CN114874982A - 一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法 - Google Patents

一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其是细胞治疗技术领域，特别涉及一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法。本发明是在传统的脐带间充质干细胞培养基中加入不同浓度和比例的TNF‑α、IFN‑γ因子进行激发，生长一段时间后，与未进行激发UC‑MSCs相比，细胞因子均有不同程度的增高，尤其是VEGF的分泌量增加了数十倍，细胞中VEGF基因含量增加数倍。本方法简单易行，对实验或生产条件要求不高并且适合不同来源的间充质干细胞进行大规模生产制备，为脐带间充质干细胞分泌更多的生长因子尤其是VEGF应用于治疗血管或皮肤修复方面提供了一种新的治疗手段。

Description

一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养 方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其是细胞治疗技术领域，特别涉及一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法。
背景技术
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是起源于生物体早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，具有自我复制和向多种细胞系（向成脂、成软骨、成骨等）分化的潜能，是组织工程和再生医学中重要来源的细胞种类。MSCs有多种来源，如骨髓来源、脂肪来源、骨骼肌来源等，人脐带间充质干细胞（Human Umbilical Cord-derived MesenchymalStem Cells，UC-MSCs）因为低免疫原性、易分离获取、具有多种免疫调节能力、少伦理争议等优点日渐成为MSCs中更适合的来源。
皮肤损伤是最常见的创伤形式之一。皮肤损伤后必须迅速恢复皮肤组织的完整性，以防止感染和体液的流失。然而，在许多病理生理条件下，如糖尿病、慢性肾功能衰竭和衰老，伤口愈合过程可能受到影响，临床上急需加强伤口愈合的新策略。
许多研究表明，静脉或皮下注射MSCs可显著促进伤口、糖尿病溃疡、放射性溃疡和烧伤患者的皮肤愈合，但MSCs的分化能力有限，MSCs在创伤修复过程中替代所有缺失的细胞难度较大。另一方面，有大量的研究证实MSCs能够分泌不同种类的细胞因子，比如血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor, FGF)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor, HGF），这些生长因子可以优化受损皮肤组织周围微环境，促进受损组织细胞增殖加快受伤部位的愈合等。
VEGF也被称为血管通透性因子(VPF)，它对血管内皮细胞具有高度特异性，具有促进血管的通透性、促进内皮细胞的增殖、促进血管的产生等重要的生物学功能。FGF是一类具有广泛生物学活性的肽类物质，分为碱性( basic)和酸性(acidic)。它们生物学活性范围相同，并通过作用于同样的细胞表面受体群发挥作用，FGF basic在体外的生物学活性除引起细胞的增殖反应外，还包括调节细胞的能动性、细胞分化、轴突成长等。EGF它能促进成纤维细胞和血管内皮细胞有丝分裂，促进细胞生殖和分化出间质和上皮细胞，EGF也是成纤维细胞，表皮细胞和内皮细胞的促有丝分裂剂，并且促进它们聚集形成表皮等。
现有技术下，促进间充质干细胞生长因子的分泌尚没有高效的培养方法。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，通过这种方法可上调间充质干细胞分泌生长因子的含量，从而增强其对于皮肤伤口愈合的治疗效果，帮助患者早日摆脱疾病的困扰。
本发明所采用的技术方案如下：
