CN112618572A - 一种治疗秃发的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗秃发的组合物，包括干细胞外泌体和米诺地尔。该外泌体来源于人脐带间充质干细胞，富含多种生物活性因子，提取过程简单，使用方便，可长时间运输和储存，可用于雄激素性脱发和非瘢痕性斑秃的治疗。每周两次采用印章微针辅助促渗技术导入外泌体和米诺地尔酊联合治疗AGA，在治疗周期内促进毛发生长，减少脱发量，操作简单，成本低廉，且不良反应较少，患者接受度高，依从性良好，具有很好的应用前景。

Description

一种治疗秃发的组合物
技术领域
本发明干细胞技术领域，更具体地，涉及一种治疗秃发的组合物。
背景技术
雄激素性秃发(androgenetic alopecia，AGA)也叫脂溢性脱发、早秃，是皮肤科门诊常见的非瘢痕性脱发，占毛发疾病的90％。调查数据显示，我国AG A的男性患者可达21.3％，女性患者可达6.0％，近年随着人们生活习惯工作方式的变化，AGA的患病率呈上升且年轻化趋势。AGA好发于青年男性，表现为毛发的进行性减少，逐渐细软，可伴有脂溢性皮炎等，男性AGA主要发生在前额发际线和头顶部位，女性AGA主要发生在头顶部。目前认为，AGA的发生与遗传、雄激素、5α-还原酶等有关。目前关于AGA的主要治疗方法包括口服非那雄胺(男性)、口服螺内酯(女性)、外用米诺地尔酊，但同时也存在治疗周期较长，且有不同程度不良反应的问题，治疗的同时可能会增加患者新的担忧。
间充质干细胞是一种多能干细胞，具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。已有研究显示，MSC注入裸鼠皮下后，一方面能分化为毛囊上皮细胞和毛乳头细胞，归巢位置以毛囊外根鞘和毛乳头处多见，另一方面间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如HGF、FGF、VEGF等，介导细胞间信号转导，修复受损的毛囊，激活毛囊干细胞，帮助毛囊恢复生长周期，促进头发生长。脐带间充质干细胞(UC-MSCs)属于间充质干细胞的一种，免疫原性低、原始性高，取材于临床足月分娩的婴儿脐带，属于医疗废弃物，来源广泛，便于临床推广使用。
无论静脉注射、肌肉注射或心肌内注射，外源移植的MSC多在72小时内死亡。那么，死亡的MSC又是如何发挥上述作用的呢？既往的研究表明，体外培养的MSC在低氧和血清撤除条件下，可以释放大量的外泌体，这种外泌体在体外可以促进内皮细胞增殖，促进内皮细胞形成毛细血管网状结构，加速缺血模型血流的恢复。临床上，间充质干细胞来源的外泌体可以用于治疗多种疾病，例如视网膜病变、肝脏衰竭、皮肤病、肺纤维化等，由于现有技术中间充质干细胞移植存活率低及长期临床应用存在致瘤隐患等不足使得其临床应用受到限制，利用间充质干细胞的外泌体相比利用间充质干细胞治疗操作更加简单、安全有效。因此，MSC来源的外泌体作为“无细胞”细胞治疗的材料，具有潜在的实用价值。
目前，CN110538197A-一种外泌体在治疗脱发的药物中的应用和CN110946 876A-间充质干细胞外泌体制剂在治疗斑秃中的应用，都公开了外泌体在治疗托发中的应用，但是效果欠佳。
米诺地尔是目前治疗AGA局部药物的“金标准”，已广泛应用于临床，其治疗脱发机制可能为：①诱导毛囊干细胞分化，促进毛囊细胞的增殖和分化；②米诺地尔可直接扩张血管，促进血管内皮细胞生长因子(VEGF)的局部表达，增加了局部血液供应。皮肤角质层作为天然屏障，对米诺地尔的吸收造成极大影响。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种治疗秃发的组合物。
本发明的另一个目的是提供任一所述的组合物在制备治疗秃发的产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明要求保护一种治疗秃发的组合物，包括干细胞外泌体和米诺地尔。
优选地，干细胞外泌体和米诺地尔的用量比例为：每0.3×1012～2.5×1012个 /ml干细胞外泌体和米诺地尔0.02～0.04或0.05～1g。
