CN110237247A - 一种利用细胞工厂生产ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用细胞工厂生产Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗的方法。与传统工艺鸡胚制造及转瓶制造相比，利用该工艺生产的3批疫苗批间差异小，半成品病毒含量均≥108.32TCID50/ml，且细胞工厂获得的病毒效价比转瓶工艺生产高13倍，占用空间仅为3.15dm3，仅为转瓶工艺的1/4，病毒总收获量是转瓶工艺产量的80倍，实现培养面积大，节省空间，在有限的空间内实现提高产能的目的，同时保证纯净性、安全性、免疫原性良好，降低人为污染、质量不可控等风险。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于细胞工厂培养技术的Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，属于兽用兽用生物技术领域。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)根据群特异性抗原可分为3个群，Ⅰ群、Ⅱ群、Ш群，其中Ⅰ群禽腺病毒在家禽体内普遍存在，且呈现隐性感染，多发生于3～5周龄的肉鸡，其毒力较强，本身就可导致易感鸡群的发病，死亡率达20％～80％。
目前我国Ⅰ群禽腺病毒主要流行的血清型：一个是临床表现为心包积液综合征，均为血清4型，其毒力较强，本身就可导致易感鸡群的发病；另一个是临床表现为包涵体肝炎，主要是血清8型和血清11型，最早是美国在1963年报道过该病，自2009年之后开始广泛流行，尤其是在2014年。
随着我国养鸡业的迅速发展，Ⅰ群禽腺病毒的发病率给养殖业造成严重的损失，腺病毒感染SPF鸡后会垂直传播给SPF种蛋，影响疫苗成品质量，国外已有预防该病的商品化疫苗，而我国至今无商品化的疫苗。
鸡肝癌细胞作为一种稳定生产腺病毒的细胞系，与传统的鸡胚苗相比，抗原性更接近自然流行株，病毒繁殖滴度高，同时可减少宿主蛋白成分，减少过敏反应。目前普遍使用转瓶培养细胞的传统工艺，但污染风险高，劳动强度大，可控性差，占用空间大，单位体积提供的细胞生长面积小等缺点，而细胞工厂以传代细胞为基质制备疫苗具有易于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定性等优点，相较于转瓶培养能在有限的空间内实现提高产能目的，减少批间差异。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用细胞工厂生产Ⅰ群禽腺病毒制备灭活疫苗的方法。
本发明的技术方案
1.一种Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗，其特征在于所述的灭活苗含有Ⅰ群禽腺病毒XNGX株灭活病毒，该株病毒已于2019年06月19日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCCNo.17998；
所述Ⅰ群禽腺病毒XNGX株灭活病毒是通过细胞工厂培养方法获得的，且病毒培养液中禽腺病毒含量≥108.0TCID50/ml。
2.如权利要求1所述一种Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗，其特征在于该疫苗的制备方法包括以下步骤：
(1)复苏鸡肝癌细胞；
(2)将鸡肝癌细胞先在培养瓶中培养，待长成良好细胞单层，继续传代扩大培养后接种到细胞工厂进行单层细胞培养；
(3)将Ⅰ群禽腺病毒XNGX株接种于细胞工厂所培养的鸡肝癌细胞并继续培养，当细胞病变达80％～90％，收获病毒液；
(4)收获的病毒液经冻融、去沉淀后的病毒液加灭活剂进行灭活处理；
(5)灭活后的病毒液加入佐剂乳化，制备成Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗。
本发明的有益效果
本发明涉及一种利用细胞工厂生产Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗的方法。与传统工艺鸡胚制造及转瓶制造相比，利用该工艺生产的3批疫苗批间差异小，收获病毒滴度较高，半成品均达到每ml病毒含量不低于108.50TCID50。细胞工厂获得的病毒效价比转瓶工艺生产高13倍，占用空间仅为3.15dm3，仅为转瓶工艺的1/4，病毒总收获量是转瓶工艺产量的80倍，实现培养面积大，节省空间，在有限的空间内实现提高产能的目的，同时保证纯净性、安全性、免疫原性良好，降低人为污染、质量不可控等风险。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的微生物是有临床疑似禽腺病毒感染的发病鸡群中分离到的1株Ⅰ群禽腺病毒XNGX株，该病毒株已于2019年06月19日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.17998。
具体实施方式
