CN106244590B - 经修饰的siRNA分子、RNAi分子混合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制PPIB基因表达的siRNA分子，所述siRNA分子的结构为：正义链和反义链完全互补；正义链或反义链的长度为17‑27nt；正义链的一端或两端的从末端开始连续5‑10个核苷酸经过2’‑位核糖修饰；如果两端都有核苷酸经过2’‑位核糖修饰，则所述的两端修饰的核苷酸个数和位置是对称的，反义链是未修饰的。本发明还公开了含有至少5种上述siRNA分子的RNAi分子混合物及其应用。所述siRNA分子能有效抑制靶基因表达，特异性高。RNAi分子混合物增强了siRNA分子的基因沉默效果，具有协同增效效应。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种经修饰的siRNA分子、RNAi分子混合物及其应用。
背景技术
RNAi广泛存在于自然界的物种中，自Andrew Fire和Craig Mello等人1998年在线虫(Caenorhabditis elegans)中首次发现RNAi现象，Tuschl和Phil Sharp等人2001年证实在哺乳动物中也存在RNAi之后，关于RNAi的机制原理、基因功能和临床应用等研究取得了一系列的进展；RNAi不仅在防御病毒感染，防转座子跳跃等多种机体保护机制中发挥关键作用(Huntvagner et al,2001；Tuschl,2001；Waterhouse et al,2001；Zamore 2001)，其相关产品也是十分有前景的候选药物。
PPIB(peptidylprolyl isomerase B，肽基脯氨酰基异构酶B)也称为亲环素B(cyclophilin B)。亲环素B在体内分布广泛，人类的亲环蛋白B(CyP B)在肾脏中含量很高；PPIB与多种疾病相关，特别是与自身免疫性疾病关系密切。同时亲环素B的下降与HCV抑制程度相关，研究表明亲环素B表达可能影响HCV引起的肝纤维化或肝硬化(中华肝脏病杂志，2012，20(9)，王慧付，付金栋，刘京营等)。另有研究发现一些亲环素抑制剂可以通过结合亲环素B，从而抑制HCV的复制。
基于PPIB在肝疾病的发生和发展中可能起着重要的作用，对以PPIB为靶基因的RNAi试剂的开发，有利于对PPIB相关疾病的机制研究与药物研制。
现有的siRNA分子，通常是每条链19nt,3’-突出端有2个dTdT悬垂,参见CN101974533A C。目前的siRNA分子或siRNA分子混合物，还存在设计复杂，且效果不好的缺陷。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种靶向PPIB基因的siRNA分子，用于抑制PPIB基因的表达，该所述siRNA分子能有效抑制靶基因表达，稳定性好且设计简单。
实现上述目的的技术方案如下。
一种抑制PPIB基因表达的siRNA分子,所述siRNA分子的结构为：(1)正义链和反义链完全互补；(2)正义链或反义链的长度为17-27nt；(3)正义链的一端或两端的从末端开始连续5-10个核苷酸经过2’-位核糖修饰；如果两端都有核苷酸经过2’-位核糖修饰，则所述的两端修饰的核苷酸个数和位置是对称的；(4)所述siRNA分子为平末端，反义链是未修饰的，所述siRNA分子靶向PPIB基因。
在其中一个实施例中，所述siRNA分子为平末端，正义链和/或反义链的的长度为24-26nt；正义链的一端或两端的从末端开始连续6-8个核苷酸经过2’-位核糖修饰。
在其中一个实施例中，正义链的两端的从末端开始连续7个核苷酸经过2’-位核糖修饰。
在其中一个实施例中，所述2’-核糖修饰是2’-O-甲基修饰。
在其中一个实施例中，所述siRNA分子的碱基组成选自所述siRNA分子的碱基组成选自：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17和SEQID NO.18，SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，或siRNA分子序列与选自SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.20的序列一致性(idendity)至少为80％的序列，更优选为90％，最优选为95％。
本发明的另一目的是提供一种抑制PPIB基因表达的RNAi分子混合物。
实现上述目的的技术方案如下。
一种抑制PPIB基因表达的RNAi分子混合物，其包括有5-10个上述的siRNA分子。