更优选地，干细胞外泌体和米诺地尔的用量比例为：每0.4×1012～2×1012个 /ml干细胞外泌体和米诺地尔0.02或0.05g。
更进一步有具体地，对于女性使用者，干细胞外泌体和米诺地尔的用量比例为：每0.4×1012～2×1012个/ml干细胞外泌体和米诺地尔0.02g。
更进一步有具体地，，对于男性使用者，干细胞外泌体和米诺地尔的用量比例为：每0.4×1012～2×1012个/ml干细胞外泌体和米诺地尔0.05g。
优选地，使用印章微针辅助促渗技术，干细胞外泌体和米诺地尔的用量：干细胞外泌体0.1×1012～0.5×1012个/ml用量为3～5ml/次，米诺地尔[男性患者使用规格5％(60ml：3g)，女性患者使用规格2％(100ml:2g)]1～2ml/次，
更优选地，使用印章微针辅助促渗技术，干细胞外泌体和米诺地尔的用量比：干细胞外泌体(0.1×1012～0.5×1012个/ml)用量4ml/次，米诺地尔[男性患者使用规格5％(60ml：3g)，女性患者使用规格2％(100ml:2g)]1ml/次。
优选地，干细胞外泌体为脐带血干细胞外泌体。
优选地，取生长状态良好的P5～P7代脐带血干细胞提取得到的外泌体。
本发明还要求保护任一所述的组合物在制备治疗秃发的产品中的应用。
优选地，所述秃发为雄激素性秃发。
优选地，所述产品通过印章微针辅助促渗技术使用。
印章微针处理后形成的微创伤增加毛囊的血液供应，刺激干细胞，诱导各类生长因子的聚集，从而有利于毛发生长相关基因如VEGF、Wnt10b等表达增加印章微针属于新型的透皮促渗技术，可快速打开皮肤角质层，形成大量直径为纳米级的微孔，突破角质层皮肤屏障，大幅度提高药物的吸收量。通过治疗过程中的观察和患者体验反馈，该项操作接近无痛状态，故操作前无需表面麻醉，治疗过程中均未见头皮出血、丘疹、瘙痒等明显不良反应，较传统激光、滚针技术等造成色素沉着、疤痕的风险亦大大降低。
研究发现，米诺地尔外用系统吸收量仅为所用剂量的0.3～4.5％，头皮组织内米诺地尔浓度一般低于给药量的5％。因此，为了促进外泌体和米诺地尔的吸收效果，本发明采用印章微针微针辅助促渗技术促进药物吸收可以解决该问。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种治疗秃发的组合物，该外泌体来源于人脐带间充质干细胞，富含多种生物活性因子，提取过程简单，使用方便，可长时间运输和储存，可用于雄激素性脱发和非瘢痕性斑秃的治疗。本发明的干细胞外泌体制剂联合米诺地尔效果较单用干细胞外泌体治疗秃发毛发数量增加明显，治疗有效率更高。每周两次采用印章微针辅助促渗技术导入外泌体和米诺地尔酊联合治疗AGA，在治疗周期内促进毛发生长，减少脱发量，操作简单，成本低廉，且不良反应较少，患者接受度高，依从性良好，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为细胞形态观察(40×)。
图2为脐带间充质干细胞表面标记表达检测结果。
图3为western-blot检测外泌体膜表面特征性蛋白CD63表达情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1脐带间充质干细胞外泌体的制备
一、实验方法
1、脐带间充质干细胞分离培养
取15～20cm长的新生儿脐带，要求妇产科健康足月剖腹产胎儿，孕妇HBV 抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、支原体、抗巨细胞病毒抗体等检测均阴性。6h内处理，无菌条件下用PBS洗涤至无血迹，纵向剖开，去除血管后剪碎至1mm×1mm×1mm大小组织块，将0.5ml组织块入75cm2培养瓶中，同时加入10ml无血清完全培养基，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。第 3天半量换液，第7天全量换液，于倒置显微镜下观察，待细胞生长至80％融合时，以0.05％胰蛋酶消化，按1：5传代，取生长状态良好的P5～P7代细胞进行外泌体培养。
2、脐带间充质干细胞检测
1)胰酶，消化3～5min；待显微镜下观察细胞大部分收缩变圆时，加入2mL 含血清的培养基终止消化，吹打细胞并转移至15mL离心管中进行800rpm离心，离心时间为5min；
