CN102405286A - 减小大小的自递送RNAi化合物 - Google Patents

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德米特里·萨马尔斯基
托德·M·伍尔夫
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Abstract

本发明涉及具有最小双链区的RNAi构建体以及它们在基因沉默中的应用。与本发明相关的RNAi构建体包含8-14个核苷酸的双链区和多种化学修饰，并且在基因沉默中非常高效。

Description

减小大小的自递送RNAi化合物
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求以下申请的优先权：于2008年9月22号提交的美国临时申请序列号US 61/192,954，题为“ChemicallyModified Polyucleotides and Methods of Using the Same”；于2009年2月4日提交的US 61/149,946，题为“Minimum Length Triggers of RNAInterference”以及于2009年7月8日提交的US 61/224,031，题为“Minimum Length Triggers of RNA Interference”，它们每个的公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及RNA干扰(RNAi)领域。本发明更具体地涉及不使用递送试剂而具有改善的体内递送特性的核酸分子，以及它们在有效的RNA沉默中的用途。
背景技术
互补寡核苷酸序列是有前景的治疗剂和阐释基因功能的有用研究工具。然而，现有技术的寡核苷酸分子存在几个可能阻碍其临床开发的问题，并且经常导致难以在体内使用这些组合物实现预期的对基因表达(包括蛋白质合成)的有效抑制。
一个主要问题是这些化合物向细胞和组织的递送。19-29个碱基长的常规双链RNAi化合物形成约1.5×10-15nm大小的高度带负电的刚性螺旋。该棒形分子不能穿过细胞膜，因此在体外和体内的效力非常有限。因此，所有常规RNAi化合物都需要某种递送载体以促进其组织分布和细胞摄取。认为这是RNAi技术的主要局限性。
对寡核苷酸进行化学修饰以促进它们的细胞摄取特性在之前已有尝试。这种修饰的一种是将胆固醇分子连接到寡核苷酸。该方法在1989年由Letsinger等第一次报道。随后，ISIS Pharmaceuticals，Inc.(Carlsbad，CA)报道了将胆固醇分子连接到寡核苷酸的更先进技术(Manoharan，1992)。
随着90年代后期siRNA的发现，对这些分子尝试了相似类型的修饰以提高它们的递送特性。文献中出现了将胆固醇分子缀合到少量修饰(Soutschek，2004)和大量修饰(Wolfrum，2007)的siRNA的报道。Yamada等，2008也报道了改进的化学接头的应用，其进一步改善了胆固醇介导的siRNA摄取。尽管有这些努力，这些类型化合物的摄取看来被生物流体的存在所抑制，导致对体内基因沉默效力的极大限制，限制了这些化合物在临床中的应用。
因此，通过设计具有改进的体内递送特性的寡核苷酸来改进现有技术的寡核苷酸具有很大益处，并且很有临床意义。
发明概述
本文公开了具有尽可能小的双链区的不对称化学修饰的核酸分子，以及这些分子在基因沉默中的应用。与本发明相关的RNAi分子包含单链区和双链区，并可在分子的单链区和双链区两者中包含多种化学修饰。此外，可将RNAi分子连接到疏水辍合物(如常规和改进的固醇类分子)上。这种RNAi分子新类型与上述RNAi分子相比在体外和体内均具有更好的效力。
本发明的一些方面涉及不对称核酸分子，其包含最小长度为16核苷酸的引导链(guide strand)，以及负载链(passenger strand)，它们形成具有双链区和单链区的双链核酸，所述双链区长度为8-15个核苷酸，所述单链区长度为5-12个核苷酸，其中所述负载链与亲脂基团连接，其中所述双链核酸中至少40％的核苷酸被修饰，并且其中单链区具有至少2个硫代磷酸酯修饰。在一些实施方案中，引导链的1位被5’磷酸化。在一些实施方案中，引导链的1位被2’O-甲基修饰和5’磷酸化。
本发明的一些方面涉及分离的双链核酸分子，其包含15-21个核苷酸长并与miRNA序列互补的较长链、8-15个核苷酸长并在3’末端与亲脂基团连接的较短链，其中所述较长链和负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述较长链具有2-13个核苷酸长的3’单链区，其包含至少2个硫代磷酸酯修饰，并且至少50％的核苷酸被修饰。
本发明的另一些方面涉及分离的双链核酸分子，其包含17-21个核苷酸长并与靶基因互补的引导链、8-16个核苷酸长并且3’末端与亲脂基团连接的负载链，其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有2-13个核苷酸长的3’单链区，所述单链区中的每个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，并且其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸包含至少一个2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰。
在另一个方面，本发明为分离的双链核酸分子，其包含17-21个核苷酸长并与靶基因互补的引导链、10-16个核苷酸长并且3’末端与亲脂基团连接的负载链，其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有5-11个核苷酸长的3’单链区，所述单链区中的至少2个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，并且其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸被2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰。
本发明的另一方面为分离的双链核酸分子，其具有17-21个核苷酸长并与靶基因互补的引导链、8-16个核苷酸长并且3’末端与亲脂基团连接的负载链，其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有6-8个核苷酸长的3’单链区，所述单链区中的每个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，其中所述负载链包含至少2个硫代磷酸酯修饰，其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸包含2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰，并且其中所述双链核酸分子的一个末端为平末端或包含1-2个核苷酸的突出端。
本发明的另一些方面提供了分离的双链核酸分子，其具有17-21个核苷酸长并与靶基因互补的引导链、8-16个核苷酸长并且3’末端与亲脂基团连接的负载链，其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有3’单链区，所述单链区中的每个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，其中所述引导链11-18位的每个C和U核苷酸具有2’O-甲基修饰，其中所述负载链的每个核苷酸为2’O-甲基修饰，并且其中所述双链核酸分子的一个末端为平末端或包含1-2核苷酸的突出端。
本发明的另一个方面为分离的双链核酸分子，其具有17-21个核苷酸长并与靶基因互补的引导链、8-15个核苷酸长并且3’末端与亲脂基团连接的负载链，其中所述亲脂基团选自胆固醇和具有5-7或9-18个碳长度的C17多碳链的固醇类分子，其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有3’单链区，所述单链区中的每个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，其中所述引导链11-18位的每个C和U核苷酸具有2’O-甲基修饰，其中所述引导链2-10位的每个C和U核苷酸具有2’F修饰，其中所述负载链的每个核苷酸为2’O-甲基修饰，并且其中所述双链核酸分子的一个末端为平末端或包含1-2核苷酸的突出端。
本发明的又一个方面为分离的核酸分子，其具有与靶基因互补的引导链和3’末端与亲脂基团连接的负载链，其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有2-13个核苷酸长的3’单链区，所述单链区中的每个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸包含至少一个2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰，并且其中所述双链核酸分子的一个末端为平末端或包含1-2核苷酸的突出端。
本发明的另一些方面提供了分离的双链核酸分子，其具有引导链和负载链，其中所述分子的双链区长度为8-14个核苷酸，其中所述引导链包含4-12个核苷酸长的单链区，并且其中所述引导链的单链区包含2-12个硫代磷酸酯修饰。
在一些实施方案中，所述引导链包含6-8个硫代磷酸酯修饰。在另一些实施方案中，所述引导链的单链区长度为6个核苷酸。
在另一些实施方案中，双链区长度为13个核苷酸。任选地，所述双链核酸分子的一个末端为平末端或包含1-2核苷酸的突出端。
本发明的另一个方面是分离的双链核酸分子，其具有引导链和负载链，其中所述引导链为16-28个核苷酸长并与靶基因互补，其中所述引导链的3’末端10个核苷酸包含至少2个磷酸酯修饰，并且其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰并包括至少一个2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰；其中所述负载链长度为8-14核苷酸并且与所述引导链互补，其中所述负载链与亲脂基团连接，其中所述引导链和所述负载链形成双链核酸分子。
在一些实施方案中，所述引导链或序列的1位核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在另一些实施方案中，所述引导链或序列2-10位的至少一个C或U核苷酸具有2’-氟代修饰。在另一些实施方案中，所述引导链2-10位的每个C和U核苷酸具有2’-氟代修饰。所述引导链或序列11-18位的至少一个C或U核苷酸可具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述引导链或序列11-18位的每个C或U核苷酸具有2’-O-甲基修饰。
在另一些实施方案中，所述引导链3’末端的10个核苷酸包含至少4个磷酸酯修饰。任选地，所述引导链3’末端10个核苷酸包含至少8个磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述引导链包含4-14个磷酸酯修饰。在另一些实施方案中，所述引导链包含4-10个磷酸酯修饰。在另一些实施方案中，所述引导链的3’末端6个核苷酸均包含磷酸酯修饰。所述磷酸酯修饰可为硫代磷酸酯修饰。
在一些实施方案中，所述负载链的每个C和U核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在另一些实施方案中，所述负载链的每个核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在一个实施方案中，所述负载链的至少一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰。在另一些实施方案中，所述负载链的至少2个核苷酸为硫代磷酸酯修饰。
所述亲脂分子可为固醇，如胆固醇。
在一些实施方案中，所述引导链长为18-19个核苷酸。在另一些实施方案，所述负载链长为11-13个核苷酸。
在另一些实施方案，双链核酸分子的一个末端为平末端或包含1-2核苷酸的突出端。
本发明的另一些方面为分离的双链核酸分子，其包含引导链和负载链，其中所述引导链为16-29个核苷酸长并与靶基因基本互补，其中所述负载链为8-14个核苷酸长并与所述引导链互补，并且其中所述引导链具有至少2个化学修饰。在一些实施方案中，所述至少2个化学修饰包括至少2个硫代磷酸酯修饰。在一些实施方案中，双链核酸分子的一个末端为平末端或包含1-2核苷酸的突出端。
本发明的一些方面为分离的双链核酸分子，其包含引导链和负载链，其中所述引导链为16-29个核苷酸长并与靶基因基本互补，其中所述负载链为8-14个核苷酸长并与所述引导链互补，并且其中所述引导链具有5个核苷酸长或更长的单链3’区和1个核苷酸或更少的单链5’区。所述单链区可包含至少2个硫代磷酸酯修饰。
本发明的另一些方面提供分离的双链核酸分子，其具有引导链和负载链，其中所述引导链为16-29个核苷酸长并与靶基因基本互补，其中所述负载链为8-16个核苷酸长并与所述引导链互补，并且其中所述引导链具有5个个核苷酸长或更长的单链3’区，并且所述负载链具有长度大于9的C17连接链的固醇类分子。
本发明的另一些方面提供了双链体多核苷酸。所述多核苷酸具有第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸和靶基因互补，其中所述第二多核苷酸比所述第一多核苷酸至少短6个核苷酸，其中所述第一多核苷酸包含含有以下修饰的单链区，所述修饰选自40-90％的疏水碱基修饰、40-90％的硫代磷酸酯和40-90％的核糖部分修饰或任何其组合。
本发明的另一些方面为双链体多核苷酸。所述多核苷酸具有第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸和靶基因互补，其中所述第二多核苷酸比所述第一多核苷酸至少短6个核苷酸，其中所述双链体多核苷酸在所述第一多核苷酸的9、11、12、13或14位核苷酸与所述第二多核苷酸的对应核苷酸之间包含错配。
本发明的另一些方面是在哺乳动物细胞中抑制靶基因表达的方法，其包括将所述哺乳动物细胞与权利要求1-41中任一项所述分离的双链核酸分子或权利要求43或44所述双链体多核苷酸接触。
本发明的另一些方面提供了在对象中诱导RNAi的方法。所述方法涉及向对象施用有效量的用于诱导靶基因mRNA之RNAi的权利要求1-41中任一项所述分离的双链核酸分子或权利要求43或44所述双链体多核苷酸。在另一些实施方案中，所述对象是人。在另一些实施方案中，所述靶基因是PPIB、MAP4K4或SOD1。
在另一些方面中提供了含有多核苷酸的分离的疏水修饰多核苷酸，其中所述多核苷酸为与疏水分子连接的双链RNA，其中所述疏水分子与非末端核苷酸的碱基、核糖或骨架连接，并且其中所述分离的双链核酸分子包含引导链和负载链，其中所述引导链长为16-29个核苷酸并与靶基因基本互补，其中所述负载链长为8-14个核苷酸并且与所述引导链互补。
在一个实施方案中，所述疏水分子与所述双链RNA的引导链连接。在另一个实施方案中，所述引导链的3’末端10个核苷酸包含至少2个磷酸酯修饰，并且其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰并包含至少一个2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰。在又一个实施方案中，所述疏水分子与所述双链RNA的负载链连接。
本发明提供分离的疏水修饰的多核苷酸，其具有与疏水分子非共价复合的多核苷酸，其中所述疏水分子是多阳离子分子。在一些实施方案中，所述多阳离子分子选自精蛋白、精氨酸富含肽和精胺。
本发明的另一些方面为具有多核苷酸的分离的疏水修饰多核苷酸，其中所述多核苷酸为不使用接头而直接与疏水分子复合的双链RNA，其中所述疏水分子不是胆固醇。
本发明的另一些方面提供了组合物，其含有疏水修饰多核苷酸、中性脂肪混合物以及任选地货物分子(cargo molecule)，其中所述多核苷酸是与疏水分子连接的双链RNA，其中所述双链核酸分子包含引导链和负载链，其中所述引导链为16-29个核苷酸长并与靶基因基本互补，其中所述负载链为8-14个核苷酸长并与所述引导链互补，其中所述引导链的1位为5’磷酸化或具有2’O-甲基修饰，其中所述双链核酸中至少40％的核苷酸被修饰，并且其中所述双链核酸分子的一个末端为平末端或包含1-2核苷酸的突出端；其中所述疏水修饰多核苷酸和中性脂肪混合物形成胶束。
在一些实施方案中，负载链的3’末端与疏水分子相连接。在另一些实施方案中，所述组合物为无菌的。在另一些实施方案中，所述中性脂肪混合物包含DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)。在另一些实施方案中，所述中性脂肪混合物包含DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)。在另一些实施方案中，所述中性脂肪混合物还包含固醇，如胆固醇。
在另一些实施方案中，所述组合物包含至少20％的DOPC和至少20％的胆固醇。在另一些实施方案中，所述疏水修饰多核苷酸的疏水部分为固醇。所述固醇可为胆固醇、胆固醇基或修饰的胆固醇基残基。在另一些实施方案中，所述疏水修饰多核苷酸的疏水部分选自胆汁酸、胆酸或牛磺胆酸、脱氧胆酸、十八烯基石胆酸(oleyl litocholic acid)、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯(isoprenoids)、维生素、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、脂肪酸酯、甘油三酯、芘、紫菜碱、Texaphyrine、金刚烷、吖啶类、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、得克萨斯红、洋地黄皂苷配基(digoxygenin)、二甲氧三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如Cy3或Cy5)、Hoechst 33258染料、补骨脂素和布洛芬。
在另一些实施方案中，所述疏水修饰多核苷酸的疏水部分为多阳离子分子，如，精蛋白、精氨酸富含肽和/或精胺。
所述组合物任选地包含货物分子(cargo molecule)，如脂质、肽、维生素和/或小分子。在一些实施方案中，所述货物分子为市售脂肪乳剂，其用于多种选自肠胃外给养的目的。在一些实施方案中，所述市售脂肪乳剂为英脱利匹特(intralipid)或nutralipid。在另一些实施方案中，所述货物分子为含有多于74％的亚油酸的脂肪酸混合物、含有至少6％心磷脂的脂肪酸混合物、或含有至少74％的亚油酸和至少6％的心磷脂的脂肪酸混合物。在另一个实施方案中，所述货物分子为融合脂(dusogenic lipid)(例如DOPE)，优选地为至少10％的融合脂。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含化学修饰。例如其可有至少40％被修饰。
本发明的另一方面提供了在对象中诱导RNAi的方法。所述方法涉及向对象施用有效量的用于诱导靶基因mRNA之RNAi的本发明分离的双链核酸分子或双链体多核苷酸或组合物，其中所述多核苷酸至少具有对应于靶基因的序列区，其中施用步骤为全身地、静脉内、腹膜内、真皮内、局部、鼻内、吸入、经口、粘膜内、局部注射、皮下、经口气管或眼内。
在另一些实施方案中，所述对象是人。在另一些实施方案中，所述靶基因是PPIB、MAP4K4或SOD1。
在一些方面中，本发明为形成发夹结构的长度少于35个核苷酸的单链RNA，所述发夹包含双链茎和单链环，所述双链茎包含具有5’末端的5’-茎序列和具有3’末端的3’-茎序列；并且所述5’-茎序列和所述环的至少一部分形成与靶基因转录本互补的引导序列，其中所述多核苷酸介导所述靶基因表达的序列依赖基因沉默，其中单链环区的每个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰，并且其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸包含2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的每个C和U核苷酸具有2’O-甲基修饰。
另一些方面提供了多核苷酸构建体，所述多核苷酸具有两个相同的单链多核苷酸，每个所述单链多核苷酸包含具有5’末端的5’茎序列、具有3’末端的3’茎序列以及连接5’茎序列和3’茎序列的接头序列，其中：(1)第一单链多核苷酸的5’茎序列与第二单链多核苷酸的3’茎序列杂交，形成第一双链茎区；(2)第二单链多核苷酸的5’茎序列与第一单链多核苷酸的3’茎序列杂交，形成第二双链茎区；并且(3)所述第一和第二单链多核苷酸的接头序列形成连接所述第一和所述第二双链茎区的环或凸出部(bulge)，其中所述5’茎序列和接头序列的至少一部分形成与靶基因转录本互补的引导序列，其中所述多核苷酸构建体介导所述靶基因表达的序列依赖基因沉默，其中所述单链环区中的每个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰，并且其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸包含2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰。
在一个实施方案中，所述引导序列11-18位的每个C和U核苷酸具有2’O-甲基修饰。
在一些实施方案中，所述引导链长为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸。在一些实施方案中，所述负载链长为8、9、10、11、12、13或14个核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸分子具有小于-20kkal/mol的热力学稳定性(ΔG)。
本发明的一些方面涉及化学修饰的核酸分子。在一些实施方案中，所述化学修饰选自5’磷酸酯、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟代、核糖胸苷、C-5丙炔基-dC(pdC)、C-5丙炔基-dU(pdU)、C-5丙炔基-C(pC)、C-5丙炔基-U(pU)、5-甲基C、5-甲基U、5-甲基dC、5-甲基dU甲氧基、(2，6-二氨基嘌呤)、5′-二甲氧基三苯甲基-N4-乙基-2′-脱氧胞苷、C-5丙炔基-fC(pfC)、C-5丙炔基-fU(pfU)、5-甲基fC、5-甲基fU、C-5丙炔基-mC(pmC)、C-5丙炔基-fU(pmU)、5-甲基mC、5-甲基mU、LNA(locked nucleic acid，锁核酸)、MGB(minor groove binder，小沟结合剂)和其它提高碱基疏水性的碱基修饰。在同一分子中可存在多于一种化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰提高稳定性和/或提高热力学稳定性(ΔG)。在一些实施方案中，核酸分子上至少90％的CU残基被修饰。
在一些实施方案中，所述引导链的1位核苷酸具有2’O-甲基修饰和/或5’磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的至少一个C或U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的每个C和U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的至少一个C或U核苷酸具有2’O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的每个C和U核苷酸具有2’-O甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链每个C和U核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链的每个核苷酸具有2’-O-甲基修饰。
