CN110616507A - 一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜及其制备方法 - Google Patents

一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜及其制备方法，所述载药纳米纤维膜的成分包括：聚L‑乳酸、聚乙烯吡咯烷酮和克拉霉素；所述载药纳米纤维膜的纤维直径在10微米以下。本发明所述的聚L‑乳酸‑PVP复合纤维膜负载克拉霉素后，可植入、粘附鼻腔鼻窦内持续缓释克拉霉素，并可自行降解，在慢性鼻‑鼻窦炎术后能够发挥抗菌、抗炎、抗粘连作用，防止术后反复感染、粘连等并发症。本发明所述的载药纳米纤维膜可用于鼻腔鼻窦防感染粘连，具有使用方便、免除反复给药、避免全身用药的不良反应等优点。

Description

一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜及其制备方法。
背景技术
慢性鼻-鼻窦炎是一种临床常见病，临床定义是指鼻腔和鼻窦黏膜的慢性炎症，鼻部症状持续超过12周，症状未完全缓解甚至加重。鼻内窥镜手术是重要治疗手段，鼻内窥镜手术的关键在于恢复黏膜纤毛系统和重建气道。但是，手术过程中不可避免地会造成局部黏膜出现新鲜创面，在恢复过程中如若受到一些因素如再次感染、局部鼻窦顽固炎症等影响，在恢复后期则可能出现反复感染、粘连等并发症，严重影响慢性鼻-鼻窦炎的术后恢复。据文献统计，因疤痕及粘连形成导致手术失败的患者比例在10％到30％之间。所以，对于慢性鼻-鼻窦炎患者在鼻内窥镜手术后预防反复感染、粘连至关重要。
目前临床上有多种方法用于预防术后并发症：①全身用药。大环内酯类药物具有抗菌、抗炎及免疫调节功能的多重作用，目前在临床上常用来口服预防上述并发症，其中克拉霉素为代表性药物。然而，长期服用大环内酯药物可能出现心血管系统风险、听力损失、胃肠道反应等副作用。②局部用药。局部给药的药物制剂形式有滴剂、喷剂、粉剂等几种，此方式可以减少药物剂量从而减少毒副作用。目前所用药物以抗组胺药物及糖皮质激素为主，主要在局部发挥抗炎作用。但是，上述制剂的药物在鼻腔内的吸收效果，会受到鼻腔解剖结构及其生理功能、鼻腔内的湿度、温度和气流等多种因素的影响，因而不易达到满意的治疗效果。③人工材料。目前，起支撑作用的辅助人工材料越来越常见，在其负载药物后，可以在规定时间里用可控的方式将药物从材料基质中释放到鼻腔内，主要目的是防止粘连、促进鼻窦黏膜引流、释放药物促进伤口愈合。
现有辅助人工材料可分为非可吸收材料和可吸收材料，其中使用非可吸收材料存在的缺点是需要二次手术；而使用胶原蛋白以及动物衍生物等可吸收材料，受限于材料的选择以及载药能力的局限，在伤口愈合、保持通畅、防止感染、粘连的效果并不理想。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提供一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜及其制备方法，本申请提供的载药纳米纤维膜具有药物缓释性，并可自行降解，能植入、粘附鼻腔鼻窦内，有效防止慢性鼻-鼻窦炎术后反复感染、粘连等并发症。
本发明提供了一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜，所述载药纳米纤维膜的成分包括：聚L-乳酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和克拉霉素；所述载药纳米纤维膜的纤维直径在10微米以下。在本发明的一些实施例中，由聚L- 乳酸、聚乙烯吡咯烷酮和克拉霉素一同成型，制得纤维直径在10微米以下的载药纳米纤维膜。在本发明的另一些实施例中，所述载药纳米纤维膜包括：聚L-乳酸-聚乙烯吡咯烷酮复合纤维膜基质和负载在所述复合纤维膜基质中的克拉霉素；所述载药纳米纤维膜的纤维直径在10微米以下。
本发明提供的负载药物的纳米纤维膜具有可生物降解性，植入并粘附于鼻腔鼻窦内，可缓慢释放药物，对慢性鼻-鼻窦炎术后反复感染、粘连等并发症的预防效果较好，具有使用方便、免除反复给药、避免全身用药的不良反应等优点。
在本发明中，所述载药纳米纤维膜主要用于防止慢性鼻-鼻窦炎术后反复感染、粘连等并发症。本发明所述的载药纳米纤维膜包括聚L-乳酸、聚乙烯吡咯烷酮这些纤维膜基质成分，即本发明实施例以聚L-乳酸和聚乙烯吡咯烷酮复合的纤维膜作为支持、载药的基质。
在本发明的实施例中，聚L-乳酸-聚乙烯吡咯烷酮复合纤维膜是一种可生物降解静电纺丝纳米材料，能够发挥支持、载药等作用。其中，聚L-乳酸材料选择较少受制于组织和药物兼容性的困扰，搭载药物种类广泛。并且，在载药基础上，多项研究证实，此材料在神经修复、皮肤血管再生、骨骼重塑等领域发挥着支撑、引导细胞生长、抗粘连等功效。聚乙烯吡咯烷酮是一种粘附性高分子，而且对聚L-乳酸的降解性没有不利影响。例如，本发明一些实施例中，所述载药纳米纤维膜中聚L-乳酸与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1： (0.01～0.5)。
本申请研究发现，聚L-乳酸与聚乙烯吡咯烷酮复合的纤维膜能作为植入鼻腔鼻窦的可降解持续缓释载药纳米材料，其中通过聚乙烯吡咯烷酮的粘附性能，实现纤维膜的粘附特性，从而粘附在鼻腔鼻窦炎症区域，实现局部给药、防止脱落，用以术后有效预防反复感染、粘连等并发症，这在慢性鼻-鼻窦炎治疗中的应用材料方面具有首创性。
