CN112121149B - 一种治疗术后腹腔粘连的药物及其新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗术后腹腔粘连的药物，所述药物为重组人血管内皮抑制素，所述的重组人血管内皮抑制素以注射方式给药，所述药物作为治疗术后腹腔粘连药物的应用；本发明能够有效减轻术后腹腔粘连，是腹部外科手术后最常见的并发症，以及减少腹腔粘连的并发症；提高经历腹部手术的治愈率，减少因腹腔粘连产生的经济负担。

Description

一种治疗术后腹腔粘连的药物及其新用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，涉及重组人血管内皮抑制素的新用途，特别涉及一种治疗术后腹腔粘连的药物及其新用途。

背景技术

腹腔粘连是指腹部在遭受手术损伤、缺血、感染或异物等刺激后，在腹腔脏器间或脏器与腹膜间产生的以胶原覆盖为主的纤维性粘连带，是腹部外科手术后最常见的并发症之一。在经历腹部手术的患者当中，超过九成的人会出现腹腔粘连的情况。腹腔粘连的并发症主要包括慢性腹痛、反复发作的肠梗阻、女性不孕等，其中肠梗阻是最常见的并发症，死亡率接近10％。据文献报道，在诊断性腹腔镜检查中，96％的患者因腹腔粘连出现慢性腹痛和/或盆腔疼痛，60-70％的患者因此出现小肠梗阻，20-40％的女性患上不孕症。这些并发症通常需要多次入院诊治，增加医疗负担。据统计，在美国每年因腹腔粘连产生的经济负担至少为20亿美元，并处于上升趋势。迄今虽然对于腹腔粘连的研究从未止步，但术后粘连是如何产生的却无人能阐明，关于针对如何有效预防和治疗腹腔粘连也没有达成共识，因此众多外科医生为其所困扰。目前研究较多的主要有以下几个方面，一、减少手术创伤，腹腔镜手术的开展有利于降低术后腹腔粘连的发生率及粘连的严重程度；二、在受损组织与腹膜之间施加物理屏障加以隔离,如透明质酸羧甲基纤维素、聚乳酸薄膜等；三、非甾体类抗炎药、组织纤溶酶原激活剂、传统中药如川穹嗪、大黄素等药物的疗效在动物模型中得以证实。虽然上述研究成果部分已应用至临床，但实际效果并不能令人满意，而且到目前为止尚无相关的权威性治疗指南和明确的治疗方法，因此需要进一步研究以找到可以防治术后腹腔粘连的更安全有效的药物。腹腔粘连的发生发展是一个极为冗杂的过程，目前发现其涉及但不仅限于氧化应激、炎性介质释放、血管新生、血液凝集、纤维蛋白溶解等过程。上述反应彼此交融，相互关联。

内皮抑素(Endostatin)是于1997年由O'Reilly MS等从培养的鼠血管内皮瘤培养液中提取并发现的；2005年，我国自主研发的重组人血管内皮抑制素(Recombinant HumanEndostatin,RHE)正式予以批准上市，用于临床非小细胞肺癌的靶向治疗及其他恶性肿瘤的辅助治疗。

发明内容

为解决目前无有效药物防治术后腹腔粘连的情况，本发明首次将用于临床非小细胞肺癌的靶向治疗及其他恶性肿瘤的辅助治疗的重组人血管内皮抑制素，应用到术后腹腔粘连的防治，解决目前防治术后腹腔粘连实际效果不佳等技术问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种治疗术后腹腔粘连的药物，所述药物为重组人血管内皮抑制素。