在一些实施方案中，与本发明相关的核酸分子包含至少为4个硫代磷酸酯修饰核苷酸的区段。在一些实施方案中，该硫代磷酸酯修饰核苷酸区段的长度为至少12个核苷酸。在一些实施方案中，该硫代磷酸酯修饰核苷酸区段不完全是单链的。
与本发明相关的核酸分子可与辍合物连接。在一些实施方案中，所述辍合物连接到引导链，而在另一些实施方案中，所述辍合物连接到负载链。在一些实施方案中，所述辍合物是疏水的。在一些实施方案中，所述辍合物是固醇，如胆固醇。在一些实施方案中，与本发明相关的核酸分子为平末端的。
本发明的一些方面涉及包含引导链和负载链双链核酸分子，其中所述分子的双链区长为8-14个核苷酸，并且其中所述分子具有小于-13kkal/mol的热力学稳定性(ΔG)。
在一些实施方案中，所述分子的双链区长为8、9、10、11、12、13或14个核苷酸。在一些实施方案中，所述分子具有小于-20kkal/mol的热力学稳定性(ΔG)。在一些实施方案中，所述核酸分子是化学修饰的。在一些实施方案中，所述化学修饰选自5’磷酸酯、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟代、核糖胸苷、C-5丙炔基-dC(pdC)、C-5丙炔基-dU(pdU)、C-5丙炔基-C(pC)、C-5丙炔基-U(pU)、5-甲基C、-5-甲基U、5-甲基dC、5-甲基dU甲氧基、(2，6-二氨基嘌呤)、5′-二甲氧基三苯甲基-N4-乙基-2′-脱氧胞苷、C-5丙炔基-fC(pfC)、C-5丙炔基-fU(pfU)、5-甲基fC、5-甲基fU、C-5丙炔基-mC(pmC)、C-5丙炔基-fU(pmU)、5-甲基mC、5-甲基mU、LNA(锁核酸)、MGB(小沟结合剂)和其它提高碱基疏水性的碱基修饰。在同一分子中可存在多于一种化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰提高稳定性和/或提高热力学稳定性(ΔG)。在一些实施方案中，核酸分子上至少90％的CU残基被修饰。
在一些实施方案中，所述引导链的1位核苷酸具有2’O-甲基修饰和/或5’磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的至少一个C或U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的每个C和U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的至少一个C或U核苷酸具有2’O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的每个C和U核苷酸具有2’-O甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链每个C和U核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链的每个核苷酸具有2’-O-甲基修饰。
与本发明相关的核酸分子可包含至少为4个硫代磷酸酯修饰核苷酸的区段。在一些实施方案中，硫代磷酸酯修饰的核苷酸区段长至少12核苷酸。在一些实施方案中，硫代磷酸酯修饰的核苷酸区段不完全是单链的。在一些实施方案中，所述核酸分子与辍合物连接。在一些实施方案中，所述辍合物连接到引导链，而在另一些实施方案，所述辍合物连接到负载链。在一些实施方案中，所述辍合物是疏水的。在一些实施方案中，所述辍合物是固醇，如胆固醇。在一些实施方案中，与本发明相关的核酸分子为平末端的。在一些实施方案中，所述核酸分子的5’末端为平末端。在一些实施方案中，所述核酸分子的5’末端为平末端，并且该分子两链之间的互补区从这里开始。
本发明的一些方面涉及抑制哺乳动物细胞中靶基因表达的方法。该方法包括将所述哺乳动物细胞与分离的双链核酸分子接触，所述分离的双链核酸分子包含引导链和负载链，其中所述引导链长16-29个核苷酸并与靶基因互补，其中所述负载链长8-14个核苷酸并与所述引导链互补，并且其中所述双链核酸分子的热力学稳定性(ΔG)为小于-13kkal/mol。
所述细胞可在体内或体外接触。在一些实施方案中，所述引导链长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸。在一些实施方案中，所述负载链长为8、9、10、11、12、13或14个核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸分子具有小于-20kkal/mol的热力学稳定性(ΔG)。
与本文所述方法相关的核酸分子可以是化学修饰的。在一些实施方案中，所述化学修饰选自5’磷酸酯、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟代、核糖胸苷、C-5丙炔基-dC(pdC)、C-5丙炔基-dU(pdU)、C-5丙炔基-C(pC)、C-5丙炔基-U(pU)、5-甲基C、-5-甲基U、5-甲基dC、5-甲基dU甲氧基、(2，6-二氨基嘌呤)、5′-二甲氧基三苯甲基-N4-乙基-2′-脱氧胞苷、C-5丙炔基-fC(pfC)、C-5丙炔基-fU(pfU)、5-甲基fC、5-甲基fU、C-5丙炔基-mC(pmC)、C-5丙炔基-fU(pmU)、5-甲基mC、5-甲基mU、LNA(锁核酸)、MGB(小沟结合剂)和其它提高碱基疏水性的碱基修饰。在同一分子中可存在多于一种化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰提高稳定性和/或提高热力学稳定性(ΔG)。在一些实施方案中，核酸分子上至少90％的CU残基被修饰。
在一些实施方案中，所述引导链的1位核苷酸具有2’O-甲基修饰和/或5’磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的至少一个C或U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的每个C和U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的至少一个C或U核苷酸具有2’O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的每个C和U核苷酸具有2’-O甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链每个C和U核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链的每个核苷酸具有2’-O-甲基修饰。
在一些实施方案中，与本发明相关的核酸分子包含至少为4个硫代磷酸酯修饰核苷酸的区段。在一些实施方案中，硫代磷酸酯修饰的核苷酸区段长至少12核苷酸。在一些实施方案中，硫代磷酸酯修饰的核苷酸区段不完全是单链的。
与本发明相关的核酸分子可与辍合物连接。在一些实施方案中，所述辍合物连接到引导链，而在另一些实施方案中，所述辍合物连接到负载链。在一些实施方案中，所述辍合物是疏水的。在一些实施方案中，所述辍合物是固醇，如胆固醇。在一些实施方案中，与本发明相关的核酸分子为平末端的。
本文所述的用于抑制哺乳动物细胞中靶基因表达的方法包括将所述哺乳动物细胞与分离的双链核酸分子接触，所述分离的双链核酸分子包含引导链和负载链，其中所述分子的双链区长8-14个核苷酸，并且其中所述分子的热力学稳定性(ΔG)小于-13kkal/mol。
在一些实施方案中，所述分子的双链区长为8、9、10、11、12、13或14个核苷酸。在一些实施方案中，所述分子具有小于-20kkal/mol的热力学稳定性(ΔG)。在一些实施方案中，所述核酸分子是化学修饰的。在一些实施方案中，所述化学修饰选自5’磷酸酯、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟代、核糖胸苷、C-5丙炔基-dC(pdC)、C-5丙炔基-dU(pdU)、C-5丙炔基-C(pC)、C-5丙炔基-U(pU)、5-甲基C、-5-甲基U、5-甲基dC、5-甲基dU甲氧基、(2，6-二氨基嘌呤)、5′-二甲氧基三苯甲基-N4-乙基-2′-脱氧胞苷、C-5丙炔基-fC(pfC)、C-5丙炔基-fU(pfU)、5-甲基fC、5-甲基fU、C-5丙炔基-mC(pmC)、C-5丙炔基-fU(pmU)、5-甲基mC、5-甲基mU、LNA(锁核酸)、MGB(小沟结合物)和其它提高碱基疏水性的碱基修饰。在同一分子中可存在多于一种化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰提高稳定性和/或提高热力学稳定性(ΔG)。在一些实施方案中，核酸分子上至少90％的CU残基被修饰。
在一些实施方案中，所述引导链的1位核苷酸具有2’O-甲基修饰和/或5’磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的至少一个C或U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的每个C和U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的至少一个C或U核苷酸具有2’O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的每个C和U核苷酸具有2’-O甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链每个C和U核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链的每个核苷酸具有2’-O-甲基修饰。
与本发明相关的核酸分子可包含至少为4个硫代磷酸酯修饰核苷酸的区段。在一些实施方案中，硫代磷酸酯修饰核苷酸的区段长至少12核苷酸。在一些实施方案中，硫代磷酸酯修饰核苷酸区段不完全是单链的。在一些实施方案中，所述核酸分子可与辍合物连接。在一些实施方案中，所述辍合物连接到引导链，而在另一些实施方案中，所述辍合物连接到负载链。在一些实施方案中，所述辍合物是疏水的。在一些实施方案中，所述辍合物是固醇，如胆固醇。在一些实施方案中，与本发明相关的核酸分子为平末端的。
在另一个实施方案中，本发明提供选择用于基因沉默的siRNA的方法，其通过以下来实现：(a)选择靶基因，其中所述靶基因包含靶序列；(b)选择候选siRNA，其中所述候选siRNA包含16-29个核苷酸碱基对的引导链和8-14个核苷酸碱基对的负载链，所述引导链和负载链形成含有反义区和有义区的双链体，并且所述候选siRNA的所述反义区与所述靶序列的区域至少80％互补；(c)测定候选siRNA的热力学稳定性(ΔG)；和(e)如果所述热力学稳定性小于-13kkal/mol，则选择所述候选siRNA作为用于基因沉默的siRNA。
本发明的一些方面涉及包含引导链和负载链的分离的双链核酸分子，其中所述引导链长18-19核苷酸并与靶基因互补，其中所述互补链长11-13核苷酸并与所述引导链互补，并且其中所述双链核酸分子的热力学稳定性(ΔG)小于-13kkal/mol。
在一些实施方案中，所述引导链的1位核苷酸具有2’O-甲基修饰和/或5’磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的至少一个C或U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的每个C和U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的至少一个C或U核苷酸具有2’O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的每个C和U核苷酸具有2’-O甲基修饰。
在一些实施方案中，所述引导链包含至少为4个硫代磷酸酯修饰核苷酸的区段。在一些实施方案中，所述引导链包含至少为8个硫代磷酸酯修饰核苷酸的区段。在一些实施方案中，所述负载链每个C和U核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链的每个核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链的至少1或至少2个核苷酸被硫代磷酸酯修饰。所述核酸分子可在引导链或负载链上与辍合物连接。在一些实施方案中，所述辍合物是固醇，如胆固醇。
本发明的一些方面涉及包含引导链和负载链的分离的双链核酸分子，其中所述引导链长16-28个核苷酸并与靶基因互补，其中所述引导链3’末端10个核苷酸包含至少2个磷酸酯修饰，并且其中所述引导链包含至少一个2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰；其中所述负载链长8-28个核苷酸并与所述引导链互补，其中所述负载链与亲脂基团连接，其中所述引导链和所述负载链形成双链核酸分子。
在一些实施方案中，所述引导链的1位核苷酸具有2’O-甲基修饰和/或5’磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的至少一个C或U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链2-10位的每个C和U核苷酸具有2’-氟代修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的至少一个C或U核苷酸具有2’O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述引导链11-18位的每个C和U核苷酸具有2’-O甲基修饰。
在一些实施方案中，所述引导链3’末端的10个核苷酸包括至少4或至少8个磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述引导链包含2-14或4-10个磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述引导链3’末端的6个核苷酸均包含磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述磷酸酯修饰是硫代磷酸酯修饰。
在一些实施方案中，所述负载链的每个C和U核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链的每个核苷酸具有2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，所述负载链的至少1或至少2个核苷酸被硫代磷酸酯修饰。在一些实施方案中，亲脂分子是固醇，如胆固醇。在一些实施方案中，所述引导链长18-19个核苷酸并且所述负载链长11-13个核苷酸。
本发明的一些方面涉及包含引导链和负载链的分离的双链核酸分子，其中所述引导链长16-29个核苷酸并与靶基因基本互补，其中所述负载链长8-14个核苷酸并与所述引导链互补，并且其中所述引导链具有至少2个化学修饰。在一些实施方案中，所述2个化学修饰为硫代磷酸酯修饰。
本发明的另一些方面涉及包含引导链和负载链的分离的双链核酸分子，其中所述引导链长16-29个核苷酸并且基本与靶基因互补，其中所述负载链长8-14个核苷酸并且与所述引导链互补，并且其中所述引导链具有5个核苷酸或更长的单链3’区。在一些实施方案中，所述单链区包含至少2个硫代磷酸酯修饰。
本发明的另一些方面涉及包含引导链和负载链的分离的双链核酸分子，其中所述引导链长18-21个核苷酸并与靶基因基本互补，其中所述负载链长11-14个核苷酸并与所述引导链互补，并且其中所述引导链的1位具有2-OMe和5’磷酸酯修饰，所述引导链2至11位的每个C和U为2-F修饰，所述引导链12-18位的每个C和U为2’OMe修饰，并且所述负载链上80％的C和U为2’OMe修饰。
本发明的另一个方面涉及包含引导链和负载链的分离的双链核酸分子，其中所述引导链长18-21个核苷酸并且与靶基因基本互补，其中所述负载链长11-14个核苷酸并与所述引导链互补，并且其中所述引导链的1位具有2-OMe和5’磷酸酯修饰，所述引导链2至11位的每个C和U为2-F修饰，所述引导链12-18位的每个C和U为2’OMe修饰，所述负载链中80％的C和U为2’OMe修饰并且负载链的3’末端与辍合物连接。在一些实施方案中，所述辍合物选自固醇、固醇类分子、疏水维生素或脂肪酸。
本发明的每种限定可涵盖本发明的多种实施方案。因此，预计本发明涉及任一要素或要素组合的每个限定可包含在本发明的每个方面中。本发明在其应用中不受限于以下说明中所公开或附图所展示组件的构建和排列的细节。本发明可包括其它实施方案或者以多种方式操作或实施。
附图说明
附图并未按比例绘制。在附图中，在多个图中显示的每个相同或几乎相同的组件由相似的标号表示。为清楚起见，并没有标出每个图中的每个组件。在图中：
图1是显示所提出的不对称双链RNA分子(asymmetric doublestranded RNA，adsRNA)的示意图。粗线表示带有与RISC装载相容的修饰模式的序列。条纹线表示带有与负载链相容的修饰的多核苷酸。平线表示针对细胞相互作用和摄取而优化了修饰模式的单链多核苷酸。图1A显示了具有延长的引导或负载链的adsRNA。图1B显示了具有不同长度的细胞透过性多核苷酸的adsRNA；图1C显示了具有3’和5’辍合物的adsRNA；图1D显示了具有错配的adsRNA。
图2是显示具有不同化学修饰模式的不对称dsRNA分子的示意图。所显示的可用于提高疏水性的几种化学修饰的实例包括4-吡啶基、2-吡啶基、异丁基和吲哚基的5位尿苷修饰。
图3是显示采用dsRNA结合结构域、精蛋白(或其它Arg富含肽)、亚精胺或相似化学结构来屏蔽双链体电荷以便于细胞进入的示意图。
图4是显示可用于多核苷酸电荷屏蔽的带正电化学品的示意图。
图5是显示进入RISC的单链多核苷酸的结构和化学组成的示意图。可采用一种或多种修饰(包括2’d、2’Ome、2’F、疏水和硫代磷酸酯修饰)的组合来优化单链的RISC进入。
图6是显示RISC底物抑制剂的结构和化学组成的实例的示意图。可采用一种或多种化学修饰的组合来介导有效摄取和与预装载的RISC复合物的有效结合。
图7是显示连接有固醇类分子的多核苷酸的结构的示意图，其中R表示9个碳或更长的多碳尾。图7A表示adsRNA分子；图7B表示约17-30bp长的siRNA分子；图7C表示进入RISC的链；图7D表示底物类似物链。可优化如图7所示的化学修饰模式以促进期望的功能。
图8是显示天然植物固醇的实例的示意图，所述植物固醇具有长于8的多碳链，连接到17位。已知多于250种不同类型的植物固醇。
图9是显示固醇样结构的实例的示意图，所述固醇样结构中连接到17位的多碳链的大小不同。
图10显示的示意图和图表证明，连接到17位的多碳链的大小直接影响包含固醇类分子的脂质乳剂的肝摄取和血浆清除百分比。该图修改自Martins等，Journal of Lipid Research(1998)的图。
图11是显示胶束形成的示意图。图11A显示具有疏水辍合物的多核苷酸；图11B显示亚油酸；图11C显示由包含疏水辍合物的多核苷酸与脂肪酸组合的混合物所形成的胶束。
图12是显示脂质组成的改变可如何影响疏水修饰和/或疏水辍合的多核苷酸的药代动力学行为和组织分布的示意图。特别地，采用富含亚油酸和心磷脂的脂质混合物导致心肌的偏好性摄取。
图13是显示用于靶向MAP4K4表达的RNAi构建体和对照的实例的示意图。RNAi构建体12083对应于SEQ ID NO：597和598。RNAi构建体12089对应于SEQ ID NO：599。
图14是显示转染本发明RNAi构建体后MAP4K4表达的图。所测试的RNAi构建体为：12083(缺口)，12085(13nt双链体)，12089(无茎配对)和12134(13nt miniRNA)。转染结果与未转染的对照样品相比较。RNAi构建体12083对应于SEQ ID NO：597和598。RNAi构建体12085对应于SEQ ID NO：600和601。RNAi构建体12089对应于SEQ ID NO：599。RNAi构建体12134对应于SEQ ID NO：602和603。
图15是显示用本发明RNAi构建体转染24小时后MAP4K4表达的图。所测试的RNAi构建体为：11546(MAP4K4rxRNA)、12083(MAP4K4缺口构建体)、12134(12bp soloRNA)和12241(14/3/14 soloRNA)。转染结果与填充物对照样品相比较。RNAi构建体11546对应于SEQ ID NO：604和605。RNAi构建体12083对应于SEQ ID NO：597和598。RNAi构建体12134对应于SEQ ID NO：602和603。RNAi构建体12241对应于SEQID NO：606和607。
图16是显示转染本发明RNAi构建体后MAP4K4表达沉默相关参数之比较的图和几个表格。rxRNA构建体对应于SEQ ID NO：604和605。14-3-14 soloRNA构建体对应于SEQ ID NO：606和607。13/19双链体(缺口构建体)对应于SEQ ID NO：597和598。12-bp soloRNA构建体对应于SEQ ID NO：602和603。
图17是显示用于靶向SOD1表达的RNAi构建体和对照的实例的示意图。12084RNAi构建体对应于SEQ ID NO：612和613。
图18是显示转染本发明RNAi构建体后SOD1表达的图。所测试的RNAi构建体为12084(缺口)、12086(13nt双链体)、12090(无茎配对)和12035(13nt MiniRNA)。转染结果与未转染对照样品相比较。12084RNAi构建体对应于SEQ ID NO：612和613。12086RNAi构建体对应于SEQ IDNO：608和609。12035RNAi构建体对应于SEQ ID NO：610和611。
图19是显示转染本发明RNAi构建体后24小时SOD1表达的图。所测试的RNAi构建体为：10015(SOD1 rxRNA)和12084(SOD1缺口构建体)。转染结果与填充物对照样品相比较。10015RNAi构建体对应于SEQID NO：614和615。12084RNAi构建体对应于SEQ ID NO：612和613。
图20是说明具有小于10个核苷酸的双链区的RNA分子不被Dicer切割的示意图。
图21为显示用于RNA诱导基因沉默的假想RNAi模型的示意图。
图22为显示不对称RNAi化合物的化学优化的图。化学修饰的存在(尤其是引导链上的2’F UC、硫代磷酸酯修饰以及负载链上的完全CU2’OMe修饰)产生了功能性化合物。显示了采用特定修饰的RNAi分子进行的脂质介导转染后的MAP4K4沉默。所测试的RNAi分子具有13个核苷酸长的有义链并包含以下修饰：未修饰；C和U 2’OMe；C和U 2’OMe并且3’Chl；rxRNA 2’Ome模式；除1位碱基外全部2’OMe。此外，所测试的RNAi分子的引导(反义)链包含以下修饰：未修饰；未修饰并具有5’P；C和U 2’F；C和U 2’F并且3’末端8PS；以及未修饰(长17nt)。还显示了rxRNA 12/10双链体和阴性对照的结果。
图23证明，本文所述的化学修饰显著提高了HeLa细胞中RNAi分子的体外无协助递送的效力。没有改变化合物的结构和序列；只改变了分子的化学修饰模式。无2’F、2’O-me、硫代磷酸酯修饰或胆固醇辍合物的化合物完全没有被动摄取活性。所有4种这些修饰类型的组合产生了最高水平的活性(化合物12386)。
图24是显示在被动摄取转染了NT Accell修饰siRNA、MAP4K4Accell siRNA、Non-Chl nanoRNA(12379)和sd-nanoRNA(12386)后HeLa细胞中MAP4K4表达的图。
图25是显示在被动摄取转染了包含以下参数的多种浓度的RNA分子后HeLa细胞中MAP4K4表达的图：Nano Lead无3’Chl；Nano Lead；Accell MAP4K4；21mer GS，8PS尾；21mer GS，12PS尾；以及25merGS，12PS尾。