1.Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定：
本发明人于2015年在广西某疑似Ⅰ群禽腺病毒感染的鸡场，采集病死鸡的心包积液、肝、肾、心、肺、脾脏等组织病料，用含青霉素(2000units/ml)、链霉素(2mg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)和制霉菌素(1000units/ml)的PBS(pH 7.0～7.4)制成1∶5的匀浆，反复冻融3次后，3000r/min离心10min，取上清液经绒毛尿囊膜途径接种5枚9日龄的SPF鸡胚，接种后收获尿囊液。参照已发表的I群禽腺病毒hexon基因片段中L1loop核苷酸保守序列，设计一对引物(序列1和序列2)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列如下所示：
序列1-F：5’-caarttcagr cagacggt-3’18
序列1-R：5’-tagtgatgmc gsgacatcat-3’20
并采用PCR扩增了所收获的鸡胚尿囊液，对扩增产物进行克隆转化和序列分析，获得了hexon基因片段，其大小为2800bp左右(序列3)。将其与GenBank中不同血清型I群禽腺病毒参考毒株的相应序列一起应用Mega 6.0软件进行同源比对分析，结果确定为Ⅰ群禽腺病毒。命名为XNGX株，该株病毒已于2019年06月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.17998。
(序列3XNGX株hexon基因)
2.疫苗制备
(1)鸡肝癌细胞；将述鸡肝癌细胞先在培养瓶中培养，待长成良好细胞单层后，继续传代增殖培养，最后将扩大培养的细胞接种到细胞工厂进行单层培养；
培养鸡肝癌细胞前先用0.1％明胶对培养瓶进行预处理，静置10～15min；
将鸡肝癌细胞悬浮于含10％胎牛血清的DMEM营养液中，之后在培养瓶中培养至细胞单层达到90％以上；
所培养的细胞用胰酶消化液(胰酶-乙二胺四乙酸二钠)消化后接种至0.1％明胶处理过的细胞工厂中，每层150～250ml细胞悬液，盖好进液盖，置37℃温室中静止培养；
(2)生产用毒种的制备：将Ⅰ群禽腺病毒生产用毒种接种于所培养的鸡肝癌细胞；
取已形成良好单层的鸡肝癌细胞培养瓶，弃去细胞营养液，接种含10％～15％毒种的无抗无血DMEM，置37.5～38℃、5％CO2温箱内吸附1h，弃去培养液，加入细胞维持液，继续培养至72h，反复冻融2次，5000r/min离心10min进行收获，取上清，定量分装于安瓿瓶中，作为生产用毒种备用。
培养至细胞密度达到4.0×106个/ml，弃去细胞工厂内培养基，按含1.5％～2.0％接种所述Ⅰ群禽腺病毒生产用毒种，每层200～250ml，置36～37℃培养；
(3)收获病毒液；培养至72h，此时细胞病变达80％～90％，反复冻融2次，去除死细胞和碎片，收获至无菌容器内；灭活时可以按终浓度为0.1％比例加入10％甲醛溶液，使其充分混合，37℃搅拌灭活至少16h，加入佐剂混合乳化后即得；
(4)将收获的病毒液灭活加入适量白油佐剂乳化(乳化时水油比例可以按病毒上清液与白油佐剂体积比1∶2～1∶3混合进行乳化)，获得所述的Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗。
3.疫苗检验
(1)半成品病毒含量测定：按《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)进行，病毒含量≥108.0TCID50/ml。
(2)性状：按《中国兽药典》规定进行以下各项检验。
1)外观：乳白色均匀乳剂
2)剂型：油包水型
3)稳定性：取10ml疫苗3000r/min离心15min，管底析出的水相应不超过0.5ml。
4)黏度：应不超过100cP。
(3)装量检查：每个供试品的装量，均应不低于瓶签的标识量
(4)无菌检验：按《中国兽药典》进行，应无菌生长
(5)安全检验：用7～28日龄SPF鸡10只，每只分两点注射疫苗1.0ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
(6)效力检验：
1)血清学方法：用7～10日龄SPF鸡15只，其中10只颈部皮下注射疫苗0.3ml，另5只作对照。21～28日后采血，分离血清，测定抗体。免疫组应至少8只鸡琼扩抗体为阳性，对照组鸡应全部为阴性。
2)免疫攻毒法：用7～10日龄SPF鸡20只，其中10只颈部皮下注射疫苗0.3ml，另10只作对照。接种后21～28日，连同免疫鸡和对照鸡攻XNGX株，肌肉注射，0.2ml/只，观察至14日，每日记录鸡只发病死亡情况。免疫组应至少9只不发病，对照组应至少9只发病。
(7)甲醛残留量测定：按《中国兽药典》规定进行，其甲醛残留量应≤0.1％。
4.结果表明：在细胞工厂中增殖的最佳条件为：至细胞密度达到4.0×106个/ml时，接种含1.5％～2.0％禽腺病毒工作毒种的细胞维持液，每层200～250ml，37℃静置培养72h，收获病毒滴度较高，其病毒含量稳定在108.0～108.5TCID50/ml之间。制备的灭活疫苗安全、有效、质量可控，且免疫效果稳定。
