NO310472B1 - Biomasse og fremgangsmåte for fremstilling av virus/virusantigen - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en biomasse og en fremgangsmåte ved produksjon av virus/virusantigen.

Fremgangsmåter ved fremstilling av virus/virus-antigen er kjent. Utgangsmaterialer er ofte såkalte primærcellekulturer som utvinnes fra humant eller animalsk vev. Disse primærceller infiseres med virus ("modervirus"), og ved virusformering dannes virusantigen.

En metode til formering av f.eks. forsommer-meningo-encef alitis-virus (FSME-virus) er beskrevet i AT -B 358.-167: Høneembryonalceller suspenderes i et cellekulturmed-ium, infiseres med viruset og anvendes som biomasse ved produksjon av FSME-virusantigen. Til dette formål holdes biomassen under aerobe betingelser ved en temperatur mellom 25 og 38°C mellom én og fem dager i suspensjon. Deretter skilles cellene og cellebruddstykkene ved sentrifugering, den oppnådde virussuspensjon inaktiveres ved hjelp av formalin eller S-propiolakton, og virusantigenet konsentre-res ved ultrafiltrering, renses og bearbeides videre på konvensjonell måte til vaksiner.

Ved vanlige preparasjoner av primærcellekulturer legges spesielt vekt på å oppnå enkeltceller eller helst små celleaggregater. For å oppnå dette, må vevet forminskes mest mulig mekanisk og enzymatisk. Behandlingen fører imidlertid også samtidig til at mange celler dør. Hvis slike cellepreparater setter seg på overflaten av egnede bærermaterialer, forblir de døde cellene i resten og kan fjernes. Ved anvendelse av slike cellepreparater i suspen-sjonskulturer ved fremstilling av FSME-virusantigen, foreligger det imidlertid ingen mulighet å skille levende celler fra døde hhv. skadede celler. Lyseringen som etter-hvert finner sted i cellene, fører følgelig til en høy forurensning fra celleproteinene i mediet og som vanskelig lar seg fjerne fra det ønskede produkt.

Også reproduserbarheten av virus/virusantigen-fremstillin-gen er liten ved bruk av enkeltceller eller små celleaggregater i suspensjon, fordi det fører til en sterk celleskade f.eks. på grunn av skjærkreftene ved omrøring.

Oppfinnelsens oppgave består i å fjerne disse ulemper og således å tilveiebringe en biomasse for produksjon av virus/virusantigen som ved kultivering utvikler en høy produksjonsytelse på virus/virusantigen, som er enkel å håndtere og som kan brukes i storteknisk målestokk ved produksjon av virus/virusantigen, hvorved virus/virusantigenet kan utvinnes fra kulturmediet med høy renhet.

Biomassen ifølge oppfinnelsen, som tilfredsstiller de nevnte krav, består av celleaggregater med en diameter på mellom lOOptm og 1000/xm, og er infisert med virus.

Celleaggregatene av biomassen ifølge oppfinnelsen kan oppnås ved hjelp av mekanisk og enzymatisk behandling av humant eller animalsk vev, idet vevet som på mekanisk måte er desintegrert, kan ved ytterligere oppløsning av celleaggregatene forminskes ytterligere med en protease såsom trypsin, kymotrypsin eller elastase inntil den ønskede celleaggregatstørrelse er oppnådd.

Celleaggregatene av biomassen ifølge oppfinnelsen kan imidlertid også oppnås fra humane eller animalske enkeltceller, idet disse behandles med celleaggregerende substanser såsom agglutinin.

Separarering av celleaggregater og enkeltceller med en diameter større enn 1000/xm hhv. mindre enn 100 fim, kan foretas ved siktning eller fortrinnsvis ved sedimentering. Sedimentasjonen er i sammenligning med siktning enklere å gjennomføre, fordi en sikt med en porestørrelse på 100/xm meget lett kan tilstoppes. Dessuten greier sedimentasjonen seg uten kostbare separatorer og byr også på fordeler i sterilteknisk henseende. Det har vist seg at celleaggregatene med en diameter på mellom 100/zm og lOOO^m sedimenterer med en hastighet større enn 1 cm/min, mens de mindre celleaggregatene sedimenterer med en hastighet på mindre enn 1 cm/min. Separasjonen av partiklene med en størrelse mindre enn 1000/xm kan foretas på enkel måte ved siktning, fordi faren for tilstoppelse her er mindre.

