CN105219803A - 一种原代成纤维细胞siRNA的转染方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种原代成纤维细胞siRNA的转染方法，包括步骤为：将成纤维细胞接种于孔板上，在接种后的一定时间内加入siRNA和转染试剂的混合物溶液进行转染，所述一定时间为30-180min。通过上述方式，本发明采用此转染方法对原代成纤维细胞进行转染，转染效率明显增加，转染效果稳定，重复性好，避免了按照常规转染方法或按照Hiperfect说明书进行实验时所出现的问题。
Description
技术领域
本发明涉及细胞转染领域，特别是涉及一种原代成纤维细胞siRNA的转染方法。
背景技术
siRNA是一种小RNA分子（21-25bp），它是siRISC中的主要成员，可激发与之互补的目标mRNA的沉默，从而调节靶基因的表达、影响细胞的生物功能。由于其功能的独特性，借助基因转染，siRNA已被广泛应用于研究特定基因对器官生长、发育和分化的影响，也被作为一种基因药物试用于预防和治疗多种疾病如病毒感染、肿瘤、遗传性和代谢性疾病以及神经系统疾病。基因转染方法的选择和这些方法转染效率的高低，直接影响了siRNA在这些领域的应用和发展。
基因转染是将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能的过程。根据转染机制和基因运载系统的不同，基因转染可分为物理性、化学性和病毒性三种，其中脂质体和脂质体复合物转染是最常用的化学转染。与其它基因一样，siRNA转染入细胞也需要借助于病毒载体或脂质体载体。这些载体虽然作用机理不同，对细胞的毒副作用有轻有重，但大都可以有效地将基因转入已成细胞系的细胞，并已在细胞系细胞的功能和生物性状的研究中发挥过重要作用。然而研究中发现，细胞系细胞往往失去了部分源组织细胞的生物性状，它的研究结果并不能完全反应源组织细胞在体内的生物过程，因此越来越多的研究直接使用原代培养的细胞，即原代细胞。病毒载体对原代细胞的转染效率较高，但操作过程复杂、存在着可整合改变宿主细胞基因的隐患。脂质体复合物载体操作简单，不直接影响宿主基因，但对原代细胞的转染效率不高，因此，完善转染方法，提高转染效率，将使脂质体复合物转染成为简单、安全并高效的体外原代细胞的转染方法，也将更有利于研究各种目的基因对细胞生物功能的影响。
成纤维细胞是结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来，在组织损伤和修复中发挥重要作用。最新研究表明，成纤维细胞还可通过自身增殖和分泌功能的调节而推动肿瘤的发展。因此，建立有效的原代成纤维细胞siRNA转染方法将不仅有利于成纤维细胞基因调控的研究，也将有利于开发出一些药物靶点来调节成纤维细胞的活性从而最终达到控制炎症和肿瘤发展的目的。
常用的脂质体或脂质体复合物转染试剂有Invitrogen公司的Lipofectamine、Qiagen公司的Hiferfect、ThermoFisherScientific的Darmafect。LipofectamineRNAiMAX是一种阳离子脂质体试剂，其说明书中虽然说明仅用1nMsiRNA即可获得较好的靶基因干扰效果，但在实际实验中发现，当用于原代成纤维细胞siRNA转染时，转染效率并不高，而提高siRNA浓度和转染试剂的含量，其毒副作用也随之提高。Darmafect也存在着类似的问题。
Hiperfect转染试剂是一种阳离子和中性脂类的复合物，能实现高效的siRNA吸收和细胞内siRNA的高效释放，而且在使用高浓度siRNA时，细胞毒副作用低。但在观察转染效率时却发现，按照常规的贴壁细胞转染方法或说明书中推荐的方法进行转染，此转染试剂的转染效率依然很低。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种原代成纤维细胞siRNA的转染方法，改进现存在的转染方法，提高siRNA在原代成纤维细胞中的转染效率。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种原代成纤维细胞siRNA的转染方法，包括步骤为：将成纤维细胞接种于孔板上，在接种后的一定时间内加入siRNA和转染试剂的混合物溶液进行转染，所述一定时间为30-180min。
