CN112891295A - 一种外泌体漱口水及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及口腔溃疡药物技术领域，具体来说是一种外泌体漱口水及其制备方法和应用，外泌体漱口水由如下重量百分比的原料制成：间充质干细胞外泌体溶液95‑97％，维生素B₂1.5‑2.5％，利多卡因1.5‑2.5％，本发明采用脐带间充质干细胞提取出来的间充质干细胞外泌体溶液、复配维生素B₂和利多卡因，能够提高间充质干细胞外泌体的黏附效果，有效改善口腔局部微环境，缩短口腔粘膜组织修复的时间。

Description

一种外泌体漱口水及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及口腔溃疡药物技术领域，具体来说是一种外泌体漱口水及其制备方法和应用。

背景技术

口腔溃疡在临床上十分常见，也被称作是“口疮”，患有该病症后患者在临床上表现出食欲下降、充血溃疡以及局部肿痛等不良症状，该病症复发率较高且不易恢复，若长时间治疗效果较差，将可能会诱发慢性溃疡，甚至是影响到患者正常的饮食及表达功能，情况严重者还可能有诱发癌前病变，甚至损害到患者生命安全。

口咽部是连接口腔、鼻咽与下呼吸道、食道等的通道，与外界环境相通，是很多细菌侵入下呼吸道和肺部并引起感染的生理部位。就人体微观生态认识的一般规律而言，在人体健康情况下，寄居于口咽部的核心菌群组合，在和谐的生理范围内波动，构成口咽部抵御外部环境变化的一道重要的微生物屏障，所以口咽部菌群对于下呼吸道感染非常重要。

间充质干细胞能够分泌许多细胞因子，例如肝细胞生长因子(HGF)、神经细胞生长因子(NGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、集落形成刺激因子(CSF)和白介素IL1-19，表皮细胞生长因子能够快速促进口腔粘膜的修复，而MSC外泌体的旁分泌作用不仅局限于直接释放细胞因子，同样依赖于其释放的外泌体。

外泌体内含有各种蛋白质、脂类和mRNA、miRNA、DNA片段等遗传物质，细胞间可以通过外泌体交换信息、相互作用，且免疫排斥风险较低，在各种病理状态及炎症反应中发挥着重要的作用，外泌体作为细胞与细胞之间通讯的介质成分，以旁分泌、远距分泌的形式在细胞间传播生物信息，在生理及病理状态下发挥重要的调控作用。MSC外泌体内具有生物学活性的分子，如蛋白质、DNA、RNA等成分与含量并非是作为一个特定静止的群体存在，而是会随着与细胞状态、培养环境、提取纯化步骤、细胞来源等多种条件的改变而呈动态变化。

现有技术的治疗口腔溃疡药物中抗生素使用频率最高，虽然抗生素有利于降低细菌繁殖量，充分发挥消毒杀菌效果，但是长期使用会影响口腔的正常菌群失调，长期以往会降低人体免疫力，增加细菌入侵的危害。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供了一种外泌体漱口水及其制备方法和应用，本发明采用脐带间充质干细胞提取出来的间充质干细胞外泌体溶液、复配维生素B₂和利多卡因，能够提高间充质干细胞外泌体的黏附效果，有效改善口腔局部微环境，缩短口腔粘膜组织修复的时间。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种外泌体漱口水，由如下重量百分比的原料制成：间充质干细胞外泌体溶液95-97％，维生素B₂1.5-2.5％，利多卡因1.5-2.5％。

优选的，由如下重量百分比的原料制成：间充质干细胞外泌体溶液95-96％，维生素B₂1.7-2.2％，利多卡因1.8-2.3％。

优选的，由如下重量百分比的原料制成：间充质干细胞外泌体溶液96％，维生素B₂2％，利多卡因2％。

本发明还保护了一种外泌体漱口水中维生素B₂和间充质干细胞外泌体的组合在制备增强病原体引起的口腔溃疡修复制剂中的应用。

优选的，所述间充质干细胞外泌体溶液按照如下步骤制备：

S1、取样：于无菌状态下将离体脐带组织，清洗后剔除组织内动脉以及静脉血管，剥离组织内的华通氏胶，得到组织块样品；

S2、贴壁培养：将步骤S1的组织块样品置于体积分数为10％FBS的α-MEM培养基内，于37℃、5％CO₂条件下培养12-15d，得到贴壁细胞；

S3、传代培养：对步骤S2的贴壁细胞进行传代培养，得到细胞上清液：

S4、提取外泌体：将步骤S3的细胞上清液离心后除菌过滤，得间充质干细胞外泌体溶液。

优选的，所述间充质干细胞外泌体溶液中外泌体浓度为0.1-0.3mg/mL。

优选的，所述步骤S1的清洗方法为：采用体积分数为含1％双抗的PBS洗涤，洗去离体脐带组织内血渍。

优选的，所述步骤S3的传代培养方法为：弃去步骤S2的细胞上清液，采用体积分数为含1％双抗的PBS洗涤细胞，之后加入10mL胰蛋白酶至液体变为白色，再加入15mL体积分数为10％FBS的α-MEM培养基，于1000r/min条件下离心5min，再按照1.6×10⁶接种密度接种至无血清的α-MEM培养基培养内，于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养72h后，再次进行细胞传代处理，收集细胞上清液。