图26为证明寡核苷酸含量的降低提高了无协助摄取效率的图。对不对称化合物、传统siRNA化合物和25mer RNAi化合物进行相似的化学修饰。证明不对称小化合物具有最显著的效力。
图27为证明硫代磷酸酯含量对无协助递送的重要性的图。图27A显示了系统性筛选的结果，其揭示引导链中至少2-12个硫代磷酸酯的存在显著提高了摄取；在一些实施方案中，发现4-8个硫代磷酸酯修饰是优选的。图27B揭示有义链中硫代磷酸酯修饰的存在与否不改变效力。
图28是显示被动摄取转染Accell Media-Ctrl-UTC；MM APOBAlnylam；活性APOB Alnylam；nanoRNA无chl；nanoRNA MAP4K4；小鼠MAP4K4 Accell Smartpool；DY547Accell对照；具有Dy547的Luc对照rxRNA；具有DY547的MAP4K4 rxRNA；和单独的AS链(nano)后原代小鼠肝细胞中MAP4K4表达的图。
图29是显示被动摄取转染Accell Media-Ctrl-UTC；MM APOBAlnylam；活性APOB Alnylam；nanoRNA无chl；nanoRNA MAP4K4；小鼠MAP4K4 Accell Smartpool；DY547 Accell对照；具有Dy547的Luc对照rxRNA；具有DY547的MAP4K4 rxRNA；和单独的AS链(nano)后原代小鼠肝细胞中ApoB表达的图。
图30是显示被动摄取转染11550 MAP4K4 rxRNA；12544 MMMAP4K4 nanoRNA；12539活性MAP4K4 nanoRNA；Accell培养基；和UTC后原代人肝细胞中MAP4K4表达的图。
图31显示被动摄取转染12505活性ApoB chol-siRNA；12506 MMApoB chol-siRNA；Accell Media；和UTC后原代人肝细胞中ApoB表达的图。
图32是显示sd-rxRNAnano定位位置的图。
图33是显示Chol-siRNA(Alnylam)定位的图。
图34为本发明第一代(G1)sd-rxRNAnano分子的示意图，显示了修饰所靶向的区域以及分子不同区域的相关功能。
图35显示为优化sd-rxRNAnano(G1)而筛选的修饰模式。在引导链上筛选的修饰包括19、21和25个核苷酸的长度，0-18个核苷酸的硫代磷酸酯修饰，以及用2’OMe、5甲基C和/或核糖胸苷修饰替换2’F修饰。所筛选的有义链修饰包括11、13和19个核苷酸的长度，0-4个核苷酸的硫代磷酸酯修饰和用2’OMe进行修饰。
图36为显示为优化而进行筛选的sd-rxRNAnano修饰的示意图。
图37为显示转染Risc游离siRNA；rxRNA；Nano(未修饰)；单独的GS；Nano Lead(无Chl)；Nano(GS：1、18和19位的(3)2’OMe，8PS，19nt)；Nano(GS：1、18和19位的(3)2’OMe，8PS，21nt)；Nano(GS：1、18和19位的(3)2’OMe，12PS，21nt)；和Nano(GS：1、18和19位的(3)2’OMe，12PS，25nt)后Hek293细胞中MAP4K4表达百分比的图。
图38为显示被动摄取转染了单独的GS；Nano Lead；Nano(GS：1、18和19位的(3)2’OMe，8PS，19nt)；Nano(GS：1、18和19位的(3)2’OMe，8PS，21nt)；Nano(GS：1、18和19位的(3)2’OMe，12PS，21nt)；Nano(GS：1、18和19位的(3)2’OMe，12PS，25nt)后HeLa细胞中MAP4K4表达百分比的图。
图39为显示脂质介导转染了单独的引导链(GS：8PS，19nt)；单独的引导链(GS：18PS，19nt)；Nano(GS：无PS，19nt)；Nano(GS：2PS，19nt)；Nano(GS：4PS，19nt)；Nano(GS：6PS，19nt)；Nano Lead(GS：8PS，19nt)；Nano(GS：10PS，19nt)；Nano(GS：12PS，19nt)；和Nano(GS：18PS，19nt)后Hek293细胞中MAP4K4表达百分比的图。
图40为显示脂质介导转染了单独的引导链(GS：8PS，19nt)；单独的引导链(GS：18PS，19nt)；Nano(GS：无PS，19nt)；Nano(GS：2PS，19nt)；Nano(GS：4PS，19nt)；Nano(GS：6PS，19nt)；Nano Lead(GS：8PS，19nt)；Nano(GS：10PS，19nt)；Nano(GS：12PS，19nt)；和Nano(GS：18PS，19nt)后Hek293细胞中MAP4K4表达百分比的图。
图41为显示被动摄取转染了Nano Lead(无Chl)；单独的引导链(18PS)；Nano(GS：0PS，19nt)；Nano(GS：2PS，19nt)；Nano(GS：4PS，19nt)；Nano(GS：6PS，19nt)；Nano Lead(GS：8PS，19nt)；Nano(GS：10PS，19nt)；Nano(GS：12PS，19nt)；和Nano(GS：18PS，19nt)后HeLa细胞中MAP4K4表达百分比的图。
图42为显示被动摄取转染了Nano Lead(无Chl)；单独的有义链(18PS)；Nano(GS：0PS，19nt)；Nano(GS：2PS，19nt)；Nano(GS：4PS，19nt)；Nano(GS：6PS，19nt)；Nano Lead(GS：8PS，19nt)；Nano(GS：10PS，19nt)；Nano(GS：12PS，19nt)；和Nano(GS：18PS，19nt)后HeLa细胞中MAP4K4表达百分比的图。
图43为显示为优化而筛选的引导链化学修饰的示意图。
图44为显示反向转染(reverse transfection)了RISC游离siRNA；单独的GS(2’F C和U)；单独的GS(2’OMe C和U)；Nano Lead(2’F C和U)；nano(GS：(3)2’OMe，16-18位)；nano(GS：(3)2’OMe，16、17和19位)；nano(GS：(4)2’OMe，11、16-18位)；nano(GS：(10)2’OMe，C和U)；nano(GS：(6)2’OMe，1和5-9位)；nano(GS：(3)2’OMe，1、18和19位)；以及nano(GS：(5)2’OMe C)后Hek293细胞中MAP4K4表达百分比的图。
图45为展示多种化学修饰模式的效力的图。特别地，1和11-18位的2-OMe修饰的容忍度很高。种子区的2’OMe修饰导致效力的轻微降低(但效力仍旧很高)。种子区的核糖修饰的容忍度很高。这些数据使得可以产生减少2’F修饰或无2’F修饰的自递送化合物。这具有重要意义，因为2’F修饰可与体内毒性相关。
图46为有义链修饰的示意图。
图47为显示有义链长度优化的图。在该测定中发现10-15个碱基长的有义链是最佳的。增加有义链长度导致这些化合物被动摄取的降低，但对于其它化合物来说是可容忍的。包含LNA修饰的有义链显示出与不包含LNA的化合物具有相似的效力。在一些实施方案中，加入LNA或其它热动力稳定性化合物可为有益的，导致将非功能性序列转化为功能性序列。
图48为显示被动摄取转染了单独的有义链(2’F C和U)；Nano Lead；Nano Lead(无Chl)；Nano(SS：11nt 2’OMe C和U，Chl)；Nano(SS：11nt，完全2’OMe，Chl)；Nano(SS：19nt，2’OMe C和U，Chl)；Nano(SS：19nt，2’OMe C和U，无Chl)后HeLa细胞中MAP4K4表达百分比的图。
图49为显示被动摄取转染Nano Lead(无Chl)；Nano(SS无PS)；Nano Lead(SS：2PS)；Nano(SS：4PS)后HeLa细胞中MAP4K4表达百分比的图。
图50是表示第二代(GII)sd-rxRNAnanolead分子的示意图。
图51为显示sd-rxRNA存在下MAP4K4沉默的EC50值的图，和显示DY547标记的rxRNAori和DY547标记的sd-rxRNA的定位的图。
图52为优化的sd-rxRNA分子存在下HeLa细胞中MAP4K4表达百分比的显示图。
图53为表示化学修饰含量在sd-rxRNA效力优化中的相关性的图。
图54为表示固醇类分子的示意图，和表明具有多种接头化学结构的sd-rxRNA化合物具有完整功能的图。用通过TEG和氨基己酸接头连接固醇类分子来合成GII不对称化合物。两种接头显示相同的效能。这种接头化学结构的功能独立性显示了本文所述分子和之前所述分子的显著不同，并为本文所述分子的规模扩大和合成提供了显著优势。
图55展示了与未修饰RNA相比，化学修饰的sd-rxRNA化合物在人血清中的稳定性。将寡核苷酸在37℃下在75％的血清中孵育所示的小时数。通过将样品在非变性凝胶上电泳并用SYBGR染色来确定降解水平。
图56为通过使寡核苷酸含量尽可能小来优化sd-rxRNA细胞摄取的图。
图57为显示小鼠PEC衍生巨噬细胞中sd-rxRNA自发细胞摄取后MAP4K4表达的百分比的图，以及显示sd-rxRNA定位的相和荧光图。
图58为显示小鼠原代肝细胞中sd-rxRNA(靶向)和sd-rxRNA(错配)自发细胞摄取后MAP4K4表达百分比的图，以及显示sd-rxRNA位置的相和荧光图。
图59为显示不使用制剂递送到RPE细胞的DY547标记sd-rxRNA的定位的示意图。
图60为显示不使用制剂用sd-rxRNAnano处理的RPE细胞中MAP4K4表达沉默的图。
图61为RNAi化合物的图和示意图，其显示了高效sd-rxRNA化合物的化学/结构组成。发现高效化合物具有以下特征：17-21个核苷酸的反义链，10-15个核苷酸的有义链，含有2-12个硫代磷酸酯修饰(优选6-8个硫代磷酸酯修饰)的单链区，和大部分核苷酸被2’OMe修饰(有或没有硫代磷酸酯修饰)的有义链。可采用任何接头化学结构将这些分子在有义链3’末端与疏水部分(如胆固醇)连接。这些RNA化合物的GII a-b形式证明2’F含量的消除对效力无影响。
图62显示了RNAi化合物的图和示意图，其证明与Wolfrum等Nature Biotech，2007发表的化合物，相比sd-rxRNA化合物具有更好的性能。本文开发的I代和II代化合物(GI和GIIa)均显示很好的效力。与之不同，当将Wolfrum等所述的化学结构(所有寡聚物包含缀合到有义链3’末端的胆固醇)应用于常规siRNA(19bp双链体，有2突出端)的相同序列上时，化合物基本无活性。这些数据强调了将本文所述的化学修饰和不对称分子组合而产生高效RNA化合物的重要性。
图63为显示sd-rxRNA在细胞内累积，而其它效力较低的缀合RNA在细胞表面累积的图。
图64为显示sd-rxRNA分子在几分钟内内化入细胞中，而其他分子则不然。
图65显示了证明与常规胆固醇辍合siRNA(如在Soucheck等中发表的那些)相比，sd-rxRNA化合物具有明显更佳的细胞和组织摄取特征的图。图65A、B比较了RPE细胞中的摄取，图65C、D比较了局部施用到皮肤后的摄取，图65E、F比较了全身施用后的肝摄取。与普通siRNA-胆固醇化合物相比，sd-rxRNA化合物的摄取水平至少高一个数量级。
图66为显示局部递送后rxRNAori和sd-rxRNA的定位的图。
图67为显示局部递送后sd-rxRNA和其它缀合RNA的定位的图。
图68为显示筛选结果的图，所述筛选用sd-rxRNAGII化学结构进行，以鉴定靶向SPP1基因的功能性化合物。鉴定出多种有效化合物，其中14131最有效。将化合物加入A-549细胞并在48小时后通过B-DNA确定SPP1/PPIB的比值水平。
图69为显示在几分钟的接触中sd-rxRNA的有效细胞摄取的图和几个图像。这是本文所述的sd-rxRNA化合物的独特特征，在其它任何RNAi化合物中未观察到。用Soutschek等的化合物作为阴性对照。
图70为证明多种细胞类型中多种序列的sd-rxRNA化合物有效摄取及沉默的图和几个图像。在每种情况下通过用分支DNA测定来观察靶基因表达，以测定沉默。
图71为显示在存在和不存在血清的情况下sd-rxRNA有活性的图。在存在血清时观察到效力的微小降低(2-5倍)。这种在血清存在时效力的极小降低将本文所述的sd-rxRNA化合物与之前所述的RNAi化合物区分开来，后者的效力有极大的降低，因此这是本文所述的sd-rxRNA分子体内效力的基础。
图72是证明在单次真皮内注射本文所述sd-rxRNA化合物后有效组织渗透和细胞摄取的图。这代表了局部递送sd-rxRNA化合物的模型，并有效证明了皮肤施用时sd-rxRNA化合物的递送和基因沉默。
图73是证明真皮内注射后sd-rxRNA有效细胞摄取和体内沉默的图像和图。
图74是证明sd-rxRNA在全身施用后具有改善的血液清除并在肝中体内诱导有效基因沉默的图。
图75为证明5-甲基C在RNAi化合物中的存在导致脂质介导转染效率提高的图，这证明在RNAi化合物中C和U的疏水修饰可以是有利的。在一些实施方案中，可在2’核糖修饰碱基的情况下采用这种类型的修饰，以保证最佳的稳定性和效力。
图76为显示被动摄取转染了单独的引导链；Nano Lead；Nano Lead(无胆固醇)；引导链w/5MeC和单独的2’F U；Nano Lead w/GS 5MeC和2’F U；Nano Lead w/GS riboT和5甲基C；和Nano Lead w/引导dT和5甲基C后MAP4K4表达百分比的图。
图77为在全身递送至肝后比较sd-rxRNA和其它RNA辍合物的定位的图。
图78为证明5-尿苷修饰具有改进的疏水特征的示意图。将这种修饰掺入sd-rxRNA化合物可提高细胞和组织摄取特性。图78B为可应用于化合物以提高细胞摄取和药代动力学行为的新型RNAi化合物修饰。当用于sd-rxRNA化合物时，该类型的修饰可促使这种化合物经口使用。
图79为显示合成的经修饰固醇类分子的结构的示意图，其中C17连接尾的长度和结构被修饰。不希望局限于任何理论，C17连接尾的长度可提高sd-rxRNA化合物的体外和体内效力。
图80为显示用石胆酸作为长侧链胆固醇的示意图。
图81为显示5-尿苷亚磷酰胺合成途径的示意图。
图82显示用于3’-胆固醇连接的三功能羟基脯氨醇接头的合成示意图。
图83为显示用于制造更短的不对称RNAi化合物链的固体支持物合成示意图。
图84显示了SPP1 sd-rxRNA化合物的选择。将靶向SPP1的sd-rxRNA化合物加入A549细胞(采用被动转染)中，并在48小时后评价SPP1的表达水平。鉴定了在SPP1沉默中有效的几种新化合物，其中最具效力的为化合物14131。
图85显示sd-rxRNA化合物14116、14121、14131、14134、14139、14149和14152在SPP1沉默中效力的独立验证。
图86显示了鉴定在CTGF敲低中具有功能的sd-rxRNA化合物的sd-rxRNA化合物筛选结果。
图87显示了鉴定在CTGF敲低中具有功能的sd-rxRNA的sd-rxRNA化合物筛选结果。
图88显示了鉴定不对称化合物最小长度的系统性筛选。将10-19碱基的负载链与17-25碱基的引导链杂交。在本测定中，发现双链体区短至10碱基的化合物在诱导中有效。
图89证明有义链与引导链的相对位置对RNAi活性很重要。在该测定中，发现平末端是最佳的，3’突出端是可容忍的，而5’突出端导致功能的完全丧失。
图90证明只在2-17位核苷酸与靶标同源的引导链在与不同长度的有义链杂交时能产生有效的RNAi。通过脂质介导的转染将化合物引入HeLa细胞。
图91为可代替胆固醇用作疏水实体的一组固醇类分子的示意图。在一些情况下，采用包含更长链的固醇类分子产生了具有显著更佳的细胞摄取和组织分布特性的sd-rxRNA化合物。
图92为可代替胆固醇用作疏水实体的一组疏水分子的示意图。这些列举只提供代表性实例；可采用本质上具有疏水性的任何小分子。
发明详述
本发明的一些方面涉及与基因沉默相关的方法和组合物。本发明至少部分基于以下惊人的发现，即具有极小长度(如8-14个核苷酸)双链区的不对称核酸分子在基因表达沉默中有效。之前没有证明具有如此之短的双链区的分子在介导RNA干扰中有效。之前推测，双链区必须为19个核苷酸或更长。本文所述的分子通过化学修饰进行优化，并且在一些情况下通过连接疏水辍合物进行优化。
本发明至少部分基于另一个惊人的发现，即与常规siRNA相比，双链区减小的不对称核酸分子的细胞摄取更加高效得多。这些分子在沉默靶基因表达中具有很高效，并且与之前所述的RNAi分子相比提供了显著的益处，包括在血清存在下具有高活性、有效的自递送、与多种接头相容、与毒性相关的化学修饰更少或完全不存在。
与单链多核苷酸不同，很难将双链体多核苷酸递送到细胞，这是因为它们具有刚性结构以及大量的负电荷，这使膜转运很困难。出人意料的是，发现本发明的多核苷酸尽管部分为双链，却在体内被识别为单链，因此，其能透过细胞膜有效递送。因此本发明的多核苷酸在多种自递送的情况下可用。因此，本发明的多核苷酸可以类似于常规RNAi试剂的方式被制备，或可将它们单独地(或与非递送型载体一起)递送到细胞或对象，并使其自递送。在本发明的一个实施方案中，提供了自递送不对称双链RNA分子，其中所述分子的一部分类似于常规RNA双链体，而所述分子的第二部分为单链。
本发明多核苷酸在本文中称为为本发明的分离的双链或双链体核酸、寡核苷酸或多核苷酸、纳米分子、纳米RNA、sd-rxRNAnano、sd-rxRNA或RNA分子。
本发明的寡核苷酸在一些方面中具有以下特征的组合：包含双链区和5个核苷酸或更长的单链区的不对称结构、特定化学修饰模式以及与亲脂或疏水分子缀合。这种新类型的RNAi样化合物在体外和体内具有极佳的效力。根据本文所述的数据，认为减小刚性双链体区域大小与应用于单链区的硫代磷酸酯修饰相组合是新颖的，并对所观察到的极佳效力是重要的。因此，本文所述的RNA分子在结构和组成以及体外和体内活性方面均不同。
在一个优选的实施方案中，本发明的RNAi分子包含不对称化合物，其包含双链区(有效RISC进入所需，10-15个碱基长)和4-12个核苷酸长的单链区；并具有13核苷酸的双链体。在一些实施方案中优选6个核苷酸的单链区。新RNAi化合物的单链区还包含2-12个硫代磷酸酯核苷酸间连接(称为硫代磷酸酯修饰)。在一些实施方案中优选6-8个硫代磷酸酯核苷酸间连接。此外，本发明的RNAi化合物还包含独特的化学修饰模式，这提供了稳定性并与RISC进入相容。这些要素的组合产生了对RNAi试剂体外和体内递送非常有用的出人意料的特性。
提供稳定性并与RISC进入相容的化学修饰模式包括对有义链(或负载链)以及反义链(或引导链)的修饰。例如可采用加强稳定性并且不干扰活性的任何化学实体修饰负载链。这些修饰包括2’核糖修饰(O-甲基、2’F、2脱氧和其它)和骨架修饰，如硫代磷酸酯修饰。负载链中优选的化学修饰模式包括负载链中C和U核苷酸的O甲基修饰，或者负载链可完全被O甲基修饰。
例如，引导链也可被任何加强稳定性而不干扰RISC进入的化学修饰进行修饰。引导链中优选的化学修饰模式包括大部分C和U核苷酸被2’F修饰并且5’末端被磷酸化。引导链中另一个优选的化学修饰模式包括1位和11-18位的C/U的2’O甲基修饰以及5’末端的化学磷酸化。引导链的另一个优选的化学修饰模式包括1位和11-18位的2’O甲基修饰和5’末端的化学磷酸化以及2-10位的C/U的2’F修饰。
本发明出乎意料地发现，上述本发明寡核苷酸的化学修饰模式被很好地容忍，并且实际上增强了不对称RNAi化合物的效力。参见如图22。
本文还通过实验证明，在多核苷酸中使用RNAi修饰的组合时获得了RNAi被动摄取的最佳效力。去除任何上述元素(引导链稳定化、硫代磷酸酯区段、有义链稳定化和疏水辍合物)或增加大小导致了亚最佳的效力，并且在一些情况下完全失去效力。要素的组合导致开发了在被动递送到细胞(如HeLa细胞)后具有完全活性的化合物(图23)。要素组合所导致的RNAi分子有效自递送程度是完全意想不到的。
图26、27和43中显示的数据证明了RNAi的多种修饰在实现稳定性和活性中的重要性。例如，图26证明采用不对称构型对被动摄取中效力的实现非常重要。当将相同的化学组成应用于传统构型的化合物(19-21个碱基的双链体和25mer双链体)时，效力以长度依赖性方式显著降低。图27显示了硫代磷酸酯化学修饰对活性之影响的系统性筛选。将序列、结构、稳定化学修饰、疏水辍合物保持不变，并改变化合物的硫代磷酸酯含量(0至18个PS键)。无硫代磷酸酯键和具有18个硫代磷酸酯键的化合物均在被动摄取中完全无活性。具有2-16个硫代磷酸酯键的化合物是有活性的，其中具有4-10个硫代磷酸酯键的化合物为活性最高的化合物。
以下实施例中的数据证明了本发明寡核苷酸在体外多种细胞类型中(支持数据)和体内在局部和全身施用后均具有高效力。例如，在数据中比较了具有不同化学结构的几种竞争RNAi分子使基因沉默的能力。将应用于相同靶标区域的sd-rxRNA(本发明寡核苷酸)和Soucheck等和Wolfrum等所述RNA进行的比较证明，只有sd-rxRNA化学结构在被动摄取中显示出显著的功能性。本发明的组合物达到10-50pM的EC50值。该效力水平是如Sauthceck等所述和Accell的常规化学结构不能达到的。在其它系统和其它基因中进行了类似的比较(图65和68)，所述系统如体外(RPE细胞系)，体内局部施用(受伤皮肤)和全身施用(50mg/kg)。在每种情况下本发明的寡核苷酸均达到更佳的结果。图64所包含的数据证明sd-rxRNA化合物在仅1分钟的接触后就发生有效的细胞摄取并导致沉默。这种效力是该组合物独有的，并且在该种类其他类型的分子中未发现。图70证明了在多种细胞类型中多种序列的sd-rxRNA化合物的有效摄取和沉默。所述sd-rxRNA化合物在存在或不存在血清和其它生物流体的情况下在细胞中也具有活性。图71证明在血清存在下活性只有少量降低。这种在不利生物环境中有效行使功能的能力进一步将sd-rxRNA化合物与其它该类所述化合物(如Accell和Soucheck等)区分开来，后者在血清存在下摄取被强烈抑制。
大量数据还证明了本发明化合物的体内效力。例如图72-74涉及本发明化合物体内递送的多种途径均产生明显活性。例如图72证明在单次真皮内注射后有效的组织渗透和细胞摄取。这是sd-rxRNA化合物局部递送的模型和在任何皮肤施用中sd-rxRNA递送和基因沉默的有效模式。图73证明了体内局部真皮内注射sd-rxRNA化合物后的有效组织渗透、细胞摄取和沉默。图74的数据证明，sd-rxRNA化合物在IV施用后导致高效的肝摄取。与Souicheck等的分子进行的比较显示，相同剂量水平下肝摄取水平相当惊人，sd-rxRNA化合物比Souicheck等的分子至少高50倍。
在一些情况下，可通过用新型化学结构改善化合物的疏水性来进一步改进sd-rxRNA。例如一个化学结构涉及采用疏水碱基修饰。只要修饰导致碱基的分配系数提高，则任何位置的任何碱基都可被修饰。修饰化学结构的优选位置为嘧啶碱基的4和5位。这些位置的主要优点为(a)易于合成，并且(b)对碱基配对和A型螺旋形成没有干扰，这对RISC复合体装载和靶标识别很重要。图75-83显示了这些化学结构的实例。所采用的一种sd-rxRNA化合物形式为存在多个脱氧尿苷并且不干扰整体化合物效力。此外，可通过优化疏水辍合物的结构来实现组织分布和细胞摄取的重大改进。在一些优选的实施方案中，修饰固醇的结构以改变(增加/减少)C17连接链。该类修饰导致细胞摄取的显著增加以及体内组织摄取特性的改进。
本发明在应用中不受在以下说明或图示中给出的构建细节和组件安排的限制。本发明可以有其它的实施方案并以多种方式操作或实施。并且，本文所用的措辞和术语是为说明目的而不应作为限制。本文中“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其改变形式的使用旨在涵盖其后列举的条目和其等同方案以及另外的条目。
