CN115337260B - 复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶及其用途，该水凝胶由透明质酸和温敏水凝胶混合而成，其中，所述温敏水凝胶的制备方法是取哺乳动物小肠黏膜下层组织，经脱细胞后得到脱细胞小肠黏膜下层组织，再经冷冻干燥、研磨、消化后得到温敏水凝胶。该复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶在间质性膀胱炎或膀胱痛综合征的治疗上效果很好，可用于制备该疾病的治疗药物。

Description

复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶及其用途

技术领域

本发明涉及温敏水凝胶制备技术领域，具体涉及一种复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶及其用途。

背景技术

水凝胶由于良好的药物缓释作用广泛用于医疗领域。温度敏感性水凝胶(temperature sensitivity hydrogel)可受温度变化影响而产生体积变化进而发生溶胶-凝胶转变(sol-gel phase transition)，对于生物材料中细胞因子和药物的控制缓释具有重要应用价值。根据温敏结构的不同，温敏性水凝胶可分为负温敏性水凝胶和正温敏性水凝胶。负温敏水凝胶的重要特征是在低临界溶液温度(lower critical solutiontemperature,LCST)以下是溶液，在LCST以上形成凝胶。因此可以在低温下保持为自由流动的溶液，灌注进入生物体内后由于体温升高形成凝胶，缓慢释放药物。但传统温敏材料如N-异丙基丙烯酰胺，纤维素，壳聚糖，泊洛沙姆等，分别存在着生物相容性差、LCST较高、机械强度低、温度响应慢，生物降解性差等缺点。

从天然材料中提取的脱细胞基质水凝胶通常具有良好的生物相容性、生物降解性、低免疫反应性和生物活性，因此引起了人们的极大兴趣。其中小肠黏膜下层(Smallintestinal submucosa，SIS)是一种很有前途的脱细胞基质材料，目前广泛应用于实验及临床。SIS由胶原、蛋白多糖、糖蛋白和多种生长因子组成，包括血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)和表皮生长因子(EGF)。它已被FDA批准用于疝修补术、膀胱成形术、输尿管重建、压力性尿失禁等。最近基于SIS的水凝胶也已经被开发和商业化，被用于药物递送、心肌细胞保护、胃溃疡修复、创面愈合等领域。

目前采用小肠黏膜下层制备的水凝胶制备过程中加入较多化学试剂使产品在使用时受到影响，生物相容性较差。另外对于水凝胶制剂的用途开发也有限。

发明内容

本发明针对现有技术中的上述不足，提供一种复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，无需交联剂，具有温敏特性，生物相容性好，温敏水凝胶能够起到很好的药物控释效果。

本发明技术方案详述如下：

一种复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，由透明质酸和温敏水凝胶混合而成。

可选或优选的，上述复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，所述温敏水凝胶的制备方法如下：

取哺乳动物小肠黏膜下层组织，剪碎浸泡在生理盐水中-80℃冷冻，再置于4℃溶解，加入含SDS的PBS中摇床脱细胞，脱细胞后的组织用CHAPS水溶液洗涤，再用Triton X-100水溶液洗涤，最后用去离子水清洗，得到脱细胞小肠黏膜下层组织；

脱细胞小肠黏膜下层组织经-80℃冷冻，再抽真空冷冻干燥，加入0.01M盐酸水溶液研磨至无肉眼可见颗粒得脱细胞小肠黏膜下层组织液，加入胃蛋白酶消化后置于4℃环境调节pH值至7.2-7.4，加入PBS调节渗透压至等渗，得到温敏水凝胶。

透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又称玻尿酸，是一种直链的天然多糖，是唯一一种由交替的(1-4)-βD-葡萄糖醛酸和(1-3)-βN-乙酰-D-氨基葡萄糖单元组成的非硫化酶解糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)，分子量可达50万至400万道尔顿，链长为10000nm。它本身不具有凝胶、韧性等机械性能。

上述温敏水凝胶无需添加任何其他温敏材料，如壳聚糖、N-异丙基丙烯酰胺、纤维素、泊洛沙姆等，即可呈现室温下为液态、37℃后逐渐成凝胶体的状态，生物相容性非常好。另外，也无需任何化学交联剂就能够很好地负载透明质酸，可延长透明质酸在作用部位滞留时间。该温敏水凝胶对温度敏感，生物相容性好，残留少，抑菌能力强。

可选或优选的，上述复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，所述摇床脱细胞步骤使用的PBS中SDS的含量为0.01％(w/v，质量/体积)，脱细胞时间为24小时。

可选或优选的，上述复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，所述CHAPS水溶液中CHAPS的含量为7％(w/w，质量/质量)，pH值7.2-7.4，CHAPS水溶液洗涤时间48小时。

CHAPS，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，是一种非变性两性离子洗涤剂。

可选或优选的，上述复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，所述Triton X-100水溶液中Triton X-100的含量为1％(v/v，体积/体积)，Triton X-100水溶液洗涤时间30分钟。使用Triton X-100水溶液能够更彻底地洗去细胞成分。

可选或优选的，上述复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，所述去离子水清洗的方式为每20分钟清洗一次，共清洗40次。去离子水多次清洗能够有效去除残存的洗涤剂。

可选或优选的，上述复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，所述胃蛋白酶与脱细胞小肠黏膜下层组织液的质量比为1:10，消化温度25℃，消化时间48小时。