优选的，所述步骤S4的离心条件为：将步骤S3的细胞上清液于2000g/min条件下离心10min。

本发明还保护了一种外泌体漱口水的制备方法，包括如下步骤：

S1、称量：按照如下重量百分比称取原料：间充质干细胞外泌体溶液95-97％，维生素B₂1.5-2.5％，利多卡因溶液1.5-2.5％，备用；

S2、将间充质干细胞外泌体溶液、利多卡因和维生素B₂混合均匀，得到外泌体漱口水。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

(1)目前市售的常用口腔溃疡治疗的药物，例如采用甲硝唑能够杀灭口腔内G⁺、G^-厌氧菌且具有收敛作用，虽然在治疗上有较好的效果，但其镇痛作欠佳，经治疗后多易复发，而且不良反应较多；因大部分抗生素长期使用会引起口腔内部的正常菌群失调。

(2)本发明主要针对免疫力下降使机体受到病原体的侵袭，使口腔的免疫平衡状态被破坏，导致口腔溃疡发生的人群。本发明的漱口水与传统漱口水对比，具有简易、安全、速效、依从性高等优点，不小心发生少量吞咽现象也无妨，本次试验在于探究漱口水治疗口腔溃疡的疗效，以期得到更有效的治愈口腔溃疡的药物；利多卡因能增强外间充质干细胞外泌体抗炎能力，降低炎症因子水平，减轻病患口腔粘膜组织疼痛感，维生素B₂能改善口腔局部微环境，能提高间充质干细胞外泌体的黏附效果，缩短口腔粘膜组织修复的时间。

(3)本发明与传统治疗方案进行了对比，具体为口腔溃疡的疗效、疗程和溃疡面大小，通常直径＜3mm者能够在3天内痊愈，直径≥3mm者需3-4天可痊愈；能够有效缓解患者疼痛程度，有助于患者正常饮食，早日康复；还能够有效促进上皮细胞再生，根据患者实际情况补充营养，增强患者饮适量，加快溃疡面愈合。

附图说明

图1为使用本发明实施例3制得的漱口水之后的前后创面对照图；

图2为本发明实施例1的脐带来源间充质干细胞扩增状态图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，用以较佳的实施例及附图配合详细的说明。

实施例1

一种外泌体漱口水的制备方法，包括如下步骤：

(1)间充质干细胞外泌体溶液的制备：

S1、取样：于无菌状态下取离体的脐带组织，采用体积分数为1％双抗PBS洗涤，洗去离体脐带组织内的血渍后剔除组织内动脉以及静脉血管，剥离组织内的华通氏胶，至脐带组织的HBV、EBV、HIV和CMV检测结果合格，剪碎至1mm³，得到组织块样品；

S2、贴壁培养：将步骤S1的组织块样品贴壁培养，将组织块样品于15mL体积分数为10％FBS的α-MEM培养基内，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养12-15d，得到贴壁细胞；

S3、传代培养：弃去步骤S2的细胞上清液，采用体积分数为含1％双抗的PBS洗涤细胞，双抗包括青霉素和链霉素，之后加入10mL胰蛋白酶至液体变为白色，再加入15mL体积分数为10％FBS的α-MEM培养基，于1000r/min条件下离心5min，再按照1.6×10⁶接种密度接种至无血清的α-MEM培养基培养内，于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养72h后再次进行细胞传代处理，收集细胞上清液，得到细胞上清液：

S4、提取外泌体：将步骤S3的细胞上清液于2000g/min条件下离心10min后除菌过滤，得间充质干细胞外泌体溶液，经BCA蛋白浓度检测试剂盒检测，所述间充质干细胞外泌体溶液中外泌体浓度为0.1mg/mL；