本发明所述载药纳米纤维膜中的药物为克拉霉素，其属于大环内酯类药物。本发明所述载药纳米纤维膜中的纤维具有光滑的表面，尺寸为微纳米级别，例如纤维直径在10微米以下，具体可为0.1～8微米、0.5～5微米等。本发明主要创新的是聚L-乳酸-PVP纤维膜和克拉霉素的局部使用，该药物从复合纤维膜基质中缓慢释放到鼻腔鼻窦内，能够有效防止粘连、促进鼻窦黏膜引流、促进伤口愈合等。
在本发明的实施例中，以聚L-乳酸的质量为基准，所述克拉霉素的负载浓度优选为8％～12％，更优选为9％～10％。由于PVP的存在，所述载药纳米纤维膜具有较好的亲水性，从而达到粘附组织的特性。所述载药纳米纤维膜的孔隙率为30％～95％，为疏松多用结构。所述载药纳米纤维膜的拉伸强度为 0.5MPa～10MPa，具有很好的拉伸性能，且柔软性较好，有利于手术操作。所述载药纳米纤维膜为类似餐巾纸的薄膜状，可以任意裁剪和折叠等，尺寸大小等都可以随意调节，厚度一般为5μm～2mm，甚至更厚，可以根据疾病需要进行调节。
本发明实施例在聚L-乳酸-PVP复合纤维膜中负载克拉霉素并缓慢释放，可免除反复给药的麻烦，并最大限度地避免全身用药的不良反应，同时利用了所述聚L-乳酸纤维膜的抗粘连作用。
本发明一些实施例提供了一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
将聚L-乳酸、聚乙烯吡咯烷酮和克拉霉素均溶解于第一有机溶剂中，得到第一混合溶液；
将所述第一混合溶液进行静电纺丝，得到用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜，其中纤维直径在10微米以下。
本发明另一些实施例提供了一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
将聚L-乳酸和聚乙烯吡咯烷酮溶解于第二有机溶剂中，得到第二混合溶液；
将所述第二混合溶液进行静电纺丝，得到复合纤维膜；
将克拉霉素负载在所述复合纤维膜中，得到用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜，其中纤维直径在10微米以下。
本发明主要以聚L-乳酸、PVP和克拉霉素为原料，利用静电纺丝技术制备负载克拉霉素的聚L-乳酸-PVP复合纤维膜。本发明一些实施例首先将聚 L-乳酸、PVP与克拉霉素同时用有机溶剂溶解，得到混合溶液(也可称预静电纺丝溶液)。为便于区分不同的方法，上述有机溶剂记为第一有机溶剂，所得混合溶液记为第一混合溶液。
其中，聚L-乳酸英文简称为PLLA，具体使用PLLA材料的分子量 Mw＝100kDa。PVP为粉末状，其分子量Mw＝10～1000kDa之间均可。克拉霉素又名甲红霉素，是红霉素的衍生物，属于大环内酯类药物。克拉霉素于上世纪90年代初由日本大正公司开发成功，并以商品名Clarith注册。后续地， 1991年10月获FDA批准定为IB类新药上市，商品名Biaxin；1993年以Klacid 在中国香港上市，在欧洲和亚洲的商品名为克拉仙。目前，生产的克拉霉素的剂型主要有片剂、颗粒剂、注射剂和干混悬剂。本发明实施例所使用的克拉霉素为粉末状，直接加入溶解即可。
在本发明中，所述聚L-乳酸与克拉霉素的质量比优选为1：(0.08～0.12)，更优选为1：(0.09～0.1)；所述聚L-乳酸与聚乙烯吡咯烷酮的质量比优选为 1：(0.01～0.5)。所述第一有机溶剂为二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种；本发明实施例优选将一定比例的PLLA、PVP与克拉霉素，加入至二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，恒定搅拌至PLLA等材料完全溶解。本发明实施例还优选将溶解得到的混合溶液在水浴中超声处理一定时间，以消除任何气泡。
得到预静电纺丝溶液后，本发明实施例进行静电纺丝，制得纤维直径在 10微米以下的装载克拉霉素的静电纺丝纤维膜，可简写为CLA-PLLA-PVP(纤维膜或膜)。本发明利用的静电纺丝技术是目前国内外较通用的微纳米材料制备技术；在本发明实施例静电纺丝的过程中，可通过药物和载药材料的不同混合比控制所得材料的降解速率，从而控制纤维膜所载药物的释放速率。本发明实施例对该药物的比例没有特殊限制，可以比例很低，也可以高达50％的比例。
本发明所述静电纺丝的设备为本领域技术人员熟知的，例如包括高压电源、微量注射泵、带针头的注射器、集电极、旋转收集器等。在本发明的实施例中，所述静电纺丝的电压优选为13～15千伏；所述静电纺丝时，喷丝头 (即针头)与集电极之间的距离为13～15厘米。具体地，本发明实施例中注射器针头直径可为0.8毫米，电压固定为15千伏，针头与集电极之间的距离设定为15厘米，溶液进料速率为0.2毫升/分钟的条件下进行静电纺丝，制作得到纤维尺寸在微纳米级别的载药PLLA-PVP膜。并且，本发明所得的 CLA-PLLA-PVP膜中的纤维具有光滑的表面，纤维直径在10微米以下，具体可为0.1～8微米、0.5～5微米等。