可选或优选的，上述复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，所述透明质酸的终浓度为0.8mg/mL，所述温敏水凝胶的终浓度为10mg/mL。

以上任一所述的复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶在制备间质性膀胱炎或膀胱痛综合征的治疗药物的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明温敏水凝胶的制备采取一系列的化学、物理和酶解的方法对新鲜兔肠黏膜下层进行脱细胞处理，同时最大限度地减少对天然ECM生化和结构特性的破坏。将未脱细胞组织和脱细胞组织两组样品进行DNA残留、外基质糖胺聚糖(GAGs)和胶原(Col)含量检测，与脱细胞前比较，肠黏膜组织在脱细胞后DNA残留几乎为0，GAGs含量和胶原含量无显著变化，表明其符合脱细胞材料的要求，而细胞成分的去除对于降低排斥风险尤为重要。经细胞增殖毒性检测实验显示该温敏水凝胶和复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶都具有很好的生物相容性，且抑菌效果好。

2、本发明的温敏水凝胶增加药物在膀胱腔内的滞留时间，HA-Gel-RhB组的HA含量在第3天、第5天均明显高于对照组、HA组。以上实验结果表明复合HA温敏水凝胶不仅使HA在膀胱腔内缓慢释放至少长达5天，而且使HA在膀胱腔内浓度高于单纯灌注HA，有效解决尿液冲刷导致HA在膀胱腔内停留时间较短的问题。

3、本发明的温敏水凝胶在体内可以保持足够的结构完整性，进而作为药物仓库，但在体内停留的时间不会过长，实验显示第5天的凝胶残留量少于第3天，凝胶会随灌注时间的延长在体内逐渐随尿液冲刷流失，避免温敏水凝胶多次灌注后在膀胱腔内凝胶积聚从而导致尿路阻塞及膀胱容量减少等不良事件的发生。

4、本发明的复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶在室温状态下即25℃下凝胶为液态，利于灌注到膀胱腔内，而进入膀胱后，随着温度升至37℃，约5-10分钟左右，凝胶从液体状转换为凝胶状附着于膀胱壁内，此凝胶体积相转换时间较短可避免HA灌药便从液态凝胶中突然释放而大量浪费。

5、该复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶在15-50℃间时，随着温度的升高，水凝胶溶胀率随温度升高而降低，至低临界温度约37.5℃时(即人体体温时)，水凝胶相变呈固体，水分直接析出，体积骤降，这一特性能够在膀胱腔内大大减少因水凝胶体积过大造成梗阻甚至影响膀胱正常功能的风险。

附图说明

图1为实施例1中小肠黏膜下层组织脱细胞前、脱细胞后以及最终制成的温敏凝胶实物展示；

图2为实施例1中GEL和HA-GEL不同温度下的凝胶状态；

图3为实施例1中GEL和HA-GEL不同温度下的溶胀率；

图4为实施例1中小肠黏膜下层组织脱细胞前、脱细胞后DNA、GAGs、Col含量变化；

图5为实施例1中各组骨髓间充质干细胞不同时间活性变化；注：数据分析采用t-test，**P＜0.01表示有统计学差异。

图6为实施例1中各组小鼠第3、5天膀胱腔内HA含量，数据分析采用one-wayanova，^**P＜0.01，^##P＜0.01表示具有统计学差异。

图7为实施例1中各组小鼠第3天膀胱内凝胶残留情况；

图8为实施例1中各组小鼠第5天膀胱内凝胶残留情况；

图9为实施例1中体外抑菌实验各组抑菌圈照片情况；

图10为实施例1中体外抑菌实验各组抑菌圈数据分析情况；数据分析采用one-wayanova，**P＜0.01表示具有统计学差异。

图11为实施例2中各组大鼠尿液中细菌量；数据分析采用one-way anova，^**P＜0.01，^##P＜0.01表示具有统计学差异。

图12为实施例2中各组大鼠膀胱组织细菌量；数据分析采用one-way anova，**P＜0.01表示具有统计学差异。

图13为实施例3中PCR程序图；

图14为实施例3中不同组排尿间隔时间和最大膀胱容量统计结果，数据分析采用one-way anova，**P＜0.01表示具有统计学差异。

图15为实施例3中膀胱移植物宏观拍照观察结果，注：黑色箭头表示HA组和HA-Gel组大鼠膀胱有部分凝胶残留；

图16为实施例3中各组膀胱病理变化HE染色结果(400倍)，红色箭头表示黏膜水肿；

图17为实施例3中各组膀胱组织甲苯胺蓝染色结果(400倍)及各组膀胱组织中肥大细胞计数结果，箭头表示肥大细胞；数据分析采用one-way anova，**P＜0.01表示具有统计学差异。

图18为实施例3中不同组膀胱组织瑞氏染色结果(400倍)及肥大细胞统计数量，箭头表示肥大细胞；数据分析采用one-way anova，**P＜0.01表示具有统计学差异。

图19为实施例3中不同组血清炎性因子分泌情况，数据分析采用one-wayanova，**P＜0.01表示具有统计学差异；

图20为实施例3中不同组IF检测CD3表达情况结果及CD3的平均光密度；数据分析采用one-way anova，**P＜0.01表示具有统计学差异。

图21为实施例3中不同组炎性相关因子基因表达情况检测结果，数据分析采用one-way anova，**P＜0.01表示具有统计学差异。

具体实施方式

下面结合较佳的具体实施例及附图对本发明技术方案进行详细解释和说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施。除特殊说明外，实施例中所用仪器、试剂均为市售产品或本领域技术人员根据普通知识配制，所述试验方法为常规方法。

