CN113750116A - 一种促进毛发生长的制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种促进毛发生长的制剂，其特征在于，包括：间充质干细胞细胞因子上清液、静脉血浓缩生长因子、人血清白蛋白和水溶性富勒烯衍生物。本发明制备的间充质干细胞细胞因子复合物可以从恢复毛囊正常生长调控的角度解决脱发问题。本发明提供的制剂取材方便，来源广泛，便于产业化。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种促进毛发生长的制剂及其制备方法。
背景技术
雄激素源性脱发(androgenetic alopecia，AGA)，又称男性型脱发，是最常见的进行性脱发类型，影响到全世界50％的男性和10％的女性。AGA是一种具有不同严重程度、发病年龄和头皮部位脱发的多基因病。在男性中，脱发通常涉及颞叶和顶叶区域，同时保留枕骨区，呈特征性的“马蹄铁”型。而女性AGA病人发病较男性迟，秃发一般较轻，进展也较男性慢，主要表现为头皮中央毛发进行性减少和变细，少部分表现为弥漫性头发变稀，但前发际线一般不受影响，早期表现一般不易被察觉。
AGA通常由毛囊周围微环境中血管功能不全或氧化应激所引起，进一步导致毛囊生态失调。AGA患者“脱发区域”的血管化不足会导致营养物质和其他生物活性分子向毛囊的输送障碍，限制了毛囊细胞从休止期到生长期的过渡。除了血管化不足可诱发“雄激素源性脱发”之外，氧化应激会破坏先天抗氧化防御系统，引发毛囊细胞凋亡。同时，过量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)可导致真皮乳头细胞的早衰，通过雄激素信号通路和氧化应激相关信号通路的介导，抑制毛囊细胞从休止期到生长期的转化。更值得注意的是，因过量ROS的积累已被证明会阻止血管生成并增加血管功能障碍，氧化应激和血管化不足亦存在相互关联，这种现象非常不利于“雄激素源性脱发”患者新生毛发的再生。因此我们的任务就是清除毛囊周围过量的ROS和诱导毛囊周围血管新生。
目前FDA批准的治疗雄激素性脱发的药物为米诺地尔和非那雄胺，但这两种药物仅对轻中度脱发有效，并且存在一定的不良反应。例如米诺地尔潜在的不良反应包括局部灼痛、红肿、过敏性接触性皮炎、头晕、心悸、水肿等不适[1]。口服非那雄胺可能会产生“非那雄胺后综合征”，该综合征最常见的表现是性功能障碍和心理障碍[2]，包括勃起功能障碍、性欲减退、射精功能障碍、男性乳房发育、焦虑、抑郁、记忆障碍、头痛、手足无力等。大多数患者停药后往往出现病情反复。
人脐带间充质干细胞(Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs)是再生医学领域的理想种子细胞，它易于获取、具有多能性、可分化各种细胞系，并具有强大旁分泌能力。由间充质干细胞分泌的的各种细胞因子已被报道有刺激毛囊和保护及诱导毛发生长的作用。
水溶性富勒烯衍生物能够模拟天然的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、核酸酶活性。已经有很多研究报道了其类SOD酶活性在自由基清除、神经保护以及抗衰老方面的作用。富勒烯不但具有在光动力下产生ROS分子使细胞损伤或凋亡的能力，还拥有淬灭ROS分子、清除自由基、抗氧化应激从而发挥细胞保护作用的能力，这是因为富勒烯拥有大量碳碳双键和LUMO轨道(最低未占分子轨道，LowestUnoccupied Molecular Orbital)，可以很好地吸收电子并与自由基反应，然后除去它们。富勒烯具有非常强的抗氧化能力，是维生素C的125倍。
浓缩生长因子(Concentrate growth factors，CGF)是最新一代也是第三代的血小板浓缩物，继富含血小板血浆(Platelet Rich Plasma，PRP)和富含血小板纤维蛋白(Platelet Rich Fibrin，PRF)后于2006年由Sacco首次提出。CGF的成分主要包括丰富的生长因子、CD34阳性细胞群及纤维蛋白等生物活性成分，其中生长因子由血小板激活后释放而来，主要包括血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor，PDGF)、转化生长因子(TransformingGrowth Factor，TGF)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)等，各生长因子在促进细胞增殖、血管发生、基质合成方面均发挥重要作用，同时CD34阳性细胞则在血管新生、维护及组织修复等方面发挥明显的作用。
参考文献：
[1]Stoehr J R,Choi J N,Colavincenzo M,et al.Off-Label Use of TopicalMinoxidil in Alopecia:A Review[J].American Journal of Clinical Dermatology,2019.