因此，本发明的一些方面涉及包含引导(反义)链和负载(有义)链的分离的双链核酸分子。本文所用术语“双链”是指一个或更多个核酸分子，其中至少部分核酸单体为互补的并且具有氢键而形成双链区。在一些实施方案中，所述引导链长度为16-29个核苷酸。在一些实施方案中，所述引导链长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸。所述引导链与靶基因具有互补性。引导链和靶基因之间的互补性可存在于所述引导链的任何部分中。本文所用的互补性可为完全互补性或不完全互补性，只要引导链与靶标的互补足以介导RNAi即可。在一些实施方案中，互补性是指引导链和靶标之间有少于25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的错配。完全互补性是指100％互补性。因此，本发明具有能容忍序列改变的优点，预计所述改变可由于基因突变、种系多态性或进化分支而产生。例如，也发现相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的siRNA序列在抑制中有效。此外，不是siRNA上的所有位置对靶标识别都具有等效的作用。siRNA中央的错配是最致命的并且基本消除了靶标RNA切割。中央部分上游和对应反义链切割位点上游的错配可被允许，但显著降低靶RNA切割。中央部分或对应反义链的切割位点下游的错配(优选地位于反义链的3’末端附近，例如距离反义链3’末端1、2、3、4、5或6个核苷酸)可被允许，并且只是轻微地降低靶RNA的切割。
不期望限制于任何特定理论，在一些实施方案中，所述引导链至少长16个核苷酸并且锚定于RISC中的Argonaute蛋白。在一些实施方案中，当引导链装载入RISC时，其具有确定的种子区(seed region)并且mRNA靶向切割发生在引导链10-11位。在一些实施方案中，引导链的5’末端被磷酸化或能被磷酸化。本文所述的核酸分子可称为最小触发RNA。
在一些实施方案中，所述负载链的长度范围为8-14个核苷酸。在一些实施方案中，所述负载链为8、9、10、11、12、13或14个核苷酸长。所述负载链与引导链互补。负载链和引导链之间的互补性可存在于所述负载链或引导链的任何部分中。在一些实施方案中，在分子的双链区中引导链和负载链之间具有100％的互补性。
本发明的一些方面涉及具有最小双链区的双链核酸分子。在一些实施方案中，所述分子的双链区的范围为8-14个核苷酸长。在一些实施方案中，所述分子的双链区为8、9、10、11、12、13或14个核苷酸长。在一些实施方案中所述双链区为13个核苷酸长。引导和负载链之间可有100％的互补性，或者引导链和负载链之间可有一个或更多个错配。在一些实施方案中，在双链分子的一个末端，所述分子为平末端或具有一个核苷酸的突出端。在一些实施方案中所述分子的单链区长4-12个核苷酸。例如所述单链区可为4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸长。然而，在一些实施方案中，单链区还可短于4个或长于12个核苷酸。在一些实施方案中，单链区长6个核苷酸。
本发明的RNAi构建体可具有小于-13kkal/mol的热力学稳定性(ΔG)。在一些实施方案中，所述热力学稳定性(ΔG)小于-20kkal/mol。在一些实施方案中，当(ΔG)小于-21kkal/mol时有效力丧失。在一些实施方案中，高于-13kkal/mol的(ΔG)值适用于本发明的一些方面。不希望限制于任何理论，在一些实施方案中，具有相对更高(ΔG)值的分子可在相对更高的浓度下变为有活性，而具有相对更低(ΔG)值的分子可在相对更低的浓度下变为有活性。在一些实施方案中，(ΔG)值可高于-9kkal/mol。包含最小双链区的本发明RNAi构建体所介导的基因沉默作用是意想不到的，这是由于已证明设计几乎相同但热力学稳定性更低的分子无活性(Rana等，2004)。
不希望限制于任何理论，本文所述的结果表明8-10bp的dsRNA或dsDNA区段将在结构上被RISC的蛋白组件或RISC的辅因子识别。此外，对于触发化合物有自由能需求，从而其可被蛋白质组分感应和/或足够稳定以与这些组分相互作用，从而使其可装载入Argonaute蛋白中。如果具有优化的热力学并且具有优选至少8个核苷酸的双链区，则双链体将被识别并装载入RNAi机器中。
在一些实施方案中，通过采用LNA碱基提高热力学稳定性。在一些实施方案中，引入另外的化学修饰。化学修饰的一些非限制性实例包括：5’磷酸酯、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟代、核糖胸苷、C-5丙炔基-dC(pdC)和C-5丙炔基-dU(pdU)；C-5丙炔基-C(pC)和C-5丙炔基-U(pU)、5-甲基C、-5-甲基U、5-甲基dC、5-甲基dU甲氧基、(2，6-二氨基嘌呤)、5′-二甲氧基三苯甲基-N4-乙基-2′-脱氧胞苷和MGB(minor groove binder，小沟结合剂)。应理解，可在同一分子中组合多于一种化学修饰。
优化本发明的分子以增强效力和/或降低毒性。例如，引导链和/或负载链的核苷酸长度、和/或引导链和/或负载链的硫代磷酸酯修饰数可在一些方面影响RNA分子的效力，而用2’-O-甲基(2’OMe)修饰替换2’-氟(2’F)修饰可在一些方面影响分子的毒性。特别地，预计减少分子的2’F含量将减轻分子的毒性。实施例部分展示了去除2’F修饰的分子，其与之前所述的RNAi化合物相比，由于预计毒性降低而具有优势。此外，RNA分子的硫代磷酸酯修饰数可影响分子的细胞摄取，例如分子被细胞被动摄取的效力。本文所述分子的优选实施方案不具有2’F修饰，而其特征为在细胞摄取和组织渗透中具有同样的效力。这些分子代表了相对于现有技术(如Accell和Wolfrum所述的分子，其通过大量使用2’F进行大规模修饰)的显著进步。
在一些实施方案中，引导链长度约18-19核苷酸并具有约2-14个磷酸酯修饰。例如，引导链可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或多于14个磷酸酯修饰的核苷酸。引导链可包含增加稳定性而不干扰RISC进入的一种或多种修饰。磷酸酯修饰的核苷酸(如硫代磷酸酯修饰的核苷酸)可在3’末端、5’末端或分散在整个引导链上。在一些实施方案中，所述引导链的3’末端10个核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个硫代磷酸酯修饰核苷酸。所述引导链还可包含2’F和/或2’OMe修饰，其可位于整个分子上。在一些实施方案中，引导链1位的核苷酸(引导链最5’末端位置的核苷酸)被2’OMe修饰和/或磷酸化。引导链中的C和U核苷酸可被2’F修饰。例如，19nt引导链中2-10位(或不同长度引导链的相应位置)的C和U核苷酸可被2’F修饰。引导链中的C和U核苷酸也可被2’OMe修饰。例如，19nt引导链11-18位(或不同长度引导链的对应位置)的C和U核苷酸可被2’OMe修饰。在一些实施方案中，引导链3’最末端的核苷酸未被修饰。在一些实施方案中，引导链中大部分C和U为2’F修饰并且引导链的5’末端被磷酸化。在另一些实施方案中，1位和11-18位的C或U被2’OMe修饰并且引导链的5’末端被磷酸化。在另一些实施方案中，1位和11-18位的C或U被2’OMe修饰，引导链5’末端被磷酸化，并且2-10位的C或U被2’F修饰。
在一些方面中，最佳的负载链长约11-14个核苷酸。负载链可包含增强稳定性的修饰。负载链的一个或更多个核苷酸可被2’OMe修饰。在一些实施方案中，负载链中一个或更多个C和/或U核苷酸被2’OMe修饰，或负载链中的所有C和U核苷酸被2’OMe修饰。在一些实施方案中，负载链的所有核苷酸被2’OMe修饰。负载链的一个或更多个核苷酸还可被磷酸酯修饰，如硫代磷酸酯修饰。负载链还可包含2’核糖、2’F和2’脱氧修饰或任何以上的组合。如在实施例中证明的，引导链和负载链两者上的化学修饰模式都被很好地容忍，并且本文表明化学修饰的组合产生增强的效力和RNA分子的自递送。
本发明的一些方面涉及RNAi构建体，其与之前用于RNAi的分子相比，具有相对于双链区延长的单链区。可修饰分子的单链区以促进细胞摄取或基因沉默。在一些实施方案中，单链区的硫代磷酸酯修饰影响细胞摄取和/或基因沉默。引导链中硫代磷酸酯修饰的区域可包括分子双链和单链区中的核苷酸。在一些实施方案中，单链区包含2-12个硫代磷酸酯修饰。例如，单链区可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个硫代磷酸酯修饰。在一些实施方案中，单链区包含6-8个硫代磷酸酯修饰。
还优化了本发明分子的细胞摄取。在本文所述的RNA分子中，引导和/或负载链可与辍合物结合。在一些实施方案中所述辍合物为疏水的。疏水辍合物可为分配系数高于10的小分子。辍合物可为固醇类分子，如胆固醇，或在C17上连接有长度提高的多碳链的分子，并且辍合物的存在可影响RNA分子在有或无脂质转染试剂的情况下被摄取入细胞的能力。辍合物可通过疏水接头与负载或引导链连接。在一些实施方案中，疏水接头的长度为5-12C，和/或基于羟基吡咯烷。在一些实施方案中，疏水辍合物连接到负载链，并且负载和/或引导链的CU残基被修饰。在一些实施方案中，负载链和/或引导链中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CU残基被修饰。在一些方面，本发明的分子是自递送(self-delivering，sd)的。本文所用的“自递送”是指分子无需另外的递送载体(如转染试剂)被递送入细胞的能力。
本发明的一些方面涉及选择用于RNAi的分子。根据本文所述的数据，具有8-14个核苷酸的双链区的分子可被选用于RNAi。在一些实施方案中，根据分子的热力学稳定性(ΔG)选择分子。在一些实施方案中，可选择(ΔG)小于-13kkal/mol的分子。例如，(ΔG)值可为-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-21、-22或小于-22kkal/mol。在另一些实施方案中，(ΔG)值可高于-13kkal/mol。例如，(ΔG)值可为-12、-11、-10、-9、-8、-7或大于-7kkal/mol。应理解，可采用本领域已知任何方法计算ΔG。在一些实施方案中，采用从Mfold网站(http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi)获得的Mfold计算ΔG。在一些参考文献中描述了计算ΔG的方法，并且将这些参考文献通过引用并入本文：Zuker，M.(2003)Nucleic Acids Res.，31(13)：3406-15；Mathews，D.H.，Sabina，J.，Zuker，M.and Turner，D.H.(1999)J.Mol.Biol.288：911-940；Mathews，D.H.，Disney，M.D.，Childs，J.L.，Schroeder，S.J.，Zuker，M.，and Turner，D.H.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101：7287-7292；Duan，S.，Mathews，D.H.，and Turner，D.H.(2006)Biochemistry 45：9819-9832；Wuchty，S.，Fontana，W.，Hofacker，I.L.，andSchuster，P.(1999)Biopolymers 49：145-165。
本发明的一些方面涉及将本文所述的核酸分子用于基因沉默，所述核酸分子具有最小双链区和/或(ΔG)小于-13kkal/mol。RNAi分子可在体内或体外施用，并且可在体内或体外实现基因沉默效果。
在一些实施方案中，多核苷酸包含5’和/或3’末端突出端。多核苷酸一个末端的突出端核苷酸的数量和/或序列可与多核苷酸另一末端的相同或不同。在一些实施方案中，一个或更多个突出端核苷酸可包含化学修饰，如硫代磷酸酯修饰或2’OMe修饰。
在一些实施方案中，多核苷酸未被修饰。在另一些实施方案，至少一个核苷酸被修饰。在另一些实施方案，所述修饰包括引导链5’末端第二个核苷酸的2’H或2’修饰核糖。所述“第二个核苷酸”被定义为多核苷酸5’末端的第二个核苷酸。
本文所用“2’修饰核糖”包括不具有2’OH基团的那些核糖。“2’修饰核糖”不包括2’脱氧核糖(可见于未修饰的常规DNA核苷酸中)。例如，2’修饰核糖可为2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代核苷酸、2’-脱氧核苷酸或其组合。
在一些实施方案中，2’修饰的核苷酸为嘧啶核苷酸(例如，C/U)。2’-O-烷基核苷酸的实例包括2’-O-甲基核苷酸或2’-O-烯丙基核苷酸。
在一些实施方案中，具有上述5’末端修饰的本发明miniRNA多核苷酸与无所述5’末端修饰的类似构建体相比，显示显著更少(例如，至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多)的“脱靶”基因沉默，因此极大地提高了RNAi试剂或疗法的整体特异性。
本文所用“脱靶”基因沉默是指非预期的基因沉默，例如由于反义(引导)序列与非预期靶mRNA序列之间的干扰性序列同源性。
根据本发明的该方面，一些引导链修饰进一步增强核酸酶稳定性和/或减少干扰素诱导，而不会显著降低RNAi活性(或者完全不降低RNAi活性)。
在一些实施方案中，5’茎序列可在多核苷酸的5’末端第二个核苷酸包含2’修饰核糖(如2’-O-甲基修饰核苷酸)，并且在一些实施方案中，无其它被修饰的核苷酸。具有这种修饰的发夹结构与所述位点无2’-O-甲基修饰的类似构建体相比，可具有增强的靶标特异性或减少的脱靶沉默。
特定5’茎序列和3’茎序列修饰的一些组合可导致其它未意想不到的益处，部分表现为抑制靶基因表达能力增强、增强的血清稳定性和/或增强的靶标特异性等。
在一些实施方案中，引导链在所述引导链5’末端的第二个核苷酸包含2’-O-甲基修饰的核苷酸，并且没有其它被修饰的核苷酸。
在另一些方面中，本发明的miniRNA结构通过小RNA(microRNA)机制介导序列依赖性基因沉默。本文所用术语“小RNA”(“miRNA”)在本领域中也称为“小瞬时RNA”(“small temporal，stRNA”)，是指基因编码(例如由病毒、哺乳动物或植物基因组编码)的并能指导或介导RNA沉默的小(10-50个核苷酸)RNA。“miRNA病症”是指特征为miRNA表达或活性异常的疾病或病症。
小RNA在小鼠、蠕虫和哺乳动物中参与关键途径(如发育和癌症)中靶基因的下调。小RNA机制的基因沉默通过miRNA与其靶信使RNA(mRNA)之间特异性但不完全匹配的碱基配对来实现。小RNA介导的靶mRNA表达下调中可利用多种机制。
miRNA为约22个核苷酸长的非编码RNA，其可在植物和动物发育过程中在转录后或翻译水平调节基因表达。miRNA一个普遍特征是它们均是从约70个核苷酸的前体RNA茎环(称为前miRNA)中切割所得(可能通过RNase III型酶Dicer或其同源物切割)。天然miRNA在体内由内源基因表达，并由Dicer或其它RNase从发夹或茎环前体(pre-miRNA或pri-miRNA)加工而得。miRNA可在体内以双链体形式瞬时存在，但只有一条链被RISC复合体利用以介导基因沉默。
在一些实施方案中描述了在细胞摄取和抑制miRNA活性方面有效的sd-rxRNA化合物形式。基本上所述化合物与进入RISC的形式相似，但是优化了长链化学修饰模式以阻止切割并作为RISC作用的有效抑制剂。例如，化合物可被完全或大部分被O甲基修饰并具有上述的PS含量。对于这种类型的化合物，5’磷酸化不是必要的。优选具有双链区，由于这促进细胞摄取和高效的RISC装载。
将小RNA用作序列特异调节剂的另一种途径为RNA干扰(RNAi)途径，其是对细胞中双链RNA(dsRNA)存在的进化保守性应答。dsRNA通过Dicer被切割成～20碱基(bp)的小干扰RNA(siRNA)。这些小RNA组装成称为RNA诱导沉默复合体(RISC)的多蛋白效应物。而后siRNA引导完全互补的靶mRNA的切割。
siRNA途径和miRNA途径的生物起源、蛋白质复合体和功能的一些方面相同。单链多核苷酸对象可在siRNA机制中模拟dsRNA，或在miRNA机制中模拟microRNA。
在一些实施方案中，修饰的RNAi构架体与具有相同序列的未修饰RNAi构建体相比，可在血清和/或脑脊液中具有改进的稳定性。
在一些实施方案中，RNAi构建体的结构不在原代细胞中诱导干扰素应答，所述原代细胞如哺乳动物原代细胞，包括人、小鼠和其它啮齿动物或其它非人哺乳动物的原代细胞。在一些实施方案中，也可用RNAi构建体在无脊椎生物中抑制靶基因的表达。
为了进一步增强本发明构建体在体内的稳定性，可用保护基团封闭发夹结构的3’末端。例如，可采用诸如反向核苷酸、反向无碱基结构或氨基末端修饰的核苷酸的保护基团。反向核苷酸可包括反向脱氧核苷酸。反向无碱基结构可包含反向脱氧无碱基结构，如3’，3’连接或5’，5’连接的脱氧无碱基结构。
本发明的RNAi构建体能抑制靶基因所编码的任何靶蛋白质的合成。本发明包括在体外或体内细胞中抑制靶基因表达的方法。因此，本发明的RNAi构建体可用于治疗患有特征为靶基因过表达的疾病的患者。
靶基因可为细胞内源或外源的(例如通过病毒或采用重组DNA技术引入细胞的)。这种方法可包括将RNA以足以抑制所述靶基因表达的量引入细胞。例如，这种RNA分子可具有与靶基因核苷酸序列互补的引导链，以使所述组合物抑制所述靶基因的表达。
本发明还涉及表达本发明核酸的载体，以及包含这种载体或核酸的细胞。所述细胞可为体内或培养物中的哺乳动物细胞，如人细胞。
本发明还涉及含有本发明RNAi构建体以及可药用载体或稀释剂的组合物。
本发明的另一方面提供了在哺乳动物细胞中抑制靶基因表达的方法，其包括使所述哺乳动物细胞与任何本发明RNAi构建体接触。
所述方法可在体外、离体或体内进行，如在培养的哺乳动物细胞中(如培养的人细胞)。
靶细胞(例如哺乳动物细胞)可在递送试剂(如脂质(例如阳离子脂质)或脂质体)的存在下进行接触。
本发明的另一方面提供了在哺乳动物细胞中抑制靶基因表达的方法，其包括使所述哺乳动物细胞与表达本发明RNAi构建体的载体接触。
在本发明的一个方面，提供了更长的双链体多核苷酸，其包括大小约16至约30个核苷酸的第一多核苷酸和大小约26至约46个核苷酸的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸(反义链)与所述第二多核苷酸(有义链)和靶基因两者都互补，并且其中两个多核苷酸形成双链体，并且其中所述第一多核苷酸包含长度长于6个碱基的单链区并且用备选化学修饰模式修饰，和/或包含便于细胞递送的辍合物结构。在本实施方案中，约40％至约90％的负载链核苷酸，约40％至约90％的引导链核苷酸和约40％至约90％的第一多核苷酸单链区的核苷酸是化学修饰核苷酸。
在一个实施方案中，双链体多核苷酸中的化学修饰核苷酸可为本领域已知的任何化学修饰核苷酸，如以上详细讨论的那些。在一个具体实施方案中，化学修饰核苷酸选自2’F修饰的核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸和2’脱氧核苷酸。在另一个具体实施方案中，化学修饰的核苷酸是由所述核苷酸碱基的“疏水修饰”所产生的。在另一个具体实施方案中，化学修饰的核苷酸为硫代磷酸酯。在另一具体实施方案中，化学修饰的核苷酸为硫代磷酸酯、2’-O-甲基、2’脱氧、疏水修饰和硫代磷酸酯的组合。由于这些修饰基团是指对核糖环、骨架和核苷酸的修饰，可行的是一些经修饰的核苷酸具有所有三种修饰的组合。
在另一个实施方案中，在双链体不同区域之间化学修饰不同。在一个具体实施方案中，第一多核苷酸(负载链)在多个位置具有大量不同的化学修饰。对于该多核苷酸而言，多达90％的核苷酸可被化学修饰和/或具有引入的错配。
在另一个实施方案中，第一或第二多核苷酸的化学修饰包括但不限于尿苷和胞苷的5’位修饰(4-吡啶基、2-吡啶基、吲哚基、苯基(C6H5OH)；色氨酰基(C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、异丁基、丁基、氨基苄基；苯基；萘基等)，其中化学修饰可能改变核苷酸的碱基配对能力。对于引导链，本发明该方面的一个重要特征是化学修饰相对于反义序列5’末端的位置。例如，引导链5’末端的化学磷酸化通常对效力有利。有义链种子区(对于5’末端的2-7位)的O-甲基修饰通常不易被容忍，而2’F和脱氧修饰被很好地容忍。在应用的化学修饰类型中，引导链的中间部分和引导链的3’末端更易容忍。引导链3’末端的脱氧修饰无法容忍。
本发明该方面的独特特点涉及在碱基上使用疏水修饰。在一个实施方案中，疏水修饰优选地位于引导链5’末端附近，在另一些实施方案中，它们位于引导链的中央，在另一些实施方案中，它们位于引导链的3’末端，在又一实施方案中，它们分布在多核苷酸的全长上。对于双链体中的负载链可应用相同类型的模式。
分子的其它部分为单链区。预计单链区为7至40个核苷酸。
在一些实施方案中，第一多核苷酸的单链区包含选自以下的修饰，40％至90％的疏水碱基修饰，40％至90％的硫代磷酸酯，40％-90％的核糖结构修饰，以及上述的任何组合。
引导链(第一多核苷酸)装载入RISC复合体的效力对于大量修饰的多核苷酸来说可能改变，因此在一个实施方案中，双链体多核苷酸在引导链(第一多核苷酸)9、11、12、13或14位核苷酸和有义链(第二多核苷酸)的相对核苷酸之间含有错配，以促进引导链的高效装载。
在以下部分描述本发明的更详细方面。
双链体特征
本发明的双链寡核苷酸可由两个独立的互补核酸链形成。双链体形成可在含有靶基因的细胞之内或之外发生。
本文所用术语“双链体”包括与互补序列氢键连接的双链核酸分子区。本发明的双链寡核苷酸可包含与靶基因同义的核苷酸序列和与靶基因反义的互补序列。例如对应于靶基因的有义和反义核苷酸序列与靶基因序列相同，或具有实现靶基因抑制作用的充分同一性(例如，约具有至少约98％的同一性、96％的同一性、94％、90％的同一性、85％的同一性或80％的同一性)。
在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在其全长上均为双链的，即在分子的两个末端无突出的单链序列，即为平末端。在另一些实施方案，个体核酸分子的长度可不同。也就是说，本发明的双链寡核苷酸并非在其全长上都是双链。例如，当采用两个独立的核酸分子时，一个分子(例如，包含反义序列的第一分子)可比与其杂交的第二分子更长(使得分子的一部分为单链)。同样，当使用单个核酸分子时，该分子任一末端的部分可保持单链。
在一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸包含错配和/或环或凸出部，但在所述寡核苷酸的至少约70％的长度上为双链。在另一实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在所述寡核苷酸至少约80％的长度上为双链的。在另一实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在所述寡核苷酸至少约90-95％的长度上为双链的。在另一实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在所述寡核苷酸至少约96-98％的长度上为双链的。在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸包含至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。
修饰
本发明的核苷酸可在多个位点被修饰，包括糖部分、磷酸二酯键和/或碱基。
糖部分包括天然、未修饰的糖(例如单糖(如戊糖，如核糖、脱氧核糖))、修饰的糖和糖类似物。一般地，对核酸单体尤其是糖部分的可能修饰包括，例如，用卤素、杂原子、脂肪族基团替换一个或更多个羟基，或将羟基功能化为醚、胺、硫醇等。
一组特别有用的修饰核酸单体为2’-O-甲基核苷酸。这种2’-O-甲基核苷酸可被称为“甲基化”，相应的核苷酸可从未甲基化的核苷酸进行烷基化而制得，或直接由甲基化的核苷酸试剂制得。修饰的核酸单体可与未修饰的核酸单体组合使用。例如，本发明的寡核苷酸可包含甲基化和未甲基化的核酸单体两者。