优选的，所述的重组人血管内皮抑制素以注射方式给药。

优选的，所述药物作为治疗术后腹腔粘连药物的应用。

优选的，所述药物的使用剂量为0.6mg/100g。

与现有技术相比本发明的有益效果为：

1、本发明能够减轻术后腹腔粘连的炎症和纤维化，使粘连组织沉积的胶原纤维的平均厚度减少；

2、本发明通过减少炎症因子释放及胶原蛋白沉积、抑制血管新生等方式来有效减少术后腹腔粘连的形成；

3、本发明能够有效减轻术后腹腔粘连，减少腹腔粘连相关的并发症，减少因腹腔粘连产生的经济负担；

4、本发明为治疗术后腹腔粘连提供一种更好的新途径；

5、本发明为重组人血管内皮抑制素提供一种新的用途。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为术后7天各组大鼠腹腔粘连情况；

图2为腹腔粘连大体评价

注：(a)各组大鼠腹腔粘连发生率示意图；(b)各组大鼠腹腔粘连评分示意图；

图3为术后7天各组大鼠血清TNF-α和IL-6表达水平

注：(a)各组大鼠血清TNF-α的浓度；(b)各组大鼠血清IL-6的浓度；

图4为术后7天各组粘连组织的HE染色结果

注：(a)为各组大鼠粘连组织或对应盲肠组织的典型HE染色情况，黑色箭头所指为粘连带，放大倍数200×；(b)为各组大鼠HE染色评分结果示意图；

图5为术后7天各组粘连组织的Masson染色结果

注：(a)为各组大鼠粘连组织或对应盲肠组织的Masson染色情况，黑色箭头所指为粘连带，放大倍数200×；(b)为各组大鼠Masson染色评分结果示意图；

图6为术后7天各组粘连组织的免疫组化染色结果

注：(a)为各组大鼠粘连组织或对应盲肠组织的VEGF免疫组化染色情况，黑色箭头所指为粘连带，放大倍数200×；(b)为各组大鼠粘连组织或对应盲肠组织的TGF-β1免疫组化染色情况，黑色箭头所指为粘连带，放大倍数200×；(c)为各组大鼠VEGF免疫组化染色半定量评分；(d)为各组大鼠TGF-β1免疫组化染色半定量评分；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种治疗术后腹腔粘连的药物，所述药物为重组人血管内皮抑制素。

优选的，所述的重组人血管内皮抑制素以注射方式给药。

优选的，所述药物作为治疗术后腹腔粘连药物的应用。

优选的，所述药物的使用剂量为0.6mg/100g。

实施例1

1、材料和方法

1.1动物

从湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买了32只健康的雌性SD大鼠，体重在230-270g(合格证号SCXK-(湘)2016-0002)，寄养于中南大学实验动物学部屏障系统中。实验前，大鼠在标准实验条件下适应环境7天，给予标准动物饲料和水，环境温度维持在20-26℃，相对湿度30％-70％。实验过程遵循人道主义原则确保实验动物的福利伦理，所有动物实验操作程序提请中南大学实验动物福利伦理委员会审核通过，在中南大学实验动物学部完成。

1.2药物与试剂

重组人血管内皮生长抑制素购自山东先声生物制药有限公司，并用生理盐水稀释到1.5mg/mL，现用现配；医用透明质酸钠凝胶购自浙江景嘉医疗科技有限公司.TNF-αand白介素-6(Interleukin-6，IL-6)大鼠酶联免疫吸附检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；VEGF抗体(兔抗大鼠多克隆IgG抗体)、TGF-β1抗体(兔抗大鼠多克隆IgG抗体)均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3实验设计与建模

