하는 다기능 T세포에 해당하는 형광 스팟을 자동 FLUOROSPOT 플레이트 리더(Microvision^TM)로 계수하였다. 결과를 10⁶개 PBMC당 IFN-γ 또는 IL-2 분비 세포의 수로 표시하였다.

YF 백신 바이러스혈증 및 기관의 바이러스 수치를 (문헌[Mantel et al. (2008)]에 기재된 바와 같이) YF-NS5 qRT-PCR로 모니터링하였다.

5.2/ 결과

생약독화 황열병 백신에 대한 보호의 상관관계는 WHO TRS 978 부록 5에서, 이전에 혈청 음성이었던 개체에서 측정 가능한 중화 항체를 유도하는 것, 예를 들어 검출 한계보다 높은 PRNT 역가로서 정의된다. 미리 설정된 보호 임계치(LOD = 20)를 훨씬 초과하는 중화 항체가 D14에 최소 9개월 동안 모든 원숭이에서 검출되었다(도 11 참조). 중화 항체 역가는 현재 백신으로 면역화한 후 검출되는 역가와 크게 다르지 않았다.

이러한 오래 지속되는 중화 항체 반응은 vYF TV3112 백신접종 후 14일째부터 221일째까지 말초 혈액에서 모니터링된 지속적인 B 기억세포 빈도에 의해 또한 뒷받침되었다(도 12 및 도 13 참조). 이들 데이터는 IgM(도 12) 및 IgG(도 13) 기억 B세포 모두 백신접종 후 14일째에 발생하여 최소 221일의 연구 기간 동안 지속되었음을 보여준다. vYF TV3112와 관련하여, 유도된 기억 B세포의 역학 및 백분율은 기준백신 Stamaril® 및 YF-VAX®에 의해 유도된 기억 B세포의 프로파일과 유사했다.

또한, YF-ENV 및 YF-NS3에 특이적인 Th1 세포 반응(IFN-γ 및 IL-2 분비 세포)은 vYF TV3112 백신접종 후 유도되었으며, Stamaril® 또는 YF-VAX®로 백신접종한 후 관찰된 세포 반응과 유사했다(도 14 참조).

이 연구는 또한, 대조군 백신과 비교하여 vYF TV3112의 다음과 같은 보존된 안전성 프로파일을 보여주었다: 임상 징후 없음, 체중 감소 없음, 온도 변화 없음, 혈액학적(백혈구 및 적혈구, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 망상적혈구, 혈소판, 헤모글로빈, 헤마토크리트, 평균 적혈구 용적, 평균 적혈구 혈색소량) 또는 생화학적(알칼리 포스파타제, 알라닌 전이효소, 아스파르테이트 전이효소, 감마 글루타밀 전이효소, C-반응성 단백질, 담즙산, 총 빌리루빈, 알부민, 혈중 요소 질소, 크레아티닌) 장애 없음(PLS-DA 통계 분석을 통한 Stamaril® 및 YF-VAX®와 통계적 차이 없음), 바이러스혈증이 없거나 매우 낮음(9마리 원숭이 중 1마리에서 4 log₁₀ Geq/mL 미만), 황열병 표적 기관에서 바이러스 RNA가 검출되지 않거나 매우 낮게 검출됨(야생형 Asibi 감염 후 관찰된 바이러스 수치보다 100 내지 10000배 낮음)(도 15 참조), 황열병 표적 기관에서 백신 관련 조직병리학적 소견 없음.

실시예 6 - 마카크 모델에서 치명적인 공격에 대해 vYV TV3112 균주에 의해 유도된 보호

목적은 vYF TV3112 후보백신으로 면역화한 원숭이에서 황열병 바이러스 공격에 대한 보호를 평가하는 것이었다.

6.1/ 방법

6.1.1/ 동물

Stamaril®, YF-VAX®, 또는 vYF TV3112 후보백신으로 면역화한 지 9개월 후, 상기 실시예 5에서 연구된 3개의 동물 그룹 각각에서 D221에 남은 6마리 원숭이에게 황열병에 대해 Asibi 독성 균주를 접종하여 백신 효능을 평가하였다. 6마리의 비투여 대조군 원숭이의 다른 그룹에도 접종하였다.

6.1.2/ YFV 및 버퍼

접종은 Texas Medical Branch 대학(UTMB)의 황열병 바이러스 균주 Asibi(YFV)로 수행되었다. YFV(로트 19455, Vero 세포에서의 감염 역가 7.7 Log₁₀ CCID₅₀/mL)를 NaCl+HSA 버퍼(NaCl 0.4% + 인간 혈청 알부민(HSA) 2.5%)에 희석하였다. 각각의 동물에게 1 mL의 NaCl+HSA 버퍼 중의 10³ CCID₅₀의 YFV를 오른쪽 등 상부에 피하 접종하였다.

6.1.3/ 모니터링

Asibi 접종 후 28일 동안 동물을 추적하였다. 동물의 음식 소비와 행동을 매일 관찰하였다. 각각의 샘플링 시점에 직장 온도와 체중을 기록하였다. 혈액 샘플링은 아래 표 8에 기재된 바와 같이 수행되었다.

6.1.4/ 생활 관찰

주 7일 동물을 관찰하였다. 채혈할 때마다, 아래 표 9에 기재된 바와 같이 임상 검사를 수행하였다.

6.2/ 결과

백신접종한 모든 원숭이는 다음과 같은 공격 효과로부터 보호되었다: 바이러스혈증(낮은 바이러스혈증만, 즉 문헌[Mantel et al. (2008)]에 기재된 바와 같이 YF-NS5 qRT-PCR로 측정시, 단 하루 동안 2/6의 원숭이에서 3.6 log₁₀ GEq/mL 미만), 혈액학적 장애, 혈액 생화학적 장애, 및 사망.

이 연구에서, 백신접종하지 않은 대조군의 6마리 NHP 중 3마리가 공격에 살아남았지만, 6마리의 대조군 NHP는 모두 바이러스혈증(8 log₁₀ Geq/mL 초과), 림프구감소증, 혈소판감소증, 및 트랜스아미나제, CRP, 빌리루빈, 및 담즙산 수치가 크게 증가한 혈액 생화학적 장애를 나타냈다.

따라서, vYF TV3112 후보백신은 현재 이용 가능한 백신 Stamaril® 및 YF-VAX®와 마찬가지로, 황열병 백신에 대한 최고의 예측 동물 모델 중 하나인 사이노몰거스 원숭이를 야생형 Asibi 감염으로부터 보호할 수 있었다.

실시예 7 - 서열 분석

RNA 바이러스는 천연적으로 이러한 바이러스의 유사종 고유 특성에 따른 높은 유전적 다양성 수준을 나타낸다. 황열병 중합효소의 오류율이 RNA 바이러스에 대해 낮은 것으로 설명되지만, 중합효소 오류율은 감염 주기당 게놈당 약 10^-6개의 치환이다.

잘 정의된 바이러스 생성 프로세스는 동일한 바이러스 성장 조건을 항상 유지함으로써 이 현상을 최소한으로 제한하도록 설정된다. 그러나 통계적으로, 바이러스가 세포에서 복제될 때마다 바이러스 유사종이 지속적으로 생성되며, 변종이 바이러스에 성장 이점을 가져올 때마다 장기적으로 보존되고 증폭되어 초기 개체군을 점진적으로 대체한다.

또한, 새로운 바이러스 성장 시스템이 계란에서 Vero 세포 배양물로 이동함에 따라, 일부 적응 돌연변이가 발생할 것으로 예상된다. 특히, NS4B의 여러 돌연변이가 Vero 세포에서 성장하기 위한 바이러스의 양성 적응으로서 다양한 플라비바이러스 모델에서 설명되었다(Blaney et al., 2003; Tang et al., 2005; Beasley et al. 2013).

또한, 현재의 시드는 클로닝되지 않았으므로, 현재의 백신 균주에는 유사종의 혼합물이 공존한다. YF-VAX® 및 Stamaril® 백신의 게놈의 고처리량 시퀀싱에 의해 기준 서열을 먼저 확립한 후, 새로운 pMSL 후보백신 게놈을 이들과 비교할 것이다.

새로운 pMSL 후보백신은 2개의 클로닝 단계 후에 얻어지므로, 이들은 균질의 바이러스 개체군을 나타낸다.

7.3/ 방법

7.3.1/ 원칙

황열병 바이러스의 시퀀싱은 바이러스 RNA의 추출 및 정제 후에 수행된다.