2)细胞准备：弃掉上清，加入2mLPBS悬浮沉淀，计数细胞；按照每管1×105个密度，将细胞悬液均匀分配至1.5mL的Ep管中，800rpm离心5min；弃上清，沉淀中加入100μL的PBS悬浮；
3)抗体孵育：每管加入对应的流式抗体1μL，避光孵育40min，孵育结束后PBS清洗，离心，最终加入300μLPBS悬浮细胞，以不加任何抗体的人脐带间充质干细胞作为阴性对照，上机操作。
二、实验结果
从脐带中分离的干细胞为多角形或梭型(图1)，细胞折光性强；经流式鉴定，分离的细胞强表达间充质干细胞的表面标记CD29、CD73、CD90阴性表达CD45R 和HLA-DR(图2)，复合间充质干细胞的特征，证实从脐带中分离的细胞为脐带间充质干细胞。
实施例2外泌体体外的制备
一、实验方法
1、外泌体体外培养
将P5～P7代的间充质干细胞胰酶消化后接种，培养基为含10％胎牛血清 DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、5％CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到80～90％时，使用PBS洗涤，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养72小时，收集培养基上清液备用；
2、外泌体收集
取上述培养基上清，300×g离心10min、2 000×g离心20min，然后通过0.45μm滤器过滤去除细胞碎片，收集上清液并以4℃、100 000×g超高速离心90min；弃上清液留取沉淀，用PBS重悬以去除大分子蛋白络合物，超高速重复离心1次，弃上清液，收集外泌体，用PBS重悬每毫升上清液含外泌体 0.1×1012～0.5×1012/EP管分装，-80℃冰箱储存备用。
3、western-blot检测外泌体膜表面特征性蛋白表达
采用外泌体CD63&TSG101蛋白检测试剂盒检测外泌体特征蛋白表达，收集细胞上清和外泌体样品，使用细胞裂解液对样品进行裂解，然后测定每个样品的蛋白浓度。经电液、结膜封闭后分别与CD63、TSG101一抗4℃孵育过夜。次日将膜与HRP标记的二抗室温反应50min，加入化学发光底物显色观察。
二、实验结果
结果如图3所示，结果显示收集的外泌体符合外泌体的特征，表达特征性蛋白CD63。
实施例3脐带间充质干细胞外泌体与米诺地尔酊联用
一、实验方法
S1：准备4ml实施例2制备的外泌体(0.1×1012～0.5×1012个/ml)和1ml米诺地尔酊[男性患者使用规格5％(60ml：3g)，女性患者使用规格2％(100ml:2g)]；
S2：将头皮清洗干净，擦拭酒精消毒；
S3：用印章微针在作用部位以自己能承受的压力滚动5～10次，然后用棉签蘸取外泌体均匀涂抹到相应作用部位，再用滚针滚动5～10次；
S4：喷涂米诺地尔酊在作用部位2～4次，男性患者使用规格5％，女性患者使用规格2％。辅以电动导入仪按摩4～5分钟。
S5：第三或四天晚上循环步骤S1～S4，每周二次。
实施例4治疗脱发使用效果检测
一、实验方法
1、分组实验
招募脱发患者进行志愿者验证，分成3组共60人，每组20人，所有入组患者在病程、年龄方面差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1，A组外泌体联合米诺地尔，使用微针导入(实施例3的方法)；B组米诺地尔[男性患者使用规格5％ (60ml：3g)，女性患者使用规格2％(100ml:2g)]，使用微针导入，每周两次，间隔3或4天；C组外泌体，使用微针导入，每周两次，间隔3或4天。注射前，先将低温储存的外泌体注射液取出复温。志愿者患区拍照，之后再用碘伏擦拭患部2遍后，棉签蘸取生理盐水再擦拭2遍。围绕患区及周边微针导入。注意：微针导入完毕后24h内不能洗头、洗澡，微针导入部位不能接触有刺激性物质。
2、观察比较三组患者治疗前及治疗结束后24周治疗的总有效率。对同一脱发区域1个皮肤镜单位下(1.28cm2)治疗前后的毛发密度进行统计分析。
3、医师疗效评价
