CN110693909A - 一种具有生发功效的脐带间充质干细胞因子的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞因子生发领域，具体而言，涉及一种具有生发功效的脐带间充质干细胞因子的制备。包括人脐带间充质干细胞的原代分离培养，细胞培养上清的收集，经过离心、超滤浓缩后得到含有所述脐带间充质干细胞因子复合物的液体，再采用冷冻干燥工艺，制备得到脐带间充质干细胞因子冻干粉。本发明提供的脐带间充质干细胞因子制备方法，能使细胞因子的活性得到最大化的保存，且方便储存及使用。从根本上激活毛囊细胞，促进头发再生效果显著，并且更持久。

Description

一种具有生发功效的脐带间充质干细胞因子的制备
技术领域
本发明涉及细胞因子生发领域，具体而言，涉及一种具有生发功效的脐带间充质干细胞因子的制备
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)来源于发育早期的中胚层，是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞。间充质干细胞广泛存在于全身多处组织中，骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盘、脐带、胚胎等都可分离制备间充质干细胞。不同来源的间充质干细胞具有相似的形态，表达相同的表面标记，具有相似的生物学特性。MSC除了具有多向组织细胞分化能力之外，还在造血、免疫炎症反应、血管新生等人体重要功能中起重要调节作用。
脐带间充质干细胞(UC-MSC)是是一类低免疫原性细胞，存在于新生儿脐带组织中，具有很强的免疫调节功能。脐带间充质干细胞拥有MSC的全部特性，并且来源丰富，便于采集。与其他来源的MSC相比，UC-MSC更原始，是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞，其增殖和分化能力比胚胎干细胞低，但明显高于成体干细胞。
脐带间充质干细胞除了能分化为组织细胞修复组织损伤外，还会在生长、增殖、分化过程中向胞外分泌促进细胞生长及调控周围环境的细胞因子等活性物质，如分泌干细胞因子(SCF)、免疫调节因子(HGF、LIF)、趋化因子、支持祖细胞的营养因子(IL-6、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、血管再生因子(VEGF165、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、抑制疤痕因子(HGF、FGF-2)、抗凋亡因子(VEGF165、FGF-2、HGF)、伤口愈合相关因子(IL-6、IL-8、TGF-β、MCP-1、VEGF、GMCSF、TIMP-1)、各型胶原蛋白以及各种溶菌酶等。其中SCF、VEGF、EGF、TGF-β、FGF、HGF相互作用，能修复受损毛囊，促进毛囊干细胞分化、加速毛母细胞分裂，从根源上促进毛发再生。
脐带间充质干细胞分泌促进头发再生因子：
(1)表皮生长因子(EGF)
EGF是上皮细胞分裂增殖的刺激原，EGF与细胞膜上的EGF受体结合，激活一系列生化反应，改变细胞内钙离子浓度，启动与细胞分裂有关的基因，使静止细胞进入分裂期，有效促进和调节毛囊细胞生长、增殖，促进头发再生。
(2)成纤维细胞生长因子(FGF)
FGF是一种多功能非特异性活性物质，对内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞有促进细胞分裂作用。FGF能够改善细胞生长的微环境，促进毛囊细胞的生长发育。FGF的促新生功能，还能促进受损毛囊的修复。
(3)角质细胞生长因子(KGF)
KGF能够促进上皮细胞增殖与分化，还能保持细胞骨架稳定，组织肌纤蛋白的断裂，保持细胞结果完整，避免活性氧引起的细胞凋亡衰老，能修复受损毛囊细胞。
(4)转化生长因子β(TGF-β)