32只大鼠随机分成4个组：假手术组、对照组、透明质酸钠(HA)组、重组人血管内皮抑制素(RHE)组。术前所有大鼠禁食禁水12小时。消毒皮肤后按大鼠体重以3％戊巴比妥钠按0.15mL/100g的剂量进行腹腔注射麻醉，麻醉满意后将大鼠仰卧位固定，腹部备皮，用络合碘消毒术区皮肤并铺巾。腹腔粘连模型的建立参照既往文献，具体操作如下：取下腹部前正中切口(2-3cm)，逐层进腹，避免损伤肠道。探查腹腔内情况，排除术前腹腔存在粘连的大鼠。将盲肠轻轻提拉至体外，放在盐水浸湿的纱布上，除假手术组外，在盲肠前外侧面用干纱布均匀摩擦浆膜层40次至肠壁出现出血点，形成2.0cm×1.5cm的伤口。用同样的方法处理与受损部位相对的腹壁。在关腹前，将盲肠放回腹腔并使两个处理面完全接触。随后以3-0的丝线逐层缝合伤口，确保肠管暴露在空气中的时间在5min以内。假手术组不予任何药物直接关腹；对照组根据体重以0.4mL/100g的生理盐水注射至盲肠受损部位后关腹；透明质酸钠组在关腹前将2mL浓度为1％医用透明质酸钠凝胶涂抹在盲肠及腹壁受损部位，涂抹均匀后关腹；RHE组在关腹前按体重以0.4mL/100g的重组人血管内皮抑制素稀释液注射至盲肠及对应腹壁磨损部位后小心关腹。术后所有大鼠禁食12小时，可自由饮水。之后RHE组每日腹腔注射稀释的重组人血管内皮抑制素(4mL/kg)，对照组每日腹腔注射生理盐水(4mL/kg)，持续一周。

1.4大体粘连评价

实验周期内每日观察大鼠的伤口愈合、活动、进食及排便情况。一周后，提前12小时将所有大鼠禁食禁饮，麻醉后在剑突下取反U型切口缓慢进腹，观察大鼠腹腔粘连情况并拍照记录，按照Nair标准进行腹腔粘连评分，0级计0分为完全无粘连；1级计1分为内脏间或内脏与腹壁间存在1条粘连带；2级计2分为内脏间或内脏与腹壁间存在2条粘连带；3级计3分为存在2条以上粘连带，但内脏未直接粘连到腹壁或形成肠梗阻；4级计4分为内脏直接粘连到腹壁，不论粘连带多少。评分由对此实验研究方案不知情的两名外科医师独立完成并记录分值。评分完成后取眶静脉血及粘连组织标本，无粘连的大鼠取对应的盲肠组织，之后以迅速脱臼法处死大鼠。

1.5酶联免疫吸附试验测定IL-6和TNF-α水平

将取自眶静脉的血液样本置于在高速低温离心机中在4℃以转速为3000r/min离心15min，取上层血清并保存在-80℃冰箱内。根据厂家说明书使用酶联免疫吸附试验试剂盒检测血清中IL-6和TNF-α的水平。

1.6组织病理学评估炎症及纤维化

将组织标本制成3μm厚的石蜡切片，对一部分切片行HE染色，在显微镜下观察染色切片的病理改变情况，根据HE染色标准来进行评分(表1)，评分由两名对此实验不知情的病理医师独立完成，每张切片至少观察五个随机高倍镜视野。

1.7Masson染色评估胶原沉积

使用Masson染色技术处理一部分石蜡切片，镜下观察染色效果，胶原纤维被染成蓝色，将切片扫描后使用CaseViewer软件随机选取八个高倍镜视野测量粘连组织胶原纤维的厚度并取平均值。

1.8免疫组织化学染色评估VEGF和TGF-β1表达情况

按照试剂制造商的说明进行操作，将组织切片经过常规脱蜡、水化、洗涤、抗原修复处理，室温下与浓度为3％过氧化氢溶液孵育15分钟，然后用山羊血清封闭30分钟。甩去封闭液，分别滴加VEGF(1:100稀释)和TGF-β1(1:100稀释)一抗4℃孵育过夜。二抗在室温下孵育15分钟，冲洗后用进行显影，苏木精复染，然后将切片脱水封片。根据组织病理学评估所述，为了评估这些指标的表达，至少对每张切片的五个随机高倍镜视野下的粘连组织进行观察，进行免疫组织化学染色的半定量。首先按染色强度计分：未着色计0分,淡黄色计1分,棕黄色计2分,棕褐色计3分；再按着色细胞数百分比计分:全阴性计0分,阳性细胞≤10％计1分，11％-50％计2分，51％-75％计3分，＞75％计4分，根据两项分数的乘积来判断阳性程度，染色强度与阳性细胞百分比的乘积＜3分为阴性(-)，≥3分为弱阳性(+),≥4分为中度阳性(++)，≥6分为强阳性(+++)。再依据表达情况计分：0-阴性，1-弱阳性，2-中度阳性，3-强阳性。