(2)外泌体漱口水的制备方法，包括如下步骤：

S1、称量：按照如下重量百分比称取原料：间充质干细胞外泌体溶液95％，维生素B₂2.5％，利多卡因2.5％，备用；

S2、将间充质干细胞外泌体溶液、利多卡因和维生素B₂混合均匀，得到外泌体漱口水。

实施例2

与实施例1的制备步骤相同，不同之处仅在于，将原料配比替换为间充质干细胞外泌体溶液96％，维生素B₂1.7％，利多卡因2.3％，所述间充质干细胞外泌体溶液中外泌体浓度为0.2mg/mL。

实施例3

与实施例1的制备步骤相同，不同之处仅在于，将原料配比替换为间充质干细胞外泌体溶液96％，维生素B₂2％，利多卡因2％，所述间充质干细胞外泌体溶液中外泌体浓度为0.3mg/mL。

实施例4

与实施例1的制备步骤相同，不同之处仅在于，将原料配比替换为间充质干细胞外泌体溶液96％，维生素B₂2.2％，利多卡因1.8％，所述间充质干细胞外泌体溶液中外泌体浓度为0.3mg/mL。

实施例5

与实施例1的制备步骤相同，不同之处仅在于，将原料配比替换为间充质干细胞外泌体溶液97％，维生素B₂1.5％，利多卡因1.5％，所述间充质干细胞外泌体溶液中外泌体浓度为0.2mg/mL。

对比例1

0.9wt％的生理盐水。

对比例2

与实施例3等量的间充质干细胞外泌体溶液，用0.9wt％的生理盐水补足100％。

对比例3

与实施例3等量的维生素B₂和利多卡因，用0.9wt％的生理盐水补足100％。

对比例4

与实施例3的制备步骤相同，不同之处仅在于，将原料配比替换为间充质干细胞外泌体溶液95％，维生素B₂5％。

本发明实施例1-实施例5均制得了对病原体引起的口腔溃疡问题具有优异的疗效的外泌体漱口水，且效果平行，下面以实施例3的样品进行针对性研究，具体研究方法如下：

(1)疗效研究：

复发性口腔溃疡以灼痛为突出特征，好发于唇、舌、软腭等部位，外观为单个或者多个大小不一的圆形或椭圆形溃疡，直径5-10μm，表面覆盖灰白或黄色假膜，中央凹陷，边界清楚，周围黏膜红而微肿；具有周期性、复发性、自限性的特征，年龄不拘，女性较多，一年四季均能够发生，且能够在1-2周自愈，不留瘢痕。

本发明选取口腔溃疡患者120人，按照干预方式不同随机分为观察组和对照组，其中观察组60人，对照组60人，给予观察组人群早晚各一次本发明漱口水漱口，给予对照组人群早晚各一次0.9％氯化钠注射液漱口；

使用方法：口腔护理前后30min内禁止饮食饮水，先口腔内含10mL漱口水，鼓动冲洗口腔各部位，闭口鼓腮反复此动作，2分钟后吐出，漱口后不需要用清水再冲洗，早晚各一次；连续使用10天，以溃疡面红斑消失、患者正常饮食为标准，如果溃疡面红斑消失可提前停止使用。

对比观察两组患者治疗效果，经过治疗后，判定标准为：

显效：患者溃疡面完全消失，疼痛、红斑均消失，并且患者正常饮食；

有效：患者溃疡面基本消失，疼痛、红斑等减轻，仍需注意饮食；

无效：经治疗后，患者溃疡面未见减少，疼痛、红斑等情况未见明显好转，仍不可正常饮食。

在经过治疗后发现，观察组患者口腔溃疡治疗有效率达到96.66％，高于对照组70％，治疗效果见表1；

表1观察组和对照组的治疗效果对比研究

经治疗及护理后，观察组患者口腔溃疡愈合时间、正常饮食时间及疼痛消失时间均明显早于对照组患者，溃疡愈合时间、正常饮食时间和疼痛消失时间对照见表2：

表2两组患者溃疡愈合时间、正常饮食及疼痛消失时间比较

组别	溃疡愈合时间(d)	正常饮食时间(d)	疼痛消失时间(d)
				观察组	3.85±1.34	2.55±0.44	2.36±0.98
对照组	7.37±0.12	4.12±0.96	4.12±0.12

