CN105106948A

CN105106948A - 一种利用细胞工厂制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的方法

Info

Publication number: CN105106948A
Application number: CN201510370207.2A
Authority: CN
Inventors: 朱文革; 郑杰; 张连祥; 谢巧; 朱秀芝; 邢佳鹏; 邵庆红; 韩莉
Original assignee: BEIJING VETERINARY BIOLOGICAL PRODUCTS FACTORY
Current assignee: BEIJING VETERINARY BIOLOGICAL PRODUCTS FACTORY
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2015-12-02

Abstract

本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗以及采用细胞工厂制备所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的方法。一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗，其特征在于，每20ml成品包括：白油佐剂：12--14ml病毒培养液：6～8ml其中每ml病毒培养液中猪繁殖与呼吸综合征病毒含量不低于10^6.5TCID50。

Description

一种利用细胞工厂制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的方法

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗及其利用细胞工厂制备所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS，又称猪蓝耳病)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种母猪繁殖障碍和各日龄猪呼吸疾病为特征的高度接触性传染病。蓝耳病是目前影响世界养猪业最严重的疾病之一，自其被发现以来传播迅速，危害性大，仔猪发病率可达100％，死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡。

目前普遍使用的是用转瓶培养细胞的传统工艺，转瓶培养具有结构简单，投资少,技术成熟，重复性好，容易扩大等优点；但也有其缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供的细胞生长的面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件限制等缺点。

因此，本领域需要新的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗及其制备方法和生产工艺。

发明内容

在本发明中，发明人提供了一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗及其利用细胞工厂制备所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的方法。

在第一方面，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗每20ml成品包括：

白油佐剂：12～14ml

病毒培养液：6～8ml

其中每ml猪繁殖与呼吸综合征病毒含量不低于10^6.5TCID50。

在某些实施方案中，本发明的疫苗可以为油乳剂灭活疫苗

在第二方面，本发明提供了制备第一方面所述的疫苗的方法，所述方法包括：

(a)复苏MARC-145细胞；

(b)将所述MARC-145细胞接种至细胞工厂进行单层培养；

(c)将猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所培养的MARC-145细胞；和

(d)收获接种后的MARC-145细胞；和

(e)将所收获的MARC-145细胞培养液灭活，加入适量白油佐剂乳化获得所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗。

在某些实施方案中，本发明的制备疫苗的方法可以包括：

(1)将MARC-145细胞悬浮于含5～8％牛血清的DMEM培养基中，之后再培养瓶中培养至90％以上的细胞贴壁；

(2)将步骤(1)中所培养的细胞用胰酶消化后接种至细胞工厂中，每层150ml-250ml细胞悬液，盖好进液口盖，放37℃温室中静止培养；

(3)细胞培养48～72小时后，弃去细胞工厂内培养基，接种所述的适量的猪繁殖与呼吸综合征病毒，吸附1小时，吸附后加入维持液，将维持液分匀后放入37℃温室中继续培养；和

(4)培养至70％及以上的细胞出现致细胞病变效应时收获所述MARC-145细胞，通过反复冻融细胞2次，将所述MARC-145细胞从细胞工厂壁上摇下过滤去除细胞碎片后，收集到无菌容器内；和

(5)加入适量的甲醛溶液，混匀，37℃灭活至少18个小时，获得所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，在抗原中加入适量白油，经过乳化获得灭活疫苗。

在某些实施方案中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒可以是NVDC-JXA1株。

在某些实施方案中，将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所述MARC-145细胞的方法可以是将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的工作毒种接种于所述细胞工厂中培养的单层MARC-145细胞。

在某些实施方案中，将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所述MARC-145细胞的方法可以是将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的工作毒种接种于MARC-145细胞悬液中后分装在所述细胞工厂中。

在某些实施方案中，可以按3％～5％接种所述猪繁殖与呼吸综合征病毒。

在某些实施方案中，灭活时可以按终浓度为0.1％～0.2％比例加入所述甲醛溶液。

在某些实施方案中，所述方法还可以包括将所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗以冷冻水循环的方式进行冷却，并于4℃保存。

本发明的有益效果：

本发明采用NVDC-JXA1病毒株作为接种病毒株，并采用细胞工厂制备的猪繁殖与呼吸综合症灭活疫苗，所获得的疫苗质量优良，免疫效力高，免疫效果稳定。

具体实施方式

下列实施例皆在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神及原则的前提下，对本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将本发明的待批权利要求范围之内。