En foretrukket utførelsesform av biomassen ifølge oppfinnelsen er karakterisert ved at den, i kulturmediumsuspen-dert tilstand, har en høy metabolsk aktivitet. Målt på glukoseforbruket ligger den metabolske aktivitet mellom 3 og 5 mg glukose pr. gram biomasse pr. time.

Celleaggregatene som anvendes ved tilberedning av biomassen ifølge oppfinnelsen, har dessuten den fordel at de allerede ved en infeksjon med en relativt liten mengde av modervirus produserer store mengder virusantigen. Det har vist seg at man ved infeksjon av celleaggregater som er mindre enn 100/xm eller større enn 1000/xm, må bruke vesentlig mere modervirus for å produsere den samme mengde virus/virusantigen.

Virus/virusantigenproduksjonen kan økes ytterligere, når biomassen ifølge oppfinnelsen holdes ved en oksygenkonsentrasjon på minst 0,01 mmol/1, fortrinnsvis på minst 0,06 mmol i kulturmediet.

Det er fordelaktig når kulturmediet har en celleaggregatkonsentrasjon på minst 10 mg celleaggregat pr. ml.

Biomassen ifølge oppfinnelsen egner seg spesielt godt til produksjon av forsommer-meningoencefalitis-virus (FSME-virus)/virusantigen, når den består av celleaggregater av fuglembryonalceller, spesielt høneembryonalceller, idet en virus/virusantigen-produksjonsytelse økes ytterligere, når det i kulturmediet innstilles en oksygen-overføringshastig-het på større enn 1,60 mmol 02.l"1.h 2, fortrinnsvis mellom 1,65 og 2,40 mmol 02.l"<1.>h"<1.>

Oksygen-overføringshastigheten (oxygen transfer rate, OTR) , uttrykt i mmol 02. 1' X . h' 1, er som kjent en målestokk for innføring av oksygen i cellekultur. Oksygen-opptagelses-hastigheten (oxygen uptake rate, OUT) er igjen en målestokk for den metabolske ytelse av en celle generelt, og således indirekte for virus/virusantigen-synteseytelsen av en celle.

Ved alle de idag kjente metoder for produksjon av FSME-virusantigen er den spesifikke produksjonsytelse på virusantigen begrenset, fordi det ved nærvær av en stor mengde infiserte celler i kulturmediet kan komme til en senkning av pH-verdien og således til en uønsket inaktivering av virustiteren og ødeleggelse av virusantigenet.

Det ble funnet at pH-verdien i en slik sterkt ventilert kultur ikke synker og at en konstant og høy produksjonsytelse av virus/virusantigen kan opprettholdes, når det innføres tilstrekkelige mengder av oksygen i kulturvæsken, f.eks. ved innrøring eller ved hjelp av statiske og/eller dynamiske gassfordelere.

Målinger har vist at FSME-produksjonen reduseres i større målestokk ved en kultur med en celletetthet på 2 x 10<7 >celler pr. milliliter, som utelukkende via overflaten står i forbindelse med oksygen-atmosfæren. Hvis derimot oksygen innføres aktivt i kulturen, så kan antigenutbyttet økes meget sterkt.

En fremgangsmåte ved produksjon av virus/virusantigen under anvendelse av en biomasse som beskrevet ovenfor er angitt i krav 5.

En foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen består i at man innstiller oksygen-overfø-ringshastigheten til større enn 1,65 mmol 02.l~<1>.h~<1>, fortrinnsvis mellom 1,65 og 2,40 mmol 02.l"<1>.h"<1>, hvorved den fuktige cellemasse helst er på maksimalt 30 g pr. liter kulturmedium.

Forsøk har vist at FSME-virus/virusantigenproduksjonen av konsentrasjonen av de ifølge oppfinnelsen anvendte celleaggregater er proporsjonal. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også utføres ved en celleaggregatkonsentrasjon på mindre enn 10 mg/ml. I motsetning til dette ble det funnet at det i tilfellet kultivering av infiserte enkeltceller kreves en minstekonsentrasjon på 10 mg/ml for en virus/ant igenproduks j on.