本发明另一些实施例首先将聚L-乳酸与PVP同时用第二有机溶剂溶解，得到第二混合溶液。具体实施例中，使用PLLA材料的分子量Mw＝100kDa。 PVP为粉末状，其分子量Mw＝10～1000kDa之间均可。所述聚L-乳酸与聚乙烯吡咯烷酮的质量比优选为1：(0.01～0.5)；所述第二有机溶剂为二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。本发明实施例优选将一定比例的PLLA 与PVP加入至二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，恒定搅拌至PLLA 等材料完全溶解。本发明实施例还优选将溶解得到的混合溶液在水浴中超声处理一定时间，以消除任何气泡。
得到预静电纺丝溶液后，本发明实施例进行静电纺丝，制得纤维直径在 10微米以下的PLLA-PVP静电纺丝纤维膜。在本发明的实施例中，所述静电纺丝的电压优选为13～15千伏；所述静电纺丝时，喷丝头(即针头)与集电极之间的距离为13～15厘米。具体地，本发明实施例中注射器针头直径可为 0.8毫米，电压固定为15千伏，针头与集电极之间的距离设定为15厘米，溶液进料速率为0.2毫升/分钟的条件下进行静电纺丝，制作得到纤维尺寸在微纳米级别的PLLA-PVP复合纤维膜。
本发明实施例将克拉霉素与所述复合纤维膜进行负载，可通过溶液浸渍等方法，实现克拉霉素在复合纤维膜中的负载，从而得到用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜，其中纤维直径在10微米以下。本发明实施例这种载药纳米纤维膜的制备方法，药物释放速度相对较快。
得到负载克拉霉素的PLLA-PVP膜后，本发明实施例进行了体外药物实验以及动物实验等。本发明以临床实践为出发点，通过工程手段为临床问题提供解决方案。国内外目前无相似应用的报道，本项目获得了意料不到的良好效果，具有一定程度的原创性。根据实验结果，本发明所述的聚L-乳酸-PVP 纤维膜负载克拉霉素后，可植入、粘附鼻腔鼻窦内，有效地持续缓释克拉霉素，并可自行降解，在慢性鼻-鼻窦炎术后能够发挥抗菌、抗炎、抗粘连作用，防止术后反复感染、粘连等并发症。本发明所述的载药纳米纤维膜可用于鼻腔鼻窦防感染粘连，具有使用方便、免除反复给药、避免全身用药的不良反应等优点。
附图说明
图1为本发明一些实施例的实验路线图；
图2为实施例1制备的CLA-PLLA-PVP膜的实物照片；
图3为实施例1制备的PLLA膜和CLA-PLLA-PVP膜的扫描电子显微镜照片；
图4为实施例1制备的PLLA膜和CLA-PLLA膜的水接触角图；
图5为实施例1制备的PLLA膜和CLA-PLLA-PVP膜的拉力曲线图；
图6为实施例1制备的CLA-PLLA-PVP膜的克拉霉素释放曲线图；
图7为实施例1制备的CLA-PLLA-PVP膜不同时间的抑菌斑直径对比图；
图8为本发明实施例中所建立的鼻窦炎模型图；
图9为本发明实施例中三组上颌窦黏膜炎症病变HE染色结果比较；
图10为本发明实施例中三组上皮溃疡程度比较；
图11为本发明实施例中三组黏膜炎性细胞浸润程度比较；
图12为本发明实施例中三组上颌窦黏膜下胶原纤维增生MASSON染色结果比较；
图13为本发明实施例中三组胶原纤维百分比比较；
图14为本发明实施例中三组上颌窦黏膜免疫组化染色观察结果；
图15为本发明实施例中IL-4、IL-8、TNF-α、TGF-β1、α-SMA和Col Ⅰ在各组中的免疫组化染色结果比较；
图16为本发明实施例中三组上颌窦黏膜扫描电子显微镜检查照片；
图17为本发明实施例中炎症因子及纤维化相关因子的mRNA水平在各组中的相对表达量比较；
图18为本发明实施例中三组IL-4、IL-8、TNF-α、TGF-β1、α-SMA、Col Ⅰ的WesternBlot结果及相对表达量比较。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本发明提供的用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜及其制备方法进行具体地描述。
参见图1，图1为本发明一些实施例的实验路线图。以下实施例所涉及的主要试剂如下：
PLLA材料(从Sigma公司购买，Mw＝100kDa)；PVP(粉末状，其分子量Mw＝1000kDa)；克拉霉素(粉剂，纯度>95％)；ODS柱(100-5C18 柱，250×4.6mm，5.0μm粒径，J&K Chemica公司)；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌液(浓度1麦氏单位)由长海医院微生物实验室提供；鼠源单克隆 Anti-IL4、Anti-IL8、Anti-TNFα(LifeSpan BioSciences公司)；兔多克隆 Anti-TGFβ1(abcam公司)；兔多克隆Anti-α-SMA(abcam公司)；兔多克隆Anti-Col Ⅰ(abcam公司)；RT-PCR试剂盒(上海威奥生物公司)；GAPDH (上海威奥生物公司)；PCR引物由NCBI Primer-blast设计，由苏州金唯智合成，序列如下：GAPDH的上游引物：CGCCTGGAGAAAGCTGCTAA、下游引物：ACGACCTGGTCCTCGGTGTA；IL-4的上游引物： TTCAAGGAGCACGGAGAGCT、下游引物：TCTGTCTGGCTTCCTTCCCA； IL-8的上游引物：ACTCCAAGCTGGCTGTGGCT、下游引物：GCACTGGCATCGAAGCTCTG；TNF-α的上游引物：CTCTGCCATCAAGAGCCCCT、下游引物：CCGGTCACCCTTCTCCAACT； TGF-β1的上游引物：CACCATTCACAGCATGAACC、下游引物：GTCCTTGCGGAAGTCAATGT：α-SMA的上游引物： TCAGCTTCCCTGAACACCAC、下游引物：GCAAAGCCAGCCTTACAAAG； Col Ⅰ的上游引物：TAAGGGTGACAGAGGCGATG、下游引物：GGACCGCTAGGACCAGTTTC；TNF-α的上游引物： CTCTGCCATCAAGAGCCCCT、下游引物：CCGGTCACCCTTCTCCAACT。其他试剂及药品采购自国药集团化学试剂有限公司。