所述RNAi分子混合物中不同种的siRNA分子的浓度比为1：1-5。
在其中一个实施例中，每种siRNA分子的浓度比为1：1。
本发明的另一目的是提供上述的siRNA分子或上述的RNAi分子混合物的应用。
实现上述目的的技术方案如下。
上述的siRNA分子或上述的RNAi分子混合物在制备抑制细胞中PPIB基因表达的药物中的应用。
在其中一个实施例中，所述细胞为癌细胞，视网膜病变细胞，自身免疫病细胞，炎性细胞。
所述癌细胞为子宫颈癌细胞、肝癌细胞、结直肠癌细胞、HCV细胞、肾癌细胞、肺癌细胞。
本发明的另一目的是提供一种降低细胞中PPIB基因表达的方法。
一种降低细胞中PPIB基因表达的方法，包括以下步骤：方法包括a)获得上述siRNA分子或其混合物，所述RNAi分子混合物至少包括5,6,7,8,9,10个siRNA；b)将所述siRNA分子或所述RNAi分子混合物递送进细胞。
上述靶向PPIB基因的RNAi分子混合物，其主要优势在于：(1)本发明只需要经过有如上设计的5-10个siRNA分子的混合物(RNAi分子混合物)均能有效抑制靶基因表达，所有的RNAi分子混合物均能确保75％以上的抑制效率，且所述RNAi分子混合物中的siRNA分子序列的碱基不需特殊设计，通过在线工具或其他常规技术均可获得；而在现有技术中，不是所有设计的siRNA分子都能达到抑制基因表达的效果，一般设计的siRNA仅有50％的概率能抑制靶基因表达，仅25％的siRNA能达到75％以上的抑制效果，从而后续还需对siRNA进行筛选、优化，或对其效果进行实验验证，费时耗力；而本发明设计的siRNA分子可以很好的解决这个问题，其核心的设计在于对正义链的1个或2个末端5-10个核苷酸进行了2’-位核糖修饰的修饰，特别是siRNA分子为平末端，正义链的两个末端6-8个核苷酸进行了2’-位核糖修饰的修饰时，具有非常好的对靶基因抑制表达的效果。
(2)解决了在不同细胞系中、不同转染试剂处理时，siRNA作用不一致的问题，可在多个细胞系中有效沉默靶基因，并且不受转染试剂的影响。
(3)增强了RNAi分子的基因沉默效果，RNAi分子间存在协同增效效应。
综上，本发明所述RNAi分子混合物提高了寡核酸抑制基因表达的概率，整体上提升了抑制效率；且其在应用过程中，省去了前期对单一RNAi分子的复杂设计、筛选、验证与优化的过程，操作简单、节省成本。是一种通用、有效、快速的RNAi工具。
附图说明
图1实施例三中HeLa细胞中不同组合的siRNAs的抑制效果比较示意图。
图2实施例五中RB-PPI-D4的体外稳定性测定结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的一个实施例中公开了一种抑制PPIB基因表达的siRNA分子,其结构为：(1)正义链和反义链完全互补；(2)正义链或反义链的长度为17-27nt；(3)正义链的一端或两端的从末端开始连续5-10个核苷酸经过2’-位核糖修饰；如果两端都有核苷酸经过2’-位核糖修饰，则所述的两端修饰的核苷酸个数和位置是对称的；(4)所述siRNA分子为平末端，反义链是未修饰的，所述siRNA分子靶向PPIB基因。
本发明的平末端是指siRNA在其整个长度上是双链的，即在分子的任一端都没有突出的单链序列。
本发明的siRNA分子为双链的dsRNA分子，dsRNA分子由两条链组成，每条链的长度为17-27个nt,优选24-26nt,反义链与mRNA完全互补，“互补”是指核碱基之间配对的能力。
本发明中也可用碱基或碱基长度来表示核苷酸或RNA分子链的长度。
在一些实施例中，正义链的5末端的第1-10位和/或3末端的第1-10位任选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个核苷酸经过修饰。在一些实施例中，正义链的5末端的第1-7位的核苷酸和3末端的第1-7位的核苷酸经过过2’-位核糖修饰。所述2’-核糖修饰是2’-O-甲基修饰。该修饰一方面提升了体外或体内抑制试验中对核酸酶的抗性；另一方面有利于储存和运输。
本发明的正义链修饰可起到：(1)增强siRNA分子稳定性，尤其是在血清中的稳定性提高。(2)减少siRNA分子脱靶性；(3)提高siRNA分子特异性；(4)减少免疫激活反应等作用。所述“特异性”指siRNA与靶mRNA间具有必要程度的互补性以诱导靶基因的抑制，而对非mRNA无抑制作用或仅有极小的抑制作用。