이어서, RNA는 상보적 DNA로 역전사된 후, 특정 프라이머를 사용해 PCR에 의해 게놈이 완전히 증폭된다. 이어서, PCR 생성물은 Nextera® XT DNA 샘플 제조 키트(Illumina, Inc.)를 이용해 라이브러리를 형성하는 데 사용된다. 라이브러리의 형성은 여러 단계로 이루어진다. 먼저, 등몰 방식으로 앰플리콘이 조립된다. 이어서, 이들은 트랜스포좀(Tagmentase)을 이용해 단편화된다. 트랜스포좀은 DNA를 절단하고 어댑터를 추가한다. 이어서, 어댑터에 상보적인 프라이머를 이용해 PCR에 의한 증폭 단계가 수행된다. 이 단계는 단편의 양측에 인덱스(샘플 태깅에 사용)를 추가시킬 수 있고, 단편을 시퀀싱 지원에 관여시킨다. 마지막으로, 라이브러리는 Agencourt® 비드(AMPure® XP, Beckman Coultern Genomics, Inc.)를 사용해 정제되고, MiSeq 시퀀서(Illumina®, Inc.)를 사용해 시퀀싱된다.

서열이 확보되면, 이어서 CLC Genomics Workbench 소프트웨어(QIAGEN®)의 분석 모듈 "품질 기반 변이 검출(레거시)"로 분석이 수행된다.

7.3.2) RNA 추출

공급업체의 권장 사항에 따라 Qiamp 바이러스 키트(QIAGEN®)로 최소 농도 10⁸ Geq/mL(YF-NS5 qRT-PCR에 의한 정량화)의 바이러스 현탁액 140 μl에서 바이러스 RNA를 추출하였다. 정제된 바이러스 RNA를 뉴클레아제가 없는 물 140 μl에 용리시켰다.

7.3.3) RT-PCR

먼저, 황열병 바이러스의 게놈과 중첩되도록 의도된 3개의 안티센스 프라이머를 사용하여 RNA의 cDNA로의 특정 역전사(RT) 단계를 수행하였다. 이어서, 표 10에 기재된 3개의 프라이머 쌍을 사용해 PCR 증폭을 수행하였다.

3개의 안티센스 프라이머(SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 12, 또는 SEQ ID NO. 14) 중 하나를 함유하는 3개의 믹스를 제조하였다(아래 표 11 참조).

+65℃에서 5분 동안 샘플을 열순환기에서 가열하고, 얼음에서 3분 동안 튜브를 인큐베이팅하여 열 충격을 즉시 수행하였다.

이어서, 아래 표 12에 기재된 바와 같이 믹스를 제조하였다.

3개의 RNA/프라이머 튜브 각각에 이 믹스 12 μl를 첨가하고, 다음 표 13에 기재된 바와 같이 역전사 실행을 수행하였다.

각각의 튜브에 1 μl의 RNAse H를 첨가하고, 튜브를 열순환기에서 37℃로 20분 동안 인큐베이팅하였다.

얻어진 cDNA로부터, PCR에 의해 3개의 앰플리콘으로 증폭하였다.

3개의 프라이머 쌍(SEQ ID NO. 9와 SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 11과 SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 13과 SEQ ID NO. 14) 중 하나를 함유하는 3개의 PCR 믹스를 아래 표 14에 기재된 바와 같이 제조하였다.

20 μl의 각각의 믹스를 5 μl의 해당 cDNA에 첨가하였다.

PCR 프로그램은 아래 표 15에 기재된 바와 같다.

7.3.5) 앰플리콘의 분석 및 정제

증폭 품질을 확인하기 위해 모든 앰플리콘을 1.2% 아가로스 겔에서 분석하였다. 공급업체의 권장 사항에 따라 QIAQuick® PCR 정제 키트(QIAGEN®)를 사용하여 수동으로 앰플리콘을 정제하였다.

7.3.6) Nextera ® XT 키트(Illumina, Inc.)를 이용한 라이브러리 형성

정제된 앰플리콘을 공급업체의 권장 사항에 따라 Qubit® dsDNA HS 검정 키트를 사용하여 Qubit® 2.0 형광계(LIFE TECHNOLOGIES®)로 정량화하였다.

검정 후, 0.2 ng/μL의 최종 농도를 얻기 위해 앰플리콘을 뉴클레아제가 없는 물에 연속 희석하였다. 이어서, 각 샘플에 대해, 3개의 앰플리콘을 혼합하여 0.6 ng/μL의 단일 농축 PCR 풀을 얻었다.

PCR 프로그램은 아래 표 16에 기재된 바와 같다.

공급업체의 권장 사항에 따라 Agencourt® AMPure® XP 키트(BECKMAN COULTER®)를 사용하여 앰플리콘을 정제 및 보정하였다. 라이브러리는 1주일 동안 -20℃에서 안정적이었다.

7.3.7) 라이브러리 분석

공급업체의 권장 사항에 따라 Qubit® dsDNA HS 검정 키트를 사용하여 Qubit® 2.0 형광계(LIFE TECHNOLOGIES®)로 라이브러리를 정량화하였다.

7.3.8) 라이브러리 시퀀싱

공급업체의 권장 사항에 따라 MiSeq 시스템(ILLUMINA®)으로 라이브러리를 시퀀싱하였다. 공급업체의 권장 사항에 따라 ILLUMINA® 시퀀싱 분석 뷰어(Illumina, Inc.)로 서열을 분석하였다.

생성된 서열의 분석을 공급업체의 권장 사항에 따라 CLC Genomics Workbenck 7.5.2 소프트웨어(QIAGEN®)로 수행하였다.

7.4/ 결과

7.4.1) YF-VAX® 및 Stamaril® 백신에 대한 기준 서열

YF-VAX® 백신의 기준 서열은 SEQ ID NO. 2로 표시되었다. Stamaril® 백신의 기준 서열은 SEQ ID NO. 3으로 확인되었다.

7.4.1.1) Stamaril® 유래 pMSL

pMSL 후보백신 게놈(계대 n°8)을 시퀀싱하고 모균주 게놈과 비교하였다. 아래 표 17은 Stamaril® 계통의 3종의 균주에 대한 고처리량 시퀀싱의 결과를 제공한다.

TV2241 및 TV2212는 기준백신으로 사용된 Stamaril® 모균주와 비교하여 단일 돌연변이를 나타낸다(NS1 코딩 영역에 위치한 뉴클레오티드 2524, 아미노산 수준에서 침묵) TV2232는 NS3 및 NS5에 모두 침묵인 5개의 돌연변이가 있는 상이한 프로파일을 보여준다.

7.4.1.2) YF-VAX® 유래 pMSL

아래 표 18은 YF-VAX® 계통의 3종의 pMSL 후보백신(계대 n°8)에 대한 고처리량 시퀀싱의 결과를 제공한다.

TV4221은 YF-VAX® 백신 균주의 기준 서열과 동일하다.

TV3111은 위치 2411(E-480, Val에서 Leu로), 3701(NS2a-65, Met에서 Val로), 및 6496(NS4a-19, 침묵)에 3개의 돌연변이를 갖는다.

TV3112는 TV3111과 동일한 돌연변이, 및 위치 1408에 하나의 추가 돌연변이(E-145, 침묵)를 갖는다.

TV3112 및 TV3111 균주는 SEQ ID NO 15로 표시되는 외피 단백질을 포함한다(위치 480에 류신 잔기를 가짐) SEQ ID NO 16(위치 65에 발린 잔기를 가짐)은 TV3112 및 TV3111 균주에서 유래된 NS2a 단백질의 서열이다. SEQ ID NO 17(위치 57에 G 뉴클레오티드를 가짐)은 TV3112 균주에서 유래된 NS4a 단백질을 코딩하는 RNA 서열이다. SEQ ID NO 18(위치 435에 U 뉴클레오티드를 가짐)은 TV3112 균주에서 유래된 외피 단백질을 코딩하는 RNA 서열이다.

게놈의 역할이 정보의 지원이라는 것과, 그 기능을 통해 단백질이 바이러스 표현형에서 역할을 한다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 침묵 돌연변이는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는다. 따라서, TV3112 및 TV3111 균주는 하기 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주로서 설명될 수 있다.

(ii) 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 65번 위치의 돌연변이를 포함하는 NS2a 단백질. 또는 TV3112 및 TV3111 균주는 하기 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주로서 설명될 수 있다.