材料及动物：

透明质酸(医药级)购于罗恩公司，Hank’s缓冲液、PBS缓冲液购于Procell，氢氧化钠购于泸试，Triton X-100、CHAPS、Hoechst33258、CCK-8检测试剂盒购于碧云天，GAG检测试剂盒、COL检测试剂盒、HA试剂盒购于南京建成，苏木素-伊红染液购于Solarbio，大肠杆菌显色琼脂平板培养皿购于科玛嘉，其他试验试剂非特殊说明均为分析品级。正置光学显微镜及成像系统购于日本尼康，HH·W21·600S电热恒温水箱购于上海跃进医疗器械公司，酶标仪购于THERMO，恒温孵育箱购于精宏，荧光分光光度计购于Hitachi，-80℃冰箱购于海尔公司。实验动物均购于上海杰思捷实验动物有限公司，实验兔、实验大鼠均为SPF级。

实施例1温敏水凝胶、复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶的制备

1、小肠黏膜下层组织的制备

在无菌条件下取经过检疫的健康成年兔的小肠长约50cm，直径3-4cm，置于无菌培养皿中。先用Hank’s液冲洗干净后，挑选管腔粗细均匀、管壁无破损及无淋巴结的部位。先翻转小肠，使黏膜面向外，清除小肠黏膜层直至黏膜下层暴露，再次翻转小肠，清除浆膜和肌层组织。洗净小肠黏膜下层，完全去除小肠黏膜下层上的残留组织，其间持续用4℃无菌水冲洗。在无菌操作台上取出小肠膜下层修剪，用剪刀剪碎至<2mm小块。

2、脱细胞方法

小肠黏膜下层组织脱细胞采用缓慢复温-洗涤剂的混合方法脱细胞。具体方法如下：将剪碎的小肠黏膜下层组织块浸泡在生理盐水中，-80℃冰箱过夜。从-80℃冰箱放置在4℃冰箱使其缓慢溶解。配置0.01％的十二烷基硫酸钠(SDS)(质量/体积)PBS中，摇床脱细胞24h。配置7％的3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)溶液用氢氧化钠调节pH至7.2-7.4，洗涤48h。配置1％(vol/vol)曲拉通X-100(Triton X-100)溶液洗涤30min，使更彻底地洗去细胞成分。最后用去离子水清洗去除残存的洗涤剂，每20分钟清洗一次，共清洗40次。去脱细胞后的小肠样本冰冻切10μm/片，经苏木素-伊红(HE)染色，并在显微镜下观察拍照确定兔小肠黏膜层脱细胞完全干净。

3、温敏水凝胶制备

将脱细胞后的小肠黏膜下层组织放置-80℃冰箱中过夜后抽真空冷冻干燥。称其重量，用研磨棒在0.01M的盐酸研磨脱细胞小肠黏膜下层组织直至无肉眼可见颗粒，并调整其浓度为100mg/10mL(即凝胶终浓度约为10mg/mL)，得脱细胞小肠黏膜下层组织液。加入胃蛋白酶消化，胃蛋白酶：脱细胞小肠黏膜下层组织液质量比例为1:10。25℃下持续搅拌48h，在冰上使温度降至4℃，加入1/10体积的0.1M氢氧化钠调节PH至7.2-7.4，加入1/9体积10×PBS调节渗透压至等渗，得到温敏水凝胶。最后将温敏水凝胶(简称为Gel)放置4℃冰箱待用。

请参考图1，左边图为脱细胞前的小肠黏膜下层组织，中间图为脱细胞后的小肠黏膜下层组织，右图为温敏水凝胶。

4、复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶的制备

0.8mg HA(透明质酸)粉末直接与1mLGel混合，使HA的终浓度为0.8mg/mL，获得复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶(简称HA-Gel)。

5、温度敏感性检测

将充分溶胀的Gel、HA-Gel分别加入5mL试管中，置于恒温槽，温度由15℃渐升至50℃，每升高2.5℃时，测定水凝胶的溶胀率，每个温度恒定20min达到热平衡后，记录凝胶体积，计算其溶胀率。Swelling Ratio＝(Vt-V0)/V0，V0为干凝胶的体积，Vt为该温度下的凝胶体积。同时对液态可注射形式和固态凝胶形式进行拍照记录。

结果显示，在15-37.5℃时，Gel、HA-Gel呈液态，在37.5-50℃时呈固态(见图2)，25℃升至37.5℃时约5-10分钟左右由液态转变为固态。

不同温度下，检测Gel和HA-Gel的体积变化，计算并绘制溶胀率曲线，结果如图3所示，随梯度升温，水凝胶体积随温度升高而降低，至临界温度约37.5℃时，水凝胶相变呈固体，水分直接析出，体积骤降。

