CN110693910A

CN110693910A - 一种具有生发功效的外泌体制备及其应用

Info

Publication number: CN110693910A
Application number: CN201911035068.2A
Authority: CN
Inventors: 董玲娟; 明磊国; 王花
Original assignee: Shaanxi Zhonghong Kerui Institute Of Regenerative Medicine Co Ltd
Current assignee: Shaanxi Zhonghong Kerui Institute Of Regenerative Medicine Co Ltd
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2020-01-17

Abstract

本发明属于再生医学和生物学技术领域，具体涉及一种具有生发功效的外泌体制备及其应用，本发明所提供的具有生发功效的外泌体是选用人脐带间充质干细胞作为外泌体来源，经培养后收集细胞培养液，梯度离心提取而来，富含多种生理活性物质，如RNA和各种蛋白质等，患部皮下注射使用，能有效改善患者脱发情况。

Description

一种具有生发功效的外泌体制备及其应用

技术领域

本发明属于再生医学和生物学技术领域，具体涉及一种具有生发功效的外泌体制备及其应用。

背景技术

近年来脱发人群呈直线上升趋势，且不分性别、年龄及行业，最新数据显示，我国已有2.5亿的脱发人群，平均每6个人中就有一个脱发患者。雄激素性脱发(AR)是常见的脱发类型，是一种激素依赖型脱发，其主要原因是体内雄激素过高，头皮毛囊对二氢睾酮的敏感性增加，导致毛囊萎缩、毛囊微型化、毛干变细变黄，头发变细脱落。临床上常用的用于治疗AR的药物非米诺地尔和非那雄胺莫属。斑秃俗称“鬼剃头”，是一种突发的局限性的脱发，具体发病原因不明，但研究者普遍认为是一种具有遗传素质和环境激发因素的自身免疫病，临床上常用固醇类激素搭配外用米诺地尔使用。无论是雄激素性脱发还是斑秃，虽然现有的药物都有一定的临床效果，但副反应大，停药后仍会复发，因此迫切需要一种能从根本上解决脱发的药物或产品。

间充质干细胞是一种多能干细胞，具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。已有研究显示，MSC注入裸鼠皮下后，一方面能分化为毛囊上皮细胞和毛乳头细胞，归巢位置以毛囊外根鞘和毛乳头处多见，另一方面间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如HGF、FGF、VEGF等，介导细胞间信号转导，修复受损的毛囊，激活毛囊干细胞，帮助毛囊恢复生长周期，促进头发生长。脐带间充质干细胞(UC-MSCs)属于间充质干细胞的一种，免疫原性低、原始性高，取材于临床足月分娩的婴儿脐带，属于医疗废弃物，来源广泛，便于临床推广使用。

MSC分泌微球状细胞外囊泡，可携带和传递重要信号分子，在不同细胞间进行信息传递，形成一种全新的细胞间信息传递系统，参与细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。研究认为，外泌体在干细胞和组织损伤细胞间的信息传递是双向的：即损伤细胞通过外泌体向干细胞传递特异性信息，使干细胞重新设定程序并获得组织特征性的表型；同时，干细胞亦通过外泌体向损伤细胞传递信息，通过上调抗凋亡基因及下调促凋亡基因的表达，抑制损伤细胞的凋亡，促进其再生和修复。间充质干细胞来源的外泌体可以用于治疗多种疾病，例如视网膜病变、肝脏衰竭、皮肤病、肺纤维化等，由于现有技术中间充质干细胞移植存活率低及长期临床应用存在致瘤隐患等不足使得其临床应用受到限制，因此，利用间充质干细胞的外泌体相比利用间充质干细胞治疗操作更加简单、安全有效。

中国专利CN 105769911A《间充质干细胞诱导斑秃处毛发再生的方法及应用》中将鉴定成功的间充质干细胞制成一定浓度的细胞悬液，注射进入斑秃患处，以期达到诱导斑秃处毛发再生的目的。但这种干细胞悬液需要现用现配，不能长时间保存及运输，且对注射细胞的数量及状态有严格的要求，否则会影响最终的使用效果，因此在使用上有一定的限制性。为了解决上述问题，克服干细胞长期使用存在的致瘤等隐患，本发明提供了一种具有生发功效的外泌体，该外泌体来源于人脐带间充质干细胞，富含多种生物活性因子，提取过程简单，使用方便，可长时间运输和储存，可用于雄激素性脱发和非瘢痕性斑秃的治疗。

发明内容

本发明的目的在于，提供了具有生发功效的外泌体制备及其应用，其将人脐带间充质干细胞干细胞扩大化培养后收集细胞培养液，经低温超速离心后获得外泌体，使用时进行皮下注射，用于治疗雄激素性脱发及斑秃。

为了解决上述问题，本发明提供了一种具有生发功效的外泌体制备及其应用，包括以下步骤：

1)人脐带间充质干细胞的原代分离：无菌采集临床健康的足月产婴儿脐带，脐带两端结扎后置于脐带组织储运液中，1h内低温运输至实验室。用含双抗的缓冲液充分清洗脐带，沿血管生长方向剪开脐带，剥离脐静脉和脐动脉后分离得到华通氏胶。将华通氏胶剪碎后，蘸取血清，贴附于一次性细胞培养皿中，4-6h后补加细胞培养基，间隔3d换液。