一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，包括以下步骤：
A、从人脐带中分离并制备人脐带间充质干细胞并冻存；
B、将分离制备后的人脐带间充质干细胞复苏冻存后，进行第一次培养；第一次培养后的人脐带间充质干细胞，待细胞汇合度达到100%时，加入胰酶消化并离心，转移至T75培养瓶中加入完全培养基，进行第二次培养；
C、至细胞汇合度90%，然后添加TNF-α因子、IFN-γ因子进行激发培养。
优选地，步骤A具体包括：
A1、脐带采集24小时之内完成样本接收，转至实验室并放置于生物安全柜中；
A2、使用含青链霉素100U/mL的生理盐水冲洗6-9次，然后将脐静脉和脐动脉剥除并去掉表皮部分；
A3、继续使用含青链霉素100U/mL的生理盐水冲洗3次，避免血液残留，然后用无菌直尖剪将脐带华通氏胶剪至3mm的组织小块；
A4、将2ml组织块贴附于150cm2培养瓶壁上，在生物安全柜中开口放置2小时，然后沿非组织接种面缓慢加入完全培养基30mL，小心放置于37℃、内含5% CO2的细胞培养箱中培养；
A5、培养7天后半量换液并去除漂浮组织块，以后每隔2-3天进行半量换液；
A6、在细胞培养瓶中细胞铺满后吸弃培养基，使用生理盐水漂洗一遍后添加Tryple消化酶2mL进行消化；
A7、消化2-5 min待细胞变圆后加入生理盐水10mL冲刷细胞面，收集细胞后以转速1000 rpm进行离心10min，然后按照1×104个/cm2的密度进行传代培养；
A8、继续传代一次，待第2代细胞生长至80-90% 汇合度时，按照步骤A7进行消化并收集细胞，使用无血清冻存液重悬后按照冻存密度为1×107/mL冻存并保存至液氮。
优选地，所述的完全培养基中含有5% 血清替代品及4 mmoL/L的L-谷氨酰胺。
优选地，所述步骤B具体包括：
B1、将存放于液氮中的细胞取出，核对信息后，迅速置于恒温37℃水浴箱内，边融化边晃动；
B2、待冻存管内的细胞悬液全部融化，用75%乙醇棉球消毒细胞冻存管管口和外壁，然后迅速转移至超净工作台中；
B3、将细胞悬液转移到无菌离心管中，在室温下以转速1200rpm进行离心5min，弃掉上清液，再用含5%血清替带品，1%谷氨酰胺的MSCBM培养基重悬，随后计数和细胞活率检测；
B4、按照脐带间充质干细胞悬液浓度为1×106个细胞/瓶接种到T75cm2细胞培养瓶中，细胞长满后，用Tryple消化酶使细胞从瓶壁上脱落，随后离心收集脐带间充质干细胞；
B5、按照步骤B1-B4将细胞继续培养一代，细胞经过24-48h后汇合度到70%，添加激发因子。
优选地，所述步骤C具体包括：
分别添加5-20 ng/mL的IFN-γ和10-60 ng/mL TNF-α，激发时间为12至48小时。
优选地，分别添加10ng/mL的IFN-γ和30ng/mL TNF-α，激发时间为12-24小时。
优选地，所述培养方法包括步骤：
B6、培养24h后用PBS缓冲液洗涤去除激发因子，然后在不含激发因子的培养基中培养12h；
B7、收集培养液，以离心力300 G离心5 min，去除细胞碎片；
B8、使用ELISA方法检测生长因子的含量。
优选地，所述人脐带优选人类新生儿脐带。
一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法获得的间充质干细胞，其用途是用于作为血管损伤的修复或皮肤损伤的愈合药物。
制备脐带间充质干细胞时，使用的胰酶为Tryple消化酶，该酶相比于传统的胰酶较温和，对细胞的伤害较少，添加量为覆盖培养瓶底部即可；获得的细胞悬液在1200rpm转速下离心5min；细胞完全培养基为在基础培养基上添加血清替代品而非血清，与传统的培养基相比，无血清培养基既能满足细胞在体外长时间培养的要求，又能规避动物血清所带来过敏源等不利因素，且在该培养体系中添加1%的谷氨酰胺，不仅可作为培养细胞的能量来源，而且还参与了蛋白质的合成和核酸代谢。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
生长因子是一类调节细胞迁移、增殖、分化和细胞外基质合成的多肽。研究发现，生长因子在间充质干细胞的迁移中起重要作用。目前，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子 β1 (TGF-β1) 常用于组织修复。