6、定量DNA检测、GAGs、COL含量检测

6.1定量DNA检测

(1)消化细胞：在PH 6.5、60℃的条件下，125μg/mL木瓜蛋白酶消化一定重量的脱细胞小肠黏膜下层组织和未脱细胞小肠黏膜下层组织16h，得消化液。

(2)染色：消化液用Hoechst33258避光染色。

(3)荧光分光光度仪检测荧光强度(激发光波长：360nm，发射光波长：450nm)，根据标准曲线确定样本中DNA含量。

6.2 GAGs、COL含量检测

使用GAGs试剂盒、COL试剂盒根据酶联免疫吸附试验法来测定脱细胞小肠黏膜下层组织和未脱细胞小肠黏膜下层组织两组样品GAGs、胶原(COL)的含量，通过酶标仪检测吸光度值，并使用标准曲线确定样本中GAGs、COL的含量。具体步骤如下：

(1)使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。

(2)空白孔：不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。

(3)标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μL，然后加入生物素抗原工作液50μL。

(4)零孔：加入标准品/样品稀释液50μL，然后加入生物素抗原工作液50μL。

(5)样品孔：加入样品50μL，然后加入生物素抗原工作液50μL。

(6)轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。

(7)将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。

(8)第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

(9)加入50μL亲和素-HRP到零孔、标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。

(10)第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

(11)显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

(12)终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

(13)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后10分钟以内进行。

(14)计算：计算得到标准曲线后，根据样本OD值计算样本GAGs、COL含量。

结果参考图4，数据分析采用t-test，**P＜0.01表示有统计学差异。与脱细胞前比较，小肠黏膜下层组织在脱细胞后DNA残留几乎为0，GAGs含量和胶原含量无显著变化，水凝胶制备成功。

因为异种或异基因的细胞成分有引起免疫排斥的风险，本发明温敏水凝胶Gel通过采取一系列的化学，物理和酶解的方法对新鲜兔肠黏膜下层进行脱细胞处理，同时最大限度地减少对天然ECM生化和结构特性的破坏。将未脱细胞组织和脱细胞组织两组样品进行DNA残留、外基质糖胺聚糖(GAGs)和胶原(Col)含量检测，与脱细胞前比较，肠黏膜组织在脱细胞后DNA残留几乎为0，GAGs含量和胶原含量无显著变化，表明其符合脱细胞材料的要求，而细胞成分的去除对于降低排斥风险尤为重要。

7、生物相容性检测

采用CCK8实验检测细胞活性。使用骨髓间充质干细胞BMSCs，饥饿处理12h后，分3组，第一组为正常对照组，加正常培养基培养；第二组中加入含1：10体积Gel的完全培养基进行培养；第三组中加入含1：10体积含HA-Gel的完全培养基进行培养。分别在培养处理12、24、36、48、60、72h后，进行细胞增殖检测。吸去原培养基，加入CCK8溶液10μL/孔；将培养板在培养箱内孵育4h后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

结果如图5所示，与对照组比较，Gel和HA-Gel组的细胞活性无显著性差异(P＞0.05)，说明凝胶具有很好的生物相容性。说明Gel和HA-Gel具有很好的生物相容性，细胞毒性较低。

8、体内药物释放试验及凝胶残留检测

实验大鼠分为生理盐水(control，对照)、HA(0.8mg/mL)、Gel-RhB、HA-Gel-RhB四组。Gel-RhB组是在水凝胶Gel中加入罗丹明(RhB)荧光指示剂，使其终浓度为0.005％(w/v)。HA-Gel-RhB组是在Gel-RhB中加入适当质量的透明质酸(HA)使其终浓度为0.8mg/mL。

按上述分组，膀胱分别灌注1mL生理盐水、1mL HA、1mL Gel-RhB或1mL复合凝胶HA-Gel-RhB，并保留30min，在5d后取材，分别进行下述检测：体内药物释放试验：取各组大鼠Day3和Day5的尿液用于ELISA检测。设标准品孔、Blank孔、待测样本孔，除blank孔外分别添加标准品、待测样本50μL；再加入酶标试剂50μL，混匀，37℃孵育30分钟；甩干，洗涤5次，拍干；先后加入显色剂A、显色剂B各50μL，混匀后37℃避光显色10分钟。在每孔加终止溶液50μL后用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

图6表示各组小鼠体内HA含量。结果显示，与对照组相比，Gel-RhB组中HA含量无明显变化。与HA组相比，HA-Gel-RhB组HA含量明显增加(P＜0.01)。

体内凝胶残留检测：在3d、5d后取出膀胱组织，进行下述检测：将冰冻切片机箱体温度设置为-20℃，样品头温度设置为-22℃；取出膀胱组织，然后开启快速制冷，将样品托放速冻位点，涂一层OCT包埋剂，覆盖样品托凹槽，用冷锤压平，制作一个基座平台。均速滴入OCT至组织完全覆盖；切片，制备好的切片室温放置1h，晾干后-20℃丙酮中固定20min，DAPI染色10min，PBS清洗10min，3次；荧光显微镜设置波长610nm，观察RhB荧光。

图7、图8表示各组小鼠第3天和第5天膀胱内凝胶残留情况。结果显示，与对照组(生理盐水组)相比，Gel-RhB组和HA-Gel-RhB组中膀胱内均有明显凝胶残留，且第3天的凝胶残留多于第5天。

9、体外抑菌实验

100μL大肠杆菌ATCC35218菌液(108CFU/mL)铺展在LB营养琼脂上，为细菌生长准备汇合的地面。在琼脂板上打孔，直径为5mm，将琼脂板分为control(对照组，加生理盐水)、HA(只加HA)、Gel(只加Gel)、HA-Gel(只加HA-Gel)四组，各组孔中加入量均为50μL。37℃下孵育过夜。测量每组抑菌圈直径。