实施例
下面结合实施例对本发明进一步详细描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
实施例1——最佳接毒剂量及接毒时间的筛选
取培养48、72h，已形成良好单层鸡肝癌细胞的细胞工厂(525cm2，共5层)8个，弃去细胞营养液，分别接种含1.0％、1.5％、2.0％、5.0％生产用毒种的细胞维持液，100ml/个，置于37℃、5％CO2温箱内培养，观察并记录出现细胞病变的时间及病变程度，当80％以上的细胞出现细胞病变时收获病毒液，反复冻融2次后，5000r/min离心10min，取上清测定病毒含量。结果见表1。
表1不同接毒剂量及接毒时间试验结果
结果表明：以1.5％和2.0％含毒量接种，接种后72h，80％以上的细胞出现细胞病变，此时收获病毒含量较高，可达到108.32TCID50～108.50TCID50/ml，且接种到培养48、72h的鸡肝癌细胞中收获的病毒含量差异不大。
实施例2——最佳收获时间的筛选
以1.5％含毒量接种已形成良好单层细胞的细胞工厂3个，分别于72、96、120小时各收获1个，反复冻融2次后，5000r/min离心10min，取上清测定病毒含量。结果见表2。
表2不同收获时间试验结果
结果表明：接种后72h收获的病毒液病毒含量达到最高，为108.32TCID50/ml。
实施例3——最佳维持液血清含量筛选
根据筛选的最佳接毒剂量和接毒时间进行接种，其中稀释种毒的维持液中胎牛血清含量分别为1.0％、2.0％、5.0％，置于37℃、5％CO2温箱内培养，在72h收获病毒液，反复冻融2次后，5000r/min离心10min，取上清测定病毒含量。结果见表3。
表3最佳维持液血清含量确定
结果表明：细胞维持液的最佳血清含量为2.0％。
实施例4——疫苗制备
1.选用美国CORNING公司出品的Cell STACK 5层(525cm2/层)，采用单层感染法制备3批Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗。
2.灭活疫苗制备工艺主要步骤如下：
(1)复苏鸡肝癌细胞
从工作细胞库中取出冻存细胞，40℃水浴融化，1000r/min离心5min，弃去上清，加入含10％胎牛血清的DMEM营养液分散悬浮细胞，移入已用0.1％明胶处理的T25细胞瓶，置37℃培养48h左右，用0.25％胰酶消化(含EDTA)细胞，按1∶2比例传代培养。
(2)将所述鸡肝癌细胞接种至细胞工厂进行单层培养
将以扩大并形成良好单层的细胞，用0.25％胰酶消化(含EDTA)消化，接种到已用0.1％明胶处理的细胞工厂中，每层150ml细胞悬液，盖好进液盖，置37℃温室中静置培养。
(3)生产用毒种制备
取已形成良好单层的鸡肝癌细胞T75培养瓶，弃去细胞营养液，接种含10％毒种的无抗无血DMEM，置37.5～38℃、5％CO2温箱内吸附1h，弃去培养液，加入细胞维持液，继续培养至72h，反复冻融2次，5000r/min离心10min进行收获，取上清，定量分装于安瓿瓶中，注明收获日期、毒种代数等，冷冻保存。
(4)将Ⅰ群禽腺病毒生产用毒种接种于所培养的鸡肝癌细胞
培养至细胞密度达到4.0×106个/ml，弃去细胞工厂内培养基，接种含1.5％生产用毒种的细胞维持液，每层200ml，置于37℃温室中继续培养。
(5)收获病毒液
培养至72h，此时细胞病变达80％以上，即可收获。反复冻融2次，5000r/min离心10min，取上清液进行收获。
(6)灭活
将病毒液导入灭活罐中，计量加入10％甲醛溶液，开动搅拌电机缓慢搅拌，使其充分混合，甲醛的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐内，以避免罐口粘附的病毒未能接触灭活剂。然后再37℃搅拌灭活20h(以罐内温度达到37℃开始计时，开动搅拌机连续搅拌)后取出，置4℃中保存。
(7)乳化
取油相放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时缓慢加入1∶3比例的水相，再以3500r/min搅拌40min。
(8)分装
定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置于4℃中保存。
3.疫苗检验
(1)半成品病毒含量测定：按《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)规定方法进行，病毒含量≥108.0TCID50/ml。
(2)性状：外观、剂型、稳定性及黏度均按《中国兽药典》规定方法进行进行。
(3)装量检查：按《中国兽药典》规定方法进行。
(4)无菌检验：按《中国兽药典》规定方法进行。
(5)安全检验：用7～28日龄SPF鸡10只，每只分两点注射疫苗1.0ml，观察14日，均未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
(6)效力检验：
1)血清学方法：用7～10日龄SPF鸡15只，其中10只颈部皮下注射疫苗0.3ml，另5只作对照。21～28日后采血，分离血清，测定抗体。