[2]ARCM,BDS,ARS,et al.Neuroactive steroid levels and psychiatric andandrological features in post-finasteride patients[J].The Journal of SteroidBiochemistry and Molecular Biology,2017,171:229-235.
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种促进毛发生长的制剂及其制备方法，旨在解决现有的医药、医疗、美容洗护用品在雄激素性脱发方面时间长起效慢、效果不明显、费用高等问题。本发明将间充质干细胞细胞因子上清液、静脉血浓缩生长因子、人血清白蛋白、水溶性富勒烯衍生物联合应用于止脱生发制剂，可对雄激素性脱发等脱发有明显预防作用及促进头发生长的功能。
一方面，本发明提供了一种促进毛发生长的制剂。
所述的制剂中包括：间充质干细胞细胞因子上清液、静脉血浓缩生长因子、人血清白蛋白和水溶性富勒烯衍生物。
所述的制剂中包括：体积分数为25-35％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为58-72％的静脉血浓缩生长因子CGF、体积分数为3-7％的人血清白蛋白、终浓度为5-7.5μg/mL水溶性富勒烯衍生物。
优选地，所述的制剂中包括：体积分数为35％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为58％的静脉血浓缩生长因子CGF、体积分数为7％的人血清白蛋白、终浓度为5μg/mL水溶性富勒烯衍生物。
所述的间充质干细胞细胞因子上清液的制备方法为：脐带组织采用组织贴壁法培养并传代，培养液吸出上清离心，取离心后上清液超滤浓缩，超滤膜孔径10KD。
优选地，所述的吸出上清离心的条件为3000转/分钟离心20分钟；超滤浓缩条件为4500转/分钟离心30分钟。
所述的静脉血浓缩生长因子的制备方法为含有抗凝溶液的人静脉血变速离心，离心结束后吸取中层产物。
另一方面，本发明提供了一种促进毛发生长的制剂的制备方法。
所述的制备方法中包括将体积分数为35％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为58％的静脉血浓缩生长因子、体积分数为7％的人血清白蛋白、终浓度为5μg/mL水溶性富勒烯衍生物混合。
所述的间充质干细胞细胞因子上清液的制备方法为：脐带组织采用组织贴壁法培养并传代，培养液吸出上清离心，取离心后上清液超滤浓缩，超滤膜孔径10KD。
所述的静脉血浓缩生长因子的制备方法为含有抗凝溶液的人静脉血变速离心，离心结束后吸取中层产物。
在一些实施例中，所述的制备方法中包括以下步骤：
(1)培养间充质干细胞并制备细胞因子溶液；优选的，所述的充质干细胞为脐带间充质干细胞；
(2)制备静脉血浓缩生长因子(Concentrate growth factors，CGF)；
(3)按比例将脐带间充质干细胞细胞因子上清液、静脉血浓缩生长因子CGF、水溶性富勒烯衍生物混合。
优选地，所述的步骤(1)中所述的培养间充质干细胞并制备细胞因子溶液的步骤为：用组织保护液清洗脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎成1-2mm3体积碎块，采用组织贴壁法接种于T75培养瓶中培养，使用无血清培养基培养；原代细胞经14天培养长至70％融合度进行传代培养；选用生长状况良好的第二代脐带间充质干细胞，按10000/cm2密度接种于康宁T175培养瓶中，加入30mL无血清培养基正常培养；培养3-4天后细胞生长至90％融合度时吸出上清液用于收集细胞因子，间充质干细胞正常传代培养，根据细胞生长状态决定培养代次；收集的细胞上清液3000转/分钟离心20分钟去除细胞碎片，收集上清液；细胞上清液加入15mL超滤管中浓缩，超滤膜孔径10KD，4500转/分钟离心30分钟，去除多余水分使体积浓缩为原体积的一半，浓缩液过0.22μm滤膜除菌，得到脐带间充质干细胞细胞因子上清液。