本发明实施例中，选用美国CORNING公司出品的CellSTACK10层(636CM2/层)或更多层数细胞工厂，采用同步感染法制备猪繁殖与呼吸综合症灭活疫苗；MARC-145细胞和猪繁殖与呼吸综合征病毒株NVDC-JXA1，由北京市兽医生物药品厂质管部保管和供应。

实施例1：

制备工艺主要步骤如下：

1)复苏细胞

从液氮罐中取出细胞管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml无血清培养基的离心管中，1,000rpm/分，离心5分钟。用含8％牛血清的DMEM培养基悬浮细胞，接种T175培养瓶中培养，37℃培养，当长成良好单层时，用0.25％胰酶消化细胞，按1:4传代培养。

2)细胞单层培养

将以扩大并长成良好单层的细胞，用0.25％胰酶消化，接种到细胞工厂中，每层150ml-250ml细胞悬液，盖好进液口盖，放37℃温室中静止培养。

3)接种及更换维持液

细胞培养48小时后，弃去细胞工厂内培养基，按4.0％接种NVDC-JXA1病毒株，吸附1小时(每层分匀)，吸附后加入维持液，将维持液分匀，拧紧口帽，放入37℃温室中继续培养

4)培养与观察

接毒后24h后每天观察一次，待70％以上细胞出现CPE时，即可收获。

5)收获

接毒后随时观察病变情况，培养至70％及以上的细胞出现致细胞病变效应(CPE)时,即可收获。反复冻融细胞2次，将细胞从细胞工厂壁上摇下，经180目绢布过滤去除细胞碎片，收集到无菌容器内，取样，做无菌检验，将收获的抗原放置于-20℃冷库中保存。

6)灭活

将已解冻好的抗原通过管道进入已灭菌的灭活罐中，混合完毕后搅拌10分钟，通过取样阀取灭前样20ml，检验和计算病毒液含量，按终浓度为0.2％比例加入一定量的甲醛溶液，并以120转/分搅拌10分钟，混匀，37℃(待罐内温度升至37℃开始计时)灭活18个小时，灭活结束后取样20ml，并做好记录放4℃冰箱保存待检。取样后加入适量吐温，搅拌10分钟，通过冷冻水循环的方式对抗原进行冷却。通过使用压缩空气把灭活罐内抗原打到灭菌白桶内放4℃库保存。

7)乳化

取油相(MARC52)2份放入胶体磨中，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以10,000r/min，搅拌3-5分钟，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％硫柳汞溶液。

8)分装

将乳化好的疫苗打入灌装间，疫苗瓶、胶塞分别灭菌后移入灌装车间，按产品规格定量灌装、加塞、轧盖。

9)贴标保存

将灌装好的疫苗瓶贴上标签，连同说明书装箱。抽取样品，挂待检牌入成品库待检区。

10)检验结果：

实施例2：

制备工艺主要步骤如下：

1)复苏细胞

本生产用细胞为MARC-145细胞，由北京市兽医生物药品厂质管部保管和供应。

从液氮罐中取出细胞管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml无血清培养基的离心管中，1,000rpm/分，离心5分钟。用含7％牛血清的DMEM培养基悬浮细胞，接种T175培养瓶中培养，37℃培养，当长成良好单层时，用0.25％胰酶消化细胞，按1:4传代培养。

2)细胞单层培养

3)接种及更换维持液：

细胞培养48小时后，弃去细胞工厂内培养基，按4.5％接种NVDC-JXA1病毒株，吸附1小时(每层分匀)，吸附后倒出病毒液，然后加入维持液，将维持液分匀，拧紧口帽，放入37℃温室中继续培养。

4)培养与观察

5)收获

6)灭活：

将已化好的抗原倒入已灭菌的灭活罐中，混合完毕后搅拌10分钟，通过取样阀取灭前样20ml，检验和计算病毒液含量，按终浓度为0.15％比例加入甲醛溶液，并以120转/分搅拌10分钟，混匀，37℃(待罐内温度升至37℃开始计时)灭活18个小时，灭活结束后取样20ml，并做好记录放4℃冰箱保存待检。取样后加入适量吐温，搅拌10分钟，通过冷冻水循环的方式对抗原进行冷却。通过使用压缩空气把灭活罐内抗原打到灭菌白桶内放4℃库保存。

