CN104689312A - 新城疫灭活疫苗的制备方法及其制品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新城疫灭活疫苗的制备方法及其制品和应用，属于新城疫灭活疫苗的制备及应用领域。本发明公开了一种新城疫灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)利用细胞工厂培养动物细胞；(2)接种新城疫病毒，在细胞工厂中增殖病毒；(3)收获病毒，制备灭活疫苗。本发明对新城疫病毒在细胞工厂中的增殖条件，包括细胞密度、病毒感染复数、TPCK-胰酶浓度和病毒培养时间进行了优化。本发明方法培养的新城疫病毒滴度高，满足免疫生产要求；工艺稳定，可规模化生产新城疫灭活疫苗。本发明方法制备的新城疫灭活疫苗对鸡只安全，能对新城疫病毒的攻击实现100％免疫保护；可以用于制备预防或治疗新城疫的药物或试剂。

Description

新城疫灭活疫苗的制备方法及其制品和应用

技术领域

本发明涉及灭活疫苗的制备方法，尤其涉及一种新城疫灭活疫苗的制备方法，本发明还涉及所述方法制备的新城疫灭活疫苗及其应用，属于新城疫灭活疫苗的制备及应用领域。

背景技术

中国过去一直通过鸡胚培养生产新城疫疫苗。由于鸡胚生产新城疫疫苗需要消耗大量鸡胚，生产周期长，易污染，不易于控制，而且每只受精鸡蛋一次只能注射一个病毒菌株，因此这种生产方法效率很低，不利于应对大规模的新城疫爆发。新城疫在中国不同地区流行情况不同，并且新城疫在不同地区之间的扩散快；用鸡胚生产新城疫疫苗，生产多少疫苗必须提前做出精确计划，但一般来说新城疫爆发，人们很难在短时间内购置生产疫苗所需的数百万只鸡蛋。为此，世界卫生组织鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产新城疫疫苗。

以哺乳动物细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定等优点。细胞工厂培养技术可用于如疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，具有低污染风险，节省空间等优点。但是，至今尚无利用细胞工厂生产新城疫灭活疫苗的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用细胞工厂生产新城疫灭活疫苗的方法，该方法培养的病毒滴度高，可实现新城疫灭活疫苗的规模化生产。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明公开了一种新城疫灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)利用细胞工厂培养动物细胞；(2)接种新城疫病毒，在细胞工厂中增殖病毒；(3)收获病毒，制备灭活疫苗。

其中，步骤(1)所述动物细胞为CEF(鸡胚原代成纤维细胞)、DF1(鸡胚成纤维细胞传代系)、Vero(非洲绿猴肾细胞)或BHK-21(仓鼠肾细胞)细胞中的任意一种；优选为DF1细胞。

步骤(1)培养DF1细胞至细胞密度0.9×10⁵细胞/ml。

步骤(2)按照病毒感染复数MOI＝0.6接种新城疫病毒；在细胞工厂中增殖病毒的病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为7.5μg/ml；所述增殖为37℃培养48-72小时。

步骤(3)所述制备灭活疫苗包括：将病毒液离心，取上清；灭活剂灭活病毒上清液；灭活后的病毒上清液与佐剂混合，乳化，即得。

其中，所述灭活剂为甲醛；灭活剂终浓度为0.1％；37℃灭活16h；灭活后的病毒上清液与佐剂按体积比1：1.5混合。所述佐剂为进口油佐剂或者为由左旋咪唑、壳聚糖及白油按照每毫升佐剂中左旋咪唑2～8mg，壳聚糖5～10mg，余量为白油组成的改良佐剂中的任意一种。

本发明方法利用细胞工厂培养新城疫病毒可以有效节省培养空间；细胞工厂培养所得的病毒，病毒HI效价为2^9-10；病毒滴度比转瓶培养的有显著提高，TCID₅₀/0.1ml达4.5×10⁷，满足免疫生产要求。本发明利用细胞工厂生产新城疫灭活疫苗的方法适用于任何一种可以获得的新城疫病毒毒株，优选为新城疫病毒La Sota株。