现有研究表明间充质干细胞（MSCs）不仅具有促进细胞分化和增殖、血管生成、炎症调节和氧化应激等功能，还是一种多能干细胞，MSCs 的分化潜能和旁分泌特性使其成为组织修复的关键选择，在再生医学领域受到了广泛关注。MSCs分泌生长因子-α (TGF-α)、TGF-β、肝细胞生长因子 (HGF)、上皮生长因子 (EGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (FGF-2)和胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 来诱导细胞增殖和血管生成；MSCs也可分泌VEGF、IGF-1、EGF 等促进伤口愈合和组织修复。
本发明的技术方案，用TNF-α、IFN-γ因子进行激发作用的干细胞分泌更多VEGF因子，通过在培养MSCs时添加TNF-α，IFN-γ因子，可促进MSCs分泌生长因子，不仅可增强的促血管内皮细胞增殖的能力，也可用于机体损伤类血管新生的修复治疗。该发明方法简便易行，适用于不同来源的MSCs的大规模生产，为干细胞应用于医学转化事业提供一条新的路径。
本发明公开了一种TNF-α、IFN-γ因子激发的干细胞的制备方法及其应用，工艺设计合理，操作简单，可行性高。可将其产业化应用于机体损伤的血管修复治疗，具有较优异的治疗效果，实用性强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的改变激发因子的浓度和比例后细胞分泌VEGF含量图；
图2为改变激发因子的激发时间后细胞分泌VEGF含量图；
图3 为正常培养的细胞与激发后的细胞存活情况图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
本实施例提供一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，其包括以下内容：
1、脐带间充质干细胞的提取。
（1.1）脐带采集24小时之内完成样本接收，转至实验室并放置于生物安全柜中；
（1.2）使用含青链霉素100U/mL的生理盐水冲洗6-9次，然后将脐静脉和脐动脉剥除并去掉表皮部分；
（1.3）继续使用含青链霉素100U/mL的生理盐水冲洗3次，避免血液残留，然后用无菌直尖剪将脐带华通氏胶剪至3mm的组织小块；
（1.4）将2ml组织块贴附于150cm2培养瓶壁上，在安全柜中开口放置2小时，然后沿非组织接种面缓慢加入完全培养基30mL，小心放置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养；完全培养基含5% 血清替代品及4 mmoL/L的L-谷氨酰胺。
（1.5）培养7d后半量换液并去除漂浮组织块，以后每隔2-3d进行半量换液；
（1.6）在细胞培养瓶中出现致密克隆后吸弃完全培养基，用生理盐水漂洗一遍后添加胰酶进行消化，消化2-5 min待细胞变圆后加入生理盐水10mL冲刷细胞面，收集细胞离心，然后按照1×104个细胞/cm2的密度进行传代培养；
（1.7）继续传代一次，待第2代细胞生长至80-90% 汇合度时，按照步骤（1.6）所述方法进行消化并收集细胞，使用无血清冻存液重悬后按照冻存密度为1×107/mL冻存并保存至液氮。
2、改变激发因子的浓度和比例。
（2.1）将存放于液氮中的细胞取出，核对信息后，迅速置于恒温37℃水浴箱内，边融化边晃动，注意不要让水面没过冻存管口。
（2.2）待冻存管内的细胞悬液全部融化，用75%乙醇棉球消毒细胞冻存管管口和外壁，然后迅速转移至超净工作台中。
（2.3）将细胞悬液转移到无菌离心管中，室温下使用转速1200rpm进行离心5min，弃掉上清液，用含5%血清替代品，1%谷氨酰胺的MSCBM培养基重悬，随后计数和细胞活率检测；
（2.4）按照UC-MSCs细胞悬液浓度为1×106个细胞/瓶接种到T75cm2细胞培养瓶中，细胞长满后用Tryple消化酶使细胞从瓶壁上脱落，随后离心收集UC-MSCs。
