CN112353819A - 一种促进毛发生长的制剂及其制备方法 - Google Patents

一种促进毛发生长的制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种促进毛发生长的制剂及其制备方法，所述制剂的制备方法包括如下步骤：(1)培养间充质干细胞并制备细胞因子溶液；(2)以步骤(1)所述细胞因子溶液制备凝胶制剂；以及可选的：在步骤(2)制得的所述凝胶制剂中，进一步添加天然化合物及细胞因子的步骤。

Description

一种促进毛发生长的制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域尤其是外用药物制剂技术领域，具体的，涉及一种促进毛发生长的制剂及其制备方法。
背景技术
脱发是生活中经常遇到的问题，在中国人群中，脱发发生率高达30％以上，随着社会进步，生活节奏加快，大家工作生活压力与日俱增，环境污染及染发烫发等生活习惯影响，脱发发生率也随之增加并有年轻化趋势。毛发由毛囊中的干细胞发育而来，正常的毛发生长周期与毛囊本身的生长周期有关，一般分为生长期，退行期和休止期，生长期的毛发根部较柔软，周围有白色透明的鞘包绕，毛球卷曲，而休止期的毛发根部较粗呈棍棒状，毛根周围没有白色透明鞘包绕。不同部位的毛囊并非同步生长，它们具有各自的生长周期，头发的生长周期较长，一般为2-5年，退行期数天，休止期大约3个月，除胡须之外，其他部位的毛囊整个生长周期仅为几个月，而且大多数处于休止期。
当生活压力加大，不健康的生活习惯及体内雄性激素增加可能打破正常的毛发生长周期，使大量毛囊退行期后直接进入休眠状态，不再生长新的毛发，从而使得毛发数量减少，造成头发稀疏甚至秃顶。一般脱发可分成两种基本类型，由于毛囊受损造成的永久性脱发，和由于毛囊短时间受损造成的暂时性脱发，永久性脱发即常见的男性秃顶，永久性脱发(即男性型脱发)的掉发过程是逐渐产生的，开始时，头前额部的头发边缘明显后缩，头顶部头发稀少；然后逐步发展，最后会发展到只剩下头后部，头两侧一圈稀疏的头发，其主要原因有三：遗传因素、激素的缺乏或失调、过于肥胖；另外，多种皮肤病或皮肤受伤留下的疤痕、天生头发发育不良、以及化学物品或物理原因对毛囊造成的严重伤害均可引起永久性脱发。
目前临床上对脱发具体原因尚无明确说法，但其根本原因是毛囊萎缩与退化，甚至进入休眠阶段。目前临床上常用药物包括米诺地尔和非那雄胺，这些药物副作用大，长期使用对身体造成严重不利影响，例如女性长期使用非那雄胺可能导致胚胎先天性畸形，男性则会出现性欲减退、阳痿等严重后果。
研究发现，间充质干细胞具有强大的旁分泌功能，可以分泌多种细胞因子，具有促进组织再生的重要作用，通过动物实验也发现，在皮肤内给予间充质干细胞分泌的细胞因子，可以有效的促进皮下毛细血管再生，为毛囊组织提供更多营养，并且可以激活处于休眠状态的毛囊干细胞，从而达到促进毛发再生的效果。
发明内容
本发明首先涉及一种用于促进毛发生长或修复毛囊组织的生发制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)培养间充质干细胞并制备细胞因子溶液；优选的，所述的充质干细胞为脐带间充质干细胞；
(2)以步骤(1)所述细胞因子溶液制备凝胶制剂；
具体的，所述的培养间充质干细胞并制备细胞因子溶液的步骤为：
(1)复苏并使用无血清培养基培养所述间充质干细胞至70％融合度，使用刺激因子于低氧环境下刺激培养24～72小时，随后收集细胞培养液上清并浓缩、过滤；
优选的，所述的细胞因子包括但不限于：Vc(1uM-200uM)、VB3(1uM-200uM)、VD3(1uM-200uM)；所述的低氧环境为氧含量1％-10％；所述的刺激培养时间为48小时；
所述的浓缩方法为：使用超滤管进行离心浓缩，超滤管膜孔径为3KD-50KD，4℃环境下以2000rpm-4000rpm的转数离心15min-30min，使液体浓缩2-20倍。
所述的过滤方法为：离心后去除下层水分，收集上层浓缩液到50ml离心管中，再以2000rpm-4000rpm的转数离心15min-30min，去除下层细胞碎片等沉淀，上层上清液分别过0.8μm、0.45μm和0.22μm滤膜，去除液体中的细菌等杂质。
步骤(2)的制备步骤为：