本发明对新城疫病毒在细胞工厂中的增殖条件进行了优化，综合考虑细胞密度、病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度和病毒培养时间四个因素对新城疫病毒增殖的影响，比较新城疫病毒血凝价(HA)在不同增殖条件下的差异。确定新城疫病毒在细胞工厂中增殖的最佳条件为：细胞密度0.9×10⁵细胞/ml；按MOI＝0.6接种新城疫病毒；病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为7.5μg/ml；37℃培养48-72h。NDV病毒最高血凝价达到9.2log2，优于其它处理。

由于多数新城疫病毒入侵细胞过程中需要使用少量胰酶，而血清中含有胰酶抑制物，因此本发明方法在接种和繁殖新城疫病毒过程中不添加血清。

本发明一方面优化了新城疫病毒在细胞工厂中的增殖条件，保证在细胞环境相对一致的情况下接种新城疫病毒，为病毒的增殖提供了稳定的生长条件，缩小了产品的批间差异，提升了产品品质，保证了疫苗质量的稳定性。

另一方面，本发明还公开了一种对新城疫灭活疫苗没有毒性的并能增强其免疫刺激能力的适用于新城疫灭活疫苗的改良佐剂。佐剂组分筛选实验结果表明，由左旋咪唑、壳聚糖与普通白油(含司本)组合的改良佐剂较其他组合的改良佐剂制备的新城疫灭活疫苗免疫鸡只后的HI抗体效价最高，免疫效果最好；未出现因注射疫苗引起死亡或明显的局部或全身反应。用量筛选实验结果表明，每毫升佐剂中含有左旋咪唑2～8mg、壳聚糖5～10mg的疫苗佐剂分别制备的新城疫灭活疫苗的免疫效果差异不显著。因此，本发明确定新城疫灭活疫苗的改良佐剂由左旋咪唑、壳聚糖以及普通白油组成；每毫升改良佐剂中含有左旋咪唑2～8mg、壳聚糖5～10mg、余量为普通白油(含司本)。

本发明还公开了所述制备方法制备得到的新城疫灭活疫苗。安全性检验证明，本发明方法制备的新城疫灭活疫苗对鸡只安全。

本发明生产的新城疫灭活疫苗与国内2个厂家生产的新城疫商品化疫苗预防新城疫的效果比较结果表明，本发明方法制备的新城疫灭活疫苗能对新城疫病毒的攻击实现100％免疫保护，明显优于2个同类型产品。

细胞毒和胚毒制备疫苗免疫保护实验结果表明，细胞苗比鸡胚苗产生保护性抗体更快，能在相对较短的时间内达到对鸡只的保护；细胞苗具有更好的免疫原性。

本发明还公开了所述新城疫灭活疫苗在制备预防或治疗新城疫的药物或试剂中的用途。

本发明方法制备的新城疫灭活疫苗对鸡只安全，能对新城疫病毒的攻击实现100％免疫保护，可以用于制备预防或治疗新城疫的药物或试剂。

本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明方法利用细胞工厂培养新城疫病毒可以有效节省培养空间；对新城疫病毒在细胞工厂中的增殖条件进行了优化，培养所得的病毒滴度TCID₅₀/0.1ml达4.5×10⁷，比转瓶培养的有显著提高，满足免疫生产要求；为病毒的增殖提供了稳定的生长条件，缩小了产品的批间差异，提升了产品品质，保证了疫苗质量的稳定性。本发明改良佐剂制备的新城疫灭活疫苗免疫效果好，HI抗体效价高。本发明方法制备的新城疫灭活疫苗对鸡只安全，能对新城疫病毒的攻击实现100％免疫保护。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。