在本发明一个较佳实施例中，所述一定时间为30min-60min。
在本发明一个较佳实施例中，转染时所述成纤维细胞的接种浓度为2-6×104至24孔板或1.5-2.0×105至6孔板。
在本发明一个较佳实施例中，转染时所述成纤维细胞的接种浓度为4×104至24孔板或1.5×105至6孔板。
在本发明一个较佳实施例中，所述siRNA在与所述转染试剂混合后的浓度为50-200nM。
在本发明一个较佳实施例中，所述siRNA在与所述转染试剂混合后的浓度为100nM。
在本发明一个较佳实施例中，所述siRNA和转染试剂的混合物是siRNA与转染试剂按体积比为1：1-1：3进行混合的。
在本发明一个较佳实施例中，所述siRNA和转染试剂的混合物是siRNA与转染试剂按体积比为1：1进行混合的。
本发明的有益效果是：本发明的原代成纤维细胞siRNA的转染方法，采用此转染方法对原代成纤维细胞进行转染，转染效率明显增加，转染效果稳定，重复性好，避免了按照常规转染方法或按照Hiperfect说明书进行实验时所出现的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明中成纤维细胞传代后不同时间时加入转染试剂和siRNA，目的基因被其siRNAknockdown的程度，图中所示是代表性目的基因透明质酸合成酶2基因的siRNA对其表达的抑制程度。
图2是本发明中加入转染试剂后成纤维细胞的密度，A为转染后24h镜下观察结果，B为转染后48h镜下观察结果，C为转染后72h镜下观察结果，本实验重复了3次，图中所示是一代表性实验结果，放大倍数100×。
图3是本发明中不同浓度的siRNA对目的基因knockdown的效果，图中所示是不同浓度代表性目的基因HAS2siRNA对HAS2基因表达的影响。
图4是本发明中不同浓度的siRNA对目的基因knockdown的效果，图中所示是不同浓度代表性目的基因HAS2siRNAknockdownHAS2基因后，成纤维细胞合成HA能力的变化。
图5是本发明中采用的细胞接种数、接种时间和siRNA浓度（如文中所述），在转染后24h、48h和72h时对目的基因knockdown的效果，图中所示是代表性目的基因HAS2siRNA的knockdown效果。
图6是本发明中采用的细胞接种数、接种时间和siRNA浓度（如文中所述），在转染后1、2、3和4天时观察目的基因HAS2knockdown对成纤维细胞增殖功能的影响。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
若按照常规的贴壁细胞转染方法，即在传代培养24-48小时后对细胞进行转染，siRNA转染肺原代成纤维细胞的效率很低，因此在改进原有转染方法的基础上本发明提供了一种原代成纤维细胞siRNA转染方法，具体为：
（1）细胞传代后不同时间进行转染
将成纤维细胞接种于6孔板，分别在接种后30min、1h、6h和24h加入100nMsiRNA和转染试剂的混合物，其中混合物溶液中siRNA和转染试剂的体积比为1：1，并于加入转染试剂后48h观察转染效果，结果如图1所示。由此可知，细胞传代后30min和60min时的转染效率明显好于传代后24h的转染效率。
（2）优化细胞接种浓度
分别将接种浓度为2×104、4×104、6×104的成纤维细胞接种至24孔板，将接种浓度为1.5×105、1.8×105、2.0×105的成纤维细胞接种至6孔板，按上述（1）中选定的siRNA浓度和转染试剂的量加入细胞培养液中，并于（1）中选定的接种后时间点进行siRNA转染，分别于转染后24h、48h、72h镜下观察细胞生长状况和密度，结果如图2所示。由图2可知，接种4×104至24孔板、1.5×105至6孔板并连续培养72h时细胞密度不太高没有聚集成团，细胞密度也不太低以致会影响后续实验所需的基因和蛋白质的量。
（3）siRNA浓度的选择