SEQ ID NO. 15의 480번 위치에 상응하는 단백질 내 위치에 류신 잔기를 포함하는 외피 단백질; 및

SEQ ID NO. 16의 65번 위치에 상응하는 단백질 내 위치에 발린 잔기를 포함하는 NS2a 단백질.

7.4.2) MSL 및 WSL 단계에서의 YF-VAX® 유래 TV3112 균주

TV3112 MSL의 공통 서열은 pMSL 모체(TV3112 pMSL)의 공통 서열과 동일하게 유지되었다. TV3112 WSL의 공통 서열은 MSL 모체(TV3112 MSL)와 동일하게 유지되었다. TV3112 균주는 유전적으로 안정적이며, pMSL에서 WSL 단계까지 뉴클레오티드 위치 1408, 2411, 3701, 및 6496의 돌연변이를 공통 서열에 유지한다.

참고문헌

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acggagccuc cgcuaccacc 10680 cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740 auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800 ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860 cu 10862 <210> 2 <211> 10862 <212> RNA <213> Yellow fever virus <220> <223> RNA sequence of the YFV YF-Vax? strain <400> 2 aguaaauccu gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa 60 acacauuugg auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau 120 gucuggucgu aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg 180 cuccuuguca aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc 240 aagagguguu caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau 300 cacagcccac cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu 360 aaggaaaguc aagagagugg uggccaguuu gaugagagga uuguccucaa ggaaacgccg 420 uucccaugau guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg 480 agugaccuug gugcggaaaa acagaugguu gcuccuaaau gugacaucug aggaccucgg 540 gaaaacauuc ucugugggca caggcaacug cacaacaaac auuuuggaag ccaaguacug 600 gugcccagac ucaauggaau acaacugucc caaucucagu ccaagagagg agccagauga 660 cauugauugc uggugcuaug ggguggaaaa cguuagaguc gcauauggua agugugacuc 720 agcaggcagg ucuaggaggu caagaagggc cauugacuug ccuacgcaug aaaaccaugg 780 uuugaagacc cggcaagaaa aauggaugac uggaagaaug ggugaaaggc aacuccaaaa 840 gauugagaga ugguucguga ggaaccccuu uuuugcagug acggcucuga ccauugccua 900 ccuuguggga agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg 960 uccggccuac ucagcucacu gcauuggaau uacugacagg gauuucauug agggggugca 1020 uggaggaacu uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc 1080 ugacaagccu ucauuggaca ucucacuaga gacaguagcc auugauagac cugcugaggu 1140 gaggaaagug uguuacaaug caguucucac ucaugugaag auuaaugaca agugccccag 1200 cacuggagag gcccaccuag cugaagagaa cgaaggggac aaugcgugca agcgcacuua 1260 uucugauaga ggcuggggca auggcugugg ccuauuuggg aaagggagca uuguggcaug 1320 cgccaaauuc acuugugcca aauccaugag uuuguuugag guugaucaga ccaaaauuca 1380 guaugucauc agagcacaau ugcauguagg ggccaagcag gaaaauugga cuaccgacau 1440 uaagacucuc aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gucgaguuca uuggguaugg 1500 aaaagcuaca cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacaucgc 1560 ugagauggaa acagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc 1620 auggcagagu ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc 1680 uccgcaugcc gccacuauca gaguacuggc ccugggaaac caggaaggcu ccuugaaaac 1740 agcucuuacu ggcgcaauga ggguuacaaa ggacacaaau gacaacaacc uuuacaaacu 1800 acauggugga cauguuucuu gcagagugaa auugucagcu uugacacuca aggggacauc 1860 cuacaaaaua ugcacugaca aaauguuuuu ugucaagaac ccaacugaca cuggccaugg 1920 cacuguugug augcagguga aagugucaaa aggagccccc ugcaggauuc cagugauagu 1980 agcugaugau cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc 2040 cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100 uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160 aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220 cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280 gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340 caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400 caugaucuug guaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460 augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520 agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580 aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640 ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700 gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760 auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820 guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880 cccguuuuca aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu 2940 caccacacgc guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau 3000 cuugggugca gcggugaacg gaaaaaagag ugcccauggc ucuccaacau uuuggauggg 3060 aagucaugaa guaaauggga cauggaugau ccacaccuug gaggcauuag auuacaagga 3120 gugugagugg ccacugacac auacgauugg aacaucaguu gaagagagug aaauguucau 3180 gccgagauca aucggaggcc caguuagcuc ucacaaucau aucccuggau acaagguuca 3240 gacgaacgga ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac 3300 uagcgugauc auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga 3360 uagcgggaaa guuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu 3420 ccaugguagu gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag 3480 ccaucuggug cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu 3540 gagcaugaug auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaauguu 3600 gguuggagga guagugcucu ugggagcaau gcuggucggg caaguaacuc uccuugauuu 3660 gcugaaacuc acaguggcug ugggauugca uuuccaugag augaacaaug gaggagacgc 3720 cauguauaug gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg 3780 gcucaggacc cuauggagcc cucgggaacg ccuugugcug acccuaggag cagccauggu 3840 ggagauugcc uuggguggcg ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu 3900 cugcauccug acaauaaaug cuguugcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu 3960 cauggcucug uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccgcaa uguucuuuug 4020 ugccgugguu aucauagggg uccuucacca gaauuucaag gacaccucca ugcagaagac 4080 uauaccucug guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg 4140 ccugugugca uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc 4200 acucgcagca gcuggucuag ugggagugcu ggcaggacug gcuuuucagg agauggagaa 4260 cuuccuuggu ccgauugcag uuggaggacu ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag 4320 gguggauggg cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau 4380 cagcgggagu uccgcccgcu augauguggc acucagugaa caaggggagu ucaagcugcu 4440 uucugaagag aaagugccau gggaccaggu ugugaugacc ucgcuggccu ugguuggggc 4500 ugcccuccau ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg 4560 agcuaggaga aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca ucgaggaaug 4620 ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca 4680 gcgaggagug ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg 4740 agcuuuccuu 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caaacggaca uacccaguga gcccuggaac acagggcaug acuggauccu 5640 ggcugacaaa aggcccacgg caugguuccu uccauccauc agagcugcaa augucauggc 5700 ugccucuuug cguaaggcug gaaagagugu ggugguccug aacaggaaaa ccuuugagag 5760 agaauacccc acgauaaagc agaagaaacc ugacuuuaua uuggccacug acauagcuga 5820 aaugggagcc aaccuuugcg uggagcgagu gcuggauugc aggacggcuu uuaagccugu 5880 gcuuguggau gaagggagga agguggcaau aaaagggcca cuucguaucu ccgcauccuc 5940 ugcugcucaa aggagggggc gcauugggag aaaucccaac agagauggag acucauacua 6000 cuauucugag ccuacaagug aaaauaaugc ccaccacguc ugcugguugg aggccucaau 6060 gcucuuggac aacauggagg ugaggggugg aauggucgcc ccacucuaug gcguugaagg 6120 aacuaaaaca ccaguuuccc cuggugaaau gagacugagg gaugaccaga ggaaagucuu 6180 cagagaacua gugaggaauu gugaccugcc cguuuggcuu ucguggcaag uggccaaggc 6240 ugguuugaag acgaaugauc guaaguggug uuuugaaggc ccugaggaac augagaucuu 6300 gaaugacagc ggugaaacag ugaagugcag ggcuccugga ggagcaaaga agccucugcg 6360 cccaaggugg ugugaugaaa gggugucauc ugaccagagu gcgcugucug aauuuauuaa 6420 guuugcugaa 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gaaaggaagc ugcaccaaca aggcaggugu cggacuugug uguacaacau 9000 gauggggaaa agagagaaga agcugucaga guuugggaaa gcaaagggaa gccgugccau 9060 augguauaug uggcugggag cgcgguaucu ugaguuugag gcccugggau uccugaauga 9120 ggaccauugg gcuuccaggg aaaacucagg aggaggagug gaaggcauug gcuuacaaua 9180 ccuaggauau gugaucagag accuggcugc aauggauggu gguggauucu acgcggauga 9240 caccgcugga ugggacacgc gcaucacaga ggcagaccuu gaugaugaac aggagaucuu 9300 gaacuacaug agcccacauc acaaaaaacu ggcacaagca gugauggaaa ugacauacaa 9360 gaacaaagug gugaaagugu ugagaccagc cccaggaggg aaagccuaca uggaugucau 9420 aagucgacga gaccagagag gauccgggca gguagugacu uaugcucuga acaccaucac 9480 caacuugaaa guccaauuga ucagaauggc agaagcagag auggugauac aucaccaaca 9540 uguucaagau ugugaugaau caguucugac caggcuggag gcauggcuca cugagcacgg 9600 auguaacaga cugaagagga uggcggugag uggagacgac uguguggucc ggcccaucga 9660 ugacagguuc ggccuggccc ugucccaucu caacgccaug uccaagguua gaaaggacau 9720 aucugaaugg cagccaucaa aaggguggaa ugauugggag aaugugcccu ucuguuccca 9780 ccacuuccau gaacuacagc ugaaggaugg caggaggauu guggugccuu gccgagaaca 9840 ggacgagcuc auugggagag