将步骤(1)所述的细胞因子溶液与凝胶基质混合，搅拌均匀，所述的凝胶基质为：如下含量的任一成分或任意组合：透明质酸(HA)：0.1％-2％(质体比)，PEG2000：0.01％-5％(质体比)，硫酸软骨素(CS)：0.01％-5％(质体比)，羧甲基壳聚糖：0.01％-5％(质体比)，卡波姆：0.1％-10％(体积比)；
进一步的，所述的生发制剂的制备方法中还包括如下步骤：
(3)在步骤(2)制得的所述凝胶制剂中，进一步按照如下含量加入如下任一成分或任意组合的天然化合物：黄岑苷0.05％-1％(质体比)、生育酚醋酸酯0.02％-1％(体积比)、D-泛醇(B5)0.05％-1％(质体比)、腺苷0.05％-1％(质体比)、烟酰胺(B3)0.05％-5％(质体比)、槲皮素0.1％-5％(质体比)、柚皮素0.05％-5％(质体比)、低聚原花青素0.05％-5％(质体比)；
优选的，对于上述天然化合物，使用有机溶剂或纯净水溶解后，按照1:1加入步骤(2)制得的凝胶制剂中；
进一步的，所述的生发制剂的制备方法中还包括如下步骤：
(4)在步骤(2)制得的所述凝胶制剂中，进一步添加如下含量的细胞因子：
头蛋白(Noggin)为0.1-50ng/ml、
血管内皮细胞生长因子(VEGF)为0.1-50ng/ml、
血小板衍生因子α(PDGF-α)为0.1-50ng/ml、
胰岛素样生长因子1(IGF-1)为0.05-25ng/ml、
集落刺激因子(CSF)为0.1-50ng/ml、
干细胞生长因子(SGF)为0.1-50ng/ml、
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为0.1-50ng/ml、
角化细胞生长因子(KGF)为0.1-50ng/ml、
金属蛋白酶2(MMP-2)为0.1-50ng/ml，
金属蛋白酶9(MMP-9)为0.1-50ng/ml，
前列腺素2(PGE2)为0.1-50ng/ml，
血管生成素1(Ang-1)0.1-50ng/ml。
本发明还涉及以所述方法制备获得的生发制剂。
本发明还涉及所述的生发制剂在制备治疗脱发的药物中的应用。
附图说明
图1、P5代脐带间充质干细胞形态；
图2、P5代脐带间充质干细胞培养上清液中细胞因子的含量；
图3、本发明所述的生发制剂促进小鼠毛发生长的结果统计；
图4、本发明所述的生发制剂促进小鼠毛发生长的实例照片；
图5、施用本发明所述的生发制剂14天后小鼠皮肤病理切片；
图6、本发明所述的生发制剂促进脱发患者头发生长的结果统计；
图7、本发明所述的生发制剂促进脱发患者头发生长的实例照片。
具体实施方式
实施例1促生发制剂制备
1、采集健康捐献者的脐带组织，捐献者需满足以下条件：①烈性传染病检测为阴性，烈性传染病包括但不限于乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)、梅毒螺旋体(TP)、人巨噬细胞病毒(CMV)、人噬T细胞病毒(HTLV)、EB病毒(EBV)；②妊娠期足月(胎龄38周龄以上)；③无支原体、B族链球菌感染。
2、采集的脐带组织置于无菌容器中并使用无菌生理盐水浸泡，冷藏条件下(4℃)于24小时内运抵实验室，运输过程中容器无破损、无漏液、样本未经过X光照射。
3、运抵实验室的脐带组织，在无菌条件下清洗并剥离其中的华通氏胶，剪碎为体积不超过2*2*2mm小块，使用无血清培养基(北京友康恒业生物科技有限公司，货号：NC0103和NC0105.S)在含5％的CO2恒温培养箱中原代培养，3天半换液，15天后细胞传代培养。
4、P0代细胞使用生理盐水清洗后加入5-10ml温和消化酶(北京友康恒业生物科技有限公司，货号：NC1004.1)消化2-10min，收集单细胞悬液离心(1500rpm*5min)，去除上清液后细胞沉淀按10000-15000/cm2的密度接种于无血清培养基中得到P1代细胞。
5、细胞在含5％的CO2恒温培养箱中培养3天，长至90％融合度后使用温和消化酶消化得到单细胞悬液，离心(1500rpm*5min)后去除上清液，细胞沉淀使用GMP级冻存液(北京友康恒业生物科技有限公司，货号：NC1010)按照4*106/ml的密度冻存于液氮中，作为种子细胞备用。
6、取P1代脐带间充质干细胞(UC-MSC)复苏后按10000-15000/cm2的密度接种于无血清培养基中，在含5％的CO2恒温培养箱中培养3天，细胞形态如图1所示；
7、UC-MSC长至90％融合度后按照1:4的密度传代培养，在含5％的CO2恒温培养箱中正常培养到P5代。