在其中某些实施方案中，RNAi分子选自包括RB-PPI-D1、RB-PPI-D2、RB-PPI-D3、RB-PPI-D4、RB-PPI-D5、RB-PPI-D6、RB-PPI-D7、RB-PPI-D8、RB-PPI-D9、RB-PPI-D10中的任一个，或与上siRNA分子序列一致性(idendity)至少为80％，更优选为90％，最优选为95％的序列。
本发明其中一个实施例中，所述RNAi分子混合物在不同细胞系中、不同转染试剂处理时可以确保至少75％的靶基因抑制效果。本发明的“抑制”或类似表达可指RNA或蛋白水平或相关生化指标的表达、活性或指标相对阴性对照的降低。
本发明的RNAi分子混合物针对PPIB基因的mRNA不同区域。
本发明所述的抑制PPIB基因表达的RNAi分子混合物，其包括有至少5个根据权利要求1-5任一项所述siRNA分子。在其中一个实施例中，其包括有6或7个所述siRNA分子。目前，文献中涉及到的RNAi分子混合物，常常是有至少几十个以上的siRNA分子构成siRNA池(pool)，其优势在于可以提高基因沉默的命中率。而在本发明中，根据上述我们改进的siRNA设计法则，可达到减少pool应用时的siRNA分子个数，同时提升了抑制基因表达的效果。
本发明中，RNAi分子混合物中单个RNAi分子的浓度可以是随机的，其最低浓度和最高浓度的siRNA的浓度范围可以为1：1至1：5，优选单个siRNA分子的浓度相等；单个RNAi分子间不会有活性的干扰。
本发明的siRNA分子的抑制效率至少为45％，50％，60％，65％，70％，75％，80％；本发明的RNAi分子混合物的抑制效率至少为75％，80％，85％，90％。
在其中一个方案中，涉及本发明的RNAi分子或其混合物在抑制细胞中靶基因表达的用途，所述靶细胞可以为真核生物细胞或原核生物细胞，原核生物细胞如植物细胞等，真核生物细胞包括哺乳动物细胞细胞，优选啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞，人类细胞；细胞可以来源于多种组织或器官，如血液，淋巴，骨髓，脑，血管，肝，肺，骨，乳腺，软骨，宫颈，结肠，角膜，胚胎，肾，肌肉，卵巢，胰腺，前列腺，皮肤，肠，脾，胃等；细胞种类可为多种，包括成纤维细胞，肌细胞，心肌细胞等，或是处于病理状态的细胞，如癌症细胞(如子宫颈癌、肝细胞癌、肺癌或肾细胞癌)，视网膜病变细胞，自身免疫病细胞，炎性细胞(包括银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩病等)、病毒疾病细胞(如HIV丙型肝炎)和心血管疾病细胞等。优选靶细胞中的靶基因表达，更优选靶细胞中的靶基因高水平表达。在一个方案中，所述细胞为HeLa、293T、A549、HUVEC细胞。
将所述siRNA分子或所述RNAi分子混合物递送进细胞，本发明是通过向细胞引入siRNA分子或其混合物，抑制靶基因的表达；引入可以为直接引入或间接引入，除使用转染试剂外，其他已知的各种将RNAi分子递送如细胞的方式都可采用，如注射、载体转染(载体可以是质粒或病毒)、电穿孔，脂质体转染，或将其与特异结合细胞表面所表达的受体或抗原的肽或抗体连接的定向施用等。
实施例一：寡核酸的设计
设计的所有单个siRNA分子均能靶向靶基因(如表1),
RNAi分子混合物由5-10个siRNA分子组成，siRNA每条链长度为25-mer,平末端；AS链和SS链完全互补，AS链与靶基因完全互补，SS的5’末端和3’末端的各有7个连续的核苷酸经过2’-O-Me修饰。
表1靶基因
| 靶基因 | 名称 | 登录号 |
| PPIB | 肽基脯氨酰基异构酶B | NM_000942 |
表2 siRNA序列
实施例二不同细胞系中RCL-02的抑制效果比较
1细胞培养方法：
将HeLa、293T、A549和HUVEC细胞(均来源于ATCC)用0.25％的胰酶胰酶消化，稀释后接种到24孔板，800μL/孔，以24h后长满30-40％为宜，37℃，5％CO2培养箱培养24h。
2细胞转染与实时荧光定量PCR
将RCL-02(100nM)转入4种不同的细胞系(293T,HeLa,A549与HUVEC)，转染试剂分别为riboFECT(5μL每孔)和LF2K(1μL每孔)。RCL-02表示7个双链siRNA分子的组合,7个双链siRNA分子为RB-PPI-D1、RB-PPI-D2、RB-PPI-D3、RB-PPI-D4、RB-PPI-D5、RB-PPI-D6、RB-PPI-D7，各单个siRNA分子在组合物中的含量是均等的，即1:1:1:1:1:1:1的配比。
riboFECT(50μL)转染体系：5μL riboFECT(广州市锐博生物科技有限公司C10511-05)，5μLsiRNA组RCL-02(终浓度100nM)和40μL转染缓冲液。