2)免疫攻毒法：用7～10日龄SPF鸡20只，其中10只颈部皮下注射疫苗0.3ml，另10只作对照。接种后21～28日，连同免疫鸡和对照鸡攻XNGX株，肌肉注射，0.2ml/只，观察至14日，每日记录鸡只发病死亡情况。
(7)甲醛残留量测定：按《中国兽药典》规定进行检验，结果为≤0.1％。
以上各项检验结果，见表4。
表4 Cell STACK(5层)单层感染法制备Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗检验结果
(10)结果表明：经过工艺优化后，用细胞工厂生产3批Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗，半成品病毒含量较高，病毒含量均≥108.32TCID50/ml，收获量稳定在900～910ml，批间差异小，纯净性良好，避免常规鸡胚疫苗病毒含量较低及转瓶工艺瓶间差异较大，可控性差等缺点；安全性良好；同时均能提供10/10的攻毒保护，说明该生产工艺稳定，生产的疫苗安全、有效、质量稳定。
实施例5
1.选用美国CORNING公司出品的Cell STACK 10层(636cm2/层)，采用单层感染法制备Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗。
2.灭活疫苗制备工艺主要步骤如下：
(1)复苏鸡肝癌细胞
从工作细胞库中取出冻存细胞，40℃水浴融化，1000r/min离心5min，弃去上清，加入含10％胎牛血清的DMEM营养液分散悬浮细胞，移入已用0.1％明胶处理的T75细胞瓶，置37℃培养48h左右，用0.25％胰酶消化(含EDTA)细胞，按1∶2比例传代培养。
(2)将所述鸡肝癌细胞接种至细胞工厂进行单层培养
将以扩大并形成良好单层的细胞，用0.25％胰酶消化(含EDTA)消化，接种到已用0.1％明胶处理的细胞工厂中，每层250mL细胞悬液，盖好进液盖，置37℃温室中静置培养。
(3)生产用毒种制备
取已形成良好单层的鸡肝癌细胞培养瓶，弃去细胞营养液，接种含15％毒种的无抗无血DMEM，置37.5～38℃、5％CO2温箱内吸附1h，弃去培养液，加入细胞维持液，继续培养至72h，反复冻融2次，5000r/min离心10min进行收获，取上清，定量分装于安瓿瓶中，注明收获日期、毒种代数等，冷冻保存。
(4)将Ⅰ群禽腺病毒生产用毒种接种于所培养的鸡肝癌细胞
培养至细胞密度达到4.0×106个/mL，弃去细胞工厂内培养基，接种含2.0％生产用毒种的细胞维持液，每层250mL，置于37℃温室中继续培养。
(5)收获病毒液
培养至72h，此时细胞病变达80％以上，即可收获。反复冻融2次，将细胞从细胞工厂壁上摇下，经180目纱布过滤取出死细胞和碎片，收获至无菌容器内。
(6)灭活
将病毒液导入灭活罐中，计量加入10％甲醛溶液，开动搅拌电机缓慢搅拌，使其充分混合，甲醛的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐内，以避免罐口粘附的病毒未能接触灭活剂。然后再37℃搅拌灭活16h(以罐内温度达到37℃开始计时，开动搅拌机连续搅拌)后取出，置4℃中保存。
(7)乳化
取油相放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时缓慢加入1∶2比例的水相，再以3500r/min搅拌40min。
(8)分装
定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置于4℃中保存。
3.疫苗检验
(1)半成品病毒含量测定：按《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)进行，病毒含量≥108.0TCID50/ml。
(2)性状：外观、剂型、稳定性及黏度均按《中国兽药典》规定方法进行进行。
(3)装量检查：按《中国兽药典》规定方法进行。
(4)无菌检验：按《中国兽药典》规定方法进行。
(5)安全检验：用7～28日龄SPF鸡10只，每只分两点注射疫苗1.0ml，观察14日，均未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
(6)效力检验：
1)血清学方法：用7～10日龄SPF鸡15只，其中10只颈部皮下注射疫苗0.3ml，另5只作对照。21～28日后采血，分离血清，测定抗体。
2)免疫攻毒法：用7～10日龄SPF鸡20只，其中10只颈部皮下注射疫苗0.3ml，另10只作对照。接种后21～28日，连同免疫鸡和对照鸡攻XNGX株，肌肉注射，0.2ml/只，观察至14日，每日记录鸡只发病死亡情况。
(7)甲醛残留量测定：按《中国兽药典》规定进行检验，结果为≤0.1％。
以上各项检验结果，见表5。
表5 Cell STACK(10层)单层感染法制备Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗检验结果