gaaggguguc uccaggaaac ggcuggauga ucaaggaaac 9900 agcuugccuc agcaaagccu augccaacau guggucacug auguauuuuc acaaaaggga 9960 caugaggcua cugucauugg cuguuuccuc agcuguuccc accucauggg uuccacaagg 10020 acgcacaaca uggucgauuc augggaaagg ggaguggaug accacggaag acaugcuuga 10080 gguguggaac agaguaugga uaaccaacaa cccacacaug caggacaaga caauggugaa 10140 aaaauggaga gaugucccuu aucuaaccaa gagacaagac aagcugugcg gaucacugau 10200 uggaaugacc aauagggcca ccugggccuc ccacauccau uuggucaucc aucguauccg 10260 aacgcugauu ggacaggaga aauacacuga cuaccuaaca gucauggaca gguauucugu 10320 ggaugcugac cugcaacugg gugagcuuau cugaaacacc aucuaacagg aauaaccggg 10380 auacaaacca cggguggaga accggacucc ccacaaccug aaaccgggau auaaaccacg 10440 gcuggagaac cggacuccgc acuuaaaaug aaacagaaac cgggauaaaa acuacggaug 10500 gagaaccgga cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacc ccacacgagu 10560 uuugccacug cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa 10620 aaaccugguu ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc 10680 cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740 auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800 ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860 cu 10862 <210> 3 <211> 10862 <212> RNA <213> Yellow fever virus <220> <223> RNA sequence of the YFV Stamaril? strain <400> 3 aguaaauccu gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa 60 acacauuugg auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau 120 gucuggucgu aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg 180 cuccuuguca aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc 240 aagagguguu caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau 300 cacagcccac cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu 360 aaggaaaguc aagagagugg uggccaguuu gaugagagga uuguccucaa ggaaacgccg 420 uucccaugau guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg 480 agugaccuug gugcggaaaa 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uuuguuugag guugaucaga ccaaaauuca 1380 guaugucauc agagcacaau ugcauguagg ggccaagcag gaaaauugga auaccgacau 1440 uaagacucuc aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gucgaguuca uuggguaugg 1500 aaaagcuaca cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacaucgc 1560 ugagauggaa acagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc 1620 auggcagagu ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc 1680 uccgcaugcc gccacuauca gaguacuggc ccugggaaac caggaaggcu ccuugaaaac 1740 agcucuuacu ggcgcaauga ggguuacaaa ggacacaaau gacaacaacc uuuacaaacu 1800 acauggugga cauguuucuu gcagagugaa auugucagcu uugacacuca aggggacauc 1860 cuacaaaaua ugcacugaca aaauguuuuu ugucaagaac ccaacugaca cuggccaugg 1920 cacuguugug augcagguga aagugucaaa aggagccccc ugcaggauuc cagugauagu 1980 agcugaugau cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc 2040 cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100 uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160 aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220 cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280 gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340 caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400 caugaucuug guaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460 augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520 agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580 aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640 ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700 gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760 auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820 guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880 cccguuuuca aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu 2940 caccacacgc guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau 3000 cuugggugca gcggugaacg gaaaaaagag ugcccauggc ucuccaacau uuuggauggg 3060 aagucaugaa guaaauggga cauggaugau ccacaccuug gaggcauuag auuacaagga 3120 gugugagugg ccacugacac auacgauugg aacaucaguu gaagagagug aaauguucau 3180 gccgagauca aucggaggcc caguuagcuc ucacaaucau aucccuggau acaagguuca 3240 gacgaacgga ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac 3300 uagcgugauc auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga 3360 uagcgggaaa guuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu 3420 ccaugguagu gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag 3480 ccaucuggug cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu 3540 gagcaugaug auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaauguu 3600 gguuggagga guagugcucu ugggagcaau gcuggucggg caaguaacuc uccuugauuu 3660 gcugaaacuc acaguggcug ugggauugca uuuccaugag augaacaaug gaggagacgc 3720 cauguauaug gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg 3780 gcucaggacc cuauggagcc cucgggaacg ccuugugcug acccuaggag cagccauggu 3840 ggagauugcc uuggguggcg ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu 3900 cugcauccug acaauaaaug cuguugcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu 3960 cauggcucug uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccgcaa uguucuuuug 4020 ugccgugguu aucauagggg uccuucacca gaacuucaag gacaccucca ugcagaagac 4080 uauaccucug guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg 4140 ccugugugca uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc 4200 acucgcagca gcuggucuag ugggagugcu ggcaggacug gcuuuucagg agauggagaa 4260 cuuccuuggu ccgauugcag uuggaggacu ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag 4320 gguggauggg cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau 4380 cagcgggagu uccgcccgcu augauguggc acucagugaa caaggggagu ucaagcugcu 4440 uucugaagag aaagugccau gggaccaggu ugugaugacc ucgcuggccu ugguuggggc 4500 ugcccuccau ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg 4560 agcuaggaga aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca ucgaggaaug 4620 ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca 4680 gcgaggagug ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg 4740 agcuuuccuu gucaggaaug gcaagaaguu gauuccaucu ugggcuucag uaaaggaaga 4800 ccuugucgcc uaugguggcu cauggaaguu ggaaggcaga ugggauggag aggaagaggu 4860 ccaguugauc gcggcuguuc caggaaagaa cguggucaac guccagacaa aaccgagcuu 4920 guucaaagug aggaaugggg gagaaaucgg ggcugucgcu cuugacuauc cgaguggcac 4980 uucaggaucu ccuauuguua acaggaacgg agaggugauu gggcuguacg gcaauggcau 5040 ccuugucggu gacaacuccu ucguguccgc cauaucccag acugagguga aggaagaagg 5100 aaaggaggag cuccaagaga ucccgacaau gcuaaagaaa ggaaugacaa cuguccuuga 5160 uuuucauccu ggagcuggga agacaagacg uuuccuccca cagaucuugg ccgagugcgc 5220 acggagacgc uugcgcacuc uuguguuggc ccccaccagg guuguucuuu cugaaaugaa 5280 ggaggcuuuu cacggccugg acgugaaauu ccacacacag gcuuuuuccg cucacggcag 5340 cgggagagaa gucauugaug ccaugugcca ugccacccua acuuacagga uguuggaacc 5400 aacuaggguu guuaacuggg aagugaucau uauggaugaa gcccauuuuu uggauccagc 5460 uagcauagcc gcuagagguu gggcagcgca cagagcuagg gcaaaugaaa gugcaacaau 5520 cuugaugaca gccacaccgc cugggacuag ugaugaauuu ccacauucaa auggugaaau 5580 agaagauguu caaacggaca uacccaguga gcccuggaac acagggcaug acuggauccu 5640 ggcugacaaa aggcccacgg caugguuccu uccauccauc agagcugcaa augucauggc 5700 ugccucuuug cguaaggcug gaaagagugu ggugguccug aacaggaaaa ccuuugagag 5760 agaauacccc acgauaaagc agaagaaacc ugacuuuaua uuggccacug acauagcuga 5820 aaugggagcc aaccuuugcg uggagcgagu gcuggauugc aggacggcuu uuaagccugu 5880 gcuuguggau gaagggagga agguggcaau aaaagggcca cuucguaucu ccgcauccuc 5940 ugcugcucaa aggagggggc gcauugggag aaaucccaac agagauggag acucauacua 6000 cuauucugag ccuacaagug aaaauaaugc ccaccacguc ugcugguugg aggccucaau 6060 gcucuuggac aacauggagg ugaggggugg aauggucgcc ccacucuaug gcguugaagg 6120 aacuaaaaca ccaguuuccc cuggugaaau gagacugagg gaugaccaga ggaaagucuu 6180 cagagaacua gugaggaauu gugaccugcc cguuuggcuu ucguggcaag uggccaaggc 6240 ugguuugaag acgaaugauc guaaguggug uuuugaaggc ccugaggaac augagaucuu 6300 gaaugacagc ggugaaacag ugaagugcag ggcuccugga ggagcaaaga agccucugcg 6360 cccaaggugg ugugaugaaa gggugucauc ugaccagagu gcgcugucug aauuuauuaa 6420 guuugcugaa gguaggaggg gagcugcuga agugcuaguu gugcugagug aacucccuga 6480 uuuccuggcu aaaaaaggug gagaggcaau ggauaccauc aguguguuuc uccacucuga 6540 ggaaggcucu agggcuuacc gcaaugcacu aucaaugaug ccugaggcaa ugacaauagu 6600 caugcuguuu auacuggcug gacuacugac aucgggaaug gucaucuuuu ucaugucucc 6660 caaaggcauc aguagaaugu cuauggcgau gggcacaaug gccggcugug gauaucucau 6720 guuccuugga ggcgucaaac ccacucacau cuccuauauc augcucauau ucuuuguccu 6780 gauggugguu gugauccccg agccagggca acaaaggucc auccaagaca accaaguggc 6840 auaccucauu auuggcaucc ugacgcuggu uucagcggug gcagccaacg agcuaggcau 6900 gcuggagaaa accaaagagg accucuuugg