LF2K(100μL转染体系)：1μL LF2K(Invitrogen 11668019)，5μL siRNA组RCL-02(终浓度100nM)和94μL Opti-MEM细胞培养基(Thermo Fisher Scientific，31985070)
转染48小时后收集细胞，Trizol法提取RNA，进行Real Time PCR，ReverseTranscription mix反转录试剂盒用于反转录(广州市锐博生物科技有限公司，C10170)，得到siRNA转染细胞的cDNA，以cDNA为模板，用对应的引物对进行RT-PCR扩增，以人的看家基因actin作为内参基因，利用Real-time PCR试剂盒SYBR Premix(2×)(BIO-RAD750000131)，按照常规方法，进行实时荧光定量PCR反应。一个样品的9个重复(3个生物学重复用于细胞转染，在qPCR时每个重复做3个复孔)的Ct误差在±0.5，然后用CFX 2.1进行相对定量分析。SPSS19.0数据统计软件数据分析，数表中数据为其平均值，P值均<0.05。
NC阴性对照组：转染的siRNA为无关非特异siRNA。
N空白对照组：正常细胞，无siRNA转染。
Real-Time PCR抑制率计算方式：
NC阴性对照组mRNA的相对表达水平为1。
引物为：
| h-PPIB-qPCR-F | GGCAAGCATGTGGTGTTTGG | SEQ ID NO.21 |
| h-PPIB-qPCR-R | GGTTTATCCCGGCTGTCTGTC | SEQ ID NO.22 |
| h-actin-qPCR-F | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | SEQ ID NO.23 |
| h-actin-qPCR-R | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA | SEQ ID NO.24 |
Real-Time PCR结果如下表所示：
表3不同细胞系中抑制率比较
结果表明，相对NC对照(NC对照表达率为1)，在不同的细胞系中，使用不同的转染试剂，RCL-02均能达到80％以上的抑制效果。
实施例三HeLa细胞中RCL-03，RCL-02的抑制效果比较
RCL-04表示5个双链siRNA分子的组合,即RB-PPI-D2、RB-PPI-D3、RB-PPI-D4、RB-PPI-D5、RB-PPI-D6的组合物，RCL-03表示6个双链siRNA分子的组合,即RB-PPI-D2、RB-PPI-D3、RB-PPI-D4、RB-PPI-D5、RB-PPI-D6、RB-PPI-D7的组合物，RCL-01表示10个双链siRNA分子的组合,即RB-PPI-D1、RB-PPI-D2、RB-PPI-D3、RB-PPI-D4、RB-PPI-D5、RB-PPI-D6、RB-PPI-D7、RB-PPI-D8、RB-PPI-D9、RB-PPI-D10的组合物。
各单个siRNA分子在组合物中的含量是均等的，即都是1:1的配比(附图中为5对组合代表RCL-04实验组，6对组合代表RCL-03实验组，7对组合代表RCL-02实验组、10对组合代表RCL-01实验组)。
1细胞培养
将HeLa细胞(细胞来源于ATCC)接种培养24h后观察细胞，状态良好开始转染。
2细胞转染与实时荧光定量PCR反应
(1)100μL转染体系：1μL LF2K(Invitrogen 11668019)，5μL(100nM)RCL-02，RCL-03分别和94μLOpti-MEM细胞培养基(Thermo Fisher Scientific，31985070)。
(2)细胞培养板的每个孔中加入上述100μL转染体系，转染48h后，收集细胞，Trizol法提取RNA，Reverse Transcription mix反转录试剂盒用于反转录(广州市锐博生物科技有限公司，C10170)，Real-time PCR试剂盒SYBR Premix(2×)(BIO-RAD 750000131)按照常规方法进行实时荧光定量PCR反应。引物为：
| h-PPIB-qPCR-F | GGCAAGCATGTGGTGTTTGG | SEQ ID NO.21 |
| h-PPIB-qPCR-R | GGTTTATCCCGGCTGTCTGTC | SEQ ID NO.22 |
(3)Real-Time PCR结果如请见图1。结果表明，不同组合的siRNAs均能起到高效抑制靶基因的作用,抑制率在75％以上。其中，RCL-02实验组与RCL-01实验组的都非常好。