以下实施例中动物实验涉及的实验动物为：36只成年健康新西兰白兔，雌雄随机，体重2公斤左右，实验前在标准环境下饲养1周。
以下实施例所涉及的实验仪器如下：
静电纺丝设备(包括高压电源、微量注射泵、带针头的注射器、集电极、旋转收集器等)；显微外科器械、纳吸绵(史赛克医疗器械有限公司)、PCR 仪(瑞士Roche公司)、凝胶成像系统(GIS-1600，上海天能科技有限公司)、扫描电子显微镜(SU8010，日本日立公司)、Kruss GmbH DSA 100Mk 2接触角测量仪(德国汉堡)。
实施例1负载克拉霉素的PLLA-PVP膜制备
将1g PLLA、0.01g PVP与0.1g克拉霉素加入至4g二氯甲烷和2g N,N- 二甲基甲酰胺的混合物中，恒定搅拌1小时使PLLA等材料完全溶解；将得到的预静电纺丝溶液在水浴中超声处理10分钟，以消除任何气泡。将超声处理后的混合溶液放置于10mL注射器中，在注射器针头直径为0.8毫米，电压固定为15千伏，针头与集电极之间的距离设定为15厘米，溶液进料速率为 0.2毫升/分钟的条件下，进行静电纺丝，制作得到装载克拉霉素的静电纺丝纤维膜(CLA-PLLA-PLLA，克拉霉素浓度10％)。
并且，按照与上述相似的制作步骤，制作得到PLLA膜；除了在制备预静电纺丝溶液时，仅将1g PLLA用有机溶剂溶解。
实施例2物理性能检测
(1)扫描电子显微镜观察
将制备好的PLLA膜和CLA-PLLA-PVP膜(实物参见图2)采集于铝箔表面，之后真空干燥24小时，通过扫描电子显微镜观察PLLA和 CLA-PLLA-PVP纤维膜的形貌。
图3为实施例1制备的PLLA膜和CLA-PLLA-PVP膜的扫描电子显微镜照片，A是PLLA膜，B是CLA-PLLA-PVP膜。根据扫描电子显微镜结果显示，PLLA膜和CLA-PLLA-PVP膜的纤维形态没有明显区别，两者均表现为光滑的表面、相似的纤维直径和孔隙率，纤维直径在10微米以下，孔隙率为 30％～95％。由此可见，本发明载药过程对这些纤维的外观基本没有产生影响。
(2)水接触角值测量
水接触角(water contact angle,WCA)值测量：通过WCA值，评价PLLA、 CLA-PLLA(按照实施例1相似的步骤制备，但不加入PVP)、CLA-PLLA-PVP 纤维膜的表面润湿性。选择厚度约1mm的纤维膜并切成小条 (70.0mm×10.0mm)，然后将这些小条粘在玻璃载玻片的表面上。WCA由 Kruss GmbH DSA 100Mk 2接触角测量仪测定，该过程在室温下通过DSA 1.8软件分析(n＝5)。
测量PLLA膜和CLA-PLLA膜的WCA如图4所示，其中，C是PLLA 膜，D是CLA-PLLA膜。结果为：PLLA膜WCA为126.3±3.4°，CLA-PLLA 膜WCA为133.4±2.1°；而CLA-PLLA-PVP纤维膜是亲水性的，接触角为0。
(3)力学性能
通过等效力测试仪器测量拉伸强度，比较PLLA和CLA-PLLA-PVP纤维膜的力学性能。先将纤维膜通过模块修改成一定形状，然后通过机器以0.5mm /min(n＝5)的速度拉伸这些样品。
测试结果参见图5，观察两种材料的拉伸曲线可知，PLLA膜在载药前后的强度没有明显变化，拉伸强度载药前约是8.7MPa。
从图5到最后的附图，其中的CLA-PLLA均代表CLA-PLLA-PVP纤维膜。
实施例3体外药物实验
(1)体外药物释放能力
将每200mg的CLA-PLLA-PVP纤维膜浸入50mL磷酸盐缓冲盐水(PBS， pH值7.4)溶液中，放置在恒温器震动水浴中，震动速度50周期/min。分别在第15，30，45，60天取出1.0mL的释放缓释溶液介质用于检测，同时补充1.0mL的新鲜PBS溶液。将取出的PBS溶液进行高效液相色谱(HPLC)分析，固定相使用ODS柱在25℃下进行分析；流动相采用磷酸二氢钾溶液/甲醇 (400：600v/v)系统；流速为1.0mL/min，检测波长为210nm。
药物释放情况参见图6，从CLA-PLLA-PVP膜的药物释放曲线可以看出，克拉霉素能够持续缓慢平稳释放两个月，在最初的10天出现一个克拉霉素释放的高峰期，将近30％的克拉霉素释放到介质中，此后剩余的克拉霉素继续持续释放50天左右，最终释放量达到总量的95％。
(2)体外抑菌能力检测
将PLLA膜和CLA-PLLA-PVP膜制成直径6mm的圆片，与标准克拉霉素药敏纸片(6mm，15μg)分别置于金葡菌琼脂板上，放置18h后测量形成的抑菌圈直径。然后，将膜转移到新的金葡菌琼脂板上，放置18h再次测量形成的抑菌圈直径。此后每18h重新以上操作一次，连续观察3周时间，重复5次实验。