取（2）中确定的细胞数量进行接种，于（1）中选定的接种后时间点进行siRNA转染，siRNA的浓度分别为25、50、100、200nM，siRNA与转染试剂的体积比分别为1:1、1:2或1:3，于加入转染试剂后72h时观察转染效果，结果如图3和4所示。由此可知，siRNA浓度为100nM、与转染试剂的体积比为1：1时转染效果最佳。成纤维细胞表达3种HAS异构体，图4是仅knockdown异构体2（HAS2）后成纤维细胞合成透明质酸（HA）的量，因此，HA的降低程度（见图4）没有HAS2基因（见图3）的降低程度大。
（4）综合上面三种因素，按照所选定的接种细胞数（4×104至24孔板、1.5×105至6孔板）、接种时间点（60min）和siRNA浓度（100nM）对原代成纤维细胞进行转染，于转染后24h、48h和72h观察综合转染效果，效果见图5。在转染后24-72h期间，均有较好的转染效果。
实验结果表明，按照优化后的转染方法对原代成纤维细胞进行转染，转染效率明显增加，转染效果稳定，重复性好，避免了按照常规转染方法或按照Hiperfect说明书进行实验时所出现的问题，如转染效率低、毒性大、细胞聚集成团（尤其在载玻片进行转染时）等。
透明质酸是细胞间质的一种主要成分，它由透明质酸合成酶（HASs)合成，由透明质酸酶(HYALs)降解。通过基因转染技术，已发现它对肿瘤细胞的生长和移动有重要的调节作用。但受转染效率的影响，内源性透明质酸对正常细胞功能的影响尚未完成阐明。成纤维细胞中合成透明质酸的酶主要是HAS2，因此我们针对此基因设计了HAS2siRNA，并采用上述改进的转染方法将HAS2siRNA转染入原代成纤维细胞，系统地观察了HAS2和内源性HA对成纤维细胞生物功能的影响。结果发现，HAS2siRNA高效（约85%）又稳定地抑制了HAS2在成纤维细胞中的表达，HAS2基因的Knockdown，明显导致成纤维细胞出现增殖抑制，具体如图6所示。由于此技术良好的稳定性和重复性，我们进而得以探明HAS2和内源性透明质酸对成纤维细胞增殖影响的分子机制。
本发明在利用现有的转染试剂（主要是HiperFect转染试剂）的基础上，改进转染方法，提高siRNA在原代成纤维细胞中的转染效率，为研究目的基因对成纤维细胞生物性状的影响提供了技术基础。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种原代成纤维细胞siRNA的转染方法，其特征在于，包括步骤为：将成纤维细胞接种于孔板上，在接种后的一定时间内加入siRNA和转染试剂的混合物溶液进行转染，所述一定时间为30-180min。
2.根据权利要求1所述的转染方法，其特征在于，所述一定时间为30min-60min。
3.根据权利要求1所述的转染方法，其特征在于，转染时所述成纤维细胞的接种浓度为2-6×104至24孔板或1.5-2.0×105至6孔板。
4.根据权利要求3所述的转染方法，其特征在于，转染时所述成纤维细胞的接种浓度为4×104至24孔板或1.5×105至6孔板。
5.根据权利要求1所述的转染方法，其特征在于，所述siRNA在与所述转染试剂混合后的浓度为50-200nM。
6.根据权利要求5所述的转染方法，其特征在于，所述siRNA在与所述转染试剂混合后的浓度为100nM。
7.根据权利要求1所述的转染方法，其特征在于，所述siRNA和转染试剂的混合物是siRNA与转染试剂按体积比为1：1-1：3进行混合的。
8.根据权利要求7所述的转染方法，其特征在于，所述siRNA和转染试剂的混合物是siRNA与转染试剂按体积比为1：1进行混合的。
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| CN103642800A (zh) * | 2013-11-19 | 2014-03-19 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | siRNA分子组合物及其在治疗增生性瘢痕中的用途 |
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