8、P5代细胞长至70％融合度后添加刺激因子Vc(Sigma，A5960)、VB2(Sigma，R9504)、VD3(Sigma，C1357)，并转移至低氧培养箱中刺激48小时后传代时收集细胞上清液置于-20℃冷冻保存备用。
9、取出冷冻保存的细胞上清液，冷藏条件(4℃)下融化，混匀后离心(4000rpm*20min)去除细胞碎片，使用超滤管(滤膜孔径为：3KD-50KD)4℃条件下离心(转数为：2000rpm-4000rpm，时间为：15min-30min)浓缩至2-20倍，检测上清液中bFGF、EGF、VEGF和TGF-β含量，使其浓度不低于10ng/ml，如图2所示。
10、浓缩液在冷藏条件下(4℃)依次过0.8μm、0.45μm和0.22μm滤膜去除细菌和微小细胞碎片后备用；
11、过滤后的细胞因子浓缩液在冷藏条件下(4℃)按照如下配方添加重组的细胞因子并混匀：头蛋白(Noggin)为0.1-50ng/ml、血管内皮细胞生长因子(VEGF)为0.1-50ng/ml、血小板衍生因子α(PDGF-α)为0.1-50ng/ml、胰岛素样生长因子1(IGF-1)为0.05-25ng/ml、集落刺激因子(CSF)为0.1-50ng/ml、干细胞生长因子(SGF)为0.1-50ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为0.1-50ng/ml、角化细胞生长因子(KGF)为0.1-50ng/ml、金属蛋白酶2(MMP-2)为0.1-50ng/ml、属蛋白酶9(MMP-9)为0.1-50ng/ml、前列腺素2(PGE2)为0.1-50ng/ml、血管生成素1(Ang-1)0.1-50ng/ml，上述重组细胞因子采购自北京同立海源生物科技有限公司生产的GMP级产品。
12、在冷藏条件下(4℃)加入透明质酸(HA)：0.1％-2％(W/V)，PEG2000：0.01％-5％(W/V)，硫酸软骨素(CS)：0.01％-5％(W/V)，羧甲基壳聚糖：0.01％-5％(W/V)，卡波姆：0.1％-10％(V/V)，将溶液配制成凝胶，搅拌均匀制备成凝胶备用。
13、称取5g槲皮素和柚皮素分别用50ml冰醋酸完全溶解得到10％储存液，过滤后备用。
14、称取0.2g维生素E醋酸酯使用10ml棕榈油完全溶解得到2％储存液，过滤后备用。
15、称取10g黄岑苷、D-泛醇、腺苷、烟酰胺、低聚原花青素分别使用100ml纯净水溶解得到10％存储液，过滤后备用。
16、将上述存储液按照如下配方比例添加并配成水溶液：黄岑苷0.05％-1％(质体比)、维生素E醋酸酯0.02％-1％(体积比)、D-泛醇(B5)0.05％-1％(质体比)、腺苷0.05％-1％(质体比)、烟酰胺(B3)0.05％-5％(质体比)、槲皮素0.1％-5％(质体比)、柚皮素0.05％-5％(质体比)、低聚原花青素0.05％-5％(质体比)，使用NaOH饱和液中和产品中的冰醋酸，调节产品pH值为6.5-7.0备用。
17、室温下将步骤12制备得到的凝胶和步骤16制备得到的水溶液按照1:1的比例添加并搅拌均匀，即得所述促生发制剂。
实施例2生发制剂促进毛发再生动物实验
1、选择12只7周龄雄性C3H/HeN小鼠，完全剃除背部毛发后随机分为2组备用；
2，实验组使用制备好的促生发制剂背部皮肤皮内多点注射，每只小鼠注射20个位点，每位点注射10ul；
3，对照组使用生理盐水背部皮肤皮内多点注射，方法与实验组相同；
4，正常饲养14天，观察毛发生长情况，使用SLIC像素对比算法分析背部毛发生长面积与毛发剃除面积的比例，如图3和图4所示；
5,饲养14天后处死小鼠，取背部皮肤做病理切片，观察毛囊细微结构和毛发再生情况，如图5所示。
结果显示，施用本发明所述的生发制剂14天后，小鼠的毛囊细微结构相比与对照组而言更为规则有序，毛发生长情况更好。
实施例3生发制剂促进头发再生人体实验
患者入组条件：
1，健康成年男性，年龄25-50岁之间，无糖尿病、心血管疾病、肿瘤及肿瘤病史；
2，发际线后移，或秃顶；
3，头皮无皮肤大面积损伤，无疤痕。
使用方法：
1，筛选5位脱发患者，每天早晚清洗头皮，擦干，取清洗干净的德国DRSDermaroller 540针滚轮微针(0.2-0.5mm)75％医用酒精消毒备用；
2，挤少许制剂均匀涂抹在头皮无头发处，轻轻按摩；
3，消毒后滚针在头皮上轻轻滚动2min，以头皮稍微发红而无明显出血为准；
4，使用滚针后再次涂抹少许制剂；