（2.5）按照上述方法将细胞继续培养一代，细胞大约经过24-48h后汇合度到70%，按照表1的方法添加激发因子，培养24h后用PBS洗涤去除激发因子，然后在不含激发因子的培养基中培养12h。
表1 不同激发因子的浓度比例
Figure 816921DEST_PATH_IMAGE002
（2.6）收集培养液，以离心力300G进行离心5 min，去除细胞碎片，使用ELISA方法检测生长因子的含量，结果如图1所示。
图中，A：20ng/mL IFN-γ和60ng/mL TNF-α
B：10ng/mL IFN-γ和30ng/mL TNF-α
C：5ng/mL IFN-γ 和15ng/mL TNF-α
D：20ng/mL IFN-γ和40ng/mL TNF-α
E：10ng/mL IFN-γ和20ng/mL TNF-α
F：5ng/mL IFN-γ和10ng/mL TNF-α
G：IFN-γ和 TNF-α各10 ng/mL
H：IFN-γ和 TNF-α各20 ng/mL
I：不添加细胞因子
添加激发因子后UC-MSCs分泌VEGF的量明显增加，且使用10ng/mL IFN-γ、30ng/mL TNF-α添加条件下分泌量最多。
实施例二
在实施例一的基础上改变UC-MSCs被激发的时间。
细胞的前处理方式及生长因子的检测方法同实施例一的方法，不同之处为改变细胞的激发时间，具体实施方式如表2方法进行，结果如图2所示。
表2 不同激发时间
Figure 83824DEST_PATH_IMAGE004
如附图2所示，改变UC-MSCs被激发的时间实验中，添加激发因子后，UC-MSCs分泌VEGF的量在激发48小时后分泌量最多。
实施例1中VEGF的含量是通过酶联免疫试剂盒测定的，在75cm2培养瓶中加入激发因子培养按照设定的条件培养UC-MSCs后，用PBS洗涤去除激发因子，然后在不含激发因子的培养基中培养12h。随后取出培养基在离心力300G条件下离心5min后，取上清液用ELISA试剂盒测定VEGF的含量。
按照实施例1中确定好的激发条件方法，制备一批新的细胞，采用定量PCR法检测VEGF基因的表达，采用RNA提取试剂盒收集细胞内的总RNA，随后采用cDNA合成反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA模板，采用PCR定量反应试剂盒配制定量PCR反应体系，随后实时荧光定量PCR仪检测UC-MSCs基因表达情况，没被激发的UC-MSCs为正常组作为对照。
按照实施实例2中确定好的激发条件方法，制备一批新的细胞，取100μL的细胞悬液，然后加入2μL 对应的流式抗体（FITC-CD44， FITC-CD45，PE-CD34，PE-CD73，PE-CD90，PE-CD105，PE-HLA DR），室温下避光孵育15min；加入1mL的生理盐水重悬，然后1000rpm离心10min以洗涤去除抗体背景干扰；弃上清后加入400μL鞘液重悬，使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行检测，然后进行数据分析。实验结果如下表3所示，由表可知激发后的细胞与正常组相比表型没有产生大的变化，并且均符合间充质干细胞的表型特征。
细胞存活实验
按照实施实例2中确定好的激发条件方法，制备一批新的细胞，收集UC-MSCs，将不同实验组(1×104细胞/cm2)接种到12孔板中，加入完全培养基正常培养，待细胞长满后，将培养基改为基础培养基(不含血清替代物和添加因子)，不换液，连续培养12天，胰蛋白酶处理分离细胞，每3天用细胞计数仪进行计数，并通过血细胞计数仪进行计数对比。结果如图3所示，与对照组相比激发组细胞存活情况未发生大的变化。
表3 细胞表型检测结果
Figure 109548DEST_PATH_IMAGE006
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，包括以下步骤：
A、从人脐带中分离并制备人脐带间充质干细胞并冻存；
B、将分离制备后的人脐带间充质干细胞复苏冻存后，进行第一次培养；第一次培养后的人脐带间充质干细胞，待细胞汇合度达到100%时，加入胰酶消化并离心，转移至T75培养瓶中加入完全培养基，进行第二次培养；