实施例四HeLa细胞中RCL-03与单个siRNA分子的靶基因抑制率比较
1细胞培养
将HeLa细胞(细胞来源于ATCC)接种培养24h后观察细胞，状态良好开始转染。
2细胞转染与实时荧光定量PCR反应
(1)100μL转染体系：1μL LF2K(Invitrogen 11668019)，5μL(100nM)RCL-02或5μL(100nM)单个siRNA分别和94μLOpti-MEM细胞培养基(Thermo Fisher Scientific，31985070)。
(2)细胞培养板的每个孔中加入上述100μL转染体系，转染48h后，收集细胞，Trizol法提取RNA，Reverse Transcription mix反转录试剂盒用于反转录(广州市锐博生物科技有限公司，C10170)，Real-time PCR试剂盒SYBR Premix(2×)(BIO-RAD 750000131)按照常规方法进行实时荧光定量PCR反应。
引物为：
| h-PPIB-qPCR-F | GGCAAGCATGTGGTGTTTGG |
| h-PPIB-qPCR-R | GGTTTATCCCGGCTGTCTGTC |
(3)Real-Time PCR结果如下表所示：
表5 HeLa细胞中RCL-02与单个siRNA分子的抑制率比较
结果表明，组合siRNAs RCL-02的抑制率大于80％，且与同等浓度的单个siRNA分子相比，起到了协同增效的作用。(D2代表RB-PPI-D2，D3代表RB-PPI-D3，以此类推)。
实施例5体外稳定性测定
将RB-PPI-D4经无RNA酶水稀释至5μM后加入等体积的新鲜大鼠血清(为上海远慕生物科技有限公司产品),然后在37℃孵育0-24小时，取样进行电泳观察不同siRNA的完整性。结果如图2显示：siRNA在血清中稳定，6h内基本没有降解，12内没有显著降解，预计其在体内具有更好的效力。
其它RB-PPI-Dx(x为D1-D10)，其实验结果相同，具体图省略。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种抑制PPIB基因表达的siRNA分子,其特征在于，所述siRNA分子的结构为：(1)正义链和反义链完全互补；(2)正义链和反义链的长度分别为25nt；(3)正义链的两端的从末端开始连续5-10个核苷酸经过2’-位核糖修饰，且两端修饰的核苷酸个数和位置是对称的；(4)所述siRNA分子为平末端，所述反义链是未修饰的，所述siRNA分子靶向PPIB基因；
所述siRNA分子选自：
正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的siRNA分子，
正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的siRNA分子，
正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的siRNA分子，
正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的siRNA分子，
正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的siRNA分子，
正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的siRNA分子，
正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的siRNA分子，
正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的siRNA分子，
正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的siRNA分子，
正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的siRNA分子。
2.根据权利要求1所述的siRNA分子,其特征在于，正义链的两端的从末端开始连续6-8个核苷酸经过2’-位核糖修饰。
3.根据权利要求2所述的siRNA分子,其特征在于，正义链的两端的从末端开始连续7个核苷酸经过2’-位核糖修饰。
4.根据权利要求1所述的siRNA分子,其特征在于，所述2’-核糖修饰是2’-O-甲基修饰。
5.根据权利要求1-4任一项所述的siRNA分子，其特征在于，所述siRNA分子的碱基组成如下：