5，按此方案连续使用12周，观察头发生长情况并统计患者头发密度，结果如图6和图7所示。
结果显示，施用本发明所述的生发制剂12周后，患者脱发部位的头发再生情况有显著改善。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于促进毛发生长或修复毛囊组织的生发制剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)培养间充质干细胞并制备细胞因子溶液；优选的，所述的充质干细胞为脐带间充质干细胞；
(2)以步骤(1)所述细胞因子溶液制备凝胶制剂；
具体的，所述的培养间充质干细胞并制备细胞因子溶液的步骤为：
复苏并使用无血清培养基培养所述间充质干细胞至70％融合度，使用刺激因子于低氧环境下刺激培养24～72小时，随后收集细胞培养液上清并浓缩、过滤；
所述的细胞因子包括但不限于：Vc(1uM-200uM)、VB3(1uM-200uM)、VD3(1uM-200uM)；
所述的低氧环境为氧含量1％-10％；
所述的刺激培养时间为24～48小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的浓缩方法为：
使用超滤管进行离心浓缩，所述超滤管的滤膜孔径为3KD-50KD，4℃环境下以2000rpm～4000rpm的转数离心15min～30min，使液体浓缩2～20倍。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的过滤方法为：
离心后去除下层水分，收集上层浓缩液到50ml离心管中，再以2000rpm～4000rpm的转数离心15min～30min，去除下层细胞碎片等沉淀，上层上清液分别过0.8μm、0.45μm和0.22μm滤膜，去除液体中的细菌等杂质。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(2)所述的制备步骤为：
将步骤(1)所述的细胞因子溶液与凝胶基质混合，搅拌均匀，所述的凝胶基质为如下含量的任一成分或任意成分的组合：
透明质酸(HA)：0.1％-2％(质体比)，
PEG2000：0.01％-5％(质体比)，
硫酸软骨素(CS)：0.01％-5％(质体比)，
羧甲基壳聚糖：0.01％-5％(质体比)，
卡波姆：0.1％-10％(体积比)。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述方法中还包括如下步骤：
在步骤(2)制得的所述凝胶制剂中，进一步按照如下含量加入如下任一成分或任意成分组合的天然化合物：
黄岑苷0.05％-1％(质体比)、生育酚醋酸酯0.02％-1％(体积比)、D-泛醇(B5)0.05％-1％(质体比)、腺苷0.05％-1％(质体比)、烟酰胺(B3)0.05％-5％(质体比)、槲皮素0.1％-5％(质体比)、柚皮素0.05％-5％(质体比)、低聚原花青素0.05％-5％(质体比)；
优选的，对于上述天然化合物，使用有机溶剂或纯净水溶解后，按照1:1加入步骤(2)制得的凝胶制剂中。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述方法中还包括如下步骤：
在步骤(2)制得的所述凝胶制剂中，进一步添加如下含量的细胞因子：
头蛋白(Noggin)为0.1-50ng/ml、血管内皮细胞生长因子(VEGF)为0.1-50ng/ml、血小板衍生因子α(PDGF-α)为0.1-50ng/ml、胰岛素样生长因子1(IGF-1)为0.05-25ng/ml、集落刺激因子(CSF)为0.1-50ng/ml、干细胞生长因子(SGF)为0.1-50ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为0.1-50ng/ml、角化细胞生长因子(KGF)为0.1-50ng/ml、金属蛋白酶2(MMP-2)为0.1-50ng/ml、金属蛋白酶9(MMP-9)为0.1-50ng/ml、前列腺素2(PGE2)为0.1-50ng/ml、血管生成素1(Ang-1)0.1-50ng/ml。
7.权利要求1-6任一所述的方法制备获得的生发制剂。
8.权利要求7所述的生发制剂在制备治疗脱发的药物中的应用。
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