术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。

术语“病毒滴度”意指病毒的毒力或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)和半数致死量(LD₅₀)，其中以LD₅₀最常用，它是指在一定时间内能使半数试验动物致死的病毒量；然而，病毒对试验动物的致病作用不一定都以死亡为标志，例如以感染发病作指标，则可以半数感染量(ID₅₀)测定；此外，当试验的材料是鸡胚时则用鸡胚半数致死量(ELD₅₀)或鸡胚半数感染量(EID₅₀)表示；试验的材料是细胞时则用组织细胞培养半数感染量(TCID₅₀)表示。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、实验材料

新城疫病毒La Sota株，购自中国兽药监察所；DF1细胞购自哈尔滨兽医研究所。国内2个厂家生产的新城疫商品化疫苗购自江苏南农高科和乾元浩南京生物制药厂。

TPCK-胰酶购自Washington公司；Thermo Scientific Nunc细胞工厂购自赛默飞世尔。普通白油(含司本)(7号)购自青岛易邦生物制品有限公司。

实施例1利用细胞工厂增殖新城疫病毒制备新城疫灭活疫苗

1、实验方法

1.1细胞培养

首先复苏种细胞DF1到T75细胞瓶中，生长48h左右，按照1：4的比例进行传代；然后把6个长满细胞的T75细胞瓶中的细胞传到1个10L转瓶进行培养；48h左右按照1：3的比例进行细胞传代培养；该过程中使用的培养基为DMEM，血清为胎牛血清，使用量为10％。

将转瓶中所得细胞用PBS洗涤2次，然后加入浓度为0.25％胰酶-EDTA溶液125ml消化，收获转瓶中的细胞。

收获的细胞经计数后，采用Thermo Scientific Nunc细胞工厂对DF1细胞进行培养，所用的培养基是DMEM培养基，含10％胎牛血清。细胞接种后在12h、24h、48h取样，观察细胞在细胞工厂上的生长状况。

1.2新城疫病毒在细胞工厂中增殖

细胞密度为0.9×10⁵细胞/ml时，按照病毒感染复数MOI＝0.6接种新城疫病毒La Sota株，病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为7.5μg/ml；37℃培养48-72小时。

1.3收获病毒

培养至80％以上的细胞出现致细胞病变效应(CPE)时，即可收获病毒。分别检测病毒滴度及HI效价，并与转瓶培养生产的病毒收获物进行比较。

1.4病毒灭活与配苗

灭活前调整至每0.1ml的病毒含量≥10^8.0EID₅₀，HA滴度≥2⁹，符合配苗要求。

病毒液5000r/min离心30min，去除死细胞和碎片，取上清；采用甲醛溶液灭活，灭活剂终浓度为0.1％，37℃灭活16h，可以完全灭活；经过无菌性检验之后，将灭活病毒分别与进口油佐剂按体积比(1：1.5)混合，乳化后用于动物免疫。

1.5免疫实验

设计实验，比较本发明生产的经检查合格的新城疫灭活疫苗与国内2个厂家生产的新城疫商品化疫苗预防新城疫的效果。

1.5.1安全性检验

本发明方法制备的各批次疫苗用40日龄SPF鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗2羽份，观察14日。

1.5.2免疫实验

将6周龄的SPF鸡随机分成A、B和C试验组，每组10只；D组为阴性对照组，SPF鸡5只。将本发明生产的新城疫灭活疫苗免疫A试验组；国内2个厂家生产的新城疫商品化疫苗分别免疫B和C试验组。每组疫苗颈部皮下接种试验鸡10只，接种剂量0.02mL/只；对照组不免疫。

免疫后7d、14d、21d，采集每只鸡血清，按现行《中国兽药典》附录方法测定试验组和阴性对照组每只鸡的HI抗体效价。

免疫3周后，用10倍稀释的新城疫病毒La Sota株病毒液静脉注射攻击试验组和对照组鸡，攻击5天后，采集泄殖腔棉拭子，用10日龄SPF鸡胚进行病毒分离。以从泄殖腔没有分离到病毒判定为免疫攻毒保护。