优选的，脐带组织储运液为含1％-10％(V/V)青链霉素的α-MEM培养基；

优选的，含双抗的缓冲液为含1％-5％(V/V)青链霉素的生理盐水缓冲液；

优选的，剪碎后华通氏胶大小为1-3mm³为宜，轻轻蘸取胎牛血清，将组织块贴附于细胞培养皿中，并放置在37℃，5％CO₂培养箱培养；

优选的，4-6h后补加的细胞培养基为含10％-15％FBS的α-MEM培养基。

2)人脐带间充质干细胞的培养与鉴定：待组织块附近有大量的细胞爬出后，移除组织块，PBS清洗后，加入消化液消化，最终按照1：2-1:4的比例传代扩大。待细胞生长至P3-P5代时，加入流式抗体后进行细胞表面标记物鉴定。

优选的，消化液为不含EDTA的0.25％的胰蛋白酶消化液，消化时间控制在3-5min；

优选的，流式鉴定时，选定的表面分子标记物为CD29、CD73、CD45R、CD90及HLA-DR。

3)人脐带间充质干细胞的上清液收集：选用鉴定成功的P2-P10代的生长状态良好的人脐带间充质干细胞，每一代次细胞消化后，用常规培养基(10％FBS+90％α-MEM)培养至生长密度达到80％-85％时，弃掉原有培养基，PBS清洗两遍后，加入无血清培养基培养48-72h，之后无菌收取细胞培养上清，过滤除菌后，收滤过液，-20℃低温保存。

优选的，无血清培养基为不含胎牛血清的α-MEM培养液；

优选的，获得的培养上清需经过0.22μm的无菌滤膜过滤，收集滤液。

4)外泌体的提取：将步骤3)得到的无菌细胞培养上清，在低温条件下高速离心后，弃上清，留沉淀；沉淀中加入少量等渗液体，混匀后得到人脐带间充质干细胞外泌体注射液。

优选的，离心条件为4℃条件下，12000-20000×g离心1-2h；

优选的，为了便于后期注射使用，离心后的沉淀用注射用0.9％氯化钠注射液悬浮；

优选的，获得的外泌体注射液为无色透明状液体，短期内使用可保存在2-8℃，若短期内不使用可在-20℃长期保存。

5)外泌体的注射：注射前需要对头皮患部进行75％酒精或碘伏消毒处理，待外泌体注射液恢复至室温后行患区皮下注射，可多点注射，注射频率为一个月两次。

本发明提供的一种具有生发功效的外泌体，可长时间保存，使用时复温，皮下注射即可。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的一种具有生发功效的外泌体制备，是将人脐带间充质干细胞经过扩大化培养后收集细胞培养上清，低温高速离心后获得外泌体沉淀，再用生理盐水悬浮，得到外泌体注射液，用于治疗脱发。

2、本发明提供的一种具有生发功效的外泌体，富含多种生物活性因子和蛋白质，提取过程简单，使用方便，具有长期保存的优势。

3、本发明提供的一种具有生发功效的外泌体，其用于治疗Ⅰ-Ⅳ级雄激素性脱发和非瘢痕性斑秃，疗效好。

附图说明

图1是获得的人脐带间充质干细胞示意图；

图2是流式细胞术鉴定人脐带间充质干细胞表面标志示意图；

图3是志愿者治疗前后效果示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：脐带间充质干细胞的分离与培养

1.组织接收：经咨询同意后，与婴儿家属签订《知情书及同意书》，无菌采集健康足月分娩的婴儿脐带，脐带两端结扎后，迅速放置在无菌储运液中，密封保存，1h内尽快送达实验室；

2.组织处理：在超净工作台内，将接收的脐带组织取出，放入培养皿中，测量组织长度与宽度。测量完毕后，生理盐水清洗2遍，之后用无菌剪刀将脐带剪成约3cm的小段，沿脐带内血管生长方向将脐带剖开，剔除脐静脉和脐动脉，获得华通氏胶；

3.组织贴壁：将华通氏胶用生理盐水清洗两遍后，剪碎切成1mm³的小块，轻轻夹起组织小块，蘸取少量血清，并贴附于一次性细胞培养皿中，待组织小块铺满皿底后，将培养皿转移入37℃，5％CO₂培养箱中培养6h；6h后补加细胞培养液继续培养，间隔3d换液一次；

4.原代细胞获得与传代培养：隔日观察组织块细胞爬出情况，待组织块附近有大量细胞附着时，移除组织块，加入PBS清洗培养皿表面，加入0.25％胰蛋白酶消化液，37℃消化5min，终止消化，吸取消化悬液，800rpm离心5min，弃上清，留沉淀，加适量细胞培养液悬浮后接种于T75培养瓶中培养；