优选地，所述的步骤(2)中，按照以下操作制备静脉血浓缩生长因子：抽取自体静脉血9mL于含抗凝溶液的无菌的真空采血管中，然后将无菌管放入离心机中进行变速离心约13min(首先加速30s，速度达到2700r/min后，维持旋转2min，再降速至2400r/min，维持旋转4min，然后再加速到2700r/min维持旋转4min，最后再加速到3300r/min维持旋转3min后减速36s至停止)。离心结束后获得三层成分，分别是：①上层贫血小板血浆(PPP)层；②富自体浓缩生长因子纤维蛋白层，具有聚集的血小板和浓缩的生长因子(CGF)；③下层红细胞(RBC)层。每9mL血液可分离出约2.5mL液态浓缩生长因子纤维蛋白。
优选地，所述水溶性富勒烯衍生物溶液制备方法为取水溶性富勒烯粉剂0.5mg，溶于100mL无菌生理盐水中，超声振荡溶解，得到浓度为5μg/mL的富勒烯溶液，高压灭菌后置于4℃冰箱中备用。
优选地，步骤(1)中使用的组织保护液为生理盐水添加25μg/mL的硫酸庆大霉素和5μg/mL的两性霉素B配制。
优选地，所述生发制剂复合物适用于雄激素脱发、烫染损伤等多种脱发疾病。
再一方面，本发明提供了前述的制剂和/或制备方法在制备防脱发产品中的应用。
所述的防脱发产品包括但不限于：洗发膏、洗发水、洗发乳、护发素、护发精油、护发乳液、护发喷雾、发膜。
所述的防脱发产品的功效包括但不限于针对雄激素性脱发、烫染损伤型脱发。
优选地，所述的防脱发产品除前述制剂外还可能包括以下成分：表面活性剂、起泡剂、芳香剂、调理剂、粘稠剂、调理剂、色素、防腐剂。
本发明的有益效果：
1、本发明制备的间充质干细胞细胞因子复合物可以从恢复毛囊正常生长调控的角度解决脱发问题。采用脐带间充质干细胞细胞因子上清液联合富含促进毛囊生长的静脉血浓缩生长因子CGF及具有高通透性和抗氧化性的水溶性富勒烯衍生物，可以在一定程度上改善毛囊干细胞的微环境，从根本上调节毛囊健康，促进毛发再生，效果更持久。
2、本发明制备的间充质干细胞细胞因子复合物，细胞取材方便，临床上分娩所得脐带属于医疗废弃物，来源广泛，便于产业化。
3、本发明制备的间充质干细胞细胞因子复合物，富含血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等，各生长因子在促进细胞增殖、血管发生、基质合成方面都发挥重要作用，CD34阳性细胞则在血管新生、维护、组织修复等方面作用明显。
附图说明
图1为实施例5中患者1施药前后效果对比图。
图2为实施例5中患者2施药前后效果对比图。
图3为实施例5中患者3施药前后效果对比图。
图4为实施例5中患者4施药前后效果对比图。
图5为实施例5中患者5施药前后效果对比图。
图6为实施例9中患者1施药前后效果对比图。
图7为实施例9中患者2施药前后效果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种促进毛发生长的制剂及其制备方法
1、医院采集足月剖腹产人胎儿脐带组织，采集前签署客户知情同意书，组织于4℃冷藏无菌环境下运抵实验室，运输过程中使用组织保护液保护脐带组织生物学活性，组织保护液由生理盐水添加25μg/mL的硫酸庆大霉素和5μg/mL的两性霉素B配制，确保运输过程中无细菌和真菌污染。
2、实验室中用组织保护液清洗脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎成1-2mm3体积碎块，采用组织贴壁法接种于T75培养瓶中培养，使用无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，间充质干细胞无血清培养基，产品货号：NC0103)培养。
3、原代细胞经14天培养长至70％融合度进行传代培养。
4、选用生长状况良好的第二代脐带间充质干细胞，按10000个/cm2密度接种于康宁T175培养瓶中，加入30mL无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，间充质干细胞无血清培养基，产品货号：NC0103)正常培养。