(10)结果表明：将细胞工厂从5层(525cm2/层)扩大到10层(636cm2/层)，收获的半成品病毒含量为108.50TCID50/ml，收获量也在预期范围内，说明该工艺稳定，同时制备的疫苗安全和效力检验均符合成品检验标准，进一步证实该工艺生产的疫苗安全、有效、质量可控。
3.细胞工厂与转瓶培养的主要参数比较
细胞工厂与转瓶培养的主要参数比较，结果见表6。
表6细胞工厂与转瓶培养的主要参数比较
| 参数 | CORNINGCF10 | 转瓶 |
| 单个培养面积 | 6360cm<sup>2</sup> | 1800cm<sup>2</sup> |
| 个数 | 2 | 7 |
| 总培养面积 | 1.27m<sup>2</sup> | 1.26m<sup>2</sup> |
| 占用空间 | 3.15dm<sup>3</sup> | 13.62dm<sup>3</sup> |
| TCID<sub>50</sub>/mL | 10<sup>8.50</sup> | 10<sup>7.38</sup> |
| 产量 | 4000ml | 7350ml |
| 总病毒含量(TCID<sub>50</sub>) | 4×10<sup>11</sup>.50 | 7.35×10<sup>10</sup>.38 |
结果说明：通过细胞工厂与转瓶培养的主要参数比较可得，细胞工厂获得的病毒效价为108.50TCID50/mL，是转瓶工艺生产(107.38TCID50/mL)的13倍；占用空间仅为3.15dm3，仅为转瓶工艺的1/4，培养面积大，占用空间少，在有限的空间内实现提高产能的目的，转瓶工艺病毒收获量为4×1011.50TCID50，而细胞工厂病毒总收获量为7.35×1010.38TCID50，是转瓶工艺产量的80倍。
序列表
<110> 中崇信诺生物科技泰州有限公司
<120> 一种利用细胞工厂生产Ⅰ 群禽腺病毒灭活疫苗的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(1-F)
<400> 1
caarttcagr cagacggt 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(1-R)
<400> 2
tagtgatgmc gsgacatcat 20
<210> 3
<211> 2814
<212> DNA
<213> Ⅰ群禽腺病毒XNGX株hexon基因(avian adenovirus)
<400> 3
atggcggccc tcacgcccga cctgactacc gcgactccgc ggctccagta ttttcacatc 60
gcgggccccg ggacgcgcga atacctctct gaggacctcc aacagttcat ttccgccacc 120
ggaagctact ttgacttgaa aaacaagttc agacagacgg tcgtggcgcc cacccgaaat 180
gtcacgacag aaaaggctca acggctgcaa atccgctttt accccatcca aaccgacgac 240
acgtcgacgg gctaccgcgt gcggtacaac atcaatgtgg gcgacggttg ggtcctggac 300
atggggtcga cctatttcga catcaaggga atcctagacc gagggccgtc cttcaagccc 360
tactgcggca cggcttacaa cccgctggct cccaaggagt ccatgtttaa caactggtcg 420
gagacggcac ccgggcagaa cgtgtccgcc tccggtcagc tgtccaacgt ctataccaac 480
acgagcacct ccaaagacac gacggcggcg caggtgacga agatttccgg cgtcttcccc 540
aatcccaacc agggacccgg aagaaatcct ctgcgacggg tacaaaacgc caacaccggc 600
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gataccatag tcgtgccgcc tcccgaggac tacgacgatt ataacatagg caccacgcgt 840
gcgctcaggc ccaactacat cgggttcagg gataacttca ttaacctgct gtatcacgac 900
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catcactatt tcgccctgtg gaaccaggcc gtggaccagt acgaccccga ggtgcgagtc 1080
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ggcgcgggag aaggctacgg ccccgatctc agtcaaatta aactctacac caacaacacc 1200