修饰的核酸单体的一些实例包括糖或骨架修饰的核糖核苷酸。修饰的核糖核苷酸可包含非天然的碱基(而不是天然碱基)，如5’位修饰的尿苷或胞苷(例如，5’-(2-氨基)丙基尿苷和5’-溴代尿苷)；8位修饰的腺苷和鸟苷(例如，8-溴代鸟苷)；脱氮核苷酸(如7-脱氮腺苷)和N-烷基化核苷酸(例如N6-甲基腺苷)。并且，糖修饰的核糖核苷酸可将2’-OH基团替换为H、烷氧基(或OR)、R或烷基、卤素、SH、SR、氨基(如NH2、NHR、NR2)、或CN基团，其中R为低级烷基、烯基或炔基。
修饰的核糖核苷酸还可将连接相邻核糖核苷酸的磷酸二酯基团替换为修饰基团，如硫代磷酸酯基团。更通常地，可组合多种核苷酸修饰。
尽管至少对于碱基配对特性而言，反义(引导)链可与靶基因(或多个靶基因)的至少一部分基本相同，但序列不必完全相同才能用于如抑制靶基因表型的表达。一般地，可用较高同源性来补偿更短反义基因的使用。在一些情况下，反义链通常与靶基因基本一致(尽管以反义方向)。
在需要使细胞胁迫应答尽可能小的情况下，2’-O-甲基修饰RNA的使用也可为有利的。具有2’-O-甲基核酸单体的RNA可能不会被认为识别未修饰RNA的细胞机制所识别。采用2’-O-甲基或部分2’-O-甲基RNA可避免对双链核酸的干扰素应答，同时保持对靶RNA的抑制。这可用于例如在诱导干扰素应答的短RNAi(例如，siRNA)序列以及诱导干扰素应答的更长RNAi序列的情况下避免干扰素或其它细胞胁迫应答。
总体上，修饰的糖可包括D-核糖、2′-O-烷基(包括2′-O-甲基和2′-O-乙基)，即2′-烷氧基、2′-氨基、2′-S-烷基、2′-卤代(包括2′-氟代)、2′-甲氧基乙氧基、2′-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2′-炔丙基、2′-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基和氰基等。在一个实施方案中，糖部分可为己糖并如所述地掺入寡核苷酸中(Augustyns，K.等，Nucl.Acids.Res.18：4711(1992))。如美国专利No.5,849,902中有示例性核酸单体，其通过引用并入本文。
术语“烷基”包括饱和脂肪族基团，其包括直链烷基基团(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、有支链的烷基基团(异丙基、叔丁基、异丁基等)、环烷基(脂环族)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在一些实施方案中，直链或有支链的烷基在其骨架中具有6或更少的碳原子(例如对于直链为C1-C6，对于支链为C3-C6)，并更优选地具有4个或更少。同样，优选的环烷基在其环结构中具有3-8个碳原子，并且更优选地在环结构中具有5或6个碳原子。术语C1-C6包括包含1-6个碳原子的烷基基团。
而且除非另外特别说明，术语烷基包括“未取代烷基”和“取代烷基”两者，后者是指其中烃骨架的一个或多个碳上的氢被独立选择的取代基替换的烷基结构。这种取代基可包括，例如，烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸、膦酸基、次膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷基硫代、芳基硫代、硫代羧化物、硫酸、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳烃或杂芳烃部分。环烷基可被进一步取代，例如，用上述取代基进一步取代。“烷基芳基”或“芳基烷基”结构是芳基取代的烷基(例如，苯甲基(苄基))。术语“烷基”还包括天然或非天然氨基酸的侧链。术语“正烷基”是指直链(即无支链)的未取代烷基基团。
术语“烯基”包括不饱和脂肪族基团，其在长度并可能在取代基上与上述烷基相似，但其包含至少一个双键。例如，术语“烯基”包括直链烯基基团(例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)、有支链的烯基基团、环烯基(脂环族)基团(环丙烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基)、烷基或烯基取代的环烯基基团，和环烷基或环烯基取代的烯基基团。在一些实施方案中，直链或有支链的烯基基团在其骨架中具有6或更少的碳原子(例如对于直链为C2-C6，对于支链为C3-C6)。同样，环烯基基团在其环结构中具有3-8个碳原子，并且更优选地在环结构中具有5或6个碳原子。术语C2-C6包括包含2-6个碳原子的烯基基团。
而且除非另外特别说明，术语烯基包括“未取代烯基”和“取代烯基”两者，后者是指其中烃骨架的一个或更多个碳上的氢被独立选择的取代基替换的烯基部分。这种取代基可包括，例如，烷基基团、炔基基团、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸、膦酸基、次膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷基硫代、芳基硫代、硫代羧酸、硫酸、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳烃或杂芳烃部分。
术语“炔基”包括不饱和脂肪族基团，其在长度并可能在取代基上与上述烷基相似，但包含至少一个三键。例如，术语“炔基”包括直链炔基基团(例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)、有支链的炔基基团以及环烷基或环烯基取代的炔基基团。在一些实施方案中，直链或有支链的炔基基团在其骨架中具有6或更少的碳原子(例如对于直链为C2-C6，对于支链为C3-C6)。术语C2-C6包括包含2-6个碳原子的炔基基团。
而且除非另外特别说明，术语炔基包括“未取代炔基”和“取代炔基”两者，后者是指其中烃骨架的一个或更多个碳上的氢被独立选择的取代基替换的炔基结构。这种取代基可包括，例如，烷基基团、炔基基团、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸、膦酸基、次膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷基硫代、芳基硫代、硫代羧酸、硫酸、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳烃或杂芳烃部分。
除非另外说明了碳的数目，否则本文所用的“低级烷基”是指在其骨架结构中具有1至5个碳原子的上述烷基基团。“低级烯基”和“低级炔基”具有的链长度为例如2-5个碳原子。
术语“烷氧基”包括与氧原子共价连接的取代和未取代的烷基、烯基和炔基基团。烷氧基基团的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基基团。取代烷氧基的实例包括卤代的烷氧基。烷氧基基团可被独立地选自下组的取代基取代，所述取代基如烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸、膦酸基、次膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷基硫代、芳基硫代、硫代羧酸、硫酸、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳烃或杂芳烃结构。卤素取代的烷氧基基团的实例包括但不限于氟代甲氧基、二氟代甲氧基、三氟代甲氧基、氯代甲氧基、二氯代甲氧基、三氯代甲氧基等。
术语“杂原子”包括除碳或氢外任何元素的原子。优选的杂原子为氮、氧、硫和磷。
术语“羟基”包括具有-OH或-O-(与适当的平衡离子一起)的基团。
术语“卤素”包括氟、溴、氯、碘等。术语“全卤素化”通常是指其中全部氢被卤原子替换的部分。
术语“取代”包括独立选择的取代基，其可被置于部分中并使分子执行其预想功能。取代基的实例包括烷基、烯基、炔基、芳基、(CR′R″)0-3NR′R″、(CR′R″)0-3CN、NO2、卤素、(CR′R″)0-3C(卤素)3、(CR′R″)0-3CH(卤素)2、(CR′R″)0-3CH2(卤素)、(CR′R″)0-3CONR′R″、(CR′R″)0-3S(O)1-2NR′R″、(CR′R″)0-3CHO、(CR′R″)0-3O(CR′R″)0-3H、(CR′R″)0-3S(O)0-2R′、(CR′R″)0-3O(CR′R″)0-3H、(CR′R″)0-3COR′、(CR′R″)0-3CO2R′或(CR′R″)0-3OR′基团；其中每个R’和R”各自独立地为氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基或芳基基团，或者R’和R”连在一起为亚苄基基团或-(CH2)2O(CH2)2-基团。
术语“胺”或“氨基”包括其中氮原子与至少一个碳或杂原子共价键合的化合物或部分。术语“烷基氨基”包括其中氮原子与至少一个另外的烷基基团键合的基团或化合物。术语“二烷基氨基”包括其中氮原子与至少2个另外的烷基基团键合的基团。
术语“醚”包括其中氧与两个不同的碳原子或杂原子键合的化合物或部分。例如，所述术语包括“烷氧基烷基”，其是指烷基、烯基或炔基与氧原子共价键合，其中所述氧原子与另一个烷基基团共价键合。
术语“碱基”包括已知的嘌呤和嘧啶杂环碱基、去氮嘌呤和其类似物(包括杂环取代类似物，如氨基乙氧基吩
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嗪)、衍生物(例如，1-烷基-、1-烯基-、杂芳基和1-炔基衍生物)和互变异构体。嘌呤的实例包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、二氨基嘌呤和黄嘌呤以及其类似物(例如，8-氧代-N6-甲基腺嘌呤或7-二氮黄嘌呤)和衍生物。嘧啶包括例如，胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶及其类似物(例如，5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(1-丙炔基)尿嘧啶、5-(1-丙炔基)胞嘧啶和4，4-桥亚乙基胞嘧啶)。其它适合的碱基的实例包括非嘌呤和非嘧啶的碱基，如2-氨基吡啶和三嗪。
在一个优选的实施方案中，本发明寡核苷酸的核酸单体为RNA核苷酸。在另一个优选的实施方案中，本发明寡核苷酸的核酸单体为修饰的RNA核苷酸。因此，所述寡核苷酸包含修饰的RNA核苷酸。
术语“核苷”包括与糖部分共价连接的碱基，所述糖部分优选为核糖和脱氧核糖。优选核苷的实例包括核糖核苷和脱氧核糖核苷。核苷还包括与氨基酸或氨基酸类似物连接的碱基，其可包含游离羧基、游离氨基或保护基。本领域已知适合的保护基(参见P.G.M.Wuts和T.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”，第二版，Wiley-Interscience，New York，1999)。
术语“核苷酸”包括进一步包含磷酸基团或磷酸类似物的核苷。
本文所用术语“连接”包括天然、未修饰的磷酸二酯部分(-O-(PO2-)-O-)，其共价偶联相邻的核酸单体。本文所用术语“取代的连接”包括共价偶联相邻核酸单体的任何天然磷酸二酯键的类似物或衍生物。取代的连接包括磷酸二酯类似物(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和P-乙氧基磷酸二酯、P-乙氧基磷酸二酯、P-烷氧基磷酸三酯、甲基磷酸酯)以及不含磷的连接，如乙缩醛或酰胺。本领域已知这种取代的连接(例如，Bjergarde等1991.Nucleic Acids Res.19：5843；Caruthers等1991.Nucleosides Nucleotides.10：47)。在一些实施方案中，优选不能水解的连接，如硫代磷酸酯连接。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含疏水修饰的核苷酸或“疏水修饰”。本文所用“疏水修饰”是指碱基被修饰以使(1)碱基的整体疏水性显著提高和/或(2)碱基仍能形成与正常Watson-Crick相互作用类似的相互作用。碱基修饰的几个非限制性实例包括尿苷和胞苷的5位修饰，如苯基、4-吡啶基、2-吡啶基、吲哚基和异丁基、苯基(C6H5OH)；色氨酰基((C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、异丁基、丁基、氨基苄基；苯基；和萘基。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含3’和5’末端(环状寡核苷酸除外)。在一个实施方案中，寡核苷酸的3’和5’末端可通过如修饰3’或5’键受到保护而基本不受核酸酶作用(例如，美国专利No.5,849,902和WO 98/13526)。例如，可通过加入“封闭基”使寡核苷酸具有抗性。本文所用术语“封闭基”是指可作为保护基或合成偶联基(例如，FITC、丙基(CH2-CH2-CH3)、二醇(-O-CH2-CH2-O-)磷酸(PO3 2-)、亚膦酸或亚磷酰胺)而连接到寡核苷酸或核酸单体上的取代基(例如，除了OH基团)。“封闭基”还包括保护寡核苷酸5’和3’末端的“末端封闭基”或“核酸外切酶封闭基”，其包括修饰的核苷酸和非核苷酸的核酸外切酶抗性结构。
末端封闭基团的实例包括帽结构(例如，7-甲基鸟苷帽)、反向核酸单体(例如具有3’-3’或5’-5’末端反转)(参见，例如，Ortiagao等，1992.Antisense Res.Dev.2：129)、甲基膦酸酯、亚磷酰胺、非核苷酸基团(如非核苷酸接头、氨基接头、辍合物)等。核酸单体的3’末端可包含修饰的糖部分。核酸单体的3’末端包含3’-O，其可任选地替换为封闭基，所述封闭基防止3’-核酸外切酶降解该寡核苷酸。例如，3’-羟基可通过3’→3’核苷酸间键酯化到核苷酸上。例如，烷氧基可为甲氧基、乙氧基或异丙氧基，并优选地为乙氧基。任选地，3’末端的3’→3’连接的核苷酸可通过取代的键连接。为了减少核酸酶降解，5’最末端的3’→5’键可为修饰的键，例如，硫代磷酸酯或P-烷氧基磷酸三酯键。优选地，5’最末端的两个3’→5’键为经修饰的键。任选地，5’末端的羟基基团可与含磷部分(例如，磷酸，硫代磷酸或P-乙氧基磷酸)发生酯化。
可连接到末端(3’或5’末端)、环区或miniRNA其它任何部分的另一辍合物类型可包括固醇、固醇类分子、肽、小分子、蛋白质等。在一些实施方案中，miniRNA可包含多于一个辍合物(其化学性质相同或不同)。在一些实施方案中，所述辍合物为胆固醇。
增加靶基因特异性或减少脱靶沉默作用的另一种方式是在对应于引导序列5’末端第二核苷酸的位置引入2’-修饰(如2’-O甲基修饰)。这允许将该2’修饰置于Dicer抗性发夹结构中，从而能设计沉默脱靶更少或没有的更佳RNAi构建体。
在一个实施方案中，本发明的发夹多核苷酸可包含为DNA的一个核酸部分以及为RNA的一个核酸部分。本发明的反义(引导)序列可为含有RNA样和DNA样区域的“嵌合寡核苷酸”。
术语“RNase H激活区”包括寡核苷酸(例如嵌合寡核苷酸)中能募集RNase H来切割与该寡核苷酸结合的靶RNA链的区域。通常地，RNase激活区包含DNA或DNA样核酸单体的最小核(至少约3-5，通常约3-12，更特别地，约5-12，更优选地约5-10个连续核酸单体)(参见，例如，美国专利5,849,902)。优选地，RNase H激活区包含约9个连续的含有脱氧核糖的核酸单体。
术语“非激活区”包括不募集或激活RNase H的反义序列区域(例如，嵌合寡核苷酸)。优选地，非激活区不包含硫代磷酸酯DNA。本发明的寡核苷酸包含至少一个非激活区。在一个实施方案中，可稳定非激活区以使其免受核酸酶作用，或非激活区可通过与靶标互补并与(待与该寡核苷酸结合的)靶标核酸分子形成氢键来提供对靶标的特异性。
在一个实施方案中，至少一部分连续的多核苷酸是通过取代键(例如硫代磷酸酯键)连接的。
在一些实施方案中，除引导序列外的大部分或全部核苷酸(2’修饰或不修饰)通过硫代磷酸酯键连接。由于其与血清蛋白质的更高亲和性，这种构建体通常具有改进的药代动力学。一旦引导链装载入RISC，多核苷酸非引导序列部分中的硫代磷酸酯键通常不干扰引导链的活性。
本发明的反义(引导)序列可包含“吗啉代寡核苷酸”。吗啉代寡核苷酸为非离子式的，并且通过RHase H非依赖性机制发挥功能。吗啉代寡核苷酸中4种遗传碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶)中的每一种均与6元的吗啉环连接。通过如非离子型二硫代磷酸酯亚基间连接将4种不同的亚基类型连接在一起，来产生吗啉代寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有很多优点，包括：对核酸酶的完全抗性(Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.1996.6：267)；靶向性可预计(Biochemica Biophysica Acta.1999.1489：141)；细胞中的可靠活性(Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.1997.7：63)；极佳的序列特异性(Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.1997.7：151)；最小非反义活性(Biochemica Biophysica Acta.1999.1489：141)；以及简单的渗透或刮擦(scrape)递送(Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.1997.7：291)。吗啉代寡核苷酸还由于其在高剂量时无毒性而被优选。Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.1997.7：187中有吗啉代寡核苷酸制备的讨论。
根据本文所述的数据，认为本文所述的化学修饰促进单链多核苷酸在RISC中的装载。已证明单链多核苷酸具有转载入RISC并诱导基因沉默的活性。然而，单链多核苷酸的活性水平与双链体多核苷酸相比似乎低2至4个数量级。
本发明提供了对化学修饰模式的描述，所述模式可(a)显著增加单链多核苷酸的稳定性(b)促进多核苷酸在RISC复合体中的有效装载，和(c)促进细胞对单链核苷酸的摄取。图5提供了可对实现细胞中单链多核苷酸效力有利的化学修饰模式的一些非限制性实例。化学修饰模式可包括核糖、骨架、疏水核苷和辍合物类型的修饰的组合。此外，在一些实施方案中，单个多核苷酸的5’末端可被化学磷酸化。
在又一个实施方案中，本发明提供了对化学修饰模式的描述，所述模式提高RISC抑制性多核苷酸的功能。已经证明单链多核苷酸通过底物竞争机制抑制预装载的RISC复合体的活性。对于这些类型的分子(通常称为antagomer)，所述活性的实现通常需要高浓度，并且体内递送不是非常有效。本发明提供了对化学修饰模式的描述，所述模式可(a)显著增加单链多核苷酸的稳定性(b)促进多核苷酸在RISC复合体中作为底物的有效识别，和/或(c)促进细胞对单链核苷酸的摄取。图6提供了可对实现细胞中单链多核苷酸效力有利的化学修饰模式的一些非限制性实例。化学修饰模式可包括核糖、骨架、疏水核苷修饰和辍合物类型的修饰的组合。
本发明提供的修饰可对所有多核苷酸应用。这包括进入RISC的单链多核苷酸、抑制RISC的单链多核苷酸、多种长度(15-40bp)的常规双链体多核苷酸、不对称双链体多核苷酸等。可用多种不同的化学修饰模式修饰多核苷酸，所述模式包括5’末端、核糖和疏水核苷修饰。
合成
本发明的寡核苷酸可通过本领域任何已知方法合成，所述方法如酶合成和/或化学合成。所述寡核苷酸可在体外(例如通过酶合成和化学合成)或在体内(采用本领域公知的重组DNA技术)合成。
在一个优选的实施方案中，采用对修饰的多核苷酸使用化学合成。线性寡核苷酸的化学修饰为本领域公知，并且可通过溶液或固相技术实现。优选地，合成是通过固相方法进行的。可通过几种不同的合成方法中的任一种产生寡核苷酸，所述方法包括亚磷酰胺、亚磷酸三酯、H-膦酸酯和磷酸三酯法，通常通过自动合成法。
本领域公知寡核苷酸合成方案，并且可在如下文献中找到：美国专利No.5,830,653；WO 98/13526；Stec等1984.J.Am.Chem.Soc.106：6077；Stec等1985.J.Org.Chem.50：3908；Stec等，J.Chromatog.1985.326：263；LaPlanche等，1986.Nucl.Acid.Res.1986.14：9081；Fasman G.D.，1989.Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology.1989.CRCPress，Boca Raton，Fla.；Lamone.1993.Biochem.Soc.Trans.21：1；美国专利No.5,013,830；美国专利No.5,214,135；美国专利No.5,525,719；Kawasaki等，1993.J.Med.Chem.36：831；WO 92/03568；美国专利No.5,276,019；和美国专利No.5,264,423。
可根据所需的寡核苷酸的长度选择合成方法，并且该选择在本领域普通技术人员知识范围内。例如，亚磷酰胺和亚磷酸三酯法可产生具有175或更多个核苷酸的寡核苷酸，而H-膦酸酯法对于小于100核苷酸的寡核苷酸效果良好。如果将修饰的碱基掺入寡核苷酸中，并且尤其是采用修饰的磷酸二酯键时，则根据已知方法按照需要改变合成方法。对此，Uhlmann等(1990，Chemical Reviews 90：543-584)提供了用修饰的碱基和修饰的磷酸二酯键产生寡核苷酸的参考和方法概述。其它用于产生寡核苷酸的示例性方法在Sonveaux.1994.“Protecting Groups in OligonucleotideSynthesis”；Agrawal.Methods in Molecular Biology 26：1中教导。还在“Oligonucleotide Synthesis-A Practical Approach”(Gait，M.J.IRL Pressat Oxford University Press.1984)中教导了示例性合成方法。此外，从几个供应商处可方便地获得序列确定(包括具有修饰核苷酸的一些序列)的线性寡核苷酸。
可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或多种色谱法的任一种(包括凝胶色谱和高效液相色谱)纯化寡核苷酸。为了证实核苷酸序列尤其是未修饰核苷酸序列，可将寡核苷酸通过任何已知方法进行DNA测序，所述方法包括Maxam和Gilbert测序、Sanger测序、毛细管电泳测序、漂移点测序(wandering spot sequencing)，或通过使用结合到Hybond纸的寡核苷酸选择性化学降解。还可通过激光解析质谱或快原子轰击来分析短寡核苷酸序列(McNeal等，1982，J.Am.Chem.Soc.104：976；Viari等，1987，Biomed.Environ.Mass Spectrom.14：83；Grotjahn等，1982，Nuc.Acid Res.10：4671)。对于RNA寡核苷酸也有测序方法。
可通过毛细管电泳和变性强阴离子HPLC(SAX-HPLC)，使用如Bergot和Egan.1992.J.Chrom.599：35的方法来检测寡核苷酸，以验证合成的寡核苷酸的质量。
本领域公知其它示例性的合成技术(参见如Sambrook等，MolecularCloning：a Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，I和II卷(DN Glover编1985)；Oligonucleotide Synthesis(M J Gait Ed，1984；Nucleic Acid Hybridisation(B D Hames和S J Higgins编1984)；APractical Guide to Molecular Cloning(1984)；或Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)丛书)。