5、培养3-4天后细胞生长至90％融合度时吸出上清液用于收集细胞因子，间充质干细胞正常传代培养，根据细胞生长状态决定培养代次。
6、收集的细胞上清液3000转/分钟离心20分钟去除细胞碎片，收集上清液。
7、细胞上清液加入15mL超滤管中浓缩，超滤膜孔径10KD，4500转/分钟离心30分钟，去除多余水分使体积浓缩为原体积的一半，浓缩液过0.22μm滤膜除菌，得到脐带间充质干细胞细胞因子上清液，制备好的细胞因子上清液放置于-80℃条件下保存待用。
8、采集静脉血：抽取9mL人静脉血，放置含抗凝溶液的无菌采血管中，采集完成后，将采血管放置于冷藏温度为4-8℃的冰箱中。
9、分离：将无菌管放入离心机中中进行变速离心约13min(首先加速30s，速度达到2700r/min后，维持旋转2min，再降速至2400r/min，维持旋转4min，然后再加速到2700r/min维持旋转4min，最后再加速到3300r/min维持旋转3min后减速36s至停止)。离心结束后获得三层成分，分别是：①上层贫血小板血浆(PPP)层；②富自体浓缩生长因子纤维蛋白凝胶层，具有聚集的血小板和浓缩的生长因子(CGF)；③下层红细胞(RBC)层。每9mL血液可分离出约2.5mL液态浓缩生长因子纤维蛋白。
10、取水溶性富勒烯粉剂(购自厦门福纳新材料科技有限公司)0.5mg，溶于100mL无菌生理盐水中，超声振荡溶解，得到浓度为5μg/mL的富勒烯溶液，高压灭菌后备用。
11、将步骤7得到的脐带间充质干细胞细胞因子上清液和步骤9得到的静脉血浓缩生长因子混合，并添加适量辅料，比例为：体积分数为35％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为58％的静脉血浓缩生长因子CGF、体积分数为7％的人血清白蛋白(购于无锡润得医疗器械有限公司)、终浓度为5μg/mL水溶性富勒烯衍生物。
修复毛囊组织和促进毛发生长的生发制剂复合物分装于10mL无菌西林瓶中并于-20℃冷冻保存。
实施例2一种促进毛发生长的制剂及其制备方法
与实施例1不同之处在于，步骤11中的比例为：体积分数为31％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为62％的静脉血浓缩生长因子CGF、体积分数为7％的人血清白蛋白、终浓度为7.5μg/mL水溶性富勒烯衍生物。
实施例3一种促进毛发生长的制剂及其制备方法
与实施例1不同的是，步骤11中的比例为：体积分数为25％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为72％的静脉血浓缩生长因子CGF、体积分数为3％的人血清白蛋白、终浓度为6.5μg/mL水溶性富勒烯衍生物。
实施例4一种促进毛发生长的制剂及其制备方法
与实施例1不同的是，步骤11中的比例为：体积分数为35％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为59％的静脉血浓缩生长因子CGF、体积分数为6％的人血清白蛋白、终浓度为7.5μg/mL水溶性富勒烯衍生物。
实施例5一种促进毛发生长的制剂的治疗效果
入组条件：
(1)健康成年男性，年龄25-50岁之间，无糖尿病、心血管疾病、肿瘤及肿瘤病史；
(2)发际线后移，或秃顶；
(3)头皮无皮肤大面积损伤，无疤痕。
使用方法：
(1)筛选5位脱发患者，每天早晚清洗头皮，擦干。
(2)将硅胶滴头装在西林瓶口，滴2ml左右实施例1提供的制剂均匀涂抹在头皮无头发处，轻轻按摩3-5分钟。
(3)按此方案连续使用4周，观察头发生长情况并统计患者头发密度：使用脱发产品前对脱发区域拍照，Image-Pro Plus 6.0软件计算其面积并统计头发密度。使用脱发产品后，以同样方法统计患者原脱发区域头发密度。
结果如表1和图1-5所示，受试者在2周可以看到脱发改善，连续使用4周后脱发改善明显。
表1
实施例6-8促进毛发生长的制剂的治疗效果
参照实施例5的方法，对实施例2-4提供的制剂进行效果检测，最终得到的结果如表2所示。
表2
实施例9一种促进毛发生长的制剂对烫染损伤治疗效果