1.5.3细胞毒和胚毒制备疫苗免疫及保护实验

为了排除免疫抗原量对免疫效果的影响，通过用空白尿囊液稀释的方法，将经细胞工厂培养和SPF鸡胚扩增的两种病毒液调整为具有相同HA效价、EID₅₀和TCID₅₀的三组病毒液，分别制备成油乳剂灭活苗，各组免疫相同的剂量后，观察免疫及保护效果。

实验动物分组：

NC/NE—表示未经稀释的原始细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

HC/HE—表示经稀释得到的具有相同HA效价的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

EC/EE—表示经稀释得到的具有相同EID₅₀的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

TC/TE—表示经稀释得到的具有相同TCID₅₀的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组；

每组10只SPF鸡，同时留5只不免疫作为对照组。免疫前采血，HI抗体检测均为阴性。每只SPF鸡0.02mL的剂量经颈背部皮下注射免疫。分别在免疫后第7d、14d、21d翅下静脉采血，分离血清，用HI方法测定血清抗体效价。

2、实验结果

2.1DF1细胞在细胞工厂上的生长状况

细胞接种后12h、24h、48h取样观察，结果表明，细胞接种48h后，细胞层更紧密、均一。

2.2细胞工厂与转瓶培养主要参数比较

细胞工厂与转瓶培养的主要参数比较结果见表1。

表1 细胞工厂与转瓶培养主要参数比较

从表1可以看出，细胞工厂培养可以有效节省培养空间；细胞工厂培养所得的病毒，病毒HI效价为2^9-10；病毒滴度比转瓶培养的有显著提高，TCID₅₀/0.1ml达4.5×10⁷。

2.3安全性检验

本发明方法生产的新城疫灭活疫苗免疫后，鸡群外观、食欲均正常，无不良反应，接种部位无红肿现象，吸收效果良好。表明本发明方法制备的新城疫灭活疫苗对鸡只安全。

2.4免疫保护实验结果

本发明生产的新城疫灭活疫苗与国内2个厂家生产的新城疫商品化疫苗接种试验鸡3周后，采血检测抗体效价，结果表明(表2)，对照鸡几何平均效价均低于2log2，免疫鸡HI抗体几何平均效价在7.7log2～9.6log2之间，远大于6log2。不同时间点，A组免疫鸡HI抗体几何平均效价均明显高于同类型产品免疫的B组和C组。攻毒后，A组的保护率达100％，显著优于同类型产品免疫的B组和C组。表明，本发明方法制备的新城疫灭活疫苗能对新城疫病毒的攻击实现100％免疫保护。

表23 组疫苗的效力试验结果

2.5细胞毒和胚毒制备疫苗免疫及保护实验结果

实验结果见表3。

表3 不同试验组在免疫后不同时间的抗体水平

从表3可见，在细胞苗和鸡胚苗二者制备方法相同，抗原添加量相等的条件下，细胞苗比鸡胚苗产生保护性抗体更快，抗体水平更高，能在相对较短的时间内达到对鸡只的保护，细胞苗具有更好的免疫原性。

实验例1新城疫病毒在细胞工厂中增殖条件的优化

1、实验方法

1.1细胞密度对新城疫病毒增殖的影响

在不同细胞密度(表4)，按MOI＝0.2接种病毒，37℃培养，在不同时间点收获病毒，比较NDV病毒血凝价(HA)在不同增殖条件下的差异，结果见表4。

表4 不同细胞密度接毒后不同时间病毒血凝价(log2)

从表4中可以看出，细胞密度为0.9×10⁵细胞/ml时，37℃培养48-72h，NDV病毒HA达到8.2log2，优于其它处理。因此，本发明利用细胞工厂增殖NDV病毒的细胞密度确定为0.9×10⁵细胞/ml。

1.2病毒感染复数(MOI)对新城疫病毒增殖的影响

在细胞密度为0.9×10⁵细胞/ml，按MOI＝0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.5分别接种NDV病毒，37℃培养，在不同时间点收获病毒。比较NDV病毒血凝价(HA)在不同增殖条件下的差异，结果见表5。

