CN103642800A - siRNA分子组合物及其在治疗增生性瘢痕中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及siRNA分子组合物及其在治疗增生性瘢痕中的用途。所述的siRNA分子组合物包含：核苷酸序列含有a）5′-ccccggaggugauuuccaucuacaa-3′，5’-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3’的siRNA分子，和核苷酸序列含有b）5′-gucuuuggucuggugccuggucuga-3′，5’-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3’的siRNA分子。本发明证实上述siRNA分子组合物可以促进体外的增生性瘢痕成纤维细胞凋亡，还对动物模型中的增生性瘢痕具有良好的治疗效果。

Description

siRNA分子组合物及其在治疗增生性瘢痕中的用途

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因治疗技术领域，具体地说，是siRNA分子在治疗增生性瘢痕中的用途。

背景技术

皮肤是人体最大器官，具备防护、免疫、排泄等功能，其中最为重要的功能是防护、维持体内环境的稳态。当皮肤的完整性受到较大破坏时，体内的稳态出现不平衡，外界侵袭因子容易进入体内，直接威胁到个体的生存。在物种进化的过程中，出现了创口的瘢痕愈合模式，这种愈合方式能最快地恢复皮肤的完整性，大大提高了物种的生存机率。因此，瘢痕是人体皮肤创口愈合不可或缺的产物。

但在创口愈合的过程中常常发生瘢痕的过度生长，形成增生性瘢痕，影响功能和外观。据文献报道，40%-70%的外科手术术后患者以及91%的烧伤患者愈合后形成增生性瘢痕，整形外科门诊通常有超过半数的患者因瘢痕就诊。目前对于增生性瘢痕的治疗方法包括手术方法和非手术方法，但都存在一定的局限性。如何改善、治疗增生性瘢痕，一直是整形外科医生关注的课题，同时也是大众关心的问题。

增生性瘢痕病因主要包括创口张力过大、感染等。增生性瘢痕形成的机制包括成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化、成纤维细胞的增殖、过度血管化、细胞胶原分泌增加以及细胞外基质过度堆积。在增生性瘢痕形成的机制研究中，对TGF-β（转化生长因子-β）的研究最多。在TGF-β的三个亚型中，TGF-β1与增生性瘢痕的形成关系最为密切，TGF-β1参与了成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，并促进细胞分泌胶原和组织血管化。已有诸多的实验报道，抑制TGF-β1的表达可以减轻增生性瘢痕。COX-2（环氧合酶-2）是PGE（前列腺素E）的前体酶，PGE是炎症反应的重要因子，对血管新生有促进作用。同时TGF-β1和COX-2对于创口愈合过程当中的上皮间质转换都有一定的促进作用。目前关于COX-2在治疗增生性瘢痕中的研究较少，关于TGF-β1和COX-2之间的作用也鲜有报道。

中国专利文献CN201010260249.8，申请日2010.08.24，发明名称为“促进皮肤伤口无疤痕愈合的siRNA即应用”，公开了促进皮肤伤口无疤痕愈合的siRNA分子、靶向多个伤口无疤痕愈合相关基因的多个siRNA分子的鸡尾酒组合、以siRNA分子或者其鸡尾酒组合作为有效成分的药物组合物，通过细胞实验以及小鼠和猪皮肤创伤模型证明了该药物组合物可以促进因外伤、外科手术或糖尿病皮肤溃疡等造成的皮肤伤口达到无疤痕愈合，其中siRNA分子可以靶向那些造成伤口病理性修复或不良反应的基因，siRNA双链有不同的长度和不同的末端，可以靶向人、小鼠及猪细胞同一基因的同源序列，鸡尾酒组合中的多个siRNA能同时抑制伤口炎症和血管再生的各种相关基因，药效更显著，药物组合物中组氨酸-赖氨酸聚合物、树枝状聚合物或脂质体等药物载体能以纳米颗粒的形式增强siRNA导入皮肤组织。但是该文献公开的是将siRNA应用于创口在愈合过程中促进愈合并减少疤痕形成，创口治疗和已形成的瘢痕治疗是完全不同的两个概念，涉及不同的生理过程，而目前关于用siRNA来治疗已形成的增生性瘢痕还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种siRNA分子组合物。