结果参见图9、10，与对照组相比HA组和HA-Gel组抑菌圈直径明显扩大，而Gel则无明显变化。

实施例2 HA-Gel治疗细菌性膀胱炎

1、细菌性膀胱炎大鼠模型构建

雌性SPF级SD大鼠，称重，实验前大鼠禁食禁水12h，术前大鼠经手按压膀胱使排空膀胱内残留尿液后，按0.2mL/100g体质量经腹腔注射3％戊巴比妥钠进行麻醉，会阴部尿道外口消毒。用静脉留置针经尿道灌注108CFU/ml的大肠杆菌0.5mL/只于大鼠膀胱内，并保持菌液30min在膀胱内，正常喂养大鼠至实验结束。

2、给药及分组

造模24h后，将细菌性膀胱炎模型大鼠分为model(模型组)、HA、Gel、HA-Gel四组，model组造模大鼠膀胱不灌注任何物质，HA组造模大鼠灌注1mL HA(0.8mg/mL)，Gel组造模大鼠灌注1mLGel，HA-Gel组造模大鼠灌注1mLHA-Gel(HA终浓度0.8mg/mL)，各组灌注后均保留30min。同时设置未造模大鼠，设为sham(假手术)组。

在5d后取材，分别进行下述检测：

(1)收集尿液：收集Day1、3、5的大鼠尿液，取50μL尿液与琼脂培养皿上均匀铺开，置37℃培养箱中培养24h后，进行菌落形成计数。每只动物的菌落数以每毫升湿组织所能培养出的CFU计算。

(2)膀胱组织：取膀胱组织称重后剪碎，加生理盐水匀浆，取50μL匀浆与琼脂培养皿上均匀铺开，置37℃培养箱中培养24h后，进行菌落形成计数。每只动物的菌落数以每毫克湿组织所能培养出的CFU计算。

图11表示各组大鼠尿液中细菌量，结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠尿液中细菌明显较多，且增长较快。与模型组相比，治疗组尿液中的细菌减少，且HA-Gel组抑菌效果最好。

图12表示各组大鼠膀胱组织细菌量，结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠膀胱组织细菌明显较多。与模型组相比，治疗组膀胱组织的细菌减少，且HA-Gel组抑菌效果最好。

实施例3 HA-Gel治疗自身免疫性间质性膀胱炎

1、UPK3A 65–84多肽的合成及纯化

根据Izgi K的研究方法[PLoS One.2013；8(8):e72067][张述蓉.NGF、PGP9.5和5-HT受体亚型在自身免疫性间质性膀胱炎小鼠的差异性表达[D].重庆医科大学,2015.]，通过http：//www.syfpeithi.de/网站筛选出能被MHC分子识别的多肽序列为(-SXXVXV-)，最终确定UPK3A65-84(序列为AMVDSAMSRNVSVQDSAGVP)多肽为致敏原。UPK3A65-84肽段可由上海生工生物工程公司合成，用HPLC法纯化，氨基酸序列通过质谱分析验证。为增加多肽的免疫活性，可将UP3A65-84肽段耦联到血蓝蛋白(keyhloe linpet hemoeyanim，KLH)载体上。

2、实验分组

(1)Control；

(2)IC；

(3)IC+HA；

(4)IC+Gel；

(5)IC+HA-Gel。

每组6只SD大鼠，其中IC表示造模大鼠。

3、造模

Control组给予PBS 0.2mL和CFA(弗氏完全佐剂)0.4mL的乳化剂；IC组给予含PBS0.2mL、CFA 0.4mL和UPK3A65-84多肽200μg的乳化剂。给药途径为皮下多点注射，皮下注射点为4-6之间(UP3A65-84纯度为87.58％及以上可满足要求)，35d后造模结束。

4、给药

造模成功后，按上述分组，IC组灌注1mL生理盐水，IC+HA组膀胱灌注1mL HA(0.8mg/mL)，IC+Gel组膀胱灌注单纯凝胶Gel，IC+HA-Gel组膀胱灌注复合凝胶HA-Gel(HA终浓度0.8mg/mL)，各组灌注后保留30min，在14d后取材，分别进行下述检测。

5、排尿间隔时间和最大膀胱容量

腹腔注射乌拉坦1g·kg^-1麻醉，取仰卧位固定，分别将腹压测压管和膀胱测压管插人大鼠膀胱和直肠约3cm，切忌暴力。经三通管两测压管与尿流动力学测量仪和微量灌注泵连接，轻压下腹，排空膀胱。保证传感器及测压管道内无气体后，体内标记零点开启微量注射泵向膀胱内灌注生理盐水，流速0.1mL·min^-1。

排尿间隔时间：自向膀胱内灌注生理盐水到开姶漏尿的时间。

最大膀胱容量(MBC)：截至漏尿时膀胱内灌注液体总量，即灌注时间与灌注速度的乘积。

6、膀胱移植物宏观拍照观察

各组取出膀胱组织，剖开膀胱，观察移植物，注意各组要拍照，主要看凝胶残留。

7、膀胱病理检查

(1)染色前，切片置60℃烘烤1h，脱蜡：二甲苯I，10min，二甲苯II，5min；

(2)水化：100％酒精I，5min；100％酒精II，5min；95％酒精I，5min；95％酒精II，5min；85％酒精，3min；75％酒精，2min；蒸馏水冲洗，1min；