7)半成品检验

灭活前每毫升病毒含量应不低于10^6.5TCID50。

无菌检验应符合规程，应无菌生长。

灭活检验

灭活后，从每瓶病毒液中取样，10倍稀释后接种于已长成良即单层的Marc-145细胞，每个样品接种4瓶，每瓶1ml，孵育1小时后弃去接种液，加维持液培养5日，同时设未接种的Marc-145细胞做空白对照。5日后盲传1代，继续培养5日，应无细胞病变出现。

8)乳化：取油相1.8份放入胶体磨中，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以10,000r/min，搅拌3-5分钟，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％硫柳汞溶液。

9)分装

10)贴标保存

11)检验结果：

实验例3：

制备工艺主要步骤如下：

1)复苏细胞

从液氮罐中取出细胞管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml无血清培养基的离心管中，1,000rpm/分，离心5分钟。用含6％牛血清的DMEM培养基悬浮细胞，接种T175培养瓶中培养，37℃培养，当长成良好单层时，用0.25％胰酶消化细胞，按1:4传代培养。

2)细胞单层培养

3)接种及更换维持液

细胞培养48小时后，弃去细胞工厂内培养基，按5％接种NVDC-JXA1病毒株，然后直接加入细胞维持液，将维持液分匀，拧紧口帽，放入37℃温室中继续培养

4)培养与观察

5)收获

6)灭活

将已解冻好的抗原通过管道进入已灭菌的灭活罐中，混合完毕后搅拌10分钟，通过取样阀取灭前样20ml，计算病毒液含量，按终浓度为0.1％比例加入一定量甲醛溶液，并以120转/分搅拌10分钟，混匀，37℃(待罐内温度升至37℃开始计时)灭活18个小时，灭活结束后取样20ml，并做好记录放4℃冰箱保存待检。取样后加入适量吐温，搅拌10分钟，通过冷冻水循环的方式对抗原进行冷却。通过使用压缩空气把灭活罐内抗原打到灭菌白桶内放4℃库保存。

7)乳化

取油相(MARC52)1.5份放入胶体磨中，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以10,000r/min，搅拌3-5分钟，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％硫柳汞溶液。

8)分装

9)贴标保存

10)检验结果：

由以上数据可以看到实施例1、实施例2和实施例3各项检测均符合规定，测定TCID50也明显高于国家标准。实验结果显示经过工艺优化后，用细胞工厂生产的猪的繁殖与呼吸综合征灭活疫苗与细胞转瓶生产的疫苗相比，具有质量优良，免疫效力高、免疫结果稳定等优点。

Claims

1.一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗，其特征在于，每20ml成品包括：

白油佐剂：12--14ml

病毒培养液：6～8ml

其中每ml病毒培养液中猪繁殖与呼吸综合征病毒含量不低于10^6.5TCID50。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为油乳剂灭活疫苗。

3.制备如权利要求1或2所述的疫苗的方法，所述方法包括：

(a)复苏MARC-145细胞；

(b)将所述MARC-145细胞接种至细胞工厂进行单层培养；

(d)收获接种后的MARC-145细胞；和

(e)将所收获的MARC-145细胞病毒培养液灭活加入适量白油乳化，获得所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述方法包括：

(1)将MARC-145细胞悬浮于含8％牛血清的DMEM培养基中，之后再培养瓶中培养至细胞单层达到90％以上；

(3)细胞培养48～72小时后，待细胞单层达到70-90％以上，弃去细胞工厂内培养基，接种所述猪繁殖与呼吸综合征病毒，吸附1小时，吸附后加入维持液，将维持液分匀后放入37℃温室中继续培养；

(5)加入适量甲醛溶液，混匀，37℃灭活至少18个小时，获得所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒是NVDC-JXA1株。

6.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所述MARC-145细胞的方法是将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的工作毒种接种于所述细胞工厂中培养的单层MARC-145细胞。

7.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所述MARC-145细胞的方法是将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的工作毒种接种于MARC-145细胞悬液中后分装在所述细胞工厂中。

8.如权利要求3至7中任一项所述的方法，其中按3％～5％接种所述猪繁殖与呼吸综合征病毒。

9.如权利要求3至8中任一项所述的方法，其中灭活时按终浓度为0.1％～0.2％比例加入所述甲醛溶液。

10.如权利要求3至9中任一项所述的方法，其还包括将所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗以冷冻水循环的方式进行冷却，并于4℃保存。