本发明另一的目的是，提供上述siRNA分子组合物的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

siRNA分子组合物，所述的siRNA分子组合物包含：

核苷酸序列含有a）5′ -ccccggaggugauuuccaucuacaa-3′，

5’-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3’的siRNA分子，和

核苷酸序列含有b）5′ -gucuuuggucuggugccuggucuga-3′，

5’-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3’的siRNA分子。

优选地，所述的siRNA分子组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

优选地，所述的药学上可接受的载体选自组氨酸和赖氨酸的聚合物。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的siRNA分子组合物在制备治疗增生性瘢痕的药物中的用途。

所述的治疗增生性瘢痕是指治疗已形成的增生性瘢痕，优选地，所述的治疗增生性瘢痕是指消退已形成的增生性瘢痕或减小已形成的增生性瘢痕的体积。

本发明优点在于：

本发明应用TGF-β1和COX-2联合siRNA方法，对体外的增生性瘢痕成纤维细胞进行TGF-β1和COX-2表达的敲低，可以达到促进增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的效果；此外，在动物模型中，证实TGF-β1和COX-2联合siRNA对增生性瘢痕的消退具有良好的治疗效果。

附图说明

图1是体外实验中瘢痕成纤维细胞的镜下形态。

图2是体外实验基因沉默效应检测中目的基因TGF-β1、COX-2mRMA表达情况。

图3是体外实验细胞增殖周期检测结果。

图4是体外实验基因沉默效应检测中相关目的基因α-SMA、Col1a1、Col3a1mRMA表达情况。

图5是体外实验α-SMA免疫荧光染色结果。

图6是体外实验Annexin V/PI流式细胞凋亡检测结果。

图7是体外实验瘢痕成纤维细胞的扫描电镜图。

图8是体外实验瘢痕成纤维细胞的透射电镜图。

图9是体外实验细胞上清羟脯氨酸含量检测结果。

图10是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织块大体形态结果。

图11是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织块体积测量结果。

图12是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织中目的基因TGF-β1、COX-2、α-SMA、Col1a1的表达情况。

图13是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织HE染色结果。

图14是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织Masson三色染色结果。

图15是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织VEGF免疫组化染色结果。

图16是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织CD31免疫组化染色结果。

图17是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织内羟脯氨酸含量检测检测结果。

图18中左图是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织块拍照结果，右图是瘢痕组织块体积测量结果。

图19是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织中目的基因TGF-β1、COX-2、α-SMA、Col1a1的表达情况。

图20是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织HE染色结果。

图21是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织Masson三色染色结果。

图22是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织VEGF免疫组化染色结果。

图23是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织CD31免疫组化染色结果。

图24是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织内羟脯氨酸含量检测结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1实验材料

1.1 siRNA有效成分

TGF-β1 siRNA分子：正义链：5′ -ccccggaggugauuuccaucuacaa-3′，反义链：5’-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3’；

COX-2 siRNA分子：正义链：5′ -gucuuuggucuggugccuggucuga-3′，反义链：5’-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3’；

药物载体：缩氨酸（HKP），组氨酸和赖氨酸的聚合物；

STP705（siRNA鸡尾酒）：将上述TGF-β1 siRNA分子、COX-2 siRNA分子和HKP形成纳米颗粒，其中TGF-β1 siRNA分子、COX-2 siRNA分子拷贝数比例为1：1，两种siRNA分子与HKP的重量比为1：4。治疗时以20μg/ml的siRNA浓度进行局部病灶注射。

以上药物由苏州圣诺生物有限公司提供。

1.2抗体

兔抗人α-肌动蛋白（α-SMA，alpha smooth muscle Actin）单克隆抗体（ab5694，Abcam，Iowa，USA），免疫组化染色一抗稀释比例1:200，免疫荧光染色一抗稀释比例1:100；