于治疗前和治疗24周后由临床经验丰富皮肤科医生在盲态下综合患者治疗前后拍摄照片对比评分，比较头发生长或脱落情况。采用7分法，评分标准如下：明显改善(3分)，中度改善(2分)，轻度改善(1分)，无变化(0)，轻度加重(-1分)，中度加重(-2分)，明显加重(-3分)。
4、安全性评价
记录受试者不良反应，如水肿、红斑、丘疹、瘙痒等。
二、实验结果
1、三组患者年龄构成相比、病程相比，差异无显著性，见表1。
表1:患者一般情况：
Figure RE-GDA0002956954340000061
Figure RE-GDA0002956954340000071
2、治疗24周后，所有受试者毛发密度较治疗前均有增加，且A组患者毛发密度增加最为显著，见表2。
表2：三组患者治疗前后的毛发密度情况比较(根/1.28cm2)
评分标准 例数 治疗前 治疗后
A组 20 54.72±19.36 101.72±16.28
B组 20 59.35±18.57 .82±20.36
C组 20 61.20±21.54 89±19.47
3、医师评价各组平均分情况：A组2.15分、B组1.65分、C组1.85分。三组评分对比，A>C>B，即A组应用外泌体联合米诺地尔酊微针导入治疗、B组应用米诺地尔酊微针导入治疗、C组应用外泌体微针导入治疗，治疗组评比较均有统计学差异。各组脱发明显改善率为：A组35％，B组15％，C组18％(见表1、表2和表3)。
表3：治疗6个月后医师评分：
评分标准 A组n＝20 B组n＝20 C组n＝20
明显改善(3分) 7(35％) 3(15％) 4(20％)
中度改善(2分) 10(50％) 9(45％) 9(45％)
轻度改善(1分) 2(10％) 6(30％) 7(35％)
无变化(0分) 1(5％) 2(10％) 1(5％)
轻度加重(-1分) 0 0 0
中度加重(-2分) 0 0 0
重度加重(-3分) 0 0 0
4、治疗过程中三组患者均未出现明显的不良反应，A组有2例病人分别于治疗第16周和18周出现头皮潮红肿胀，考虑为患者治疗后未满4小时即行洗头发沾水导致，后外用百多邦3天即好转。
综上，外泌体联合米诺地尔使用微针导入疗效显著提高，患者无不良反应，操作简单，适合临床推广。

Claims (10)

1.一种治疗秃发的组合物，其特征在于，包括干细胞外泌体和米诺地尔。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，干细胞外泌体和米诺地尔的用量比例为：每0.3×1012～2.5×1012个/ml干细胞外泌体和米诺地尔0.02～0.04或0.05～1g。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，干细胞外泌体和米诺地尔的用量比例为：每0.4×1012～2×1012个/ml干细胞外泌体和米诺地尔0.02或0.05g。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，对于女性使用者，干细胞外泌体和米诺地尔的用量比例为：每0.4×1012～2×1012个/ml干细胞外泌体和米诺地尔0.02g。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，对于男性使用者，干细胞外泌体和米诺地尔的用量比例为：每0.4×1012～2×1012个/ml干细胞外泌体和米诺地尔0.05g。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，干细胞外泌体为脐带血干细胞外泌体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，取生长状态良好的P5～P7代脐带血干细胞提取得到的外泌体。
8.权利要求1到7任一所述的组合物在制备治疗秃发的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述秃发为雄激素性秃发。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品通过印章微针辅助促渗技术使用。
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