在一些实施方案中，本发明的RNAi构建体或至少其一部分从编码本发明构建体的表达载体中转录。任何本领域已知载体均可用于此目的。可在进行所需的修饰前(如用修饰的有义链替换未修饰的有义链等)分离和纯化所转录的RNAi构建体。
递送/载体
细胞对寡核苷酸的摄取
将寡核苷酸和寡核苷酸组合物与一个或多个细胞或细胞裂解物接触(即，使其相接触，本文中也称为施用或递送到)并被其摄取。术语“细胞”包括原核和真核细胞，优选为脊椎动物细胞并且更优选地为哺乳动物细胞。在一个优选的实施方案中，使本发明的寡核苷酸组合物与人细胞接触。
本发明的寡核苷酸组合物可在体外(例如在试管或培养皿中(并可引入对象中或不引入对象中))或体内(在对象中如哺乳动物对象中)与细胞接触。寡核苷酸通过胞吞作用以低速率被细胞摄取，但是胞吞的寡核苷酸通常被隔离而不可用(例如用于与靶核酸分子杂交)。在一个实施方案中，可通过电穿孔或磷酸钙沉淀来促进细胞摄取。然而，这些方法仅用于体外或离体实施方案中，不方便并且在一些情况下与细胞毒性相关。
在另一个实施方案中，可通过本领域公知的适合方法增强寡核苷酸到细胞中的递送，所述方法包括磷酸钙、DMSO、甘油或葡聚糖、电穿孔或通过转染(例如采用本领域已知方法通过阳离子、阴离子或中性脂质组合物或脂质体)(参见如WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；美国专利No.4,897,355；Bergan等，1993.Nucleic Acids Research.21：3567)。增强的寡核苷酸递送还可用载体(参见例如Shi，Y.2003.Trends Genet 2003Jan.19：9；Reichhart J M et al.Genesis.2002.34(1-2)：1604，Yu等2002.Proc.Natl.Acad Sci.USA 99：6047；Sui等2002.Proc.Natl.Acad Sci.USA99：5515)病毒、聚胺或聚阳离子辍合物(采用如聚赖氨酸、精蛋白或Ni，N12-bis(乙基)精胺的化合物)来介导(参见例如Bartzatt，R等，1989.Biotechnol.Appl.Biochem.11：133；Wagner E等1992.Proc.Natl.Acad.Sci.88：4255)。
在一些实施方案中，本发明的miniRNA可通过采用多种含β-葡聚糖的颗粒进行递送，如在US 2005/0281781 A1，WO 2006/007372和WO2007/050643(所有均通过引用并入本文)中所述的那些。在一些实施方案中，所述β-葡聚糖颗粒源自酵母。在一些实施方案中，有效负载的捕获分子为聚合物，如分子量至少为约1000Da、10,000Da、50,000Da、100kDa、500kDa等的那些。优选的聚合物包括(但不限于)阳离子聚合物、壳聚糖或PEI(聚乙烯亚胺)等。
这种基于β-葡聚糖的递送系统可制备为经口递送，其中经口递送的β-葡聚糖/miniRNA构建体可被巨噬细胞或其它相关吞噬细胞吞噬，所述细胞继而在所选的体内位点释放miniRNA构建体。作为替代方案或另外地，miniRNA可改变一些巨噬细胞靶向基因的表达。
寡核苷酸摄取的最佳方案将取决于多种因素，最关键的是采用的细胞类型。在摄取中重要的其它因素包括但不限于寡核苷酸的性质和浓度、细胞的汇合度、细胞所在的培养物类型(例如悬浮培养物或铺板的)以及细胞生长所用的培养基类型。
包封剂
包封剂将寡核苷酸捕获在载体中。在本发明的另一个实施方案中，寡核苷酸可与运载体或载体(例如，脂质体或胶束)相连，但本领域技术人员理解，也可使用其它的载体。脂质体为脂双层制成的载体，具有与生物膜类似的结构。这种载体用于促进细胞摄取或寡核苷酸的靶向，或改善寡核苷酸的药代动力学或毒理特性。
例如，本发明的寡核苷酸还可在包封在脂质体、药物组合物中施用，其中所包含的活性成分分散或多样地存在于微粒中，所述微粒由贴附在脂质层的同心水层组成。所述寡核苷酸根据其溶解性可存在于水层和脂质层两者中，或存在于通常所谓的脂质体悬液中。疏水层通常(但不必然)包含磷脂(如卵磷脂或鞘磷脂)、类固醇(如胆固醇)、或多或少的离子型表面活性剂(如二乙酰磷酸、硬脂酰胺或磷脂酸)或其它疏水性质的材料。脂质体的直径通常为约15nm至约5微米。
采用脂质体作为药物递送载体有几个优点。脂质体提高了细胞内稳定性，提高摄取效率并提高生物活性。脂质体为中空的球状载体，其中的脂质以与构成细胞膜的那些脂质相类似的方式排布。它们具有捕获水溶性化合物的内部水性空间，大小为直径0.05至几微米。若干研究表明，脂质体可将核酸递送至细胞并且核酸保有生物活性。例如，起初设计为研究工具的脂质递送载体(如Lipofectin或LIPOFECTAMINETM 2000)可将完整的核酸分子递送至细胞。
采用脂质体的特有优点包括以下几点：在组合物中它们无毒并且可生物降解；它们显示出长的循环半衰期；以及对于组织靶向而言，识别分子可容易地贴附在它们表面。最后，基于脂质体的药物(在液体悬液中或为冻干产品)的高生产性价比证明该技术作为可应用的药物递送系统的可行性。
在一些方面中，本发明的制剂可选自天然或化学合成的或者修饰的饱和及不饱和脂肪酸残基的种类。脂肪酸可以甘油三酯、甘油二酯或单独脂肪酸的形式存在。在另一个实施方案中，可采用目前在药学中用于肠胃外给养的已验证良好的脂肪酸和/或脂肪乳剂混合物。
基于脂质体的制剂广泛地用于寡核苷酸递送中。然而，大部分市售脂质或脂质体制剂包含至少一种正电荷脂质(阳离子脂质)。认为该正电荷脂质的存在对寡核苷酸的高程度装载和增强脂质体的融合特性很重要。已经实施并发表了鉴定最佳正电荷脂质化学结构的几种方法。然而，包含阳离子脂质的市售脂质体制剂的特征是高水平毒性。受限制的体内治疗指标显示，在仅稍微高于实现RNA沉默所需浓度的浓度下，含有正电荷脂质的脂质体制剂与毒性相关(即肝酶升高)。
本发明开发了无现有技术中脂质体毒性的新脂质体制剂。这些新脂质体制剂为基于中性脂肪的制剂，其用于有效递送寡核苷酸，尤其用于递送本发明的RNA分子。将所述组合物称为中性纳米转运体，因为它们能定量地将寡核苷酸掺入不带电的脂质混合物中。本发明中性纳米转运体组合物中没有阳离子脂质毒性水平，这是一个重要的特征。
所述中性纳米转运体组合物能将寡核苷酸有效装载入中性脂肪制剂中。所述组合物包含寡核苷酸，该寡核苷酸被修饰以提高所述分子的疏水性(例如将疏水分子(共价或非共价)连接到寡核苷酸末端或非末端核苷酸、碱基、糖或骨架上的疏水分子上)，所述修饰的与中性脂肪制剂(例如含有至少25％的胆固醇和25％的DOPC或其类似物)混合。还可将货物分子(如另一种脂质)包含在所述组合物中。该组合物(其中部分制剂构建在寡核苷酸本身中)能将寡核苷酸有效包封在中性脂质颗粒中。
与本发明相关的几个意想不到的发现之一是本发明的寡核苷酸能被有效地掺入无阳离子脂质的脂质混合物中，并且该组合物能将治疗性寡核苷酸以发挥其功能的方式有效地递送至细胞。另一个意想不到的发现是当脂肪混合物由基于磷脂酰胆碱的脂肪酸和固醇(如胆固醇)构成时观察到高水平的活性。例如，中性脂肪混合物的一个优选制剂由至少20％的DOPC或DSPC和至少20％的固醇(如胆固醇)构成。甚至脂质与寡核苷酸的比值在低至1∶5时也足以在无电荷制剂中获得寡核苷酸的完全包封。现有技术显示，只有1-5％的寡核苷酸被包封在无电荷制剂中，这不足以达到体内效力的所需量。与使用中性脂质的现有技术相比，对细胞进行寡核苷酸递送的水平是非常意想不到的。
将疏水寡核苷酸与优选的制剂复合形成大小为50至140nm的稳定颗粒。有意思的是，制剂本身通常不形成小颗粒而是形成凝集块，其在加入疏水修饰的寡核苷酸后转化成稳定的50-120nm颗粒。
本发明的中性纳米转运体组合物包含疏水修饰的多核苷酸、中性脂肪混合物以及任选地包含货物分子。本文所用“疏水修饰多核苷酸”为本发明的多核苷酸(即，sd-rxRNA)，其具有使多核苷酸比修饰前的多核苷酸更疏水的至少一种修饰。所述修饰可通过将疏水分子(共价或非共价)连接到多核苷酸上来实现。在一些情况下，疏水分子为亲脂基团或包含亲脂基团。
术语“亲脂基团”是指对脂的亲和性比对水的亲和性更高的基团。亲脂基团的实例包括但不限于胆固醇、胆固醇基或修饰的胆固醇基残基、金刚化合物(adamantine)、二氢睾酮、长链烷基、长链烯基、长链炔基、十八烯基石胆酸、胆酸、十八烯基胆酸、十六烷基、十七烷基、肉豆蔻酰基、胆汁酸、胆酸或牛磺胆酸、脱氧胆酸、十八烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯如类固醇、维生素如维生素E、饱和或不饱和的脂肪酸、脂肪酸酯如甘油三酯、芘、紫菜碱、Texaphyrine、金刚烷、吖啶类、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、得克萨斯红、洋地黄皂苷配基、二甲氧三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如Cy3或Cy5)、Hoechst 33258染料、补骨脂素或布洛芬。胆固醇部分可被还原(例如，在胆甾烷中)或被取代(例如被卤素)。还可在一个分子中组合不同的亲脂基团。
可将疏水分子连接到多核苷酸的多个位置。如以上所述，疏水分子可连接到多核苷酸的末端残基，如多核苷酸的3’或5’末端。或者，其可连接到内部核苷酸或多核苷酸支链的核苷酸上。例如，还可将疏水分子连接到核苷酸的2’位置。疏水分子还可连接到多核苷酸中核苷酸的杂环碱基、糖或骨架上。
疏水分子可通过接头部分与多核苷酸相连。任选地，所述接头部分为非核苷酸接头部分。非核苷酸接头为，例如无碱基残基(dSpacer)、寡聚乙二醇如三甘醇(间隔物9)或六聚乙二醇(间隔物18)或烷二醇如丁二醇。间隔物单元优选地通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键连接。接头单元可在分子中只出现一次或者掺入几次，例如通过磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯或酰胺键。
典型的辍合方案涉及合成在序列一个或更多个位置具有氨基接头的多核苷酸，然而，接头不是必需的。而后采用适合的偶联或激活剂将氨基基团与辍合分子反应。辍合反应可在多核苷酸仍结合在固相支持物时进行，或在将其切割后的溶液相中进行。通过HPLC纯化修饰的多核苷酸通常得到纯物质。
在一些实施方案中，疏水分子为固醇类辍合物、植物甾醇辍合物、胆固醇辍合物、侧链长度改变的固醇类辍合物、脂肪酸辍合物、任何其它疏水基团辍合物和/或内部核苷的疏水修饰，其提供足以掺入胶束的充分疏水性。
为本发明目的，术语“固醇”是指甾类醇，其为A环的3位具有羟基的甾类化合物亚类。它们是通过HMG-CoA还原酶途径从乙酰辅酶A合成的两亲脂质。分子整体相当扁平。A环上的羟基是极性的。脂肪链上的其它部分是非极性的。通常认为固醇在17位具有8碳链。
为本发明目的，术语“固醇类分子”是指甾类醇，其与固醇的结构相似。主要区别是环结构和21位连接侧链的碳原子数。
为本发明目的，术语“植物甾醇”(也称为植物固醇)为甾类醇的亚类，为植物中的天然植物化学物。有多于200种不同的已知植物甾醇。
为本发明目的，术语“固醇侧链”是指侧链连接到固醇类分子17位的化学组成。在标准定义中，固醇被限制为在17位具有8个碳原子链的4环结构。在本发明中，固醇类分子所具有的侧链比通常所述的更长或更短。侧链可为分支的或含有两个骨架。
因此，本发明所用的固醇包括，例如胆固醇以及在17位连接有2-7或长于9个碳原子的侧链的独特固醇。在一个具体实施方案中，多碳尾的长度为5-9个碳原子不等。图9证实血浆清除度、肝摄取与多碳链长度之间有相关性。这种辍合物可具有显著更好的体内效力，尤其是肝递送。预计这种类型的分子可在比常规胆固醇辍合的寡核苷酸低5至9倍的浓度下工作。
或者，多核苷酸可与发挥疏水分子功能的蛋白质、肽或正电化合物连接。所述蛋白质可选自精蛋白、dsRNA结合结构域和精氨酸富含肽。示例性的正电化合物包括精胺、亚精胺、尸胺和腐胺。
在另一个实施方案中，当与多核苷酸的最佳化学修饰模式(如本文详细描述的)(包含但不限于疏水修饰、硫代磷酸酯修饰和2’核糖修饰)相组合时，疏水分子辍合物可具有甚至更高的效率。
在另一个实施方案中，固醇类分子可为天然的植物甾醇，如在图8中显示的那些。多碳链可长于9并可为线性、支链和/或含有双键。一些含有植物甾醇的多核苷酸辍合物可在多核苷酸到多个组织的递送中显著更强并更有活性。一些植物甾醇可显示出组织偏好性，并因此用作将RNAi特异性递送到特定组织的方法。
将疏水修饰的多核苷酸与中性脂肪混合物混合以形成胶束。中性脂肪酸混合物为脂肪的混合物，其净电荷在生理pH或其附近为中性或稍带负电，并可与疏水修饰的多核苷酸形成胶束。为本发明目的，术语“胶束”是指由无电荷脂肪酸和磷脂混合物形成的小纳米颗粒。中性脂肪混合物可包含阳离子脂质，只要其存在的量不会导致毒性即可。在一些优选的实施方案中，中性脂肪混合物中没有阳离子脂质。无阳离子脂质的混合物是总脂质的少于1％(优选地0％)是阳离子脂质的那些。术语“阳离子脂质”包括在生理pH或其附近静电荷为正电的脂质和合成脂质。术语“阴离子脂质”包括在生理pH或其附近静电荷为负电的脂质和合成脂质。
中性脂肪通过强但非共价吸引(例如，静电、范德华力、π堆积等相互作用)与本发明寡核苷酸结合。
中性脂肪混合物可包括选自天然或化学合成的或者修饰的饱和及不饱和脂肪酸残基类型的制剂。脂肪酸可以甘油三酯、甘油二酯或单独脂肪酸的形式存在。在另一个实施方案中，可使用目前在药学中用于肠胃外给养的已验证良好的脂肪酸和/或脂肪乳剂。
中性脂肪混合物优选为基于胆碱的脂肪酸和固醇的混合物。基于胆碱的脂肪酸包括，例如，合成的磷酸胆碱衍生物，如DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC和DEPC。DOPC(化学登记号4235-95-4)为二油酰磷脂酰胆碱(也称为dielaidoylphosphatidylcholine、二油酰-PC、二油酰磷酸胆碱、二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、二-十八烯基磷脂酰胆碱)。DSPC(化学登记号816-94-4)为二硬脂酰磷脂酰胆碱(也称为1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)。
中性脂肪混合物中的固醇可为例如胆固醇。中性脂肪混合物可完全由基于胆固醇的脂肪酸和固醇构成，或其可任选地包含货物分子。例如，中性脂肪混合物可具有至少20％或25％的脂肪酸和20％或25％的固醇。
为本发明目的，术语“脂肪酸”涉及脂肪酸的常规描述。其可以单个实体存在或以甘油二酯或甘油三酯的形式存在。为本发明目的，术语“脂肪乳剂”指经静脉内给予不能从其饮食中获得足够脂肪的对象的安全脂肪制剂。其是大豆油(或其它天然油)和卵磷脂的乳剂。脂肪乳剂被用于制备一些不可溶麻醉剂。在本公开内容中，脂肪乳剂可以是市售制剂(如Intralipid、Liposyn、Nutrilipid)的一部分、富含特定脂肪酸的修饰的市售制剂或全部重新制备的脂肪酸和磷脂的组合。
在一个实施方案中，待与本发明寡核苷酸组合物相接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质的混合物(例如上述的一种脂质或脂质组合物)接触约12至约24小时。在另一个实施方案中，待与寡核苷酸组合物相接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质的混合物(例如上述的一种脂质或脂质组合物)接触约1至约5天。在一个实施方案中，将细胞与包含脂质和寡核苷酸的混合物接触约3天至多达约30天。在另一个实施方案中，将含有脂质的混合物与细胞接触至少约5至约20天。在另一个实施方案中，将含有脂质的混合物与细胞接触至少约7至约15天。
制剂的50-60％可任选地为任何其它脂质或分子。本文中将这种脂质或分子称为货物脂质或货物分子。货物分子包括但不限于英脱利匹特、小分子、融合肽(fusogenic peptide)或脂质或其它可被加入以改变细胞摄取、内体释放或组织分布特性的小分子。耐受货物分子的能力对这些颗粒特性的调节很重要(如果需要这些特性)。例如，一些组织特异代谢物的存在可显著地改变组织分布谱。例如采用具有富含多种饱和程度的更短或更长脂肪链的英脱利匹特型制剂影响了这些制剂类型的组织分布谱(和它们的装载)。
用于本发明的货物脂质的实例为融合脂质。例如两性脂质DOPE(化学登记号4004-5-1，1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)为优选的货物脂质。
英脱利匹特可包含以下组成：1000mL中包含：纯化的大豆油90g，纯化的卵磷脂12g，无水甘油22g，注射用水适量添加至1000mL。pH用氢氧化钠调节至约pH 8。能量含量/L：4.6MJ(190kcal)。摩尔渗透压浓度(约)：300mOsm/kg水。在另一个实施方案中，脂肪乳剂是liposyn，其含有注射用水中的5％红花油、5％大豆油、作为乳化剂加入的多至1.2％的卵磷脂以及2.5％甘油。其还可包含用于调整pH的氢氧化钠。pH 8.0(6.0-9.0)。Liposyn的摩尔渗透压浓度为276m Osmol/升(实际)。
货物脂质的密度、量和比例的变化影响这些化合物的细胞摄取和组织分布特性。例如，脂质尾的长度和饱和水平影响肝、肺、脂肪和心肌的差异性摄取。特定疏水分子(如维生素或不同类型的固醇)的添加可利于分布到参与特定化合物代谢的特定组织中。以不同寡核苷酸浓度形成复合物，更高的浓度有利于更有效的复合物形成(图21-22)。
在另一个实施方案中，脂肪乳剂基于脂质的混合物。这种脂质可包括天然化合物、化学合成化合物、纯化的脂肪酸或任何其它脂质。在又一个实施方案中，脂肪乳剂是完全人工的。在又一个实施方案中，脂肪乳剂是多于70％的亚油酸。在又一个特定实施方案中，脂肪乳剂是至少1％的心磷脂。亚油酸(LA)是不饱和的omega-6脂肪酸。其是由具有18碳链和两个顺式双键的羧酸构成的无色液体。
在本发明的又一个实施方案中，改变脂肪乳剂的组成用于改变疏水修饰多核苷酸的组织分布的方法。提供该方法用于多核苷酸到特定组织的特异性递送(图12)。
在另一个实施方案中，所述货物分子的脂肪乳剂包含多于70％的亚油酸(C18H32O2)和/或用于将RNAi特异递送到心肌的心磷脂。
之前已经使用脂肪乳剂(如英脱利匹特)作为一些非水溶药物的递送制剂(如Propofol，重新制备为Diprivan)。本发明的独特特征包括(a)将修饰多核苷酸与疏水化合物组合以使其能掺入脂肪胶束中的构思和(b)将其与脂肪乳剂混合以提供可逆载体。在注射入血流后，胶束通常与血清蛋白质(包括白蛋白、HDL、LDL和其它)结合。该结合是可逆的并且最终脂肪被细胞吸收。而后作为胶束一部分掺入的多核苷酸被递送到细胞表面附近。其后可通过多种机制(包括但不限于固醇类递送)进行细胞摄取。
复合剂
复合剂通过强但非共价的吸引(例如，静电、范德华、π堆积等相互作用)与本发明的寡核苷酸结合。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可与复合剂复合以提高寡核苷酸的细胞摄取。复合剂的实例包括阳离子脂质。可采用阳离子脂质将寡核苷酸递送到细胞。然而，如上所述，在一些实施方案中优选无阳离子脂质的制剂。
术语“阳离子脂质”包括脂质和合成脂质，其具有极性和非极性结构域，并可在生理pH或生理pH附近带正电荷，并且其能结合聚阴离子(如核酸)并利于核酸到细胞的递送。一般地，阳离子脂质包括饱和及不饱和的烷基和脂环醚以及胺的酯、酰胺或其衍生物。阳离子脂质的直链和支链烷基和烯基基团可包含，如1至约25个碳原子。优选的直链或支链烷基或烯烃基团具有6或更多个碳原子。脂环基团包括胆固醇和其它类固醇基团。阳离子脂质可用多种平衡离子(阴离子)制备，包括如，Cl-、Br-、I-、F-、乙酸根、三氟乙酸根、硫酸根、亚硝酸根和硝酸根。
阳离子脂质的实例包括聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺(PAMAM)超分支树状分子、Lipofectin(DOTMA和DOPE的组合)、Lipofectase、LIPOFECTAMINETM(如LIPOFECTAMINETM 2000)、DOPE、Cytofectin(Gilead Sciences，Foster City，Calif.)和Eufectins(JBL，San Luis Obispo，Calif.)。示例性阳离子脂质体可从N-[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N-[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸酯(DOTAP)、3β-[N-(N′，N′-二甲基氨乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、2，3，-二油烯基氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)、1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基铵溴；和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)制成。发现阳离子脂质(如，N-(1-(2，3-二油烯基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA))将硫代磷酸酯寡核苷酸的反义作用增强1000倍(Vlassov等，1994，Biochimica etBiophysica Acta 1197：95-108)。寡核苷酸还可与如多聚(L-赖氨酸)或抗生物素蛋白复合并且该混合物中可包含或不包含脂质，例如固醇基-多聚(L-赖氨酸)。
在本领域已经使用阳离子脂质将寡核苷酸递送到细胞(参见，例如，美国专利No.5,855,910；5,851,548；5,830,430；5,780,053；5,767,099；Lewis等，1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：3176；Hope等1998.MolecularMembrane Biology 15：1)。用于促进摄取本发明寡核苷酸的其它脂质组合物可与要求保护的方法联合使用。除以上列出的外，本领域已知其它脂质组合物，例如在美国专利No.4,235,871；美国专利No.4,501,728；4,837,028；4,737,323中教导的那些。
在一个实施方案中，脂质组合物还可包含试剂(如病毒蛋白质以增强寡核苷酸的脂质介导转染(Kamata等，1994.Nucl.Acids.Res.22：536))。在另一个实施方案中，如在美国专利5,736,392中教导的，寡核苷酸可作为包含寡核苷酸、肽和脂质的组合物的一部分与细胞接触。已经描述了具有血清抗性的改进的脂质(Lewis等，1996.Proc.Natl.Acad.Sci.93：3176)。阳离子脂质和其它复合剂的作用是增加通过胞吞作用进入细胞的寡核苷酸的数目。
在另一个实施方案中，可采用N-取代的甘氨酸寡核苷酸(拟肽(peptoid))优化寡核苷酸的摄取。已经采用拟肽生成用于转染的阳离子脂质样化合物(Murphy等，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.95：1517)。拟肽可采用标准方法合成(例如，Zuckermann，R.N.等，1992.J.Am.Chem.Soc.114：10646；Zuckermann，R.N.等1992.Int.J.Peptide Protein Res.40：497)。还可采用阳离子脂质和拟肽、liptoid的组合来优化本发明寡核苷酸的摄取(Hunag等，1998.Chemistry and Biology.5：345)。Liptoid可通过产生拟肽寡核苷酸并将氨基末端亚单体(submonomer)通过其氨基与脂质相偶联来合成(Hunag等，1998.Chemistry and Biology.5：345)。