TGF-β是成纤维细胞的主要趋化因子，能够刺激成纤维细胞分裂增殖。TGF-β对成纤维细胞的诱导趋化有利于组织修复过程的进行。TGF-β1能够通过细胞外调节蛋白激酶、P38促分裂素原活化蛋白激酶信号通路来调节毛囊的生成及上皮化过程，细胞内信号通路的交互作用能够精细调控毛囊干细胞的增值分化，从而确保毛发再生与再上皮化过程顺利进行。TGF-β还能够诱导巨噬细胞分泌血管发生因子，加速血管形成，为头发生长提供充足的营养。
(5)血管内皮生长因子(VEGF)
VEGF是目前发现的作用最强、特异性最高的促血管生成因子。头皮表面组织无血管结构，主要通过真皮微血管提供营养物质并排出代谢废弃物。VEGF可有效提高局部血管通透性，为成纤维细胞的增殖及胶原合成提供充足的营养物质和生长因子，促进细胞分裂，改善毛囊微循环。
本发明中，所述具有生发功效的脐带间充质干细胞因子，主要为FGF、EGF、KGF、TGF-β、VEGF，其分子量分别为17KD、6KD、19KD、25KD、46KD，脐带间充质干细胞培养液中还含有胎牛血清白蛋白，其分子量为66KD，为阳性致敏物，浓缩液先通过30～60KD的超滤膜进行超滤透析，再将透析液通过3～10KD超滤膜，可有效剔除易致敏的胎牛血清白蛋白，最大程度收集有效因子。
直接使用脐带间充质干细胞培养液，可以减少在反复操作过程中，有效成分的流失，但是干细胞分泌的细胞因子在常温下或温度变化的条件下，会发生部分活性降低或丧失，达不到预期的效果；脐带间充质干细胞培养液中含有胎牛血清白蛋白，为阳性致敏物，使用安全性得不到保障；且液体状态下的干细胞培养液在室温保存时间短，不利于运输。干细胞培养液冻干粉的使用，可以在体外进行干细胞的扩大培养，并进行细胞的条件诱导处理，以使细胞可以分泌更多有效的细胞因子，而且冻干工艺的使用，能稳定的保存细胞因子的活性，便于储存和运输，且在使用时，只需要用相应水剂溶解，便于操作。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有生发功效的脐带间充质干细胞因子复合物的制备，脐带间充质干细胞因子复合物主要含有表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、干细胞因子(SCF)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)等，该细胞因子复合物对促进毛发再生具有显著的改善作用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：脐带间充质干细胞分离培养及表面标志物鉴定
(1)将检验合格的脐带组织放于无菌瓶内，瓶内含100-200ml的组织保存液，密封，冷藏运送至实验室；
(2)实验室洁净空间内，检查盛放脐带组织无菌瓶是否完整，详细记录容器标签相关信息，并拍照留存；
(3)生物安全柜内，用生理盐水充分洗涤脐带3-6次，留取最后一次冲洗液1ml标记送质检室检菌；
(4)将脐带剪成约2-4cm的小段，用剪刀将脐带沿血管平行方向纵向剖开，小心的将1根静脉和两根动脉从脐带中剥离干净；
(5)剩余剩余华通胶部分用生理盐水充分洗涤3-5遍，再剪碎至约1-3mm3大小；
(6)将组织块转移至一次性细胞培养皿中，轻轻摇晃使组织块均匀分布于平皿中，加少量胎牛血清固定，静置2-5min使组织块粘附于平皿；
(7)在平皿中缓慢加入3mlα-MEM培养基，注意不要冲起组织。放于37℃，5％CO2培养箱内培养，72h后换液，以后每隔48h换液一次，培养至第10-15天，细胞长满至80％-90％,消化细胞，进行传代培养。
(8)选取P3-P5代处于对数生长期的细胞，酶消化后将细胞悬液按照每管1*105个密度转移至1.5mL的Ep管中，加入PBS，800-1000rpm离心5min，离心2-3次；弃掉上清，每管加入新鲜的100uLPBS，混匀；避光加入各流式抗体，混匀后与留对照管一同置于4℃冰箱中避光孵育30-60min；加入PBS，800-1000rpm离心5min，离心2-3次，再加300-400uLPBS重悬，混匀后转移至流式专用管中，上机操作。经流式检验合格的细胞方可进行后续操作。
步骤2：细胞培养液的收集、离心、超滤浓缩和蛋白浓度检测
(1)取P20代以内的细胞，待细胞长满至80％-90％，收集细胞培养液于离心瓶内离心，800rpm，5min；