(3)染色

①苏木精染液中浸5～20min，自来水冲洗3～5min

②1％盐酸酒精分化1～5s，自来水冲洗1～3min

③1％伊红酒精染色1min，蒸馏水洗2min

(4)脱水：75％酒精，2min；85％酒精，2min；95％酒精I，5min；95％酒精II，5min；100％酒精I，5min；100％酒精II，5min。用梯度酒精脱水时，在低浓度酒精中时间不宜过长，到高浓度时逐步延长脱水时间。以免脱水不彻底，影响二甲苯透明的效果；

(5)透明：二甲苯I，5min；二甲苯II，5min；

(6)封片：中性树胶封片。

8、肥大细胞染色观察

8.1.甲苯胺蓝染色

(1)取新鲜组织立即固定于10％中性福尔马林固定液中，常规脱水包埋；

(2)切片厚度4-5μm，常规脱蜡至水；

(3)系列乙醇，自来水洗；

(4)入ToluidineBlueOStain，浸染20分钟；

(5)自来水稍洗；

(6)TBO分化液分化，直至细胞核和颗粒清晰，可在显微镜下控制；

(7)自来水稍洗，滤纸吸干或吹风机吹干水分；

(8)95％乙醇，无水乙醇，每次；

(9)二甲苯透明，中性树胶封固。

8.2.瑞氏染色

(1)滴加瑞氏吉姆萨A液(约0.5mL-0.8mL)涂片上，并让染液覆盖整个标本染色1min；

(2)再将瑞氏吉姆萨B液加于A液上面(滴加量为A液的2-3倍)，以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液充分混合，染色3-10min；

(3)水洗(冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有沉渣沉淀在标本上)，干燥、镜检。

9、Elisa检测

(1)取部分各组新鲜膀胱组织，匀浆，离心，获得上清用于ELISA检测。

(2)加样：分别设标准品孔、Blank孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本50μL；

(3)每孔立即加入酶标试剂50μL，空白孔除外，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃孵育30分钟；

(4)弃去孔内液体，甩干，洗涤5次，拍干；

(5)每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10分钟。

(6)依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。

(7)在反应终止后用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

(8)详细步骤按照瑞氏染色检测说明书完成，为现有技术。

10、qRT-PCR检测

10.1 Total RNA的提取和鉴定

1)取适量细胞样本加入Trizol，室温裂解5min；

2)加入1/5Trizol体积的氯仿，剧烈振荡15s，待溶液充分乳化无分相现象，室温静置5min；

3)12,000g，4℃离心15min；

4)小心取出离心管，吸取上清液转移至另一RNase free EP管中；

5)加入等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀后，室温静置10min；

6)12,000g，4℃离心10min，弃去上清；

7)75％乙醇1mL洗涤，12,000g 4℃离心5min，小心弃去乙醇；

8)室温干燥2-3min，加入20μL灭菌DEPC水溶解沉淀，用手指尖轻弹EP管底部至完全溶解。

9)测定RNA样品浓度。OD260/OD280＝1.91，提取的RNA纯度高，无蛋白质和DNA的残余。

10.2 cDNA合成

1)0.2mL RNase free EP管中配制混合液，冰上操作。

表1反转录反应体系

2)37℃，15min，85℃，5s，4℃，60min得到的cDNA加入30μL ddH₂O稀释备用。可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或PCR扩增，-20℃保存。PCR扩增时cDNA的推荐最大使用量为原液1μL。

10.3定量PCR反应

1)设计的引物序列及分析条件如表2：

表2引物信息

2)PCR管中配制PCR反应混合液，冰上操作。

表3 real-time PCR反应体系

3)混匀，每个样品做3个重复对照。

4)设定PCR程序，如图13所示。

5)上机扩增检测，利用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

10、IHC染色

(1)染色前，切片置60℃烘烤1h；

(2)脱蜡：二甲苯I，5min；二甲苯Ⅱ，5min

(3)水化：100％乙醇，5min；95％乙醇，5min；90％乙醇，3min；80％乙醇，3min；70％乙醇，3min；

(4)蒸馏水8min/次，2次；

(5)3％H₂O₂-甲醇室温20min抑制内源性过氧化酶；

(6)蒸馏水清洗2次，5min/次；

(7)0.01M柠檬酸钠缓冲液高温修复抗原；

(8)PBS清洗2次，5min/次；

(9)5％BSA 37℃封闭20min；

(10)孵育一抗CD3抗体，4℃过夜；

(11)PBS清洗2次，5min/次；

(12)孵育二抗羊抗小鼠IgG-HRP，37℃3h；

(13)PBS清洗2次，5min/次；

(14)DAB染色10min；

(15)自来水冲洗；

(16)苏木素复染2min；

(17)自来水冲洗返蓝；

(18)80％乙醇，1-2sec；95％乙醇I，3min；95％乙醇Ⅱ，3min；100％乙醇I，3min；100％乙醇Ⅱ，3min；

(19)二甲苯I,3min；二甲苯Ⅱ,3min；

(20)中性树脂封片后，显微镜下拍照。

实验结果：

1、排尿间隔时间和最大膀胱容量

结果参见图14，结果显示，与对照组比较，IC模型组大鼠排尿间隔时间和最大膀胱容量均降低，经过HA和Gel处理后，排尿间隔时间和最大膀胱容量明显升高，而经过HA-Gel处理后，排尿间隔时间和最大膀胱容量明显升高。说明HA-Gel能够改善膀胱炎。