1.9统计分析

用SPSS19.0统计软件对所有数据进行分析，本实验所有结果除特殊说明外，均采用均数±标准差表示，对比组间差异使用t检验或多样本方差检验(ANOVA)，三组间比较采用完全随机设计多个样本比较的Kruskal-Wallis检验，两组率的比较采用χ²检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组术后一般情况

术中及术后各组大鼠未出现死亡，腹部切口均愈合良好，无伤口裂开、切口疝发生。术后1天，各组大鼠一般情况不佳，活动较少，基本不进食，少量饮水。术后2天，情况较第一天稍改善，活动量、进食和饮水增加。自术后第3天，各项情况逐步恢复同术前状态。

2.2各组大体粘连评价

图1展示了术后7天各组大鼠腹腔粘连的情况，假手术组基本未见腹腔粘连；对照组可见明显的粘连组织，难以分离；透明质酸钠组可见局部有粘连组织形成，粘连组织疏松易分离；RHE组部分有粘连组织形成，粘连带可钝性分离或自行脱落。黑色箭头所指为粘连部分。比较各组腹腔粘连发生率，最高的为对照组，最低的为假手术组，透明质酸钠组和RHE组介于两者之间，且与对照组相比，两组的腹腔粘连发生率无明显降低(P＞0.05)(图2-a)。而与假手术组对比，对照组的腹腔粘连等级评分较假手术组明显升高，组间差异具有统计学意义(P＜0.01)，说明腹腔粘连模型的构建是成功的；与对照组对比，透明质酸钠组和RHE组的腹腔粘连等级评分均降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)；相较于透明质酸钠组，RHE组的腹腔粘连等级评分降低，但不具有统计学意义(P＝0.554)(图2-b)。综上，虽然RHE组的腹腔粘连的发生率相较于对照组无明显下降，但其粘连的严重程度是明显降低的，因此考虑重组人血管内皮抑制素可在一定程度上减轻术后腹腔粘连的形成。注：与假手术组相比，P＜0.01；与对照组相比，P＜0.01。采用均数±标准差表示所有数据，分析两组样本之间的差异使用t检验。分析两组之间粘连率的差异使用χ2检验。

2.3各组血清TNF-α和IL-6水平的测定

各组大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量分别如图3-a、3-b所示，与假手术组相比，对照组大鼠血清的TNF-α和IL-6含量增多，具有显著差异(P<0.01)；而在RHE组大鼠血清中TNF-α和IL-6表达水平较对照组降低，差异具有明显统计学意义(P<0.01)，RHE组与透明质酸钠组血清的TNF-α和IL-6表达水平无明显差异(P＝0.052、P＝0.383)，提示重组人血管内皮抑制素可能通过减少炎症因子的释放来发挥抗粘连的作用。注：与假手术组相比，P＜0.01；与对照组相比，P＜0.01。采用均数±标准差表示所有数据，分析两组样本之间的差异使用t检验。