gaagaagaac uuaauuccau cuagugcuuc 6960 acccuggagu uggccggauc uugaccugaa gccaggagcu gccuggacag uguacguugg 7020 cauuguuaca augcucucuc caauguugca ccacuggauc aaagucgaau auggcaaccu 7080 gucucugucu ggaauagccc agucagccuc aguccuuucu uucauggaca aggggauacc 7140 auucaugaag augaauaucu cggucauaau gcugcugguc aguggcugga auucaauaac 7200 agugaugccu cugcucugug gcauagggug cgccaugcuc cacuggucuc ucauuuuacc 7260 uggaaucaaa gcgcagcagu caaagcuugc acagagaagg guguuccaug gcguugccaa 7320 gaacccugug guugauggga auccaacagu ugacauugag gaagcuccug aaaugccugc 7380 ccuuuaugag aagaaacugg cucuauaucu ccuucuugcu cucagccuag cuucuguugc 7440 caugugcaga acgcccuuuu cauuggcuga aggcauuguc cuagcaucag cugccuuagg 7500 gccgcucaua gagggaaaca ccagccuucu uuggaaugga cccauggcug ucuccaugac 7560 aggagucaug agggggaauc acuaugcuuu ugugggaguc auguacaauc uauggaagau 7620 gaaaacugga cgccggggga gcgcgaaugg aaaaacuuug ggugaagucu ggaagaggga 7680 acugaaucug uuggacaagc gacaguuuga guuguauaaa aggaccgaca uuguggaggu 7740 ggaucgugau acggcacgca ggcauuuggc cgaagggaag guggacaccg ggguggcggu 7800 cuccaggggg accgcaaagu uaaggugguu ccaugagcgu ggcuauguca agcuggaagg 7860 uagggugauu gaccuggggu guggccgcgg aggcuggugu uacuacgcug cugcgcaaaa 7920 ggaagugagu ggggucaaag gauuuacucu uggaagagac ggccaugaga aacccaugaa 7980 ugugcaaagu cugggaugga acaucaucac cuucaaggac aaaacugaua uccaccgccu 8040 agaaccagug aaaugugaca cccuuuugug ugacauugga gagucaucau cgucaucggu 8100 cacagagggg gaaaggaccg ugagaguucu ugauacugua gaaaaauggc uggcuugugg 8160 gguugacaac uucuguguga agguguuagc uccauacaug ccagauguuc ucgagaaacu 8220 ggaauugcuc caaaggaggu uuggcggaac agugaucagg aacccucucu ccaggaauuc 8280 cacucaugaa auguacuacg ugucuggagc ccgcagcaau gucacauuua cugugaacca 8340 aacaucccgc cuccugauga ggagaaugag gcguccaacu ggaaaaguga cccuggaggc 8400 ugacgucauc cucccaauug ggacacgcag uguugagaca gacaagggac cccuggacaa 8460 agaggccaua gaagaaaggg uugagaggau aaaaucugag uacaugaccu cuugguuuua 8520 ugacaaugac aaccccuaca ggaccuggca cuacuguggc uccuauguca caaaaaccuc 8580 aggaagugcg gcgagcaugg uaaauggugu uauuaaaauu cugacauauc caugggacag 8640 gauagaggag gucacaagaa uggcaaugac ugacacaacc ccuuuuggac agcaaagagu 8700 guuuaaagaa aaaguugaca ccagagcaaa ggauccacca gcgggaacua ggaagaucau 8760 gaaaguuguc aacagguggc uguuccgcca ccuggccaga gaaaagaacc ccagacugug 8820 cacaaaggaa gaauuuauug caaaaguccg aagucaugca gccauuggag cuuaccugga 8880 agaacaagaa caguggaaga cugccaauga 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ugauugggag aaugugcccu ucuguuccca 9780 ccacuuccau gaacuacagc ugaaggaugg caggaggauu guggugccuu gccgagaaca 9840 ggacgagcuc auugggagag gaaggguguc uccaggaaac ggcuggauga ucaaggaaac 9900 agcuugccuc agcaaagccu augccaacau guggucacug auguauuuuc acaaaaggga 9960 caugaggcua cugucauugg cuguuuccuc agcuguuccc accucauggg uuccacaagg 10020 acgcacaaca uggucgauuc augggaaagg ggaguggaug accacggaag acaugcuuga 10080 gguguggaac agaguaugga uaaccaacaa cccacacaug caggacaaga caauggugaa 10140 aaaauggaga gaugucccuu aucuaaccaa gagacaagac aagcugugcg gaucacugau 10200 uggaaugacc aauagggcca ccugggccuc ccacauccau uuggucaucc aucguauccg 10260 aacgcugauu ggacaggaga aauacacuga cuaccuaaca gucauggaca gguauucugu 10320 ggaugcugac cugcaacugg gugagcuuau cugaaacacc aucuaacagg aauaaccggg 10380 auacaaacca cggguggaga accggacucc ccacaaccug aaaccgggau auaaaccacg 10440 gcuggagaac cggacuccgc acuuaaaaug aaacagaaac cgggauaaaa acuacggaug 10500 gagaaccgga cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacc ccacacgagu 10560 uuugccacug cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa 10620 aaaccugguu ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc 10680 cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740 auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800 ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860 cu 10862 <210> 4 <211> 10862 <212> RNA <213> Yellow fever virus <220> <223> RNA sequence of the YFV 17D-213 strain <400> 4 aguaaauccu gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa 60 acacauuugg auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau 120 gucuggucgu aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg 180 cuccuuguca aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc 240 aagagguguu caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau 300 cacagcccac cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu 360 aaggaaaguc aagagagugg uggccaguuu gaugagagga uuguccucaa ggaaacgccg 420 uucccaugau guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg 480 agugaccuug gugcggaaaa acagaugguu gcuccuaaau gugacaucug aggaccucgg 540 gaaaacauuc ucugugggca caggcaacug cacaacaaac auuuuggaag ccaaguacug 600 gugcccagac ucaauggaau acaacugucc caaucucagu ccaagagagg agccagauga 660 cauugauugc uggugcuaug ggguggaaaa cguuagaguc gcauauggua agugugacuc 720 agcaggcagg ucuaggaggu caagaagggc cauugacuug ccuacgcaug aaaaccaugg 780 uuugaagacc cggcaagaaa aauggaugac uggaagaaug ggugaaaggc aacuccaaaa 840 gauugagaga ugguucguga ggaaccccuu uuuugcagug acggcucuga ccauugccua 900 ccuuguggga agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg 960 uccggccuac ucagcucacu gcauuggaau uacugacagg gauuucauug agggggugca 1020 uggaggaacu uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc 1080 ugacaagccu ucauuggaca ucucacuaga gacaguagcc auugauagac cugcugaggu 1140 gaggaaagug uguuacaaug caguucucac ucaugugaag auuaaugaca agugccccag 1200 cacuggagag gcccaccuag cugaagagaa cgaaggggac aaugcgugca agcgcacuua 1260 uucugauaga ggcuggggca auggcugugg ccuauuuggg aaagggagca uuguggcaug 1320 cgccaaauuc acuugugcca aauccaugag uuuguuugag guugaucaga ccaaaauuca 1380 guaugucauc agagcacaau ugcauguagg ggccaagcag gaaaauugga cuaccgacau 1440 uaagacucuc aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gucgaguuca uuggguaugg 1500 aaaagcuaca cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacaucgc 1560 ugagauggaa acagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc 1620 auggcagagu ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc 1680 uccgcaugcc gccacuauca gaguacuggc ccugggaaac caggaaggcu ccuugaaaac 1740 agcucuuacu ggcgcaauga ggguuacaaa ggacacaaau gacaacaacc uuuacaaacu 1800 acauggugga cauguuucuu gcagagugaa auugucagcu uugacacuca aggggacauc 1860 cuacaaaaua ugcacugaca aaauguuuuu ugucaagaac ccaacugaca cuggccaugg 1920 cacuguugug augcagguga aagugucaaa aggagccccc ugcaggauuc cagugauagu 1980 agcugaugau cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc 2040 cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100 uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160 aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220 cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280 gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340 caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400 caugaucuug guaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460 augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520 agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580 aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640 ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700 gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760 auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820 guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880 cccguuuuca aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu 2940 caccacacgc guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau 3000 cuugggugca gcggugaacg gaaaaaagag ugcccauggc ucuccaacau uuuggauggg 3060 aagucaugaa guaaauggga cauggaugau ccacaccuug gaggcauuag auuacaagga 3120 gugugagugg ccacugacac auacgauugg aacaucaguu gaagagagug aaauguucau 3180 gccgagauca aucggaggcc caguuagcuc ucacaaucau aucccuggau acaagguuca 3240 gacgaacgga ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac 3300 uagcgugauc auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga 3360 uagcgggaaa guuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu 3420 ccaugguagu gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag 3480 ccaucuggug cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu 3540 gagcaugaug auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaauguu 3600 gguuggagga guagugcucu ugggagcaau gcuggucggg caaguaacuc uccuugauuu 3660 gcugaaacuc acaguggcug ugggauugca uuuccaugag augaacaaug gaggagacgc 3720 cauguauaug gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg 3780 gcucaggacc cuauggagcc cucgggaacg ccuugugcug acccuaggag cagccauggu 3840 ggagauugcc uuggguggcg ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu 3900 cugcauccug acaauaaaug cuguugcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu 3960 cauggcucug uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccgcaa uguucuuuug 