实验发现，PLLA膜在整个观察阶段未产生抑菌圈，而CLA-PLLA-PVP 膜和克拉霉素纸片在第1天均产生明显的抑菌圈；第3天克拉霉素纸片已无抑菌圈，而CLA-PLLA-PVP膜仍产生抑菌圈，但直径缩小。此后 CLA-PLLA-PVP膜的抑菌圈逐渐缩小，在第7天时维持在14mm左右，并持续3周(图7A-E)。分别在第1、7、14、21天将2种材料抑菌圈直径进行比较得出：CLA-PLLA-PVP膜在以上各观测点的抑菌圈直径均大于PLLA膜，差异有统计学意义(p均<0.01)。对CLA-PLLA膜的各观测点之间的比较得出，第1天的抑菌圈直径明显大于第7、14、21天，差异有统计学意义(p均 <0.01)，第7天的抑菌圈直径明显大于第14、21天，差异有统计学意义(p 均<0.01)，第14、21天的抑菌圈直径无明显统计学差异(p>0.05)(图7F)。
实施例4动物实验
(一)兔慢性鼻窦炎模型制作
模型制作：用10％水合氯醛(3毫升/千克)腹腔注射麻醉兔子，沿鼻背正中做一长约3cm纵行切口，向右侧分离皮下组织及骨膜直至暴露上颌窦前壁，切开上颌窦前壁，使用适量纳吸棉堵塞上颌窦口，向上颌窦腔内注入0.2mL 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌液(浓度1麦氏单位)，关闭上颌窦前壁切口。同法处理左侧上颌窦，缝合皮肤。手术期间有2只兔子死亡。继续在标准环境下饲养3个月制成CRS模型，在此期间有1只兔子死亡。将剩余的33只兔随机分为3组，每组11只兔。
分组手术步骤：33只兔用同样方法麻醉，在严格无菌操作下切开原切口，暴露上颌窦前壁，切开前壁，用无菌棉签取双侧上颌窦腔内分泌物行细菌培养，清除上颌窦内脓性分泌物，冲洗上颌窦腔，保证窦口通畅。将第一组兔的上颌窦壁及皮肤直接缝合，此组为对照组(Control组)；第二组兔的上颌窦腔内置入PLLA膜后缝合上颌窦壁及皮肤，此组为材料组(PLLA组)；第三组的上颌窦腔内置入负载克拉霉素的PLLA膜，此为载药材料组 (CLA-PLLA-PVP组)。各组术后继续在标准环境下饲养14天，在此期间对照组死亡1只兔子，PLLA组死亡2只兔子，CLA-PLLA-PVP组死亡1只兔子。14天后处死所有兔子，在无菌情况下取双侧上颌窦内分泌物行细菌培养，后取双侧上颌窦黏膜标本待检测。
(二)动物实验标本检测
1、细菌培养
在动物分组手术阶段及处死阶段严格按照无菌操作打开双侧上颌窦，用无菌棉签取双侧上颌窦腔内分泌物行细菌培养。
2、组织学观察
取出上颌窦黏膜标本，经10％甲醛固定、脱水、石蜡包埋，5μm厚连续切片。行HE染色、MASSON染色观察黏膜、腺体、胶原纤维等情况。
HE染色：二甲苯脱蜡，于梯度酒精中脱去二甲苯，蒸馏水浸洗，苏木精染色15分钟，1％盐酸酒精及1％氨水酒精冲洗，流水冲洗1小时，入酒精伊红染色液染色2-3分钟，染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，将已透明的切片封固。染色结果判定：采用Kim[1]的方法，每张切片随机选取 10个不同的低倍视野(×100)，观察上皮层溃疡形成的长度比例，小于等于 5％为轻度，5-20％为中度，大于20％为重度；炎性细胞浸润累计大部分上皮层及上皮下层为重度，局限在上皮层为轻度，在两者之间为中度。划分半量化等级结果：正常(-)，轻度(+)，中度(++)，重度(+++)。
MASSON染色：石蜡切片脱蜡至水，依次自来水和蒸馏水洗，用Weigert 铁苏木精染色液染色5-10分钟，分化，反蓝，充分水洗，蒸馏水洗，用Masson 丽春红酸性复红液5-10分钟，以2％冰醋酸水溶液洗1分钟，1％磷钼酸水溶液洗3-5分钟，直接放入苯胺蓝染5分钟，以0.2％冰醋酸水溶液浸洗1分钟， 95％酒精快速脱水，无水酒精脱水3次、二甲苯透明3次、中性树胶封固。染色结果判定：每张切片随机选取10个不同的高倍视野(×400)，应用Image J图像分析软件计算胶原纤维在整个观察视野中所占百分比。MASSON染色中红色为正常的黏膜组织，蓝色为胶原纤维。
3、免疫组化染色
石蜡切片脱蜡至水，3％过氧化氢室温孵育十分钟，抗原修复，滴加第一抗体(鼠源单克隆Anti-IL4，滴度1：200；鼠源单克隆Anti-IL8，滴度1：200；鼠源单克隆Anti-TNF-α，滴度1：200；兔源多克隆Anti-α-SMA，滴度1：400；兔源多克隆Anti-Col I，滴度1：50；兔多克隆Anti-TGF-β1，滴度1：200)， PBS溶液浸洗，滴加生物素化的二抗，PBS浸洗，滴加三抗，PBS浸洗，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，封片。
免疫组化染色结果：每张切片随机选取10个不同的高倍视野(×400)，采用Leeman[2]的方法，测量阳性细胞百分数和染色强度进行评分。阳性细胞百分数：计数每个高倍视野100个细胞中阳性细胞所占比例，取平均值，阳性细胞百分数<5％为0分，6％-25％为1分，26％-50％为2分，51％-75％为3 分，>76％为4分。染色强度：不显色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。将阳性细胞百分数和染色强度相乘得出半量化等级染色结果，其中 0-1分为阴性(-)，2-4分为弱阳性(+)，5-8分为中度阳性(++)，9-12 分以上为强阳性(+++)。
引文：1.Kim CS,Jeon SY,Min YG,et al.Effects of beta-toxin ofStaphylococcus aureus on ciliary activity of nasal epithelial cells[J].Laryngoscope, 2000,110(12):2085-2088.DOI:10.1097/00005537-200012000-00021.