De høye modervirustiterne som er nødvendige for infeksjon av en primærcellekultur, oppnås vanligvis bare ved formering av viruset i musehjerner. Fordi celleaggregatene ifølge oppfinnelsen kan infiseres med en vesentlig mindre virusmengde, kan moderviruset som er nødvendig for infeksjon av biomassen også utvinnes fra cellekulturrester. Dette minsker tydelig muligheten for en kontaminasjon med mushjerneprotein. Det har dessuten vist seg at biomassen ifølge oppfinnelsen, som består av celleaggregater fra fugle-embryonalceller, egner seg likeledes til produksjon av influensa-, vaccinia- eller avipox-virusantigen.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved de etterfølgende utførelseseksempler.

Eksempel 1: Celleaggregatstørrelsens påvirkning på

antigenutbyttet.

SPF-(specific pathogen free)-hønseegg ble ruget i 12 dager ved 37°C, testet med et Schlierapparat ("Schliergeråt") på embryoveksten, desinfisert med alkohol og åpnet i en sterilboks. Embryoene ble tatt ut, vasket og grovhakket ved hjelp av en kutteanordning. Deretter skjedde en enzymatisk spaltning av det embryonale vev ved tilsetning av proteo-lytiske enzymer (1 mg/embryo) ved 37°C i 20 minutter. Fra denne vevsuspensjonen ble det separert vevs tykker > 100 /xm over en sikt med en maskevidde tilsvarende > 1000 /xm. En ytterligere oppdeling av disse celleaggregater kunne oppnås ved hjelp av en sedimentasjonsfremgangsmåte idet det som oppdelingskriterium ble valgt en sedimentasjonsrate på = 1 cm/min. Til dette ble cellesuspensjonen med en flyterate på 1 cm/min. pumpet nedenifra oppover gjennom et sedimen-tas jonskar. Enkeltcellene hhv. små celleaggregater forble i suspensjon, mens større celleaggregater satte seg på bunnen av karet. Undersøkelser ved hjelp av siktning av foreskjellige porestørrelser viste at celleaggregatene som avsetter seg under disse betingelser, har en størrelsesfor-deling på < 1000 /xm, > 100 /xm. Størrelsen av celleaggregatene som forblir i suspensjon var således < 100 /xm.

På denne måte ble det oppnådd tre fraksjoner celleaggregater

Fra disse fraksjoner ble det suspendert de samme biomasse-konsentrasjoner (30 g pr. liter) i et kul'turmedium (Med 199) , og infisert med FSME-virus (1 x IO<5> pfu pr. mg biomasse).. Virusformeringen skjedde ved 37°C, idet cellene holdes under jevn omrøring i suspesjon. Etter fire dager ble den dannede virusantigenmengde bestemt ved hjelp av

ELISA.

I tilfellet fraksjon 1 (celleaggregater mindre enn lOO/xm) var virus/virusantigenproduksjonen 4,9 /xg/ml; i tilfellet fraksjon 2 (celleaggregater større enn 1000/xm) var virus/- virusantigenproduksjonen 4,7 /xg/ml; i tilfellet fraksjonen ifølge oppfinnelsen var virus/virusantigenproduksjonen 9,3 /xg/ml.

Eksempel 2: Celleaggregatstørrelsens påvirkning på

forurensningen med CEC(chick embryo cell)-protein

De i eksempel 1 oppnådde kulturmedier fra fraksjon 1 og 3 ble undersøkt på CEC-protein-innholdet to dager etter kultiveringsstart. Kulturmediet fra fraksjon 1 inneholdt 1,80 mg CEC-protein/ml, mens kulturmediet fra fraksjon 3 hadde kun 0,84 mg CEC-protein/ml.

Eksempel 3: Påvirkning av mengden modervirus på virus/

antigenproduksjonen

Biomasser, som beskrevet i eksempel 1, ble kultivert med celleaggregatstørrelser fra fraksjonene 1 og 3, og virus /antigenproduksjonen ble bestemt, idet det for infeksjon ble anvendt fire forskjellig mengder modervirus (3,2.10<3 >pfu, 1.10<4> pfu, 3,2. IO4 pfu og 1.10<5> pfu, hver pr. mg biomasse) pr. fraksjon. Resultatene er angitt i den etter-følgende tabell 1, hvorav det fremgår at fraksjon 3 ifølge oppfinnelsen ved samme mengde modervirus har en vesentlig større produksjon av virus/virusantigen.