4020 ugccgugguu aucauagggg uccuucacca gaauuucaag gacaccucca ugcagaagac 4080 uauaccucug guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg 4140 ccugugugca uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc 4200 acucgcagca gcuggucuag ugggagugcu ggcaggacug gcuuuucagg agauggagaa 4260 cuuccuuggu ccgauugcag uuggaggacu ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag 4320 gguggauggg cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau 4380 cagcgggagu uccgcccgcu augauguggc acucagugaa caaggggagu ucaagcugcu 4440 uucugaagag aaagugccau gggaccaggu ugugaugacc ucgcuggccu ugguuggggc 4500 ugcccuccau ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg 4560 agcuaggaga aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca ucgaggaaug 4620 ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg 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uucccaugau guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg 480 agugaccuug gugcggaaaa acagaugguu gcuccuaaau gugacaucug aggaccucgg 540 gaaaacauuc ucugugggca caggcaacug cacaacaaac auuuuggaag ccaaguacug 600 gugcccagac ucaauggaau acaacugucc caaucucagu ccgagagagg agccagauga 660 cauugauugc uggugcuaug ggguggaaaa cguuagaguc gcauauggua agugugacuc 720 agcaggcagg ucuaggaggu caagaagggc cauugacuug ccuacgcaug aaaaccaugg 780 uuugaagacc cggcaagaaa aauggaugac uggaagaaug ggugaaaggc aacuccaaaa 840 gauugagaga ugguucguga ggaaccccuu uuuugcagug acagcucuga ccauugccua 900 ccuuguggga agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg 960 uccggccuac ucagcucacu gcauuggaau uacugacagg gauuucauug agggggugca 1020 uggaggaacu uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc 1080 ugacaagccu ucauuggaca ucucacuaga gacaguagcc auugauagac cugcugaggc 1140 gaggaaagug uguuacaaug caguucucac ucaugugaag auuaaugaca agugccccag 1200 cacuggagag gcccaccuag cugaagagaa cgaaggggac aaugcgugca agcgcacuua 1260 uucugauaga ggcuggggca auggcugugg ccuauuuggg aaagggagca uuguggcaug 1320 cgccaaauuc acuugugcca aauccaugag uuuguuugag guugaucaga ccaaaauuca 1380 guaugucauc agagcacaau ugcauguagg ggccaagcag gaaaauugga auaccagcau 1440 uaagacucuc aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gucgaguuca uuggguaugg 1500 aaaagcuaca cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacauagc 1560 ugagauggaa acagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc 1620 auggcagagu ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc 1680 uccgcaugcc gccacuauca gaguacuggc ccugggaaac caggaaggcu ccuugaaaac 1740 agcucuuacu ggcgcaauga ggguuacaaa ggacacaaau gacaacaacc uuuacaaacu 1800 acauggugga cauguuucuu gcagagugaa auugucagcu uugacacuca aggggacauc 1860 cuacaaaaua ugcacugaca aaauguuuuu ugucaagaac ccaacugaca cuggccaugg 1920 cacuguugug augcagguga aagugccaaa aggagccccc ugcaggauuc cagugauagu 1980 agcugaugau cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc 2040 cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100 uaucguugga agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160 aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacgu 2220 cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280 gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340 caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400 caugaucuug guaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460 augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520 agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580 aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640 ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700 gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760 auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820 guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880 cccguuuuca aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu 2940 caccacacgc 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gagaaccgga cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacu ccacacgagu 10560 uuugccacug cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa 10620 aaaccugguu ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc 10680 cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740 auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800 ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860 cu 10862 <210> 6 <211> 10833 <212> RNA <213> Yellow fever virus <220> <223> RNA sequence of the YFV Asibi strain <400> 6 gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa acacauuugg 60 auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau gucuggucgu 120 aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg cuccuuguca 180 aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc aagagguguu 240 caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau cacggcccac 300 cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu aaggaaaguu 360 aagagagugg uggccaguuu 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gggcugcuca ucggcuuugg gcucaggacc 3780 cuauggagcc cucgggaacg ccuuguacug acccuaggag cagccauggu ggagauugcc 3840 uuggguggca ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu cugcauccug 3900 acaauaaaug cuguagcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu cauggcucug 3960 uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccacaa ugcucuuuug uaccgugguu 4020 aucauagggg uccuucacca gaacuccaag gacaccucca ugcagaagac uauaccucug 4080 guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg ccugugugca 4140 uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc acucgcagca 4200 gcuggucuag ugggagugcu ggcaggacug gcuuuucagg agauggagaa cuuccuuggu 4260 ccgauugcag uuggaggaau ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag gguggauggg 4320 cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau cagcggaagu 4380 uccgcccgcu augauguggc acucagugaa caaggggagu ucaagcugcu uucugaagag 4440 aaagugccau gggaccaggu ugugaugacc ucgcuggccu ugguuggggc ugccauucau 4500 ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg agcuaggaga 4560 aguggggaug ucuuguggga uauucccacu 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ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100 uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160 aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220 cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280 gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340 caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400 caugaucuug uuaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460 augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520 agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580 aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640 ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700 gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760 auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820 guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880 cccguuuuca aaccgggucu 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ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca ucgaggaaug 4620 ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca 4680 gcgaggagug ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg 4740 agcuuuccuu gucaggaaug gcaagaaguu gauuccaucu ugggcuucag uaaaggaaga 4800 ccuugucgcc uaugguggcu cauggaaguu ggaaggcaga ugggauggag aggaagaggu 4860 ccaguugauc gcggcuguuc caggaaagaa cguggucaac guccagacaa aaccgagcuu 4920 guucaaagug aggaaugggg gagaaaucgg ggcugucgcu cuugacuauc cgaguggcac 4980 uucaggaucu ccuauuguua acaggaacgg agaggugauu gggcuguacg gcaauggcau 5040 ccuugucggu gacaacuccu ucguguccgc cauaucccag acugagguga aggaagaagg 5100 aaaggaggag cuccaagaga ucccgacaau gcuaaagaaa ggaaugacaa cuguccuuga 5160 uuuucauccu ggagcuggga agacaagacg uuuccuccca cagaucuugg ccgagugcgc 5220 acggagacgc uugcgcacuc uuguguuggc ccccaccagg guuguucuuu cugaaaugaa 5280 ggaggcuuuu cacggccugg acgugaaauu ccacacacag gcuuuuuccg cucacggcag 5340 cgggagagaa gucauugaug cuaugugcca ugccacccua acuuacagga uguuggaacc 5400 aacuaggguu guuaacuggg 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guuacaguua accccaucgc 2040 cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100 uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160 aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220 cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280 gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340 caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400 caugaucuug uuaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460 augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520 agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580 aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640 ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700 gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760 auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820 guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau 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gcauggcuca cugagcacgg 9600 auguaacaga cugaagagga uggcggugag uggagacgac uguguggucc ggcccaucga 9660 ugacagguuc ggccuggccc ugucccaucu caacgccaug uccaagguua gaaaggacau 9720 aucugaaugg cagccaucaa aaggguggaa ugauugggag aaugugcccu ucuguuccca 9780 ccacuuccau gaacuacagc ugaaggaugg caggaggauu guggugccuu gccgagaaca 9840 ggacgagcuc auugggagag gaaggguguc uccaggaaac ggcuggauga ucaaggaaac 9900 agcuugccuc agcaaagccu augccaacau guggucacug auguauuuuc acaaaaggga 9960 caugaggcua cugucauugg cuguuuccuc agcuguuccc accucauggg uuccacaagg 10020 acgcacaaca uggucgauuc augggaaagg ggaguggaug accacggaag acaugcuuga 10080 gguguggaac agaguaugga uaaccaacaa cccacacaug caggacaaga caauggugaa 10140 aaaauggaga gaugucccuu aucuaaccaa gagacaagac aagcugugcg gaucacugau 10200 uggaaugacc aauagggcca ccugggccuc ccacauccau uuggucaucc aucguauccg 10260 aacgcugauu ggacaggaga aauacacuga cuaccuaaca gucauggaca gguauucugu 10320 ggaugcugac cugcaacugg gugagcuuau cugaaacacc aucuaacagg aauaaccggg 10380 auacaaacca cggguggaga accggacucc ccacaaccug aaaccgggau auaaaccacg 10440 gcuggagaac cggacuccgc acuuaaaaug aaacagaaac cgggauaaaa acuacggaug 10500 gagaaccgga cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacc ccacacgagu 10560 uuugccacug cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa 10620 aaaccugguu ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc 10680 cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740 auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800 ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860 cu 10862 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 9 gctaggcaat aaacacattt gga 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 10 ttcactggga tactccttcg c 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 11 atcaaatacc atcttgcccc tc 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 12 agtaaatcct ttgaccccac t 21 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 13 ggcttaccgc aatgcact 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 14 cagagaacca ctccggtc 18 <210> 15 <211> 493 <212> PRT <213> Yellow fever virus <220> <223> Sequence of the envelope protein of the YFV TV3111 or TV3112 strains <400> 15 Ala His Cys Ile Gly Ile Thr Asp Arg Asp Phe Ile Glu Gly Val His 1 5 10 15 Gly Gly Thr Trp Val Ser Ala Thr Leu Glu Gln Asp Lys Cys Val Thr 20 25 30 Val Met Ala Pro Asp Lys Pro Ser Leu Asp Ile Ser Leu Glu Thr Val 35 40 45 Ala Ile Asp Arg Pro Ala Glu Val Arg Lys Val Cys Tyr Asn Ala Val 50 55 60 Leu Thr His Val Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr Gly Glu Ala 65 70 75 80 His Leu Ala Glu Glu Asn Glu Gly Asp Asn Ala Cys Lys Arg Thr Tyr 85 90 95 Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Ile Val Ala Cys Ala Lys Phe Thr Cys Ala Lys Ser Met Ser Leu Phe 115 120 125 Glu Val Asp Gln Thr Lys Ile Gln Tyr Val Ile Arg Ala Gln Leu His 130 135 140 Val Gly Ala Lys Gln Glu Asn Trp Thr Thr Asp Ile Lys Thr Leu Lys 145 150 155 160 Phe Asp Ala Leu Ser Gly Ser Gln Glu Val Glu Phe Ile Gly Tyr Gly 165 170 175 Lys Ala Thr Leu Glu Cys Gln Val Gln Thr Ala Val Asp Phe Gly Asn 180 185 190 Ser Tyr Ile Ala Glu Met Glu Thr Glu Ser Trp Ile Val Asp Arg Gln 195 200 205 Trp Ala Gln Asp Leu Thr Leu Pro Trp Gln Ser Gly Ser Gly Gly Val 210 215 220 Trp Arg Glu Met His His Leu Val Glu Phe Glu Pro Pro His Ala Ala 225 230 235 240 Thr Ile Arg Val Leu Ala Leu Gly Asn Gln Glu Gly Ser Leu Lys Thr 245 250 255 Ala Leu Thr Gly Ala Met Arg Val Thr Lys Asp Thr Asn Asp Asn Asn 260 265 270 Leu Tyr Lys Leu His Gly Gly His Val Ser Cys Arg Val Lys Leu Ser 275 280 285 Ala Leu Thr Leu Lys Gly Thr Ser Tyr Lys Ile Cys Thr Asp Lys Met 290 295 300 Phe Phe Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met 305 310 315 320 Gln Val Lys Val Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile Val 325 330 335 Ala Asp Asp Leu Thr Ala Ala Ile Asn Lys Gly Ile Leu Val Thr Val 340 345 350 Asn Pro Ile Ala Ser Thr Asn Asp Asp Glu Val Leu Ile Glu Val Asn 355 360 365 Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly Arg Gly Asp Ser Arg 370 375 380 Leu Thr Tyr Gln Trp His Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys Leu Phe 385 390 395 400 Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val Met Gly Asp Thr 405 410 415 Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr Ser Val Gly Lys 420 425 430 Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly Leu Phe Gly Gly 435 440 445 Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile Trp Val 450 455 460 Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Leu 465 470 475 480 Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala 485 490 <210> 16 <211> 224 <212> PRT <213> Yellow fever virus <220> <223> Sequence of the NS2a protein of the YFV TV3111 or TV3112 strains <400> 16 Gly Glu Ile His Ala Val Pro Phe Gly Leu Val Ser Met Met Ile Ala 1 5 10 15 Met Glu Val Val Leu Arg Lys Arg Gln Gly Pro Lys Gln Met Leu Val 20 25 30 Gly Gly Val Val Leu Leu Gly Ala Met Leu Val Gly Gln Val Thr Leu 35 40 45 Leu Asp Leu Leu Lys Leu Thr Val Ala Val Gly Leu His Phe His Glu 50 55 60 Val Asn Asn Gly Gly Asp Ala Met Tyr Met Ala Leu Ile Ala Ala Phe 65 70 75 80 Ser Ile Arg Pro Gly Leu Leu Ile Gly Phe Gly Leu Arg Thr Leu Trp 85 90 95 Ser Pro Arg Glu Arg Leu Val Leu Thr Leu Gly Ala Ala Met Val Glu 100 105 110 Ile Ala Leu Gly Gly Val Met Gly Gly Leu Trp Lys Tyr Leu Asn Ala 115 120 125 Val Ser Leu Cys Ile Leu Thr Ile Asn Ala Val Ala Ser Arg Lys Ala 130 135 140 Ser Asn Thr Ile Leu Pro Leu Met Ala Leu Leu Thr Pro Val Thr Met 145 150 155 160 Ala Glu Val Arg Leu Ala Ala Met Phe Phe Cys Ala Val Val Ile Ile 165 170 175 Gly Val Leu His Gln Asn Phe Lys Asp Thr Ser Met Gln Lys Thr Ile 180 185 190 Pro Leu Val Ala Leu Thr Leu Thr Ser Tyr Leu Gly Leu Thr Gln Pro 195 200 205 Phe Leu Gly Leu Cys Ala Phe Leu Ala Thr Arg Ile Phe Gly Arg Arg 210 215 220 <210> 17 <211> 378 <212> RNA <213> Yellow fever virus <220> <223> RNA Sequence coding for the NS4a protein of the YFV TV3112 strain <400> 17 ggagcugcug aagugcuagu ugugcugagu gaacucccug auuuccuggc uaaaaagggu 60 ggagaggcaa uggauaccau caguguguuu cuccacucug aggaaggcuc uagggcuuac 120 cgcaaugcac uaucaaugau gccugaggca augacaauag ucaugcuguu uauacuggcu 180 ggacuacuga caucgggaau ggucaucuuu uucaugucuc ccaaaggcau caguagaaug 240 ucuauggcga ugggcacaau ggccggcugu ggauaucuca uguuccuugg aggcgucaaa 300 cccacucaca ucuccuauau caugcucaua uucuuugucc ugaugguggu ugugaucccc 360 gagccagggc aacaaagg 378 <210> 18 <211> 1479 <212> RNA <213> Yellow fever virus <220> <223> RNA Sequence coding for the envelope protein of the YFV TV3112 strain <400> 18 gcucacugca uuggaauuac ugacagggau uucauugagg gggugcaugg aggaacuugg 60 guuucagcua cccuggagca agacaagugu gucacuguua uggccccuga caagccuuca 120 uuggacaucu cacuagagac aguagccauu gauagaccug cugaggugag gaaagugugu 180 uacaaugcag uucucacuca ugugaagauu aaugacaagu gccccagcac uggagaggcc 240 caccuagcug aagagaacga aggggacaau gcgugcaagc gcacuuauuc ugauagaggc 300 uggggcaaug gcuguggccu auuugggaaa gggagcauug uggcaugcgc caaauucacu 360 ugugccaaau ccaugaguuu guuugagguu gaucagacca aaauucagua ugucaucaga 420 gcacaauugc auguuggggc caagcaggaa aauuggacua ccgacauuaa gacucucaag 480 uuugaugccc ugucaggcuc ccaggaaguc gaguucauug gguauggaaa agcuacacug 540 gaaugccagg ugcaaacugc gguggacuuu gguaacaguu acaucgcuga gauggaaaca 600 gagagcugga uaguggacag acagugggcc caggacuuga cccugccaug gcagagugga 660 aguggcgggg uguggagaga gaugcaucau cuugucgaau uugaaccucc gcaugccgcc 720 acuaucagag uacuggcccu gggaaaccag gaaggcuccu ugaaaacagc ucuuacuggc 780 gcaaugaggg uuacaaagga cacaaaugac aacaaccuuu acaaacuaca ugguggacau 840 guuucuugca gagugaaauu gucagcuuug acacucaagg ggacauccua caaaauaugc 900 acugacaaaa uguuuuuugu caagaaccca acugacacug gccauggcac uguugugaug 960 caggugaaag ugucaaaagg agcccccugc aggauuccag ugauaguagc ugaugaucuu 1020 acagcggcaa ucaauaaagg cauuuugguu acaguuaacc ccaucgccuc aaccaaugau 1080 gaugaagugc ugauugaggu gaacccaccu uuuggagaca gcuacauuau cguugggaga 1140 ggagauucac gucucacuua ccaguggcac aaagagggaa gcucaauagg aaaguuguuc 1200 acucagacca ugaaaggcgu ggaacgccug gccgucaugg gagacaccgc cugggauuuc 1260 agcuccgcug gaggguucuu cacuucgguu gggaaaggaa uucauacggu guuuggcucu 1320 gccuuucagg ggcuauuugg cggcuugaac uggauaacaa aggucaucau gggggcggua 1380 cuuauauggg uuggcaucaa cacaagaaac augacaaugu ccaugagcau gaucuuguua 1440 ggagugauca ugauguuuuu gucucuagga guuggggcg 1479