兔抗人I型主要组织相容性抗原（human MHC class I）单克隆抗体（cat. #1913-1，Epitomics，California，USA），免疫组化染色一抗稀释比例1:250；

兔抗人CD31单克隆抗体（ab38264，Abcam，Iowa，USA），免疫组化染色一抗稀释比例1:50。；

兔抗人血管内皮生长因子（VEGF，vascular endothelial growth factor）单克隆抗体（cat. #1909-1，Epitomics，California，USA），免疫组化染色一抗稀释比例1: 50。

1.3 Q-PCR用引物

2实验方法

2.1体外实验

2.1.1组织标本来源

增生性瘢痕组织标本均来源于我院整形外科住院患者，增生性瘢痕切除术中标本。标本1，患儿，男，3岁，烧伤后左足背增生性瘢痕伴挛缩畸形，瘢痕形成1年；标本2，患儿，女，6岁，烧伤后颈部增生性瘢痕伴挛缩畸形，瘢痕形成6个月。

2.1.2人增生性瘢痕细胞分离和培养

在手术室无菌条件下将手术切下的增生性瘢痕组织块去除表皮及皮下脂肪组织，然后在超净工作台上用眼科剪刀将组织剪成大小约 0.5-1mm³的小块，用0.25% I型胶原酶消化2-4小时，待组织块消化成絮状后滤网过滤，获取消化分离的细胞。再加入适量含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液继续培养，接种于培养皿中，在95%空气、5%CO₂、37℃的饱和湿度条件下培养。每三天换液一次。细胞融合达到90%时，传代。

2.1.3细胞增殖曲线的测定

细胞增殖实验选用增殖状态良好的P2代细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，细胞计数。96孔板每孔加入100微升2000个细胞。6小时后细胞贴壁，更换培养液，培养液中分别加入STP705、HKP、TGF-β1 siRNA、COX-2 siRNA，药物浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml。干预48小时后，吸尽培养液，PBS冲洗3次，每孔加入100μl培养液和10μl CCK-8溶液。加入相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为blank。在细胞培养箱内继续孵育3小时后，用酶标仪（Varioskan flash，Thermo Electron Co.）检测。在波长450nm测定吸光度，各孔数值减去blank值，获得绝对吸光值。绘制细胞增殖曲线。

2.1.4药物体外干预实验

增生性瘢痕成纤维细胞传至第三代，以2×10⁶接种于6孔板内。细胞贴壁后换液，加入不同干预因素。设置2组，对照组细胞加入单纯培养液，STP705组在培养液中加入STP705，浓度为10μg/ml。干预48小时后进行检测，观察细胞形态。

2.1.5 RNA沉默效果检测

Q-PCR检测对照组和各实验组在干预48小时后的目的基因TGF-β1、COX-2表达的变化，以及相关目的基因α-SMA、Col1a1、Col3a1表达的变化。

2.1.6细胞增殖周期检测

干预48小时后，0.25%胰蛋白酶消化形成单细胞，收集成纤维细胞。将细胞混匀后，短时低速离心1000rpm/min、5min，弃上清，加PBS吹打均匀，重复3次。加70%酒精4℃过夜。2000rpm、5min离心去乙醇，PBS洗涤两遍。加50μg/ml PI（propidium iodide碘化丙啶）染料500μl，4℃，过夜。检测前单细胞滤网过滤，流式细胞仪（EPICS Altra，BACKMAN COUNLTER）检测细胞周期。

2.1.7 Annexin V/PI细胞凋亡检测

Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料（如PI）合并使用，来区分凋亡细胞（Annexin V+/核酸染料-）与死亡细胞（Annexin V+/核酸染料+）。 