表5 不同病毒感染复数接毒后不同时间病毒血凝价(log2)

从表5中可以看出，病毒感染复数MOI为0.6时，37℃培养48-72h，新城疫病毒HA达到8.8log2，优于另外几种处理。病毒感染量过低使增值速度降低，无法达到较高的血凝价。因此，本发明利用细胞工厂增殖NDV病毒的病毒感染复数MOI为0.6，病毒增殖速度较快，且达到较高的血凝价。

1.3TPCK-胰酶浓度对新城疫病毒增殖的影响

在细胞密度为0.9×10⁵细胞/ml，按MOI＝0.6接种新城疫病毒，TPCK-胰酶浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、7.5和10.0μg/ml，37℃培养，每隔12h，收获病毒，测定血凝价(HA)，结果见表6。

表6 不同TPCK-胰酶浓度接毒后不同时间病毒血凝价(log2)

从表6中可以看出，TPCK-胰酶浓度为7.5μg/ml时，培养48-72h时NDV病毒最高血凝价提高到9.2log2，优于其它处理；当TPCK-胰酶浓度为10.0μg/ml，细胞在生长不到24小时即开始脱落。因此，本发明利用细胞工厂增殖NDV病毒的病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为7.5μg/ml。

综上，确定新城疫病毒在细胞工厂中增殖的最佳条件为：细胞密度0.9×10⁵细胞/ml；按MOI＝0.6接种新城疫病毒；病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为7.5μg/ml；37℃培养48-72h。

实验例2不同佐剂制备新城疫灭活疫苗及免疫效果实验

1、佐剂组分筛选实验方法及结果

改良佐剂A由左旋咪唑、壳聚糖与完全弗氏佐剂组成，每毫升佐剂中左旋咪唑5mg、壳聚糖8mg，余量为完全弗氏佐剂；

改良佐剂B由左旋咪唑、白油与皂苷组成，每毫升佐剂中左旋咪唑5mg、皂苷8mg，余量为普通白油；

改良佐剂C由白油、壳聚糖与卡波姆(树脂)组成，每毫升佐剂中壳聚糖5mg、卡波姆8mg，余量为普通白油；

改良佐剂D由左旋咪唑、壳聚糖与白油组成，每毫升佐剂中含有左旋咪唑5mg、壳聚糖8mg，余量为普通白油。

用本发明的改良佐剂分别制备新城疫灭活疫苗，疫苗制备方法同实施例1。将本发明的改良佐剂和普通白油佐剂制备的新城疫灭活疫苗分别免疫6周龄的SPF鸡，每组疫苗颈部皮下接种试验鸡10只，接种剂量0.02mL/只；对照组SPF鸡5只，注射PBS缓冲液。

观察不同佐剂接种后动物的临床反应。免疫后7d、14d、21d、28d，采集每只鸡血清，按现行《中国兽药典》附录方法测定实验组和阴性对照组每只鸡的HI抗体效价。

不同佐剂配制的新城疫灭活疫苗对鸡接种试验，临床观察结果表明(表7)，改良佐剂B、C、D和普通白油制备的疫苗在SPF鸡均未出现因注射疫苗引起死亡或明显的局部或全身反应。

表7 不同佐剂接种后动物的临床反应

免疫后HI效价检测结果见表8，由左旋咪唑、壳聚糖与普通白油组合的改良佐剂D制备的新城疫灭活疫苗的HI抗体效价最高，免疫效果最好。

表8 免疫后HI效价检测结果

2、用量筛选实验方法及结果

以100ml佐剂为例进行配制时，分别取下述各例剂量可制得合格的疫苗佐剂：

1)取50mg/ml的左旋咪唑母液4ml、20mg/ml的壳聚糖母液15ml与81ml白油混合均匀高压除菌后，即为每ml溶液中含有左旋咪唑为2mg、壳聚糖为3mg的疫苗佐剂。