对实施例1提供的制剂进行烫染损伤治疗效果检测。
入组条件：
(1)健康成年女性，年龄18-50岁之间，无糖尿病、心血管疾病、肿瘤及肿瘤病史；
(2)因多次烫法染发造成脱发现象；
(3)头皮无皮肤大面积损伤，无疤痕。
具体使用方法参考实施例5，本实施例中共筛选到2位患者，最终效果如图6-7所示，根据图片结果可知：受试者在2周可以看到脱发改善，连续使用4周后脱发改善明显。
对比例1-4
参照实施例1设置对比例1-4制备制剂，并参照实施例5的方法进行效果检验，各组筛选2名患者，结果取平均值，对比例1-4与实施例1的差别和最终检测效果如表3所示：
表3
对比例5-6
参照实施例1设置对比例5-6制备制剂，并参照实施例5的方法进行效果检验，各组筛选2名患者，结果取平均值，对比例5-6与实施例1的差别和最终检测效果如表4所示：
表4
Claims (10)
1.一种促进毛发生长的制剂，其特征在于，包括：间充质干细胞细胞因子上清液、静脉血浓缩生长因子、人血清白蛋白和水溶性富勒烯衍生物；所述的水溶性富勒烯衍生物终浓度为5-7.5μg/mL。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，包括：体积分数为25-35％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为58-72％的静脉血浓缩生长因子、体积分数为3-7％的人血清白蛋白、终浓度为5-7.5μg/mL水溶性富勒烯衍生物。
3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，包括：体积分数为35％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为58％的静脉血浓缩生长因子CGF、体积分数为7％的人血清白蛋白、终浓度为5μg/mL水溶性富勒烯衍生物。
4.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的间充质干细胞细胞因子上清液的制备方法为：脐带组织采用组织贴壁法培养并传代，培养液吸出上清离心，取离心后上清液超滤浓缩，超滤膜孔径10KD。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述的吸出上清离心的条件为3000转/分钟离心20分钟；超滤浓缩条件为4500转/分钟离心30分钟。
6.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的静脉血浓缩生长因子的制备方法为含有抗凝溶液的人静脉血变速离心，离心结束后吸取中层产物。
7.一种促进毛发生长的制剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中包括将体积分数为35％的脐带间充质干细胞细胞因子上清液、体积分数为58％的静脉血浓缩生长因子、体积分数为7％的人血清白蛋白、终浓度为5μg/mL水溶性富勒烯衍生物混合。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的间充质干细胞细胞因子上清液的制备方法为：脐带组织采用组织贴壁法培养并传代，培养液吸出上清离心，取离心后上清液超滤浓缩，超滤膜孔径10KD。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的静脉血浓缩生长因子的制备方法为含有抗凝溶液的人静脉血变速离心，离心结束后吸取中层产物。
10.权利要求1-6任一项所述的制剂和/或权利要求7-9任一项所述的制备方法在制备防脱发产品中的应用。
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| CN202111233773.0A CN113750116A (zh) | 2021-10-22 | 2021-10-22 | 一种促进毛发生长的制剂及其制备方法 |
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