Eksempel 4: Oksygenkonsentrasjonens påvirkning på

antigenproduksjonen

Ifølge betingelsene angitt i eksempel 1, ble biomassen ifølge oppfinnelsen kultivert ved forskjellige oksygenkon-sentrasjoner i kulturmedium, og mengden virus/virusantigen ble bestemt. Resultatene er angitt i den etterfølgende tabell 2, idet utbyttet ble beregnet på virus/virusantigen under en oksygenkonsentrasjon på 0,06 mmol/1 med 100 %.

Eksempel 5: Oksygenoverføringspåvirkning på virus/

antigenutbytte

Biomasse ble slik som beskrevet i eksempel 1, infisert med celleaggregater fra fraksjon 3, kultivert i forskjellige store kulturkar og gasset med luft for å oppnå forskjellige OTR-verdier. Suspensjonen ble i 4 dager holdt ved en temperatur på 33°C - 37°C, og virus/antigenutbytte ble bestemt. (Sml. tabell 3).

Fra resultatene i tabell 3 kan det avledes at det ved en OTR større enn 2 virus/antigen-utbytte, kan oppnås ca. 6 /xg/ml.

Claims (11)

1. Biomasse ved produksjon av virus/virusantigen, karakterisert ved at biomassen består av celleaggregater med en diameter mellom 100/xm og 1000/xm, hvilken biomasse er infisert med virus.

2. Biomasse som angitt i krav 1, karakterisert ved at celleaggregatene oppnås ved mekanisk og enzymatisk behandling av humant eller animalsk vev.

3. Biomasse som angitt i krav 1, karakterisert ved at celleaggregatene oppnås fra humane eller animalske enkeltceller ved behandling med celleaggregerte substanser.

4. Biomasse som angitt i krav 1, karakterisert ved at den metabolske aktivitet av biomassen som er suspendert i kulturmedium utgjør pr. time mellom 3 og 5 mg glukose pr. gram biomasse, målt på glukosef orbruket.'

5. Fremgangsmåte ved produksjon av virus/virusantigen under anvendelse av en biomasse med celleaggregater med en diameter mellom 100/xm og 1000/xm ifølge ett eller flere av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den gjennomføres i et kulturmedium ved en oksygenkonsentrasjon på minst 0,01 mmol/1, fortrinnsvis minst 0,06 mmol/1, og hvor det blir foretatt en separasjon av biomassen før den infiseres med et virus.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at den gjennomføres i et kulturmedium som har minst 10 mg celleaggregater med en diameter mellom 100/xm og 1000/xm pr. ml, og hvor det blir foretatt en separasjon av biomassen før den infiseres med et virus.

7. Fremgangsmåte ved produksjon av forsommer-meningoencefalitis-virus(FSME-virus)/virusantigen som angitt i krav 5, karakterisert ved at det som kulturmedium anvendes en biomasse bestående av celleaggregater med en diameter mellom 100/xm og 1000/xm av fuglembyronalceller, spesielt høneembryonalceller, og hvor det blir foretatt en separasjon av biomassen før den infiseres med et virus.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at det som kulturmedium anvendes en biomasse bestående av celleaggregater med en diameter mellom 100/xm og 1000/xm og ved at det i kulturmediet innstilles en oksygen-overføringshastighet større enn 1,60 mmol 02 • l"1.h"1, fortrinnsvis mellom 1,65 og 2,4 0 mmol 02.l"<1>.h"<1>, og hvor det blir foretatt en separasjon av biomassen før den infiseres med et virus.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at det som kulturmedium anvendes en biomasse bestående av celleaggregater med en diameter mellom 100/xm og 1000/xm og ved at det ved en oksygen-overføringshastighet på 1,65 mmol 02.l"<1>.h"<1> anvendes en biomasse på maksimalt 30 g pr. liter kulturmedium, og hvor det blir foretatt en separasjon av biomassen før den infiseres med et virus.

10. Fremgangsmåte ved produksjon av influensa-, vaccinia-eller avipox-virus/virusantigen som angitt i krav 5, karakterisert ved at det som kulturmedium anvendes en biomasse bestående av celleaggregater av fuglembyronalceller med en diameter mellom 100/xm og 1000/xm, og hvor det blir foretatt en separasjon av biomassen før den infiseres med et virus.

11. Anvendelse av celleaggregater med en diameter mellom 100/xm og 1000/xm ved fremstilling av en biomasse ifølge krav 1.