2、膀胱移植物宏观拍照观察

参见图15，展示了膀胱凝胶残留情况，可见IC+Gel组和IC+HA-Gel组大鼠膀胱有部分凝胶残留。

3、HE染色

HE染色观察膀胱病理变化，结果如图16所示，与对照组比较，IC模型组大鼠黏膜出现水肿，炎性细胞浸润增加，黏膜剥脱，并伴有出血；经过HA、Gel和HA-Gel处理后，黏膜水肿减轻，炎性细胞浸润减少，黏膜剥脱减少，其中HA-Gel处理组大鼠的膀胱组织水肿减轻最明显，炎性细胞浸润减少最多，黏膜形态基本恢复正常，无明显出血情况。说明HA-Gel能够明显改善膀胱炎。

4、甲苯胺蓝染色

甲苯胺蓝染色观察肥大细胞数量，结果如图17所示，与对照组比较，IC模型组大鼠黏膜肥大细胞数量较多，经过HA和Gel处理后，肥大细胞数量减少并不明显，而经过HA-Gel处理后，肥大细胞数量明显减少。说明HA-Gel能够抑制IC模型大鼠膀胱肥大细胞浸润，抑制炎症反应，改善膀胱炎。

不同组内黏膜肥大细胞数量统计结果

	Control	IC	IC+HA	IC+Gel	IC+HA-Gel
						计数	2.00±1.41	59.00±8.74	49.57±5.47	50.67±5.61	3.67±1.86

5、瑞氏染色

瑞氏染色观察肥大细胞数量，结果如图18所示，与对照组比较，IC模型组大鼠黏膜肥大细胞数量较多，经过HA和Gel处理后，肥大细胞数量减少并不明显，而经过HA-Gel处理后，肥大细胞数量明显减少。说明HA-Gel能够抑制IC模型大鼠膀胱肥大细胞浸润，抑制炎症反应，改善膀胱炎。

	Control	IC	IC+HA	IC+Gel	IC+HA-Gel
						计数	0.67±0.82	7.83±0.75	6.17±1.17	6.33±1.03	1.50±0.55

6、ELISA检测炎症因子分泌情况

ELISA检测炎症因子分泌情况，结果如图19所示，与对照组比较，IC模型组大鼠血清ICAM-1(intercellular cell adhesion molecule-1即细胞间黏附分子-1)和TNFα水平增加，经过HA、Gel和HA-Gel处理后，血清ICAM-1和TNFα水平均下调，其中经过HA-Gel处理的大鼠血清ICAM-1和TNFα降低最明显。

说明HA-Gel能够抑制膀胱炎。

	Control	IC	IC+HA	IC+Gel	IC+HA-Gel
						ICAM(pg/mL)	159.93±6.13	1033.36±38.45	718.27±24.20	570.60±16.87	431.38±18.43
TNFα(pg/mL)	13.55±1.70	253.38±10.01	154.08±7.11	114.01±5.26	78.14±3.77

7、IF检测CD3表达

IF检测CD3表达，结果如图20所示，与对照组比较，IC模型组大鼠CD3表达较高，经过HA和Gel处理后，CD3表达降低并不明显，而经过HA-Gel处理后，CD3表达明显降低。说明HA-Gel能够抑制IC模型大鼠炎症反应，改善膀胱炎。

	Control	IC	IC+HA	IC+Gel	IC+HA-Gel
						平均光密度	2.51±0.19	5.91±0.16	4.59±0.32	4.37±0.27	3.05±0.24

8、qRT-PCR检测相关因子基因表达

qRT-PCR检测炎症相关因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6)和TRPM8基因表达，结果如图21所示，与对照组比较，IC模型组大鼠TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、TRPM8基因均为高表达，经过HA和Gel处理后，TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、TRPM8基因表达明显降低，而经过HA-Gel处理后，TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、TRPM8基因表达明显降低。说明HA-Gel能够抑制IC模型大鼠炎症反应，改善膀胱炎。

	Control	IC	IC+HA	IC+Gel	IC+HA-Gel
						TNF-α	1.00±0.06	2.99±0.07	2.50±0.06	2.40±0.06	2.00±0.06
IFN-γ	1.00±0.06	4.00±0.06	2.80±0.06	2.60±0.05	2.10±0.05
						IL-1β	1.01±0.05	3.20±0.06	2.70±0.06	2.41±0.06	2.10±0.05
IL-6	1.00±0.05	2.81±0.06	2.10±0.07	1.80±0.05	1.50±0.06
						TRPM8	1.01±0.06	2.50±0.06	2.00±0.04	1.80±0.05	1.40±0.06

总结：

尽管IC/BPS因其病因复杂、机制不清等因素导致临床治疗效果欠佳，但GAG层替代疗法治疗间质性膀胱炎中已经占据重要地位，其中膀胱腔内灌注透明质酸是一种补充GAG的方式。膀胱腔内治疗的疗效取决于药物在膀胱内的滞留时间，然而大多数透明质酸在膀胱腔内灌注后的第一次排尿过程中便被消除。因此，为使透明质酸发挥更持久的作用，往往将其做成凝胶的形式，使其能够更长时间地在病变局部停留，持续发挥作用。