2.Leeman MF,McKay JA,Murray GI.Matrix metalloproteinase 13activity isassociated with poor prognosis in colorectal cancer.J Clin Pathol.2002.55(10): 758-62.
4、扫描电子显微镜观察
取上颌窦黏膜1cm×1cm大小的标本，生理盐水洗净后放入2.5％戊二醛中固定4小时，双蒸水洗3次，酒精脱水，醋酸戊酯取代，临界点干燥标本后真空喷镀，通过扫描电子纤维镜观察纤毛情况。
5、实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR，QRT-PCR)
总RNA抽提：在绿豆大小的组织中加1mL Trizol，用Tissue Ruptor匀浆器1min，室温放置10min；加200μL氯仿，充分混匀，15000转离心5-7min。取上清，至1.5mL Eppendorf管加600μL氯仿，混匀，15000转离心5min。取上清，至1.5mL Eppendorf管加500μL异丙醇，混匀，15000转离心10min。弃上清，用75％乙醇1mL冲洗，高速离心5min。弃上清，RNA沉淀于空气中干燥(2-3min)。将干燥后的RNA溶解于RNA-free Water中。取1μL总 RNA测OD260，并定量。逆转录：在1.5mL离心管中加入0.5μL RNA酶抑制剂(50U/μL)、2μL随机引物(50pM/μL)、2μg RNA，在65℃水浴处理5min，室温放置10min，高速(高于5000g)离心5秒，再加入RNA酶抑制剂 (50U/μL)0.5μL、4μL 5×buffer(invitrogen)、2μL dNTP MIX(10mM/each)、2μL DTT、1μL AMV(200U/μL)后水浴40℃下反应1小时；90℃处理5-10min；冰浴5min；高速(高于5000g)离心5秒。荧光定量PCR扩增：加入上述逆转录产物1μL、8μL 2×SYBGEEN PCR mix、分别加入IL-4、IL-8、TNF-α、TGF-β1、α-SMA、Col I的上、下游引物各1μL，加双蒸馏水5μL定容至16μL。95℃2min 后，94℃10s，60℃10s，72℃40s循环40次。测出mRNA的CT值后先与内参做了⊿Ct，然后用第一个样品做了相对表达量＝2-⊿⊿Ct分析。
6、Western Blot蛋白质免疫印迹
将收集的标本剪碎，按照每20mg组织加入100μL裂解液的比例加入RIPA 裂解液，在匀浆机中研磨，充分裂解后12000rpm离心5分钟，取上清，取部分上清蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度，和等体积5×上样缓冲液混合，即为上样液。将上样液于100℃沸水中煮沸5min，使蛋白变性，冰上骤冷，3000 转/min离心1min。每孔加上样液20μg，留一孔加10μL预染的Marker。加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70v恒压电泳，约30min，当指示剂溴芬兰进入分离胶后改用90v恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm 处时关闭电源，取出胶板。
在电泳即将结束前，预先将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)浸泡在甲醇中 15s，然后用双蒸水漂洗2min，浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作。在水中撬胶，修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡15min。接上正负极，按膜向正极的方向将转移盒放入电转仪中，加入转膜缓冲液。将电转仪置于冰水中，200mA恒流转膜35min、50min、70min。转膜结束后，快速取出PVDF 膜，放入5％BSA室温封闭2h。取出膜，于摇床上用TBST洗膜5min×3次。孵育袋中分别加入封闭液稀释的IL-4(1:200)、IL-8(1:200)、TNF-a(1:200)、 TGF-β1(1:200)、α-SMA(1:500)、Col I(1:1500)和GAPDH(1:2000)， 4℃孵育过夜。TBST洗膜5min×3次，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(Jackson 1：2000)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠二抗(Jackson 1：2000)室温孵育2h。TBST洗膜15min×5次。膜于化学发光检测试剂(试剂A：试剂B＝1：1)反应2min，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好 PVDF膜，暗室中用X胶片感光、显影、定影。并测量各样本的灰度值，与内参GAPDH的灰度值相除后得出相对灰度值。
本申请实施例中，使用SPSS 13.0软件进行统计学数据分析。符合正态分布计量资料使用均数±标准差表示，不符合正态分布的计量资料以中位数表示。CLA-PLLA-PVP材料抑菌圈直径比较采用重复测量方差分析，各组兔细菌感染率比较采用卡方检验，免疫组化染色半量化等级结果、Western Blot免疫印迹条带相对灰度值、QRT-PCR中mRNA相对表达量数据的组间比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和检验。以p＜0.05为差异有统计学意义。
(三)动物实验结果
1、宏观观察