干预48小时后，胰蛋白酶消化细胞，终止消化，离心1500rpm、5min，调整待检测细胞浓度为10⁶个/ml，取200μl，转至流式检测管，1000rpm×5min（4℃）。预冷的PBS 1ml洗涤两次，1000rpm×5min（4℃）。将细胞重悬于60μl binding buffer，加入4μl Annexin V-FITC（20μg /ml），轻轻混匀，避光冰上放置15分钟。每个样品临上机前加入4μl PI（50μg /ml），加Buffer补足200μl，2分钟后迅速检测。同时以不加Annexin V-FITC及PI的一管作为阴性对照。

结果分析：以AnnexinV为横轴，PI为纵轴，左上象限为机械性损伤细胞；右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞；左下为阴性正常细胞；右下为早期凋亡细胞。

2.1.8 α-SMA免疫荧光染色

细胞干预48小时后，吸尽培养皿内培养液。固定：4%多聚甲醛固定10min，然后PBS洗3次，每次5分钟，干燥后选择细胞染色区域，油性笔标记。抗原修复：滴加抗原修复液，作用5min。透膜：加0.1% Triton-X100透膜10min，PBS洗三次。封闭：10%羊血清封闭1h。一抗孵育：在细胞表面滴加1:100 α-SMA抗体，放在湿盒内，4℃过夜。一抗孵育完毕，PBS洗涤三次。二抗孵育：避光操作，在细胞表面滴加1:200羊抗兔二抗，作用30min。设置阴性对照组、不加一抗只加二抗组。二抗孵育完毕，PBS洗涤三次。1:1000 DAPI染色1分钟，PBS洗三次。荧光显微镜下观察，拍照。

2.1.9扫描电镜检测

制作细胞爬片，细胞干预48小时后，吸尽培养液，PBS洗涤三次。加入2%锇酸固定，4℃过夜。固定、脱水、干燥及表面镀金。扫描电镜（Quaya-200，PHILIPS，Holland）检测。

2.1.10透射电镜检测

细胞干预48小时后，吸尽培养液，PBS洗涤三次。加入2%锇酸室温固定1小时，用橡胶细胞刮匙将细胞刮下。离心制成细胞团块。制样，超薄切片，粘贴。投射电镜（CM-120 Bio Twio，PHILIPS，Holland）检测。

2.1.11羟脯氨酸检测

实验原理：羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在。测量组织、体液、培养液中的羟脯氨酸含量，可以推算出胶原蛋白的含量。

T氯胺检测法，Hydroxyproline Colorimetric Assay Kit（Catalog #K555-100，BioVision，USA）。配制T氯胺试剂，每孔6μl T氯胺、94μl氧化反应缓冲液。配制DMAB（甲基氨基苯甲醛）试剂：每孔二甲基氨基苯甲醛50μl，高氯酸/异丙醇50μl，避光保存。

标准曲线的绘制：配置0.1mg/ml羟脯氨酸溶液，1mg/ml羟脯氨酸标准品10μl 加90μl双氧水，混匀。分别取0，2, 4, 6, 8, 10μl 1mg/ml羟脯氨酸溶液稀释至100μl，制成标准品样本。取10μl标准样本加入96孔板内，真空下干燥样本。每孔加入100μl T氯胺试剂，室温孵育5分钟，加入100μl DMAB试剂，60℃孵育90分钟。酶标仪560nm下测量吸光度。加入0标准品的孔为blank，每孔的读数减去blank值。绘制标准曲线。

上清液样本10μl加入90μl H₂O。100μl样本液中加入100μl浓HCl，聚四氟乙烯EP管密封，120℃水解 3小时。取10μl样本水解也加入96孔板内，真空下干燥样本。每孔加入100μl T氯胺试剂，室温孵育5分钟，加入100μl DMAB试剂，60℃孵育90分钟。酶标仪560nm下测量吸光度。每孔的吸光值在标准曲线中换算成羟脯氨酸含量（Sa）（单位μg）。加入96孔板中的样本体积为Sv（μl），样本中的羟脯氨酸浓度计算C = Sa/Sv μg/μl。