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gtaccctcct acgaaatcga tatcagcgct acccagaggc gcaactttat catggccaac 1320
atcgccgagt atctgcccga ccgttacaag tttagcatct ccggcttcga cgccaccagc 1380
gtcgcgccta ccacctacga gtacatgaac aagcgcgtcc ccctcaccaa cgtcgtcgac 1440
atgttcacga acgtgggtgc gcgttggtcc atcgaccaga tggacaacgt caaccccttc 1500
aaccaccaca gaaactgggg gctgaaatac cgctcccagc tgctgggaaa cagtcgctac 1560
gtcaacttcc acatccaagt gccccaaaaa ttcttcgcca tcaaaaacct gctgctgctc 1620
tccggctcgt acacctacga gtgggtgctg cgcaaagacc ccaacatgat cctccaatcc 1680
agtctgggca acgacctgcg cgccgacggc gccagcatca tctacaacga ggtgaacctc 1740
atggccaact tcatgcccat ggatcacaac accagtaacc agctcgagct gatgctgaga 1800
aacgccacca acgatcagac cttcgtggac tacctgggag ccaaaaacgc tctatactcg 1860
gtgcccgcgg gctccaccgc cctcaccatc aacattcccg ctcgcacctg ggaggggatg 1920
cgcgggtggt ccttcactcg catcaaggcg gccgagacgc ctcagctggg cgcccagtac 1980
gacgtcaact tcaagtactc gggcagcatc gcctactcag atggaggctt ctacctctcg 2040
cacaccttcc gtaacatgag catcctcttc gacacgtcca tcaactggcc gggcaacgac 2100
cggttgctca cgcctaacat gttcgagatc aagcgctcgg tggcgctcga caccgagggc 2160
ttcaccatga gccagtgcga catcaccaag gactggtacc tgatccagat ggccacgaac 2220
tacaacttcg tctataacgg ctatcgattc tggcccgatc gtcagtactt ccactacgac 2280
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cccgcacagg tcctcagcta caagaagttc ctctgcgaca actacctgtg gaccatcccg 2580
ttcagttccg actttatgta catgggcgaa ctgacagatc tgggccagaa ccccatgtac 2640
accaacaact cgcacagcat ggtcatcaac ttcgagctcg accccatgga tgatcccact 2700
tacgtgtaca tgctctatgg cgtgttcgac accgttaggg tcaaccagcc cgaacgtaac 2760
gtgctagcta tggcttactt ccgtacgcct ttcgccacag gcaacgccgt gtaa 2814
Claims (2)
1.一种Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗，其特征在于所述的灭活苗含有Ⅰ群禽腺病毒XNGX株灭活病毒，该株病毒已于2019年06月19日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCCNo.17998；
所述Ⅰ群禽腺病毒XNGX株灭活病毒是通过细胞工厂培养方法获得的，且病毒培养液中禽腺病毒含量≥108.0TCID50/ml。
2.如权利要求1所述一种Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗，其特征在于该疫苗的制备方法包括以下步骤：
(1)复苏鸡肝癌细胞；
(2)将鸡肝癌细胞先在培养瓶中培养，待长成良好细胞单层，继续传代扩大培养后接种到细胞工厂进行单层细胞培养；
(3)将Ⅰ群禽腺病毒XNGX株接种于细胞工厂所培养的鸡肝癌细胞并继续培养，当细胞病变达80％～90％，收获病毒液；
(4)收获的病毒液经冻融、去沉淀后的病毒液加灭活剂进行灭活处理；
(5)灭活后的病毒液加入佐剂乳化，制备成Ⅰ群禽腺病毒灭活疫苗。
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