CRS模型建成后，对照组、材料组、载药组兔上颌窦前壁隆起，前鼻孔可见明显脓性分泌物，干预手术术中见上颌窦窦腔结构破坏，腔内大量积脓 (如图8所示)。从图8分别具体可见，兔上颌窦前壁隆起(A)，鼻腔可见明显脓性分泌物(B)，上颌窦窦腔结构破坏，腔内大量积脓(C)。
2、微生物培养
在分组手术前对上颌窦腔内分泌物行微生物培养，发现除金黄色葡萄球菌外，还存在多杀巴斯德菌、科氏葡萄球菌解脲亚种、腐生葡萄球菌等机会致病菌，所有组别内兔子感染细菌阳性比均为11/11。在分组手术后14天处死兔子同时对3组分泌物行微生物培养，发现Control组和PLLA组的细菌感染率分别是10/10和9/9，CLA-PLLA-PVP组的细菌培养比率为6/10，三组间的细菌阳性率差异有统计学意义(p<0.05)。数据具体结果见表1。
表1各组上颌窦细菌培养结果
注：术前指分组手术前，术后指分组手术后。*：有1只兔培养出2种细菌；#：有1只兔培养出3种细菌；△：有2只兔子培养出2种细菌。
3、组织学观察
(1)、HE染色结果
如图9所示的光镜下发现，Control组黏膜上皮有溃疡形成、部分上皮部分脱落，纤毛缺失，基底膜增厚，黏膜下大量炎性细胞浸润，腺体增生。PLLA 组黏膜上皮有部分溃疡，基底膜略增厚，黏膜下可见少量炎性细胞。CLA-PLLA-PVP组黏膜平整光滑，基底膜无增厚，黏膜下炎性细胞较少。比较各组黏膜上皮溃疡程度，CLA-PLLA-PVP组轻于Control组及PLLA组，差异有统计学意义(p<0.05，p<0.01)，Control组和PLLA组之间没有明显差异(p>0.05)(参见图10)。CLA-PLLA-PVP组的炎性细胞浸润程度同样轻于Control组及PLLA组(p<0.01，p<0.05),Control组和PLLA组之间没有明显差异(p>0.05)(参见图11)。
图9中，HE染色(×100)显示Control组(A)黏膜上皮有溃疡形成、部分上皮部分脱落，纤毛缺失，基底膜增厚，黏膜下炎性细胞浸润，腺体增生。PLLA组(B)黏膜上皮有部分溃疡，基底膜略增厚，黏膜下可见少量炎性细胞。CLA-PLLA-PVP组(C)黏膜平整光滑，基底膜无增厚，黏膜下炎性细胞较少；图10是各组上皮溃疡程度比较；图11是各组黏膜炎性细胞浸润程度比较。*：p<0.05；NS：无统计学意义。
(2)、MASSON染色结果
Masson染色结果可以看到胶原纤维呈蓝色。从图12可见，Control组黏膜下胶原纤维显著增生，排列紧密；PLLA组和CLA-PLLA-PVP组的黏膜下胶原纤维细长、走向平直，增生情况较Control组减轻。观察高倍视野下胶原纤维百分比可知，PLLA组和CLA-PLLA-PVP组黏膜下胶原纤维面积百分比少于Control组，差异有统计学意义(p均<0.01)，而PLLA组和CLA-PLLA-PVP 组之间的差异无统计学意义(p>0.05)。
如图12所示的MASSON染色(×100)结果，Control组(A)黏膜下胶原纤维大量增生，排列紧密。PLLA组(B)和CLA-PLLA-PVP组(C)黏膜下胶原纤维增生较对照组稍减轻，且纤维细长，走向平直。图13是3组胶原纤维百分比比较；*：p＜0.05；NS：无统计学意义。
4、免疫组化染色结果
参见图14，IL-4、IL-8、TNF-α、TGF-β1、α-SMA和Col Ⅰ在3组鼻窦黏膜中均有表达，IL-4、IL-8、TNF-α、TGF-β1主要表达于基底细胞、炎性细胞中，α-SMA和Col Ⅰ主要表达在黏膜下结缔组织中。其中IL-4、IL-8、TNF-α在Control组和PLLA组中表达明显，阳性细胞呈明显的棕黄色或棕褐色，在 CLA-PLLA-PVP组仅见少量表达，阳性细胞呈浅黄色。TGF-β1、α-SMA、Col I在Control组中表达明显，呈棕褐色，在PLLA组和CLA-PLLA-PVP组中表达减少，呈棕黄色或浅黄色。比较各组的免疫组化评分，IL-4、IL-8、TNF-α在CLA-PLLA-PVP组中的表达低于PLLA组，差异有统计学意义(p均<0.05)，同样低于Control组，差异有统计学意义(p均<0.01)，而PLLA与Control 组中的表达差异无统计学意义(p均>0.05)。TGF-β1、α-SMA、Col I在CLA-PLLA-PVP组中的表达低于Control组，差异有统计学意义(p均<0.05)，在PLLA组中的表达也均低于Control组，差异有统计学意义(p均<0.05)，而在PLLA组和CLA-PLLA-PVP组中的表达无明显统计学差异(p均>0.05) (参见图15)。
图14中，3组上颌窦黏膜免疫组化染色观察(×200)：IL-4、IL-8、TNF-α、 TGF-β1、α-SMA和Col Ⅰ在3组鼻窦黏膜中均有表达，IL-4、IL-8、TNF-α、 TGF-β1主要表达于基底细胞、炎性细胞中，α-SMA和Col Ⅰ主要表达在黏膜下结缔组织中。其中IL-4、IL-8、TNF-α在Control组和PLLA组中表达明显，阳性细胞呈明显的棕黄色或棕褐色，在CLA-PLLA组仅见少量表达，阳性细胞呈浅黄色。TGF-β1、α-SMA、Col I在Control组中表达明显，呈棕褐色，在PLLA组和CLA-PLLA-PVP组中表达减少，呈棕黄色或浅黄色。图15是 IL-4、IL-8、TNF-α、TGF-β1、α-SMA和Col Ⅰ在各组中的免疫组化染色结果比较，其中，NS：无统计学意义；*：p＜0.05。
5、扫描电子显微镜观察结果
从图16的扫描电子显微镜照片可观察到，Control组的黏膜表面纤毛排列紊乱、倒伏、长短不一、大片脱落，上皮表面有分泌物。PLLA组可见部分纤毛脱落、紊乱；CLA-PLLA-PVP组纤毛排列整齐、长短一致、粗细均匀、无脱落，可见纤毛再生。