5.流式鉴定：

1)细胞消化：弃掉培养瓶内液体，瓶内加入5ml的PBS清洗两遍后，再加入3ml的0.25％胰酶，消化3-5min；待显微镜下观察细胞大部分收缩变圆时，加入2mL含血清的培养基终止消化，吹打细胞并转移至15mL离心管中进行800rpm离心，离心时间为5min；

2)细胞准备：弃掉上清，加入2mLPBS悬浮沉淀，计数细胞；按照每管1*10⁵个密度，将细胞悬液均匀分配至1.5mL的Ep管中，800rpm离心5min；弃上清，沉淀中加入100uL的PBS悬浮；

3)抗体孵育：每管加入对应的流式抗体1uL，避光孵育40min，孵育结束后PBS清洗，离心，最终加入300uLPBS悬浮细胞，以不加任何抗体的人脐带间充质干细胞作为阴性对照，上机操作。

结果：从脐带中分离的干细胞为多角形或梭型(图1)，细胞折光性强；经流式鉴定，分离的细胞强表达间充质干细胞的表面标记CD29、CD73、CD90阴性表达CD45R和HLA-DR(图2)，复合间充质干细胞的特征，证实从脐带中分离的细胞为脐带间充质干细胞。

实施例2：脐带间充质干细胞来源的外泌体治疗脱发

招募脱发患者进行志愿者验证，每个月2次，间隔15d。注射前，先将低温储存的外泌体注射液取出复温。志愿者患区拍照，之后再用碘伏擦拭患部2遍后，棉签蘸取生理盐水再擦拭2遍。围绕患区周边行皮下多点注射。注意：注射完毕后24h内不能洗头、洗澡，注射部位不能接触有刺激性物质。

结果：志愿者验证者分别在注射后有不同效果的改善，患区均有新生头发长出，雄激素性脱发患者在注射后患区头发变多，斑秃患者患区面积缩小(图3)。

Claims

1.一种具有生发功效的外泌体制备，包括人脐带间充质干细胞的原代分离与培养、上清液收集和外泌体提取三个步骤，其特征在于：

步骤一：所述人脐带间充质干细胞的原代分离与培养分为以下步骤：

1)无菌采集临床健康的足月产婴儿脐带，用含双抗的缓冲液清洗后分离得到华通氏胶，组织块贴壁培养法获得原代脐带间充质干细胞；

2)脐带间充质干细胞常规培养至细胞密度为85％-90％时，消化液消化，按照1:2-1:4的比例传代扩大；

步骤二：所述的上清液收集包括以下步骤：

1)选用P2-P10代之间的细胞，常规培养基培养至细胞密度达到80-85％时，换无血清培养基饥饿培养；

2)无菌收取细胞培养上清，过滤除菌后，-20℃低温保存。

步骤三：所述外泌体的提取包括以下步骤：

1)将步骤二得到的无菌细胞培养上清，经低温高速离心(12000-2000×g)后，弃上清，留沉淀；

2)获得的沉淀中加入生理盐水，混匀后得到人脐带间充质干细胞外泌体注射液。

2.根据如权利要求1所述的一种具有生发功效的外泌体制备，其特征在于：步骤一中所述的华通氏胶需要脐带组织在含双抗的生理盐水中清洗至少2次后，剥离脐静脉和脐动脉后所得。

3.根据如权利要求1所述的一种具有生发功效的外泌体制备，其特征在于：步骤一中所述的组织块贴壁培养法，其具体是将清洗干净的华通氏胶剪碎成1-3mm³后，无菌蘸取血清，贴壁于无菌培养皿中，37℃，5％CO₂培养箱中放置4-6h后补加细胞培养基，间隔3天换液。

4.根据如权利要求1所述的一种具有生发功效的外泌体的制备，其特征在于：步骤一中所述的胰蛋白酶消化液为不含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液，消化时间为3-5min。

5.根据如权利要求1所述的一种具有生发功效的外泌体的制备，其特征在于：步骤二中所述的细胞饥饿培养，具体为：选用P2-P10代的人脐带间充质干细胞，每一代次细胞消化后，用常规培养基(10％FBS+90％α-MEM)培养至生长密度达到80％-85％时，弃掉原有培养基，PBS清洗两遍后，加入无血清培养基培养48h，其中无血清培养基为不含FBS的α-MEM细胞培养液。

6.根据如权利要求1所述的一种具有生发功效的外泌体的制备，其特征在于：步骤二中所述的细胞培养上清的收集，其收集后需要经过0.22μm滤膜过滤除菌后才可进行步骤三外泌体的提取。

7.根据如权利要求1所述的一种具有生发功效的外泌体的制备，其特征在于：步骤三中所述的沉淀的获得，具体条件为无菌培养上清在4℃条件下经过12000-20000×g离心1-2h获得。

8.根据如权利要求1所述的一种具有生发功效的外泌体的应用，其特征在于：步骤三中所述的外泌体注射液可直接用于患区皮下注射，一个月两次，多点注射，用于改善雄激素性脱发和斑秃，效果好。

9.根据如权利要求8所述的一种具有生发功效的外泌体的应用，其特征在于：所述的能改善的雄激素性脱发的等级为Ⅰ-Ⅳ级，斑秃为非瘢痕性斑秃。