2.4各组组织炎症及纤维化情况

观察各组大鼠粘连组织或对应盲肠组织切片HE染色结果(图4-a)，假手术组盲肠肠壁组织结构清晰，各组织层基本无充血及炎症等改变；对照组盲肠浆膜层与邻近组织形成粘连，纤维组织广泛增生，形成粘连的浆膜层高度充血水肿，其间可见大量炎性细胞浸润，偶可见新生血管及中性粒细胞聚集成的微脓肿；透明质酸钠组可见中度充血水肿，纤维组织轻度增生，炎性细胞浸润；在RHE组各组织层大致结构保持完整，少许纤维组织增生，浆膜层可见轻度充血水肿，散布少许炎性细胞。图4-b所示RHE组的炎症及纤维化评分均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；而与透明质酸钠组相比，RHE组的炎症及纤维化评分降低不明显(P＝0.758)。HE染色结果表明重组人血管内皮抑制素可以减轻大鼠模型术后腹腔粘连的炎症和纤维化。注：与假手术组相比，P＜0.01；与对照组相比，P＜0.01。采用均数±标准差表示所有数据，析两组样本之间的差异使用t检验。

2.5各组组织胶原纤维沉积情况

假手术组浆膜层基本没有蓝染的胶原组织，而在对照组中粘连部分广泛被染成深蓝色，这表明其中有大量的胶原纤维沉积，透明质酸钠组和RHE组局部浆膜层外呈现浅蓝色，这意味着胶原纤维在两组中沉积相对较少(图5-a)。相较于对照组，经过重组人血管内皮抑制素处理后，粘连组织沉积的胶原纤维的平均厚度减少52.6％(图5-b)；相比于透明质酸钠组，RHE组的胶原纤维沉积厚度也明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)。注：与假手术组相比，P＜0.01；与对照组相比，P＜0.01；与透明质酸钠组相比，P＜0.01。采用均数±标准差表示所有数据，分析两组样本之间的差异使用t检验。

2.6各组组织中VEGF和TGF-β1的表达水平

各组大鼠粘连组织的VEGF和TGF-β1免疫组织化学染色的特征性图片分别展现在图6-a、图6-b中，其半定量结果分别如图6-c、图6-d所示。实验结果表明:VEGF在对照组中的表达显著高于假手术组(P<0.01)；而与对照组相比，透明质酸钠组和RHE组粘连组织中的VEGF蛋白水平均降低(P<0.05)，提示重组人血管内皮抑制素可能通过抑制VEGF作用而减少粘连形成。相较于假手术组，对照组中TGF-β1蛋白表达水平明显升高(P<0.01)；在透明质酸钠组中TGF-β1蛋白的表达情况与对照组相比无明显变化(P＝0.12)，而在RHE组中其表达较对照组和透明质酸钠组水平下降(P<0.05)。注：与假手术组相比，P＜0.01；与对照组相比，P＜0.05，P＜0.01；与透明质酸钠组相比，P＜0.05。采用均数±标准差表示所有数据，分析两组样本之间的差异使用t检验。

本实验选用医用透明质酸钠凝胶为治疗对照组药物，是目前在临床中应用较为广泛的防粘连材料，其主要成分为透明质酸钠。既往研究发现透明质酸钠涂抹在受伤组织表面形成隔离层，防止受损部位与其他组织接触从而抑制粘连的形成；此外透明质酸钠能够使白细胞趋化和纤维蛋白渗出等炎症反应受到抑制，同时减少术后渗血，促进创面修复等来减少粘连形成。此次实验作为重组人血管内皮抑制素治疗效果的对照，结果表明总体看两者均表现出不错的抗粘连效果，并且相比下重组人血管内皮抑制素的效果略优，尤其在减少纤维蛋白沉积和抗炎方面。

综上所述，通过对大鼠的术后一般情况、大体粘连评价、血清TNF-α和IL-6水平的测定、组织炎症及纤维化情况、组织胶原纤维沉积情况、VEGF和TGF-β1的表达水平数据可以看出，重组人血管内皮抑制素能够有效防治术后腹腔粘粘的形成。

Claims (3)

1.重组人血管内皮抑制素在制备治疗术后腹腔粘连药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的重组人血管内皮抑制素以注射方式给药。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，药物的使用剂量为0.6mg/100g。