(2)收集离心后的上清液，先通过30～60KD的超滤膜进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过3～10KD超滤膜，收集截流液，所得液体即为含有大量细胞因子的脐带间充质干细胞因子超滤浓缩液。
(3)蛋白浓度检测，即采用BCA蛋白浓度测定法对脐带间充质干细胞因子超滤浓缩液总蛋白浓度进行测定。标准为：蛋白浓度≥0.65mg/ml。
步骤3：脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备
(1)称取50-150g的甘露醇，加热到60-70℃，溶解至澄清。
(2)另取一烧杯，称取1-10g的右旋糖酐40，用配制量10％体积的纯化水先将右旋糖酐40溶解，需加热煮沸，至完全澄清，将右旋糖酐及甘露醇混合，再加入1-10g的海藻糖，搅拌均匀至澄清。
(3)待液体放至室温，加入脐带间充质干细胞因子超滤浓缩液，最终用纯化水定容至1L，搅拌均匀至澄清即可。
(4)液体过滤：溶解均匀的液体用0.22-0.45μm的滤器进行过滤，滤液收集在灭过菌的容器中。
(5)液体分装：过滤后的液体按照每支西林瓶(7mL)装样2mL进行分装，分装结束后半加胶塞(分装所用的器皿都要经过121℃，20min，0.1MPa的高温高压进行灭菌，并且烘干。
(6)冻干：所述冻干的条件为：以9～11℃/min的速度降至-60～-45℃，维持冷冻1～3小时；后置于真空冷冻干燥机中于压强10～50Pa，温度-38～35℃的条件下冻干20～48h，得到冻干粉常温贮存备用。
本发明中，所述组织保存液为含1％-5％双抗的α-MEM培养基，所述细胞培养液为含5％-15％胎牛血清和0.5％-1.5％双抗的α-MEM培养基。
本发明提供的具有生发功效的脐带间充质干细胞因子的具体使用方法为：先使用沾有生理盐水的棉球擦拭一遍头皮，然后使用碘伏消毒，将冻干粉用水剂溶解，微针导入头皮。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过将脐带上的华通氏胶离体培养得到脐带间充质干细胞，制备得到脐带间充质干细胞因子。选用的脐带间充质干细胞增殖快、免疫源性低，且为医疗废弃物，获取简单，避开了社会伦理争议。
2.该干细胞因子的制备方法制备得到的细胞因子复合物的液体富含EGF、FGF、KGF、TGF-β和VEGF，促进毛囊再生效果显著。
3.本发明采用上述方法培养脐带间充质干细胞制备得到的干细胞因子与合适的冻干粉保护剂制备得到脐带间充质干细胞因子冻干粉，能稳定的保存细胞因子的活性，便于储存和运输，且在使用时，只需要用相应水剂溶解，便于操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法的流程示意图；
图2为脐带间充质干细胞形态图；
图3为脐带间充质干细胞因子冻干粉实样图；
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合实施例，进一步阐述本发明。下列实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
实施例1：
步骤1：脐带间充质干细胞原代分离、培养
(1)将检验合格的脐带组织放于无菌瓶内，内含200ml的组织保存液(含2％双抗的α-MEM培养基)，密封好,4小时内冷藏运送至实验室；
(2)实验室洁净空间内，检查盛放脐带组织无菌瓶是否完整，运输温度是否合格，详细记录容器标签及运送时间、温度相关信息，观察脐带色泽，测量脐带长度并拍照留存；
(3)生物安全柜内，将脐带放入新的无菌瓶内用生理盐水充分洗涤5次，留取最后一次冲洗液1ml标记送质检室检菌；
(4)用尖头直剪将脐带剪成约3cm的小段，用眼科剪将脐带沿血管平行方向纵向剖开，小心的将1根静脉和两根动脉从脐带中剥离干净；
(5)剩余华通胶部分转移至新的小无菌瓶中用生理盐水充分洗涤3遍，再剪碎至约2mm3大小；
(6)将组织块转移至一次性细胞培养皿中，轻轻摇晃使组织块均匀分布于平皿中，加少量胎牛血清固定，静置3min使组织块粘附于平皿；