本领域已知带正电的核酸可用于生成高活性的阳离子脂质(Lewis等，1996.Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.93：3176)。在一个实施方案中，用于递送本发明寡核苷酸的组合物包含与亲脂部分相连的一定数量的精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸残基(参见例如美国专利No.5,777,153)。
在另一个实施方案中，用于递送本发明寡核苷酸的组合物包含具有约1至约4个碱性残基的肽。这些残基可位于如，氨基末端、C末端或所述肽的内部区域。本领域中已经定义了有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如，甘氨酸(也可认为是非极性的)、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。除了碱性氨基酸以外，所述肽的大部分或全部其它残基可选自非碱性氨基酸，例如除赖氨酸、精氨酸或组氨酸外的氨基酸。优选地主要采用具有长中性侧链的中性氨基酸。
在一个实施方案中，用于递送本发明寡核苷酸的组合物包含具有一个或更多个γ-羧谷氨酸残基或γ-Gla残基的天然或合成多肽。这些γ-羧谷氨酸残基能使所述多肽彼此之间结合并与膜表面结合。也就是说，具有一系列γ-Gla的多肽可用作通用递送模式，其帮助RNAi构建体粘附到与其接触的任何膜。这至少可减缓RNAi构建体的血流清除并增强它们结合到靶标的机会。
所述γ-羧谷氨酸残基可存在于天然蛋白质中(例如，凝血酶原具有10个γ-Gla残基)。或者，它们可通过羧化(例如采用维生素K依赖性羧化酶)被引入到纯化的、重组产生的或化学合成的多肽中。所述γ-羧谷氨酸残基可为连续的或非连续的，并且可调节/微调所述γ-羧谷氨酸残基在多肽中的总数和位置，以达到所述多肽不同水平的“粘性”。
在一个实施方案中，待与本发明寡核苷酸组合物接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质的混合物(例如上述的一种脂质或脂质组合物)接触约12小时至约24小时。在另一个实施方案中，待与本发明寡核苷酸组合物接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质的混合物(例如上述的一种脂质或脂质组合物)接触约1至约5天。在一个实施方案中，细胞与含有脂质和寡核苷酸的混合物接触约3天至长达约30天。在另一个实施方案中，含有脂质的混合物与细胞接触至少约5至约20天。在另一个实施方案中，含有脂质的混合物与细胞接触至少约7至约15天。
例如，在一个实施方案中，可在脂质(如cytofectin CS或GSV(购自Glen Research；Sterling，Va.)、GS3815、GS2888)的存在下将寡核苷酸组合物与细胞接触本文所述的延长的孵育时间。
在一个实施方案中，将细胞与包含脂质和寡核苷酸组合物的混合物一起孵育不降低细胞的活性。优选地，在转染阶段后细胞仍基本是存活的。在一个实施方案中，在转染后，细胞存活至少约70％至至少约100％之间。在另一个实施方案中，细胞存活至少约80％至至少约95％之间。在又一个实施方案中，细胞存活至少约85％至至少约90％之间。
在一个实施方案中，通过连接将寡核苷酸转运入细胞的肽序列而对寡核苷酸进行修饰，所述肽在本文中称为“转运肽”。在一个实施方案中，组合物包含寡核苷酸和共价连接的转运肽，所述寡核苷酸与编码蛋白质的靶标核酸分子互补。
术语“转运肽”包括促进将寡核苷酸转运入细胞的氨基酸序列。本领域已知促进将其连接的部分转运入细胞的示例性肽，其包括如HIV TAT转录因子、乳铁蛋白、疱疹VP22蛋白和成纤维细胞生长因子2(Pooga等，1998.Nature Biotechnology.16：857；和Derossi等，1998.Trends in CellBiology.8：84；Elliott and O′Hare.1997.Cell 88：223)。
可采用已知技术将寡核苷酸连接到转运肽，如(Prochiantz，A.1996.Curr.Opin.Neurobiol.6：629；Derossi等，1998.Trends Cell Biol.8：84；Troy等，1996.J.Neurosci.16：253)，Vives等1997.J.Biol.Chem.272：16010)。例如，在一个实施方案中，带有活化的硫醇基团的寡核苷酸通过所述硫醇基团与转运肽中存在的半胱氨酸连接(例如，如在Derossi等1998.Trends Cell Biol.8：84；Prochiantz.1996.Current Opinion inNeurobiol.6：629；Allinquant等1995.J Cell Biol.128：919中教导的，与存在于触角足同源异型域的第二和第三螺旋之间的β转角中的半胱氨酸连接)。在另一个实施方案中，Boc-Cys-(Npys)OH基团可作为最末端(N末端)氨基酸与转运肽偶联，并且具有SH基团的寡核苷酸可与所述肽偶联(Troy等，1996.J.Neurosci.16：253)。
在一个实施方案中，连接基团可连接到核酸单体并且转运肽可与所述接头共价连接。在一个实施方案中，接头的功能可以是作为转运肽的粘附位点并提供针对核酸酶的稳定性。适合的接头的实例包括取代或未取代的C1-C20烷基链、C2-C20烯基链、C2-C20炔基链、肽和杂原子(例如，S、O、NH等)。其它示例性接头包括双功能性交联剂，如磺基琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚苯胺基)-丁酸酯(SMPB)(参见例如Smith等，Biochem J 1991.276：417-2)。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可作为分子辍合物被合成，其利用受体介导的胞吞机制将基因递送入细胞(参见例如Bunnell等，1992.Somatic Cell and Molecular Genetics.18：559以及其中引用的参考文献)。
靶向剂
可通过使寡核苷酸靶向细胞受体来增强寡核苷酸的递送。靶向结构可缀合到寡核苷酸上，或可连接到与寡核苷酸连接的载体基团上(即，多聚(L-赖氨酸)或脂质体)。该方法尤其适用于显示特异性受体介导胞吞作用的细胞。
例如，与游离的寡核苷酸相比，与6-磷酸甘露糖化蛋白质辍合的寡核苷酸被表达6-磷酸甘露糖特异性受体的细胞内化的效率高20倍。寡核苷酸还可用可生物降解接头与细胞受体的配体偶联。在另一个实例中，递送构建体是甘露糖化的链霉抗生物素蛋白，其与生物素化的寡核苷酸形成紧密的复合物。发现甘露糖化的链霉抗生物素蛋白将生物素化寡核苷酸的内化提高20倍(Vlassov等，1994.Biochimica et Biophysica Acta1197：95-108)。
此外，特异性配体可与基于聚赖氨酸递送系统的聚赖氨酸组分缀合。例如，在真核细胞中转铁蛋白-聚赖氨酸、腺病毒-聚赖氨酸和流感病毒血凝素HA-2-N末端融合肽-聚赖氨酸辍合物极大地提高了受体介导的DNA递送。已经利用了缀合到肺泡巨噬细胞聚(L-赖氨酸)的甘露糖化糖蛋白以增强寡核苷酸的细胞摄取。Liang等，1999.Pharmazie 54：559-566。
由于恶性细胞对如叶酸和转铁蛋白的基本营养物的需求增加，因此可采用这些营养物将寡核苷酸靶向到癌细胞。例如，当将叶酸连接到聚(L-赖氨酸)时，在早幼粒细胞白血病(HL-60)细胞和人黑素瘤(M-14)细胞中可观察到增强的寡核苷酸摄取。Ginobbi等，1997.Anticancer Res.17：29。在另一个实例中，用甘露糖化牛血清白蛋白、叶酸或高铁血红素IX包被的脂质体在鼠巨噬细胞、KB细胞和人2.2.15肝细胞中显示寡核苷酸细胞摄取的增强。Liang等，1999.Pharmazie 54：559-566。
脂质体在肝、脾和网状内皮系统中自然累积(所谓的被动靶向)。通过将脂质体与多种配体(如蛋白A抗体)偶联，它们可主动靶向到特定的细胞类群。例如，具有蛋白A的脂质体可用H-2K特异性抗体预处理，H-2K特异性抗体靶向在L细胞中表达的小鼠主要组织相容性复合体编码的H-2K蛋白。(Vlassov等，1994.Biochimica et Biophysica Acta1197：95-108)
本领域已知其它RNAi试剂的体外和/或体内递送，并且可用于递送本发明RNAi构建体。参见例如，美国专利申请公开20080152661、20080112916、20080107694、20080038296、20070231392、20060240093、20060178327、20060008910、20050265957、20050064595、20050042227、20050037496、20050026286、20040162235、20040072785、20040063654、20030157030、WO 2008/036825、WO04/065601和AU200420625582，其上只是几个实例(均通过引用并入)。
施用
寡核苷酸的施用或递送的最佳途径可根据所需的结果和/或待处理的对象而异。本文所用“施用”是指将细胞与寡核苷酸接触，并且可在体外或体内实施。可无需过度试验地调整寡核苷酸的剂量以最优地降低靶核酸分子翻译所得蛋白质的表达，例如，通过RNA稳定性的数据或通过治疗反应来测量。
例如，可测量靶核酸所编码蛋白质的表达，以确定是否需要相应地调整剂量配方。此外，可采用任何本领域公知的技术测量细胞中或细胞产生的RNA或蛋白质水平的升高或降低。通过确定转录是否降低，可确定寡核苷酸诱导靶RNA切割的效率。
任何上述寡核苷酸组合物可单独使用或与可药用载体组合使用。本文所用“可药用载体”包括适合的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、渗透剂和吸收延缓剂等。本领域公知这种介质和试剂在药物活性物质中的应用。任何常规介质或试剂除非与活性成分不相容，否则均可用在治疗组合物中。还可将补充性活性成分整合入组合物中。
可将寡核苷酸整合入脂质体或用聚乙二醇修饰的脂质体中或与阳离子脂质混合用于肠胃外施用。将另外的物质(例如对特定靶细胞上的膜蛋白有反应性的抗体)整合入脂质体可帮助寡核苷酸对特定细胞类型的靶向。
此外，本发明提供用渗透泵对本发明寡核苷酸进行施用，所述渗透泵提供这种寡核苷酸的持续灌注，例如，如在Rataiczak等(1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11823-11827)中所述。这种渗透泵可购得，例如从AlzetInc.(Palo Alto，Calif.)。优选在阳离子脂质载体中的局部施用和肠胃外施用。
对于体内应用，本发明的制剂可以适于所选施用途径(例如，肠胃外、经口或腹膜内)的多种方式施用给患者。优选的是肠胃外施用，其包括以下途径的施用：静脉内；肌内；间质内；动脉内；皮下；眼内；滑膜内；透表皮包括透皮；经吸入的经肺；经眼；舌下和经颊粘膜；局部，包括经眼；皮肤；眼；直肠以及通过吹入的鼻吸入。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性或水中分散形式的活性化合物的水溶液。此外，可施用作为适合的含油注射悬液的活性化合物的悬液。适合的亲脂溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)。含水注射悬液可包含增加悬液粘度的物质，包括例如羟甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖，任选地，所述悬液还可包含稳定剂。本发明的寡核苷酸可在液体溶液中制备，优选地在生理相容性缓冲液(如Hank溶液或Ringer溶液)中。此外，寡核苷酸可制备为固体形式并在临用前重新溶解或悬浮。本发明还包括冻干形式。
局部施用的药物制剂包括透皮贴剂、软膏、洗液、乳霜、凝胶、滴剂、喷剂、栓剂、液体和粉末。此外，可在局部施用的药物制剂中使用常规的药物载体、含水、粉末或含油基质或增稠剂。
经口施用的药物制剂包括粉末或颗粒、水或非水基质中的悬液或溶液、胶囊、扁囊剂或片剂。此外，在经口施用的药物制剂中可采用增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。
对于透粘膜或透皮施用，在制剂中使用适用于待渗透屏障的渗透剂。本领域已知这种渗透剂，并包括，例如，用于透粘膜施用的胆汁酸夫西地酸衍生物以及去污剂。透粘膜施用可通过鼻喷雾或采用栓剂。对于经口施用，寡核苷酸可制备成常规的口服施用形式，如胶囊、片剂和滋补品。对于局部施用，本发明的寡核苷酸被制备成本领域已知的软膏、油膏、凝胶或乳霜。
可选择用于如体外、全身或局部施用的药物递送载体。可将这些载体设计成缓慢释放库，或设计成将其内含物直接递送到靶细胞。采用一些直接递送药物载体的优点是每次摄取递送多个分子。已经显示这些载体提高药物的循环半衰期，否则药物将从血流中快速清除。属于该类型的这种专门药物递送载体的一些实例包括脂质体、水凝胶、环糊精、可生物降解纳米颗粒和生物黏附性微球。
所需的寡核苷酸可全身地施用给对象。全身吸收是指药物进入血流而后分布在全身中。导致全身吸收的施用途径包括：静脉内、皮下、腹膜内和鼻内。这些施用途径的每一种将寡核苷酸递送到可到达的疾病细胞。在皮下施用后，治疗剂流入局部淋巴结并继续通过淋巴网进入循环。已经证明循环的进入速率是分子量或分子大小的函数。脂质体或其他药物载体的使用将寡核苷酸定位在淋巴结。可修饰寡核苷酸以使其扩散入细胞，或者脂质体可直接参与未修饰或修饰的寡核苷酸到细胞的递送。
所选的递送方法会导致进入细胞中。优选的递送方法包括脂质体(10-400nm)、水凝胶、控制释放聚合物和其它可药用载体，以及显微注射或电穿孔(对于离体治疗)。
可将本发明的药物制剂可制备和配制成乳剂。乳剂通常为一种液体以液滴形式分散在另一种液体中的异质系统，所述液滴的直径通常超过0.1μm。本发明的乳剂可包含赋形剂，如乳化剂、稳定剂、染料、脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、疏水胶体、防腐剂，并且抗氧化剂也可根据需要存在于乳化剂中。这些赋形剂可以水相、油相中的溶液存在或其自身为独立的相。
可用于本发明乳剂制剂的天然乳化剂的实例包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶。精细分割的固体也可用作良好的乳化剂，尤其是在与表面活性剂联合和在粘性制剂中。可用作乳化剂的精细分割的固体的实例包括极性无机固体(如重金属氢氧化物、不膨胀粘土(如膨润土、硅镁土、锂蒙脱石、高岭土、montrnorillonite、胶体硅酸铝、胶体硅酸铝镁)、色素和非极性固体(如碳或硬脂酸甘油三脂)。
可包含在乳剂制剂中的防腐剂的实例包括甲基苯甲酸酯、丙基苯甲酸酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。可包含在乳剂制剂中的抗氧化剂的实例包括自由基清除剂(如生育酚、烷基镓酸盐、丁基化羟基茴醚、丁基化羟基甲苯)或还原剂(如抗坏血酸和焦亚硫酸钠)和抗氧化增效剂(如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂)。
在一个实施方案中，寡核苷酸的组合物被制备为微乳剂。微乳剂是水、油和两亲分子的系统，其为单光学等向性并且热动力学稳定的液体溶液。通常，通过首先将油分散在表面活性剂的水溶液中，而后加入足量的第四组分(通常为中等链长的醇)以形成透明系统来制备微乳剂。
可用于制备微乳剂的表面活性剂包括但不限于单独或与助表面活性剂组合的离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(S0750)、十甘油十油酸酯(DA0750)。助表面活性剂(通常为短链醇，如乙醇、1-丙醇和1-丁醇)的作用是通过穿透表面活性剂膜并随后由于在表面活性剂分子之间产生空隙而产生混乱的膜来增加界面间流动性。
然而，微乳剂的制备可不采用助表面活性剂，并且本领域已知无醇自乳化微乳剂系统。通常水相可为(但不限于)水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇的衍生物。油相可包括但不限于如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单、双和三甘油脂、聚氧乙烯化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇、多糖基化的甘油酯、饱和多糖基化的C8-C10甘油酯、植物油和硅酮油的材料。
微乳剂在药物增溶和增加药物的吸收的角度而言尤其有意义。已提出基于脂质的微乳剂(油/水和水/油两种)增加药物的口服生物利用度。
微乳剂提供了增强的药物溶解，保护药物免受酶水解，由于表面活性剂诱导的膜流动性和渗透性的改变而可能增强药物的吸收，易于制备、与固体剂型相比易于口服施用，提高临床效力并降低毒性(Constantinides等，Pharmaceutical Research，1994，11：1385；Ho等，J.Pharm.Sci.，1996，85：138-143)。微乳剂也在化妆品和药物应用中活性组分的透皮递送中有效。预计本发明微乳剂组合物和制剂有利于寡核苷酸从胃肠道的全身吸收，并促进胃肠道、阴道、颊间和其它施用区域中寡核苷酸的局部细胞摄取。
在一个实施方案中，本发明采用多种穿透增强剂来使核酸(尤其是寡核苷酸)有效递送到动物的皮肤。如果用穿透增强剂处理待穿过的膜，甚至非亲脂性药物也可穿过细胞膜。除增加非亲脂药物穿过细胞膜的扩散外，穿透增强剂的作用还有增强亲脂药物的渗透性。
在本发明中可用的5类穿透增强剂包括：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂。其它可用于增强所施用寡核苷酸的穿透的试剂包括：二醇如乙二醇和丙二醇，吡咯如2-15吡咯、氮酮和萜烯如萜二烯以及薄荷酮。
寡核苷酸(尤其是在脂质制剂中)还可通过与阳离子脂质制剂一起包被医疗装置来进行施用，例如导管(如血管成形术气囊导管)。例如，可通过将医疗装置放入脂质制剂或脂质制剂和适合的溶剂(如基于水的缓冲液、含水溶剂、乙醇、二氯甲烷、氯仿等)的混合物中来进行包被。一定量的制剂将自然粘附到装置的表面，随后将装置适当地施用给患者。或者，可将脂质制剂的冻干混合物与装置的表面特异性地结合。在如K.Ishihara等，Journal of Biomedical Materials Research，27卷，1309-1314页(1993)(其公开内容通过整体引用并入本文)中描述了这种结合技术。
待施用的有效剂量和具体施用方式根据以下因素而异，如细胞类型，或对于体内施用而言的年龄，体重和特定动物以及待处理的部位，特定的寡核苷酸和所用的递送方法，预想的治疗或诊断应用和制剂形式(如悬液、乳剂、胶束或脂质体)，这对本领域技术人员是显而易见的。通常，以较低的水平施用剂量而后增加剂量直至达到所需的效果。当采用脂质递送寡核苷酸时，被施用的脂质化合物的量可不同，并且通常取决于施用的寡核苷酸试剂的量。例如，脂质化合物与寡核苷酸试剂的重量比优选为约1∶1至约15∶1，更优选的重量比为约5∶1至约10∶1。通常，施用的阳离子脂质化合物的量为约0.1毫克(mg)至约1毫克(mg)不等。作为一般性指导，通常对于每千克患者体重施用约0.1mg至约10mg的特定寡核苷酸药剂和约1mg至约100mg的脂质组合物，但也可采用更高和更低的量。
本发明的试剂以适于药物施用的生物相容形式施用给患者或与细胞接触。“适于施用的生物相容形式”是指寡核苷酸以这样的形式施用，其中所述寡核苷酸的任何毒性作用被治疗作用超过。在一个实施方案中，可将寡核苷酸施用给对象。对象的实例包括哺乳动物，例如任何其它灵长类动物；牛、猪、马和畜牧(农业)动物；狗、猫和其它家养宠物；小鼠、大鼠和转基因非人动物。
施用活性量的本发明寡核苷酸定义为在达成期望结果所需的剂量和时间下的有效量。例如。寡核苷酸的活性量可根据以下因素变化，如细胞类型，所用的寡核苷酸，并且对于体内使用为个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及寡核苷酸在个体中引发所需应答的能力。细胞中寡核苷酸治疗水平的确定取决于摄取和流出或降解的速率。降低降解程度延长了寡核苷酸的细胞内半衰期。因此，化学修饰的寡核苷酸(例如，具有磷酸骨架的修饰)可需要不同的剂量。
寡核苷酸的精确剂量和施用剂量的次数取决于实验和临床试验中获得的数据。如所需作用、递送载体、疾病适应症和施用途径等因素会影响剂量。本领域普通技术人员可容易地确定剂量并制备成本发明药物组合物。优选地，治疗的持续时间将至少持续到疾病症状过程中。
可调整剂量方案以提供最佳的治疗应答。例如，可重复地施用寡核苷酸，例如，可每天施用几个剂量或如治疗情况的实际状况所指示的成比例地减少。不论将寡核苷酸施用给细胞或对象，本领域普通技术人员能容易地确定施用对象寡核苷酸的适合剂量和施用时间表。
引入核酸的物理方法包括注射含有核酸的溶液、用涂覆有核酸的颗粒轰击，将细胞或组织浸入核酸溶液中或在核酸的存在下对细胞膜进行电穿孔。包装入病毒颗粒的病毒构建体能有效地将表达构建体引入细胞并转录表达构建体所编码的核酸。可采用其它本领域已知的将核酸引入细胞的方法，如脂质介导的载体转运，化学介导的转运(如磷酸钙)等。因此，核酸可与发挥一种或更多种以下活性的组分一起被引入：增强细胞的核酸摄取，抑制单链的退火，稳定单链或者以其他方式增强对靶基因的抑制。
可将核酸直接引入细胞(即细胞内方式)；或细胞外地引入腔、间隙，引入生物的循环，经口或通过吸入引入，或可通过在含有核酸的溶液中浸泡细胞或生物体引入。血管或血管外循环，血液或淋巴系统和脑脊液是可引入核酸的部位。
具有靶基因的细胞可源自或包含在任何生物体中。所述生物体可为植物、动物、原生动物、细菌、病毒或真菌。植物可为单子叶、双子叶或裸子植物；动物可为脊椎动物或非脊椎动物。优选的微生物是在农业或工业中使用的，以及对植物或动物为致病性的那些。
或者，可使用本领域公知技术将载体(例如编码本发明siRNA的转基因)改造到宿主细胞或转基因动物中。
本发明核酸(或其编码载体或转基因)的另一用途是在真核细胞或真核非人生物(优选哺乳动物细胞或生物，最优选人细胞(例如像HeLa或293的细胞系)或啮齿类动物(例如大鼠和小鼠))中进行功能性分析。通过施用与靶mRNA序列充分互补以指导靶标特异性RNA干扰的适当的本发明核酸，可在靶细胞中(例如在细胞培养物中或在靶生物体中)实现特异性敲除或敲低现象。
因此，本发明的另一主题为显示包含至少一个内源靶基因全部或至少部分缺陷表达的靶基因特异性敲除或敲低现象的真核细胞或真核非人生物，其中所述细胞或生物被至少一种载体转染，所述载体包含编码能抑制靶基因表达的RNAi剂的DNA。应注意，由于RNAi剂的特异性，本发明可靶标特异性地敲除或敲低几个不同内源基因。
可在分析方法中利用细胞或非人生物(特别是人细胞或非人哺乳动物)的基因特异敲除或敲低现象，如在复杂生理过程的功能和/或表型分析中(如分析基因表达谱和/或蛋白质组)。优选地，采用如基于寡核苷酸的芯片通过高通量方法进行所述分析。
寡核苷酸稳定性测定
在一些实施方案中，可使本发明的寡核苷酸稳定化，即对核酸内切酶和核酸外切酶降解具有显著抗性。当寡核苷酸对细胞内源核酸酶的抗性为对应寡核苷酸的约至少3倍时，将前者定义为对核酸酶具有显著抗性，当抗性为对应寡核苷酸的至少6倍时，将前者定义为具有高核酸酶抗性。这可以通过利用本领域已知技术显示本发明寡核苷酸对核酸酶具有显著抗性来证实。
证明显著稳定性的一种方法是例如通过测定蛋白质水平或通过检测mRNA切割来表明本发明寡核苷酸递送到细胞后发挥功能，例如它们减少靶核酸分子的转录或翻译。可在转染后约24小时进行靶RNA稳定性的测定(例如，采用本领域已知的Northern印迹技术，RNase保护测定或QC-PCR测定)。或者，可测量靶蛋白质的水平。优选地，除检测目的RNA或蛋白质水平外，检测对照的非靶标基因的RNA或蛋白质水平(例如，肌动蛋白，或优选的与靶标具有序列相似性的对照)作为特异性参照。可利用任何本领域公知技术进行RNA或蛋白质测定。优选地，在转染后约16-24小时开始进行测定(M.Y.Chiang等，1991.J Biol Chem.266：18162-71；T.Fisher等，1993.Nucleic Acids Research.21 3857)。