2)取50mg/ml的左旋咪唑母液4ml、20mg/ml的壳聚糖母液25ml与71ml白油混合均匀高压除菌后，即为每ml溶液中含有左旋咪唑为2mg、壳聚糖为5mg的疫苗佐剂。

3)取50mg/ml的左旋咪唑母液4ml、20mg/ml的壳聚糖母液50ml与46ml白油混合均匀高压除菌后，即为每ml溶液中含有左旋咪唑为2mg、壳聚糖为10mg的疫苗佐剂。

4)取50mg/ml的左旋咪唑母液10ml、20mg/ml的壳聚糖母液25ml与65ml白油混合均匀高压除菌后，即为每ml溶液中含有左旋咪唑为5mg、壳聚糖为5mg的疫苗佐剂。

5)取50mg/ml的左旋咪唑母液10ml、20mg/ml的壳聚糖母液50ml与40ml白油混合均匀高压除菌后，即为每ml溶液中含有左旋咪唑为5mg、壳聚糖为10mg的疫苗佐剂。

6)取50mg/ml的左旋咪唑母液16ml、20mg/ml的壳聚糖母液25ml与59ml白油混合均匀高压除菌后，即为每ml溶液中含有左旋咪唑为8mg、壳聚糖为5mg的疫苗佐剂。

7)取50mg/ml的左旋咪唑母液16ml、20mg/ml的壳聚糖母液50ml与34ml白油混合均匀高压除菌后，即为每ml溶液中含有左旋咪唑为8mg、壳聚糖为10mg的疫苗佐剂。

用以上的配制的疫苗佐剂分别制备新城疫灭活疫苗，疫苗制备方法同实施例1，分别免疫6周龄的SPF鸡。每组疫苗颈部皮下接种试验鸡10只，接种剂量0.02mL/只；对照组SPF鸡5只，注射PBS缓冲液。

免疫后7d、14d、21d、28d，采集每只鸡血清，按现行《中国兽药典》附录方法测定实验组和阴性对照组每只鸡的HI抗体效价。

免疫后HI效价检测结果见表9，每毫升佐剂中含有左旋咪唑2～8mg、壳聚糖5～10mg的疫苗佐剂分别制备的新城疫灭活疫苗的免疫效果差异不显著，产生抗体速度快，效价高。

表9 免疫后HI效价检测结果

综上，本发明确定新城疫灭活疫苗的改良佐剂，由左旋咪唑、壳聚糖以及普通白油组成，每毫升佐剂中含有左旋咪唑2～8mg、壳聚糖5～10mg，余量为普通白油(含司本)。

Claims (10)

1.一种新城疫灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用细胞工厂培养动物细胞；(2)接种新城疫病毒，在细胞工厂中增殖病毒；(3)收获病毒，制备灭活疫苗。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述动物细胞为CEF、DF1、Vero或BHK-21细胞中的任意一种；优选为DF1细胞。

3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)培养DF1细胞至细胞密度0.9×10⁵细胞/ml。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)按照病毒感染复数MOI＝0.6接种新城疫病毒。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)在细胞工厂中增殖病毒的病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为7.5μg/ml；所述增殖为37℃培养48-72小时。

6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述制备灭活疫苗包括：将病毒液离心，取上清；灭活剂灭活病毒上清液；灭活后的病毒上清液与佐剂混合，乳化，即得。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述灭活剂为甲醛；灭活剂终浓度为0.1％；37℃灭活16h。

8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)灭活后的病毒上清液与佐剂按体积比1：1.5混合；所述佐剂为进口油佐剂或者为由左旋咪唑、壳聚糖及白油按照每毫升佐剂中左旋咪唑2～8mg、壳聚糖5～10mg、余量为白油组成的改良佐剂中的任意一种。

9.权利要求1至8任何一项所述制备方法制备得到的新城疫灭活疫苗。

10.权利要求9所述新城疫灭活疫苗在制备预防或治疗新城疫的药物或试剂中的用途。