图16中，(A，B)Control组：黏膜表面纤毛排列紊乱、倒伏、长短不一、大片脱落，上皮表面有分泌物。(C，D)PLLA组：粘膜表面部分脱落，纤毛紊乱。(E、F)CLA-PLLA-PVP组：黏膜表面完整，纤毛排列整齐、长短一致、粗细均匀、无脱落，可见纤毛再生。
6、QRT-PCR结果
CLA-PLLA-PVP组中IL-4mRNA、IL-8mRNA、TNF-αmRNA的相对表达量低于PLLA组，差异有统计学意义(p<0.05，p<0.05，p<0.01)，同样低于Control组，差异有统计学意义(p<0.01，p<0.05，p<0.01)，在PLLA组与Control组中的表达差异无统计学意义(p均>0.05)。TGF-β1mRNA、α-SMA mRNA、Col ⅠmRNA的相对表达量在CLA-PLLA-PVP组中的表达低于Control组，差异有统计学意义(p<0.01，p<0.05，p<0.01)，在PLLA组中的表达同样低于Control组，差异有统计学意义(p<0.01，p<0.01，p<0.05)，而在CLA-PLLA-PVP组和PLLA组之间的差异无统计学意义(p均>0.05)，具体见图17(*：p<0.05；NS：无统计学意义)。
7、Western Blot蛋白质免疫印迹结果
根据Western Blot蛋白质免疫印迹结果显示，CLA-PLLA组中IL-4、IL-8、 TNF-α的相对表达量低于PLLA组，差异有统计学意义(p<0.01，p<0.01， p<0.05)，同样低于Control组，差异有统计学意义(p均<0.01)，在PLLA 组与Control组之间无统计学差异(p均>0.05)。TGF-β1、α-SMA、Col Ⅰ的相对表达量在PLLA组中的表达低于Control组，差异有统计学意义(p<0.01， p<0.05，p<0.05)，在CLA-PLLA-PVP组中的表达也低于Control组(p<0.05， p<0.01，p<0.01)，TGF-β1、α-SMA、Col Ⅰ的相对表达量在PLLA组和 CLA-PLLA-PVP组之间没有统计学差异(p均>0.05)。具体见图18。
图18是各组IL-4、IL-8、TNF-α、TGF-β1、α-SMA、Col Ⅰ的Western Blot 结果及相对表达量比较，其中，*：p＜0.05；NS：无统计学意义。
由以上实施例可见，本发明以临床实践为出发点，通过工程手段为临床问题提供解决方案。根据实验结果，本发明所述的聚L-乳酸纤维-PVP膜负载克拉霉素后，可植入、粘附鼻腔鼻窦内持续缓释克拉霉素，并可自行降解，在慢性鼻-鼻窦炎术后能够发挥抗菌、抗炎、抗粘连作用，防止术后反复感染、粘连等并发症。本发明所述的载药纳米纤维膜可用于鼻腔鼻窦防感染粘连，具有使用方便、免除反复给药、避免全身用药的不良反应等优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于使本技术领域的专业技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，是能够实现对这些实施例的多种修改的，而这些修改也应视为本发明应该保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜，其特征在于，所述载药纳米纤维膜的成分包括：聚L-乳酸、聚乙烯吡咯烷酮和克拉霉素；所述载药纳米纤维膜的纤维直径在10微米以下。
2.根据权利要求1所述的载药纳米纤维膜，其特征在于，以所述聚L-乳酸的质量为基准，所述克拉霉素的负载浓度为8％～12％。
3.根据权利要求2所述的载药纳米纤维膜，其特征在于，所述载药纳米纤维膜中聚L-乳酸与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1：(0.01～0.5)。
4.一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
将聚L-乳酸、聚乙烯吡咯烷酮和克拉霉素均溶解于第一有机溶剂中，得到第一混合溶液；
将所述第一混合溶液进行静电纺丝，得到用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜，其中纤维直径在10微米以下。
5.一种用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
将聚L-乳酸和聚乙烯吡咯烷酮溶解于第二有机溶剂中，得到第二混合溶液；
将所述第二混合溶液进行静电纺丝，得到复合纤维膜；
将克拉霉素负载在所述复合纤维膜中，得到用于防鼻腔感染粘连的载药纳米纤维膜，其中纤维直径在10微米以下。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述聚L-乳酸与克拉霉素的质量比为1：(0.08～0.12)。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述聚L-乳酸与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1：(0.01～0.5)。
8.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂或第二有机溶剂独立地为二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
9.根据权利要求4～8中任一项所述的制备方法，其特征在于，在进行静电纺丝之前，所述第一混合溶液或第二混合溶液还通过超声处理消除气泡。
10.根据权利要求4～8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的电压为13～15千伏；所述静电纺丝时，喷丝头与集电极之间的距离为13～15厘米。
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