(7)在平皿中缓慢加入3mlα-MEM培养基，注意不要冲起组织。放于37℃，5％CO2培养箱内培养，72h后换液，以后每隔48h换液一次，培养至第10-15天，细胞长满至80％,消化细胞，进行传代培养。人脐带间充质干细胞贴壁生长，为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，如图2。
实施例2：细胞培养液的收集、离心、超滤浓缩
(1)取P4代的细胞，待细胞长满至85％，收集细胞培养液于离心瓶内离心，800rpm，5min；
(2)收集离心后的细胞上清液，先通过50KD的超滤膜进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过5KD超滤膜，收集截流液，所得液体即为含有大量细胞因子的浓缩液。
实施例3：脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备
(1)称取100g的甘露醇，需加热到60-70℃，溶解至澄清。
(2)另取一烧杯，称取4g的右旋糖酐40，用配制量10％体积的纯化水先将右旋糖酐40溶解，需加热煮沸，至完全澄清，将右旋糖酐及甘露醇混合，再加入6g的海藻糖，搅拌均匀至澄清。
(3)待液体放至室温，加入脐带间充质干细胞因子浓缩液，最终用纯化水定容至1L，搅拌均匀至澄清即可。
(4)液体过滤：溶解均匀的液体用0.22μm的滤器进行过滤，滤液收集在灭过菌的容器中。
(5)液体分装：过滤后的液体按照每支西林瓶(7mL)装样2mL进行分装，分装结束后半加胶塞(分装所用的器皿都要经过121℃，20min，0.1MPa的高温高压进行灭菌，并且烘干。
(6)冻干：所述冻干的条件为：以10℃/min的速度降至-50℃，维持冷冻1～3小时；后置于真空冷冻干燥机中于压强30Pa，温度-35℃的条件下冻干48h，得到冻干粉常温贮存备用。所得冻干粉颜色为白色，形态疏松，表面光滑，均匀分布在西林瓶平底，如图3。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (5)

1.一种具有生发功效的脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括人脐带间充质干细胞的原代分离培养、细胞培养上清的收集、过滤及超滤浓缩，得到含有所述脐带间充质干细胞因子复合物的液体，再采用冷冻干燥工艺，制备得到脐带间充质干细胞因子冻干粉。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞原代分离培养通过以下方法制备：检测合格的脐带在通过初步的清洗后，将脐带剪成约2-4cm的小段，用剪刀将脐带沿血管平行方向纵向剖开，小心地将3根血管从脐带中剥离干净，剩余华通胶部分用生理盐水充分清洗2-3次，充分剪碎至约1-3mm3大小。将组织块移入平皿中，加入培养基轻轻摇晃使其均匀分布于平皿底，加入培养基，37℃，5％CO2培养箱内培养。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述收集脐带间充质干细胞培养液通过以下方法制备：脐带间充质干细胞进行贴壁培养、换液、继续培养，至细胞长满至80％-90％，无菌收集P20代内脐带间充质干细胞培养液，离心后去除死细胞及细胞碎片后，得到含有大量脐带间充质干细胞因子复合物的培养液。
4.根据权利要求1和权利要求3所述的应用，其特征在于，权利要求3中获得的脐带间充质干细胞因子的培养液先通过30～60KD的超滤膜进行超滤透析，留取透析液；再将此透析液通过3～10KD超滤膜，收集截流液，即为脐带间充质干细胞因子超滤浓缩液。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冷冻干燥工艺需要在脐带间充质干细胞因子超滤浓缩液中加入以下组分进行冻干液体的配制：0.1％-1％的右旋糖酐40，5％-15％的甘露醇，0.1％-1％的海藻糖。冻干的条件为：以9～11℃/min的速度降至-60～-45℃，维持冷冻1～3小时；后置于真空冷冻干燥机中于压强10～50Pa，温度-38～35℃的条件下冻干20～48h。
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