Claims

Vero 세포에서 성장하도록 적응되지 않은 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주로부터 Vero 세포에서 성장하도록 적응되고, 상기 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주보다 신경독성이 적은 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제1항에 있어서, 모체 황열병 바이러스 균주는 계란에서 성장하도록 적응된 생약독화 황열병 바이러스 균주인, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서, 모체 황열병 바이러스 균주는 황열병 바이러스 17D-204 하위균주인, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주는 SEQ ID NO. 2의 RNA 서열을 포함하는, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생약독화 황열병 바이러스 균주는 마우스 치사량 50(MLD₅₀) 시험에서 모체 황열병 바이러스 17D 하위균주보다 신경독성이 적은, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
i) 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 또는
ii) 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이
를 포함하는 핵산을 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제6항에 있어서,
i) 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 480번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이, 및
ii) 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 비구조 단백질 2A(NS2a)의 65번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이
를 포함하는 핵산을 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제6항 또는 제7항에 있어서, 핵산은 AAA에서 AAG로의 코돈 변화를 일으키는 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 추가로 포함하는, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 GUA에서 GUU로의 코돈 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 145번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 추가로 포함하는, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 480번 위치의 돌연변이를 포함하는 외피 단백질을 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주.
SEQ ID NO. 15의 480번 위치에 상응하는 단백질 내 위치에 류신 잔기를 포함하는 외피 단백질을 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제11항에 있어서, 상기 외피 단백질은 SEQ ID NO. 15의 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
(i) 발린에서 류신으로의 아미노산 변화를 일으키는 480번 위치의 돌연변이를 포함하는 외피 단백질, 및
(ii) 메티오닌에서 발린으로의 아미노산 변화를 일으키는 65번 위치의 돌연변이를 포함하는 NS2a 단백질
을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제13항에 있어서, 핵산은 AAA에서 AAG로의 코돈 변화를 일으키는 비구조 단백질 4A(NS4a)의 19번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 추가로 포함하는, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제13항 또는 제14항에 있어서, 핵산은 GUA에서 GUU로의 코돈 변화를 일으키는 외피 단백질(E)의 145번 위치의 아미노산에 대한 코돈의 돌연변이를 추가로 포함하는, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
SEQ ID NO. 15의 480번 위치에 상응하는 단백질 내 위치에 류신 잔기를 포함하는 외피 단백질; 및
SEQ ID NO. 16의 65번 위치에 상응하는 단백질 내 위치에 발린 잔기를 포함하는 NS2a 단백질
을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제16항에 있어서, 상기 외피 단백질은 SEQ ID NO. 15의 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 상기 NS2a 단백질은 SEQ ID NO. 16의 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제16항 또는 제17항에 있어서, 핵산은 SEQ ID NO. 17의 57번 위치에 상응하는 비구조 단백질 4A(NS4a)를 코딩하는 핵산 내 위치에 G 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 SEQ ID NO. 18의 435번 위치에 상응하는 외피 단백질(E)을 코딩하는 핵산 내 위치에 U 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 생약독화 황열병 바이러스 균주.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 생약독화 황열병 바이러스 균주 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 면역원성 조성물.
Vero 세포에서 성장하도록 적응된 생약독화 황열병 바이러스 균주를 획득하는 방법으로서,
- a) Vero 세포에서 성장하도록 적응되지 않고, 선택적으로 계란에서 성장하도록 적응된 모체 생약독화 황열병 바이러스 균주의 바이러스 게놈 RNA를 정제하는 단계;
- b) 단계 a)에서 정제된 바이러스 게놈 RNA로 Vero 세포를 형질감염시켜 형질감염된 Vero 세포를 획득하는 단계;
- c) 단계 b)에서 획득한 형질감염된 Vero 세포를 배양 배지에서 성장시켜 제1 황열병 바이러스 개체군을 획득하고 추가로 회수하는 단계;
- d) 단계 c)의 마지막에 획득한 회수된 제1 황열병 바이러스 개체군을 새로운 Vero 세포에서 2회 이상 증폭하여 제2 황열병 바이러스 개체군을 획득하는 단계;
- e) 단계 d)에서 획득한 제2 황열병 바이러스 개체군을 Vero 세포에서 2회 이상의 연속 플라크 정제에 의해 클로닝하여 복수의 황열병 바이러스 클론을 획득하는 단계;
- f) 단계 e)의 마지막에 획득한 회수된 황열병 바이러스 클론 각각을 개별적으로 새로운 Vero 세포에서 2회 이상 증폭하여 복수의 황열병 바이러스 균주를 획득하는 단계; 및
- g) 단계 f)에서 회수된 상기 복수의 황열병 바이러스 균주로부터, 마우스 치사량 50(MLD₅₀) 시험에서 모체 생약독화 황열병 바이러스 균주보다 신경독성이 적은 하나 이상의 생약독화 황열병 바이러스 균주를 선별하는 단계를 포함하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 배양 배지는 무혈청이고, 선택적으로 인간 또는 동물 유래 물질을 함유하지 않는, 방법.
제21항 또는 제22항에 따른 방법에 의해 획득 가능한 생약독화 황열병 바이러스 균주.
백신의 제조에 사용하기 위한 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항 또는 제23항에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주.
황열병 바이러스 감염의 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항 또는 제23항에 따른 생약독화 황열병 바이러스 균주를 포함하는 백신.