C、至细胞汇合度90%，然后添加TNF-α因子、IFN-γ因子进行激发培养。
2.根据权利要求1所述的一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，其特征在于，所述的步骤A具体包括：
A1、脐带采集24小时之内完成样本接收，转至实验室并放置于生物安全柜中；
A2、使用含青链霉素100U/mL的生理盐水冲洗6-9次，然后将脐静脉和脐动脉剥除并去掉表皮部分；
A3、继续使用含青链霉素100U/mL的生理盐水冲洗3次，避免血液残留，然后用无菌直尖剪将脐带华通氏胶剪至3mm的组织小块；
A4、将2mL组织块贴附于150cm2培养瓶壁上，在生物安全柜中开口放置2小时，然后沿非组织接种面缓慢加入完全培养基30mL，小心放置于37℃、内含5% CO2的细胞培养箱中培养；
A5、培养7天后半量换液并去除漂浮组织块，以后每隔2-3天进行半量换液；
A6、在细胞培养瓶中细胞铺满后吸弃培养基，使用生理盐水漂洗一遍后添加Tryple消化酶2mL进行消化；
A7、消化2-5 min待细胞变圆后加入生理盐水10mL冲刷细胞面，收集细胞后以转速1000rpm进行离心10min，然后按照1×104个/cm2的密度进行传代培养；
A8、继续传代一次，待第2代细胞生长至80-90% 汇合度时，按照步骤A7进行消化并收集细胞，使用无血清冻存液重悬后按照冻存密度为1×107/mL冻存并保存至液氮。
3.根据权利要求2所述的一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，其特征在于，所述的完全培养基中含有5% 血清替代品及4 mmoL/L的L-谷氨酰胺。
4.根据权利要求1所述的一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，其特征在于，所述步骤B具体包括：
B1、将存放于液氮中的细胞取出，核对信息后，迅速置于恒温37℃水浴箱内，边融化边晃动；
B2、待冻存管内的细胞悬液全部融化，用75%乙醇棉球消毒细胞冻存管管口和外壁，然后迅速转移至超净工作台中；
B3、将细胞悬液转移到无菌离心管中，在室温下以转速1200rpm进行离心5min，弃掉上清液，再用含5%血清替带品，1%谷氨酰胺的MSCBM培养基重悬，随后计数和细胞活率检测；
B4、按照脐带间充质干细胞悬液浓度为1×106个细胞/瓶接种到T75cm2细胞培养瓶中，细胞长满后，用Tryple消化酶使细胞从瓶壁上脱落，随后离心收集脐带间充质干细胞；
B5、按照步骤B1-B4将细胞继续培养一代，细胞经过24-48h后汇合度到70%，添加激发因子。
5.根据权利要求1所述的一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，其特征在于，所述步骤C具体包括：
分别添加5-20 ng/mL的IFN-γ和10-60 ng/mL TNF-α，激发时间为12至48小时。
6.根据权利要求5所述的一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，其特征在于，分别添加10ng/mL的IFN-γ和30ng/mL TNF-α，激发时间为12-24小时。
7.根据权利要求5所述的一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括步骤：
B6、培养24h后用PBS缓冲液洗涤去除激发因子，然后在不含激发因子的培养基中培养12h；
B7、收集培养液，以离心力300 G离心5 min，去除细胞碎片；
B8、使用ELISA方法检测生长因子的含量。
8.根据权利要求1所述的一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法，其特征在于，所述人脐带优选人类新生儿脐带。
9.一种如权利要求1所述的增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法获得的间充质干细胞，其用途是用于作为血管损伤的修复或皮肤损伤的愈合药物。
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