2.2体内实验       

2.2.1动物模型的建立

2.2.1.1人增生性瘢痕组织块植入模型

（1）实验动物

实验动物由上海试验动物中心提供，实验动物的使用符合实验动物伦理及实验动物福利条款（伦理审批沪动科伦[2012]-7（HDKL[2012]-7）。

（2）组织标本来源

增生性瘢痕组织标本均来源于我院整形外科住院患者，增生性瘢痕切除术中标本。标本的使用获得患者的知情同意。

（3）建立方法

将人增生性瘢痕组织块去除表皮后，植入裸鼠皮下腔穴，植入的组织块与鼠背部的深筋膜组织和皮肤固定缝合三点。植入的增生性瘢痕组织块两面都能与裸鼠组织建立稳定的接触，一周后新生血管吻合过程完成，组织成活率高，形成人增生性瘢痕组织块植入模型。

2.2.1.2裸鼠背部植皮模型

（1）组织标本来源

全厚皮片来自我院整形外科巨乳缩小术患者术中切除皮肤。女性患者3名，年龄23-36岁。标本的使用获得患者的知情同意。

（2）建立方法

在无菌条件下获取全厚皮片，制成2×1.6cm大小皮片备用。雄性裸鼠，6周，10%水合氯醛0.1ml麻醉。固定后，在裸鼠背部剪除2×1.6cm皮肤。将人的全厚皮片移植到鼠背创面上。皮片创周鼠皮间断缝合。四周留长线，打包固定。2周后拆线，可见皮片成活。随后皮片逐渐形成痂皮，1个月左右痂皮脱落。痂皮脱落后，可见类似增生性瘢痕的组织形成，出现一高出皮面组织块，中央常有小创面残留，充血发红，质硬。长期观察可见，新生组织块的增殖状态可以维持3个月左右，组织块存留时间超过6个月。

2.2.2体内干预目的基因的沉默效应检测

使用人增生性瘢痕组织块植入模型进行STP705干预，干预浓度20μg/ml。配制浓度为80μg/ml的STP705。麻醉动物后，测量裸鼠背部组织块的体积（表面积×厚度），单位cm³，按终浓度为20μg/ml，换算出80μg/ml STP705的注射量。

注射方法：为了将药物尽可能均匀地注射在组织块内，采用5点法注射。组织块中央一点，均分4个象限各注射一点。药物注射在瘢痕组织块内。

标本的收集：收集单次注射后1天、3天、5天、7天，4个时间点的标本各3个。

目的基因的检测：将收集的组织标本进行Q-PCR检测，冻存的组织块，用磨头粉碎，在样本中加入Trizol裂解，检测TGF-β1、COX-2表达量。

对检测结果进行分析，得出单次注射的有效时限。

制定动物模型体内干预实验的治疗方案为：干预后STP705终浓度为20μg/ml，给药3次，每次间隔4天。

2.2.3体内干预实验

对两种增生性瘢痕模型进行体内干预实验。

动物模型及干预时间点：人增生性瘢痕组织块植入模型，人瘢痕组织块植入2周时；裸鼠背部植皮模型，瘢痕组织形成后2周。

分组：设置对照组和实验组，每组4只实验动物。

处理方法：实验组动物瘢痕组织块内注射STP705，终浓度为20μg/ml，给药3次，每次间隔4天。对照组动物瘢痕组织块处理方法同实验组，注射DEPC水。

实验结果的记录：拍照记录组织大体资料。测量瘢痕组织块体积大小变化。干预后4周两组间瘢痕组织块出现显著性差异。

组织学检测：收集各组干预后4周的组织标本，进行HE染色、Masson三色染色。

HE染色：4%多聚甲醛固定，使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。脱水透明：用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精、又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块中的酒精，才能浸蜡包埋。浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5-8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。脱蜡染色：常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精（Hematoxylin，H）是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红（Eosin，E）是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。HE染色：将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。酸水及氨水中分色，各数秒钟。流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。入70%和90%酒精中脱水各10分钟。入酒精伊红染色液染色2-3分钟。脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。树胶封片。