mGmAmUmGmGmCmACAGGAGGAAAGmAmGmCmAmUmCmU
AGAUGCUCUUUCCUCCUGUGCCAUC；或
mUmCmUmCmCmGmAACGCAACAUGAmAmGmGmUmGmCmU
AGCACCUUCAUGUUGCGUUCGGAGA；或
mCmCmUmAmCmGmAAUUGGAGAUGAmAmGmAmUmGmUmA
UACAUCUUCAUCUCCAAUUCGUAGG；或
mGmGmGmUmGmAmUCUUUGGUCUCUmUmCmGmGmAmAmA
UUUCCGAAGAGACCAAAGAUCACCC；或
mCmAmCmCmAmAmGACAGACAGCCGmGmGmAmUmAmAmA
UUUAUCCCGGCUGUCUGUCUUGGUG；或
其中，m表示2’-甲氧基修饰。
6.一种抑制PPIB基因表达的RNAi分子混合物，其特征在于，其包括有至少5个权利要求1-5任一项所述的siRNA分子。
7.一种抑制PPIB基因表达的RNAi分子混合物，其特征在于，其包括有权利要求1-5任一项所述的6个或7个siRNA分子。
8.根据权利要求6或7所述的RNAi分子混合物，其特征在于，所述RNAi分子混合物中非同一对的siRNA分子的浓度比为1：1-5。
9.如权利要求1-5任一项所述的siRNA分子或权利要求6--8任一项所述的RNAi分子混合物在制备抑制细胞中PPIB基因表达的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞为癌细胞、视网膜病变细胞、自身免疫病细胞、炎性细胞。
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Non-Patent Citations (3)
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| siRNA核糖分子化学修饰对RNAi功能的影响;武文斌;《生物技术通报》;20091231(第6期);第34-37页 * |
| 亲环素B、D在肝纤维化模型中的变化及其意义;王慧 等;《中华肝脏病杂志》;20120930;第20卷(第9期);第705-706页 * |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Biliang Inventor after: Yang Xiuqun Inventor before: Zhang Biliang Inventor before: Yang Xiuqun Inventor before: Craig Merlow Inventor before: Ye Yidong |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Modified siRNA molecule, RNAi molecule mixture and its application Effective date of registration: 20211223 Granted publication date: 20191001 Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd. Registration number: Y2021980016275 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20221209 Granted publication date: 20191001 Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd. Registration number: Y2021980016275 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Modified siRNA molecules and RNAi molecule mixtures and their applications Effective date of registration: 20230615 Granted publication date: 20191001 Pledgee: CITIC Bank Co.,Ltd. Guangzhou Branch Pledgor: GUANGZHOU RIBOBIO Co.,Ltd. Registration number: Y2023980044095 |