本发明的Gel、HA-Gel亲水基团与疏水基团的比例合适，可在水溶液中发生凝胶转变。Gel、HA-Gel在室温状态下即25℃下凝胶为液态，利于灌注到膀胱腔内，而进入膀胱后，随着温度升至37℃，约5-10分钟左右，凝胶从液体状转换为凝胶状附着于膀胱壁内，此凝胶体积相转换时间较短可避免HA灌药从液态凝胶中突然释放而大量浪费。此外在15-50℃间，水凝胶溶胀率随温度升高而降低，至低临界温度约37.5℃时(即人体体温时)，水凝胶相变呈固体，水分直接析出，体积骤降，在膀胱腔内大大减少因水凝胶体积过大造成梗阻甚至影响膀胱正常功能的风险。

膀胱内药物灌注药物治疗是治疗IC/BPS的重要方法，可在膀胱腔内提供较高的药物浓度，同时最大限度地减少全身副作用。然而，药物的低滞留、尿液稀释和快速清除是IC/BPS中药物有效干预的障碍，并导致药效降低甚至治疗失败。因此增加药物在膀胱腔内的滞留时间对提高膀胱腔内治疗的疗效至关重要。在本组体内药物释放实验中可以看到，HA-Gel-RhB组的HA含量在第3天、第5天均明显高于对照组、HA组。以上实验结果表明复合HA温敏水凝胶不仅使HA在膀胱腔内缓慢释放至少长达5天，而且使HA在膀胱腔内浓度高于单纯灌注HA，有效解决尿液冲刷导致HA在膀胱腔内停留时间较短的问题。

HA-Gel在体内的凝胶化是其作为HA体内储存库的重要前提，并且Gel在体内存留时间的长短与HA在体内的滞留时间有关。在凝胶残留试验中可以看到，液体状Gel注入膀胱后，在原位形成胶体状，与对照组相比，Gel-RhB组和HA-Gel-RhB组中膀胱内均有明显凝胶残留。这些结果表明，负载HA的Gel在体内保持了足够的结构完整性，可以作为药物仓库。此外第5天的凝胶残留少于第3天，这提示水凝胶可能随灌注时间的延长在体内逐渐随尿液冲刷流失，避免了水凝胶多次灌注后在膀胱腔内凝胶积聚从而导致尿路阻塞及膀胱容量减少等不良事件的发生。

膀胱腔内灌注透明质酸需要使用导尿管，但任何导尿术都有已知的尿路黏膜微观或肉眼损伤的副作用的风险，导尿术可从体外带入膀胱的细菌长期附着于尿道，导致疼痛、出血和更高的感染风险。尽管水凝胶的使用延长了HA在膀胱腔内的停留时间，但与此同时也破坏了尿液冲刷预防尿路感染的物理机制，极有可能增加尿路感染风险，成为了水凝胶黏附特性的双刃剑。本发明体内抑菌试验表明，与模型组相比，治疗组尿液与膀胱组织的细菌减少，且HA-Gel组抑菌效果最好。这主要因为HA补充GAG层增加了屏障功能进而防止大肠杆菌感染尿路上皮细胞有关，而且可能因为HA-Gel组导致HA在膀胱内停留时间延长，使HA-Gel组抑菌效果强于HA组；此外也因为HA具有抑制免疫复合物与多形核细胞粘附及抑制白细胞迁移和聚集等特性，HA已在临床上用于预防尿路感染。可见HA-Gel相较于HA不仅增加药物停留时间，也增加了抑菌效果，因此不会额外增加感染风险。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，其特征在于，由透明质酸和温敏水凝胶混合而成；所述温敏水凝胶的制备方法如下：

采用缓慢复温-洗涤剂的混合方法脱细胞：取哺乳动物小肠黏膜下层组织，剪碎浸泡在生理盐水中-80℃冷冻，再置于4℃溶解，加入含SDS的PBS中摇床脱细胞，脱细胞后的组织用CHAPS水溶液洗涤，再用Triton X-100水溶液洗涤，最后用去离子水清洗40次，每次20分钟，得到脱细胞小肠黏膜下层组织；

所述摇床脱细胞步骤使用的PBS中SDS的含量为0.01％(w/v)，脱细胞时间为24小时；所述CHAPS水溶液中CHAPS的含量为7％(w/w)，pH值7.2-7.4，CHAPS水溶液洗涤时间48小时；所述Triton X-100水溶液中Triton X-100的含量为1％(v/v)，Triton X-100水溶液洗涤时间30分钟；

脱细胞小肠黏膜下层组织经-80℃冷冻，再抽真空冷冻干燥，加入0.01M盐酸水溶液研磨至无肉眼可见颗粒得脱细胞小肠黏膜下层组织液，加入胃蛋白酶消化后置于4℃环境调节pH值至7.2-7.4，加入PBS调节渗透压至等渗，得到温敏水凝胶。

2.根据权利要求1所述的复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，其特征在于，所述胃蛋白酶与脱细胞小肠黏膜下层组织液的质量比为1:10，消化温度25℃，消化时间48小时。

3.根据权利要求1或2所述的复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶，其特征在于，所述透明质酸的终浓度为0.8mg/mL，所述温敏水凝胶的终浓度为10mg/mL。

4.权利要求1～3任一所述的复合型脱细胞支架/透明质酸温敏水凝胶在制备间质性膀胱炎或膀胱痛综合征的治疗药物的用途。

Images