Masson三色染色：烤片、脱蜡及水化同HE染色。天青石蓝液染15分钟，自来水冲洗2分钟。苏木素核染15分钟，自来水冲洗2分钟。1％盐酸酒精分化，自来水冲洗至镜下观胞核变蓝。复合液（丽春红和酸性复红：0.2％冰醋酸 1：9）染20分钟（量为50μl/标本）。0.2％醋酸液冲洗2次。磷钨酸分化15分钟，0.2％冰醋酸冲洗2次。亮绿液染15分钟，0.2％醋酸冲洗2次，快速浸入95%乙醇、无水乙醇脱水。二甲苯透明，中性树脂封片。

胞核蓝黑色，胶原纤维、软骨、粘液蓝色或深绿色，弹性纤维棕色，胞浆、肌肉、神经胶质红色。

免疫组化检测：收集各组干预后4周的组织标本，进行α-SMA、VEGF、CD31免疫组化染色。

组织块的包埋、切片同HE染色。石蜡片脱蜡至水，PBS冲洗3次，每次5分钟。3%双氧水5-10分钟，降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色/RT细胞打孔，PBS冲洗3次，每次5分钟。10%羊血清封闭30分钟。一抗4℃孵育过夜。PBS冲洗2次，每次3分钟。过氧化物酶标记的二抗37℃孵育30分钟，PBS冲洗2次，每次3分钟。DAB（1ml ddH₂O+ DAB显色试剂盒中试剂A.B.C.各1滴）显色，DAB作用10-30分钟，加显色液后随时观察，发现显色后，立即放入水中终止显色。复染苏木素染核，脱水，封片。

目的基因检测：收集各组干预后4周的组织标本，进行Q-PCR检测。检测目的基因TGF-β1、COX-2表达，以及相关目的基因α-SMA、Col1a1、Col3a1的表达。进行组间比较。

羟脯氨酸含量检测：收集各组干预后4周的组织标本，进行组织羟脯氨酸含量检测。采用T氯胺法。

3实验结果

3.1体外实验

原代细胞培养后，传至3代，进行体外干预实验。

通过CCK8检测绘制不同浓度的TGF-β1 siRNA、COX-2 siRNA对细胞增殖的影响，结果显示TGF-β1 siRNA、COX-2 siRNA对体外培养的瘢痕成纤维细胞增殖具有明显的抑制作用。适宜的药物干预浓度为10μg/ml，干预时间为48小时。

如图1所示，镜下观察空白对照组瘢痕成纤维细胞生长、增殖良好；实验组瘢痕成纤维细胞周边出现小泡状结构，细胞密度低于对照组。

如图2所示，干预后目的基因的沉默效应：TGF-β1、COX-2 mRNA表达明显降低，实验组与对照组有显著性统计学差异。

如图3所示，细胞周期检测结果显示，实验组细胞增殖前期细胞比例明显低于空白对照组。表明TGF-β1 siRNA、COX-2 siRNA对细胞有抑制增殖作用。

如图4所示，TGF-β1、COX-2 siRNA干预后，细胞相关目的基因的表达变化：Q-PCR检测结果显示实验组细胞α-SMA、Col1a1、Col3a1 mRNA表达水平明显低于对照组。

如图5所示，实验组与对照组两组细胞进行a-SMA免疫荧光染色，结果显示TGF-β1 siRNA、COX-2 siRNA干预后α-SMA表达明显低于对照组细胞。

如图6所示，实验组和对照组细胞应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测，实验组细胞存在凋亡现象，空白对照组未见凋亡。