使用外泌漱口水的溃疡愈合时间、正常饮食时间及疼痛消失时间均明显短于对照组患者，说明本发明制得的外泌漱口水短时高效，有效减轻患者痛苦时间。

(2)漱口水对比研究：

本次研究选取口腔溃疡患者50例，纳入标准：①临床诊断确诊为口腔溃疡；②患者同意本次研究且签署知情同意书；排除标准：

排除口腔恶性疾病、免疫系统疾病患者；两组患者一般资料具有可比性(P>0.05)，分为5组，具体如下：

对比例1的空白对照组，10人，早晚仅用生理盐水进行漱口；

对比例2的实验1组，10人，早晚用间充质干细胞外泌体溶液漱口；

对比例3的实验2组，10人，早晚用维生素+利多卡因漱口；

对比例4的实验3组，10人，早晚用维生素+间充质干细胞外泌体溶液；

实施例3的实验4组，10人，早晚用间充质干细胞外泌体溶液+维生素B₂+利多卡因漱口；

连续使用10天，随后几天观察患者创面的疼痛度，创面大小，是否红肿，愈合时间来判断作用效果。

对比观察几组患者治疗效果，经过治疗后，判定标准为：

显效：疼痛度>2天，创面大小>1mm²,充血天数>1天，愈合天数>4天；

有效：疼痛度>3天，创面大小>1mm²,充血天数>2天，愈合天数>5天；

无效：疼痛度>5天，创面大小>1mm²,充血天数>3天，愈合天数>10天；

表3不同漱口水研究效果对照表

表4治疗前后炎症因子的变化情况对比

IL-1是机体内炎症介质，可有效致热；IL-6是机体内炎症递质，可有效促进炎症反应的释放；IL-8即中性粒细胞因子，在抗肿瘤、抗感染及调节免疫反应中具有重要的作用；可用于评估患者预后。

实验3组与空白对照组和实验1组相比，结果表明，外泌体漱口水中维生素B₂和间充质干细胞外泌体溶液的组合能够增强病原体引起的口腔溃疡问题；另外，以上实验对比得出，联合使用间充质干细胞外泌体溶液+维生素B₂+利多卡因漱口水，恢复速度快，愈合时间短，治疗效果最好。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种外泌体漱口水，其特征在于，由如下重量百分比的原料制成：间充质干细胞外泌体溶液95-97％，维生素B₂1.5-2.5％，利多卡因1.5-2.5％，上述原料的重量百分比之和为100％。

2.根据权利要求1所述的一种外泌体漱口水，其特征在于，由如下重量百分比的原料制成：间充质干细胞外泌体溶液95-96％，维生素B₂1.7-2.2％，利多卡因1.8-2.3％，上述原料的重量百分比之和为100％。

3.根据权利要求1所述的一种外泌体漱口水，其特征在于，由如下重量百分比的原料制成：间充质干细胞外泌体溶液96％，维生素B₂2％，利多卡因2％。

4.根据权利要求1所述的一种外泌体漱口水中维生素B₂和间充质干细胞外泌体的组合在制备增强病原体引起的口腔溃疡修复制剂中的应用。

5.根据权利要求1所述的一种外泌体漱口水，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体溶液按照如下步骤制备：

S1、取样：于无菌状态下将离体脐带组织清洗后剔除组织内动脉以及静脉血管，剥离组织内的华通氏胶，得到组织块样品；

S2、贴壁培养：将步骤S1的组织块样品置于体积分数为10％FBS的α-MEM培养基内，于37℃、5％CO₂条件下培养12-15d，得到贴壁细胞；

S3、传代培养：对步骤S2的贴壁细胞进行传代培养，得到细胞上清液：

S4、提取外泌体：将步骤S3的细胞上清液离心后除菌过滤，得间充质干细胞外泌体溶液。

6.根据权利要求5所述的一种外泌体漱口水，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体溶液中外泌体浓度为0.1-0.3mg/mL。

7.根据权利要求5所述的一种外泌体漱口水，其特征在于，所述步骤S1的清洗方法为：采用体积分数为含1％双抗的PBS洗涤，洗去离体脐带组织内血渍。

8.根据权利要求5所述的一种外泌体漱口水，其特征在于，所述步骤S3的传代培养方法为：弃去步骤S2的细胞上清液，采用体积分数为含1％双抗的PBS洗涤细胞，之后加入10mL胰蛋白酶至液体变为白色，再加入15mL体积分数为10％FBS的α-MEM培养基，于1000r/min条件下离心5min，再按照1.6×10⁶接种密度接种至无血清的α-MEM培养基培养内，于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养72h后，再次进行细胞传代处理，收集细胞上清液。

9.根据权利要求5所述的一种外泌体漱口水，其特征在于，所述步骤S4的离心条件为：将步骤S3的细胞上清液于2000g/min条件下离心10min。

10.根据权利要求1-9任一项所述的一种外泌体漱口水的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、称量：按照如下重量百分比称取原料：间充质干细胞外泌体溶液95-97％，维生素B₂1.5-2.5％，利多卡因溶液1.5-2.5％，备用；

S2、将间充质干细胞外泌体溶液、利多卡因和维生素B₂混合均匀，得到外泌体漱口水。

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