如图7和图8所示，对实验组和对照组细胞进行扫描电镜、投射电镜检测。扫描电镜中可见对照组细胞形态饱满，细胞纤毛丰富；实验组细胞，细胞形态欠饱满，扁平，纤毛较少。投射电镜可见对照组细胞呈长梭形，胞膜完整，各类细胞器丰富，内质网形态完整，分布较广，线粒体嵴清晰。实验组细胞近似长梭形，可见siRNA颗粒进入细胞，细胞胞吞活跃，细胞内可见大量空泡，细胞器数量减少，细胞器形态基本正常，可见凋亡小体。

如图9所示，TGF-β1 siRNA、COX-2 siRNA干预后，实验组细胞分泌胶原的能力明显低于对照组细胞。

3.2体内实验——人增生性瘢痕组织块植入模型

如图10所示，对照组、实验组大体比较：大体观实验组动物模型中的组织块体积较对照组小，组织块表面无充血现象。如图11所示，经测量瘢痕组织块体积大小变化，显示干预后4周对照组和实验组间瘢痕组织块出现显著性差异，且实验组在注射前和注射后瘢痕组织块体积差异显著，表明TGF-β1 siRNA、COX-2 siRNA干预后可显著减小增生性瘢痕。

如图12所示，干预后四周，对照组和实验组瘢痕组织内TGF-β1、COX-2 mRNA表达量经Q-PCR检测，显示实验组目的基因TGF-β1、COX-2较对照组组织表达明显降低。其它相关目的基因α-SMA、Cola1 mRNA表达量下降。

如图13和图14所示，HE染色、Masson三色染色可见治疗组瘢痕组织内细胞成分明显减少，纤维条索断裂、溶解状。

如图15所示，VEGF免疫组化染色可见治疗组瘢痕组织内VEGF分泌降低。如图16所示，CD31免疫组化染色可见治疗组瘢痕组织内血管、新生血管减少。

如图17所示，对照组与实验组瘢痕组织块内胶原含量对比。实验组组织内胶原含量明显低于对照，差异有统计学差异。

3.3体内实验——裸鼠背部植皮模型

如图18左图所示，对照组、实验组大体比较：大体观实验组动物模型中的瘢痕组织体积较对照组明显变平，色泽转白，组织块表面充血现象减轻。如图18右图所示，经测量瘢痕组织块体积大小变化，显示干预后4周对照组和实验组间瘢痕组织块出现显著性差异，且实验组在注射前和注射后瘢痕组织块体积差异显著，表明TGF-β1 siRNA、COX-2 siRNA干预后可显著减小增生性瘢痕。

如图19所示，干预后四周，对照组和实验组组织内TGF-β1、COX-2 mRNA表达量经Q-PCR检测，结果显示实验组目的基因TGF-β1、COX-2较对照组组织表达明显降低。其它相关目的基因α-SMA、Cola1 mRNA表达量下降。

如图20和图21所示，HE染色、Masson三色染色可见治疗组瘢痕组织内细胞成分明显减少，纤维条索断裂、溶解状。

如图22所示，VEGF免疫组化染色可见治疗组瘢痕组织内VEGF分泌降低。如图23所示，CD31免疫组化染色可见治疗组瘢痕组织内血管、新生血管减少。

如图24所示，对照组与实验组瘢痕组织块内胶原含量对比。实验组组织内胶原含量明显低于对照组，差异有统计学差异。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.siRNA分子组合物，其特征在于，所述的siRNA分子组合物包含：

核苷酸序列含有a）5′ -ccccggaggugauuuccaucuacaa-3′，

5’-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3’的siRNA分子，和

核苷酸序列含有b）5′ -gucuuuggucuggugccuggucuga-3′，

5’-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3’的siRNA分子。

2.根据权利要求1所述的siRNA分子组合物，其特征在于，所述的siRNA分子组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

3.根据权利要求2所述的siRNA分子组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体选自组氨酸和赖氨酸的聚合物。

4.权利要求1-3任一所述的siRNA分子组合物在制备治疗增生性瘢痕的药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的治疗增生性瘢痕是指消退已形成的增生性瘢痕或减小已形成的增生性瘢痕的体积。

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