可利用本领域已知技术测定本发明寡核苷酸组合物抑制蛋白质合成的能力，例如通过检测对基因转录或蛋白质合成的抑制。例如，可进行核酸酶S1作图(Nuclease S1 mapping)。在另一个实施方案中，可采用Northern印迹分析来检测编码特定蛋白质的RNA的存在。例如，可通过氯化铯垫(cesium chloride cushion)制备总RNA(参见例如Ausebel等，1987.Current Protocols in Molecular Biology(Greene & Wiley，NewYork))。然后可采用RNA进行Northern印迹并检测(参见例如同前)。在另一个实例中，可采用如PCR测定靶蛋白质产生的特异mRNA的水平。在又一个实例中，可采用Western印迹检测存在的靶蛋白质的量。在另一个实施方案中，可检测被蛋白质量影响的表型。本领域公知进行Western印迹的技术(参见例如Chen等，J.Biol.Chem.271：28259)。
在另一个实例中，靶基因的启动子序列可与报告基因连接并且可监测报告基因的转录(例如，如下文详细描述的)。或者，可通过将靶核酸分子的一部分与报告基因融合以转录报告基因来鉴定不靶向启动子的寡核苷酸组合物。通过在寡核苷酸组合物的存在下监测报告基因表达的变化，可以确定寡核苷酸组合物抑制报告基因表达的效力。例如，在一个实施方案中，有效的寡核苷酸组合物将减少报告基因的表达。
“报告基因”为表达可检测基因产物(其可为RNA或蛋白质)的核酸。可通过Northern印迹进行mRNA表达的检测，并且可通过用对蛋白质特异的抗体染色来进行蛋白质的检测。优选的报告基因产生容易检测的产物。报告基因可与调控DNA序列可操作性连接，以使对报告基因产物的检测为调控序列的转录活性提供检测手段。在一些优选的实施方案中，通过与产物相关的固有活性来检测报告基因的基因产物。例如，报告基因可编码这样的基因产物，即其通过酶活性产生基于颜色、荧光或发光的可检测信号。报告基因的实例包括但不限于编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶的基因。
本领域技术人员能容易地识别适用于本发明的多种报告基因。这些包括但不限于氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶、人生长激素(hGH)和β-半乳糖苷酶。F.A.Ausubel等编，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，(1989)中有这种报告基因的实例。编码可检测产物(例如具有可检测酶活性或可产生针对其的特异性抗体)的任何基因均可用作本发明的报告基因。
一个报告基因系统是萤火虫萤光素酶报告系统(Gould，S.J.和Subramani，S.1988.Anal.Biochem.，7：404-408，通过引用并入本文)。萤光素酶测定是快速和灵敏的。在本测定中，制备测试细胞的裂解物并与ATP和底物萤光素组合。所编码的酶萤光素酶催化底物快速发生ATP依赖性氧化以产生发光产物。测量光输出总量，并且其在大范围的酶浓度下与存在的萤光素酶量成比例。
CAT是另一个常用的报告基因系统；该系统的主要优点是其被大量地证实并作为启动子的测量方法被广泛接受(Gorman C.M.，Moffat，L.F.，和Howard，B.H.1982.Mol.Cell.Biol.，2：1044-1051)。在该系统中，用CAT表达载体转染测试细胞，并转染最初的2-3天内与候选底物一起孵育。其后制备细胞提取物。将提取物与乙酰辅酶A和放射性氯霉素一起孵育。在孵育后，通过薄层层析将乙酰化氯霉素从未乙酰化形式中分离。在此测定中，乙酰化的程度反映了具有特定启动子的CAT基因的活性。
另一个适合的报告基因系统基于hGH的免疫检测。该系统也很迅速并易于使用。(Selden，R.，Burke-Howie，K.Rowe，M.E.，Goodman，H.M.，和Moore，D.D.(1986)，Mol.Cell，Biol.，6：3173-3179，通过引用并入本文)。该hGH系统的优点是表达的hGH多肽在培养基中而不是在细胞提取物中进行测定。因此，该系统不需要破坏测试细胞。应理解，该报告基因系统的原理不限于hGH，而是可以适用于任何可获得或可制备特异性可接受抗体的任何多肽。
在一个实施方案中，测量本发明双链寡核苷酸的核酸酶稳定性并与对照比较，所述对照如本领域通常采用的RNAi分子(例如长度小于25个核苷酸并包含2核苷酸碱基突出端的双链体寡核苷酸)或平末端的未修饰RNA二聚体。
采用本发明siRNA实现的靶RNA切割是高度序列特异的。可通过序列比较和本领域已知的比对算法确定序列同一性。为了确定两个核酸序列(或两个氨基酸序列)的同一性百分比，以进行最佳比较为目的进行序列比对(例如为了最佳比对可在第一序列或第二序列中引入缺口)。用于序列比较的局部比对算法的优选的、非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68的算法，在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中进行了改进。该算法被整合入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的BLAST程序(2.0版)中。或者，多个商业实体(如Dharmacon和Invitrogen)在其网站中提供了算法。Whitehead Institute也提供了免费的siRNA选择程序。优选地，siRNA和靶基因部分之间具有大于90％的序列同一性(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的序列同一性)。或者，可将siRNA在功能上限定为能与靶基因转录本的一部分杂交的核苷酸序列(或寡核苷酸序列)。多核苷酸杂交的严格条件的实例在Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，9和11章，以及Current Protocols in Molecular Biology，1995，F.M.Ausubel等编，John Wiley & Sons，Inc.，sections 2.10and6.3-6.4中提供。
治疗用途
通过抑制基因表达，本发明的寡核苷酸组合物可用于治疗任何涉及蛋白质表达的疾病。可用寡核苷酸组合物治疗的疾病的说明性实例包括：癌症、视网膜病变、自身免疫病、炎性疾病(即ICAM-1相关疾病、牛皮癣、溃疡性结肠炎、克罗恩病)、病毒疾病(即HIV、丙肝)、miRNA障碍和心血管疾病。
在一个实施方案中，寡核苷酸的体外细胞治疗可用于从对象中取出的细胞的离体治疗(例如用于治疗白血病或病毒感染)，或用于处理不源自对象但施用给对象的细胞(例如消除待移植给对象的细胞上表达的移植抗原)。此外，细胞的体外处理可用于非治疗背景(例如评价基因功能)，以研究基因调控和蛋白质合成或评价设计用于调节基因表达或蛋白质合成的寡核苷酸的改进。细胞的体内处理可用于一些需要抑制蛋白质表达的治疗背景。据报道反义治疗适于多种医学病症(参见例如美国专利No.5,830,653)以及呼吸道合胞体病毒感染(WO 95/22,553)、流感病毒(WO94/23,028)和恶性肿瘤(WO 94/08,003)。其它反义序列临床应用的实例在如Glaser.1996.Genetic Engineering News 16：1中综述。寡核苷酸切割的示例性靶标包括，例如蛋白激酶Ca、ICAM-1、c-raf激酶、p53，c-myb和在慢性髓细胞性白血病中发现的bcr/abl融合基因。
本发明核酸可在任何具有RNAi途径的动物中用于基于RNAi的治疗，所述动物如人、非人灵长类动物、非人哺乳动物、非人脊椎动物、啮齿类动物(小鼠、大鼠、仓鼠、兔等)、家畜、宠物(猫、狗等)、爪蟾、鱼、昆虫(果蝇等)和蠕虫(线虫)等。
本发明提供通过向对象施用本发明核酸来抑制或预防对象中与异常或有害的靶基因表达或活性相关的疾病和病症的方法。适当时，首先用引发剂处理对象以使其对随后的RNAi治疗的应答性更高。可通过如本领域已知的任何诊断或预后测定或其组合来鉴定有发生由异常或有害靶基因表达或活性引起或有其参与的疾病之风险的对象。预防剂的施用可在表现出靶基因异常的症状之前进行，以预防疾病或异常，或者作为替代地延缓其发展。例如，根据靶基因异常的类型，可采用靶基因、靶基因激动剂或靶基因拮抗剂来治疗对象。
在另一个方面，本发明涉及为治疗目的而调节靶基因表达、蛋白质表达或活性的方法。因此，在一个示例性实施方案中，本发明方法涉及将能表达靶基因的细胞与对靶基因或蛋白质具有特异性的本发明核酸(即对所述基因编码的mRNA具有特异性或特异性靶向所述蛋白质的氨基酸序列)接触以调节靶蛋白质的表达或一种或更多种活性。这些方法可在体外(例如，通过用试剂培养细胞)、体内(例如，通过将试剂施用给对象)或离体进行。可首先用引发剂处理对象以使其对随后的RNAi治疗的应答性更高。因此，本发明提供治疗患疾病或异常的对象的方法，所述疾病或异常的特征在于靶基因多肽或核酸分子的异常或不想要的表达或活性。在靶基因异常地不受调控和/或靶基因活性降低可能有有利作用的情况下，期望抑制靶基因活性。
因此可将本发明的治疗剂施用给对象以(预防性地或治疗性地)治疗与异常或不想要的靶基因活性相关的疾病。可考虑将药物基因组学(即研究个体基因型与该个体对外界化合物或药物反应之间的关系)与该治疗结合。通过改变剂量与药理学活性药物的血液浓度之间的关系，治疗剂代谢的差异可导致严重的毒性或治疗失败。因此，内科医生或临床医生可考虑将从相关药物基因组学研究中获得的知识用于确定是否施用治疗剂并依据个体确定治疗剂的剂量和/或治疗方案。药物基因组学涉及对药物应答(由于改变的药物特性和在患者中的异常作用)的具有临床意义的遗传改变。
为本发明目的，本文中可将范围表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当这样表示范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当值通过采用前置的“约”被表达为约数时，应理解其它特定值形成另一个实施方案。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点相关和与另一个端点无关的情况下都是有意义的。
此外，为本发明目的，当未限定实体的数量时是指一个或更多个该实体；例如，“蛋白质”或“核酸分子”是指一个或多个这种化合物或至少一个化合物。因此，本文中不限定数量的用法可与“一或更多”和“至少一”相互替换使用。还应注意术语“包含”、“包括”和“具有”可相互替换使用。此外，“选自……”的化合物是指以下列出的一个或更多个化合物，包括两个或更多个化合物的混合物(即组合)。根据本发明，分离的、生物纯的蛋白质或核酸分子是从其天然环境中分离的化合物。因此，“分离的”和“生物纯”不一定反映所述化合物被纯化的程度。本发明的分离化合物可从其天然来源获得，可采用分子生物学技术产生或可通过化学合成生成。
本发明还通过以下实施例进行说明，不应将所述实施例作为进一步的限制。本申请中引用的所有参考文献(包括文献参考文献、授权专利、公开的专利申请和待批的专利申请)的全部内容均通过引用特意地并入。
实施例
实施例1：利用最小长度的触发RNA抑制基因表达
转染最小长度的触发RNA(Minimum Length Trigger RNA，mltRNA)
化学合成mltRNA构建体(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA)并根据生产商说明采用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染入HEK293细胞(ATCC，Manassas，VA)。简单来讲，将RNA稀释为12X浓度而后与12X浓度的Lipofectamine RNAiMAX组合以进行复合。使RNA和转染试剂在室温下复合20分钟制成6X浓度。在复合的同时，清洗HEK293细胞，用胰酶消化并计数。将细胞稀释到制造商建议和之前所述条件的浓度，即1×105个细胞/ml。当RNA完成与RNAiMAX转染试剂的复合时，将20ul复合物一式三份加入96孔板的适当孔中。将细胞加到每个孔中(100ul体积)以使每孔的最终细胞数为1×104个细胞/孔。细胞的体积将6X浓度的复合物稀释至1X，与记录的浓度相等(10-0.05nM)。将细胞在正常生长条件下孵育24小时或48小时。
在24或48小时的孵育后，裂解细胞，并用QuantiGene测定(Panomics，Freemont，CA，其利用bDNA杂交技术)检测基因沉默活性。根据制造商的说明进行所述测定。
ΔG计算
采用从Mfold网站(http://mfold.bioinfo.rpi.edu/ cgi-bin/rna-form1.cgi)上获得的Mfold计算ΔG。在以下文献中描述了ΔG的计算方法，它们均通过引用并入：Zuker，M.(2003)Nucleic Acids Res.，31(13)：3406-15；Mathews，D.H.，Sabina，J.，Zuker，M和Turner，D.H.(1999)J.Mol.Biol.288：911-940；Mathews，D.H.，Disney，M.D.，Childs，J.L.，Schroeder，S.J.，Zuker，M.和Turner，D.H.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101：7287-7292；Duan，S.，Mathews，D.H.和Turner，D.H.(2006)Biochemistry 45：9819-9832；Wuchty，S.，Fontana，W.，Hofacker，I.L.和Schuster，P.(1999)Biopolymers 49：145-165。
实施例2：优化用于基因沉默的sd-rxRNAnano分子
本文开发了具有最小双链区的不对称双链RNAi分子，其在基因沉默中高效。这些分子可在有义和/或反义链上包含多种化学修饰，并可与固醇样分子(如胆固醇)缀合。
图1-3显示本发明RNAi分子的示意图。在包含有义和反义链的不对称分子中，任一条链可为较长链。任一条链还可包含单链区。如图1D所示，有义和反义链之间还可有错配。优选地，双链分子的一个末端为平末端或包含短的突出端，如一个核苷酸的突出端。图2表示应用于有义和反义链上的化学修饰类型，包括2’F、2’OMe、疏水修饰和硫代磷酸酯修饰。优选地，分子的单链区包含多个硫代磷酸酯修饰。可使用诸如5-U的4-吡啶基、5-U的2-吡啶基、5-U的异丁基和5-U的吲哚基的化合物增加分子的疏水性(图2)。还可采用如精蛋白(或其它Arg富含肽)、亚精胺或类似化学结构的蛋白质或肽来屏蔽双链体电荷以便于细胞进入(图3)。可通过共价或非共价修饰获得增强的疏水性。图4显示了几种正电荷的化学物质，其可用于封闭多核苷酸电荷。
多核苷酸的化学修饰(例如双链体分子的引导链)可促进RISC进入。图5显示了单链多核苷酸，其代表双链体分子的引导链，其上具有多种化学修饰，包括2’d、2’OMe、2’F、疏水修饰、硫代磷酸酯修饰和缀合物附着(如图5中的“X”，其中X可为与PAZ结构域具有高亲和性的小分子或固醇类实体)。类似地，图6显示单链多核苷酸，代表双链体分子中的负载链，其具有预测的RISC底物抑制剂的结构和化学构成。化学修饰的组合可保证有效摄取和与预装载的RISC复合物的有效结合。
图7显示连接有固醇类分子的多核苷酸的结构，其中R表示9碳或更长的多碳尾。图8显示17位连接有长于8的多碳链的天然植物甾醇的实例。已知多于250种的不同植物甾醇类型。图9显示固醇样结构的实例，其中连接到17位的多碳链的大小不同。图91代表可代替胆固醇用作疏水实体的固醇类分子的其它实例。图92代表可代替胆固醇用作疏水实体的疏水分子的其它实例。这些特性的优化可增强RNAi分子的摄取特性。图10显示从Martins等(J Lipid Research)获取的数据，其表明连接到17位的多碳链的大小直接影响包含固醇类分子的脂质乳剂的肝摄取和血浆清除百分率。图11显示由与疏水辍合物连接的多核苷酸和脂肪酸的混合物形成的胶束。图12显示脂质组成的改变可如何影响疏水修饰和/或疏水辍合的多核苷酸的药代动力学行为和组织分布。特别地，采用富含亚油酸和心磷脂的脂质混合物导致心肌的偏好性摄取。
图13显示设计为靶向MAP4K4表达的RNAi构建体和对照的实例。图14和15揭示具有最小双链区(如约13个核苷酸的双链区)的RNAi构建体在介导细胞培养物的RNA沉默中有效。图16显示了与这些RNA分子相关的参数。图17显示设计用于靶向SOD1表达的RNAi构建体和对照的实例。图18和19揭示采用这些RNAi分子靶向细胞中SOD1的基因沉默实验的结果。图20为说明具有小于10个核苷酸的双链区的RNA分子不被Dicer切割的示意图，图21为显示用于RNA诱导基因沉默的假想RNAi模型的示意图。
将本文所述的RNA分子在有义和反义链上进行多种化学修饰，并且观察这种修饰的作用。合成RNAi分子并通过测试多种修饰对其进行优化。在第一代的优化中，将sd-rxRNAnano分子的有义(负载)和反义(引导)链进行修饰，所述修饰如通过掺入C和U的2’OMe修饰、2’F修饰、硫代磷酸酯修饰、磷酸化和胆固醇辍合。测试分子通过脂质介导和被动摄取转染对细胞(包括HeLa、原代小鼠肝细胞和原代人肝细胞)MAP4K4表达的抑制。
图22揭示化学修饰可增强基因沉默。特别地，将引导链的2’F UC修饰和硫代磷酸酯修饰区段与负载链上的完全CU O’Me修饰组合，产生了在基因沉默中高效的分子。还检测了化学修饰在HeLa细胞中体外无协助递送中的作用。图23证明无任何2’F、2’OMe、硫代磷酸酯区段或胆固醇辍合物的化合物在被动摄取中完全无活性。全部4种化学修饰的组合(例如12386化合物中)显示在基因沉默中非常高效。图24还显示了12386化合物在基因沉默中的有效性。
还研究了寡核苷酸长度的优化。图25和26揭示与25个核苷酸长的寡核苷酸相比，21个核苷酸长的寡核苷酸更有效，这表明减小RNA分子的大小可提高效力，可能是通过促进其摄取。还进行了筛选以优化双链RNA分子双链区的大小。图88揭示具有10个核苷酸双链体的化合物在诱导基因沉默中有效。有义链相对于引导链的位置也可对基因表达沉默很关键(图89)。在此测定中，发现平末端是最有效的。3’突出端是可容忍的，但5’突出端导致功能的完全丧失。当与多种长度的有义链杂交时，引导链可在基因沉默中有效(图90)。在图90显示的测定中，通过脂质介导的转染将化合物引入HeLa细胞。
还研究了RNA分子的硫代磷酸酯含量对于无协助递送的重要性。图27显示了证明引导链中至少2-12个硫代磷酸酯(优选4-8个)的存在对达成摄取极为有利的系统性筛选的结果。图27还表明有义链硫代磷酸酯修饰的存在与否不改变效力。
图28-29揭示RNA化合物的被动摄取对原代小鼠肝细胞的基因沉默的作用。发现nanoRNA分子是高效的，特别是浓度为1μM时(图28)。图30和31揭示本发明的RNA化合物在原代人肝细胞的被动摄取后的基因沉默中也是有效的。如图32和33所示，检测了本发明RNA分子的细胞定位并将其与Chol-siRNA(Alnylam)分子的定位比较。
图21显示了对第一代sd-rxRNA分子的概述。将化学修饰引入RNA分子的至少一部分中，以增加效力(例如通过优化核苷酸长度和硫代磷酸酯含量)、减少毒性(例如通过用其它修饰替换引导链上的2’F修饰)、增强递送(例如通过将接头和固醇模式添加或辍合到RNA分子)并提高制造RNA分子的方便性。图35显示在第一代分子中所筛选的一些化学修饰的示意图。在引导链上进行优化的参数包括核苷酸长度(例如19、21和25个核苷酸)、硫代磷酸酯含量(例如，0-18个硫代磷酸酯连接)和用2’OMe、5MeC或核糖胸苷替换2’F基团。所优化的有义链参数包括核苷酸长度(11、13和19个核苷酸)、硫代磷酸酯含量(例如，0-4个硫代磷酸酯连接)和2’OMe修饰。图36概括了所筛选的参数。例如，以优化为目的修饰和筛选了核苷酸长度和硫代磷酸酯尾长度，也筛选了2’OMe C和U修饰的添加。发现引导链长度和核苷酸硫代磷酸酯修饰区段的长度影响效力(图37-38)。引导链中可容忍硫代磷酸酯修饰并发现其影响被动摄取(图39-42)。
图43显示所筛选的引导链化学修饰的示意图。图44和45表明引导链3’末端可容忍2’OMe修饰。特别地，1和11-18位的2’OMe修饰被很好地容忍。种子区的2’OMe修饰可容忍，但导致效力的轻微降低。种子区的核糖修饰也被很好地容忍。这些数据表明，本发明分子具有减少2’F修饰或无2’F修饰的显著优势。这是有利的，因为认为2’F修饰在体内产生毒性。在一些情况下，发现用2’OMe完全替换2’F修饰导致效力的部分降低。然而，2’OMe取代的分子仍具有相当高的活性。发现2’F含量降低50％的分子(包括11、16-18位替换成2’OMe修饰)与完全2’F C和U修饰的化合物具有类似的效力。发现在一些情况下位置上的2’OMe修饰降低效力，尽管其可部分被1位(具有化学磷酸酯)的2’OMe修饰补偿。在一些情况下，用5Me C和/或核糖胸苷替换2’F修饰导致被动摄取效力的降低，但与2’F修饰相比增强了脂质介导转染的效力。脂质介导转染的优化结果不一定与被动摄取的相同。
如图46所示，还开发和测试了有义链上的修饰。图47揭示在一些情况下，发现约10-15碱基的有义链长度是最优的。对于图47中测试的分子，有义链长度的增加导致被动摄取的减少，然而对于一些化合物有义链长度的增加是可容忍的。图47还揭示有义链的LNA修饰显示出与不含LNA修饰的化合物相似的效力。一般地，发现添加LNA或其它热动力学稳定性化合物是有利的，在一些情况下导致无功能序列转变为有功能序列。图48也显示了有义链长度优化的数据，而图49显示对于被动摄取不需要有义链的硫代磷酸酯修饰。
根据上述优化试验，开发了第二代RNA分子。如图50所示，这些分子相对于第一代RNA分子包含减少的硫代磷酸酯修饰含量和减少的2’F修饰含量。重要的是，这些RNA分子显示在无递送载体的情况下自发的细胞摄取和效力(图51)。这些分子可实现自递送(即无转染试剂)，并且在自递送之后可在细胞培养物中显示纳摩尔活性。还可用脂质介导的转染递送这些分子，并在转染后显示皮摩尔活性。重要的是，这些分子显示高效的摄取，为被细胞培养物中95％的细胞摄取，并在100％人血清的存在下稳定多于3天。这些分子也是高特异性的并不显示或显示极少的免疫诱导。图52和53显示了化学修饰和这些修饰的构型对影响本发明RNA分子特性的重要性。
还测试了与本发明RNA分子相连的接头化学结构。如图54中所示，合成了第二代RNA分子，其中将固醇类分子通过TEG和氨基己酸接头连接。两种接头显示相同的效能。这种不依赖于接头化学结构的RNA分子功能为规模扩大和合成提供了额外的优势，并证明这些RNA分子的功能机制和之前所述RNA分子的显著不同。
图55证明了与未修饰RNA相比，本文所述化学修饰的sd-rxRNA化合物在人血清中的稳定性。将双链体分子在37℃下在75％的血清中孵育所示时间。通过将样品在非变性凝胶上电泳并用SYBGR染色确定降解水平。
图56和57表示sd-rxRNA分子细胞摄取的数据。图56表明最小化RNA分子长度对细胞摄取很重要，而图57所显示的数据显示小鼠PEC衍生巨噬细胞中自发细胞摄取后的靶基因沉默。图58证明原代细胞中的自发摄取和靶基因沉默。图59显示不使用制剂将本发明的sd-rxRNA分子递送到RPE细胞的结果。Hoechst和DY547成像显示在sd-rxRNA样品中清晰存在代表RNA分子的信号，而在其它样品(包括与竞争辍合物、rxRNA样品和未转染对照的样品)中没有检测到信号。图60揭示不使用转染制剂用本发明sd-rxRNA处理RPE细胞24-48小时后靶基因表达的沉默。
图61显示了sd-rxRNA化合物化学/结构组成的进一步优化。在一些情况下，优选的特征包括17-21个核苷酸长的反义链，10-15个核苷酸长的有义链，在分子的单链区含有2-12个硫代磷酸酯修饰核苷酸(优选在单链区中具有6-8个硫代磷酸酯修饰核苷酸)，和大部分位点被2’OMe修饰的具有或不具有硫代磷酸酯修饰的有义链。可采用任何接头化学结构将疏水部分(如胆固醇)与有义链3’末端连接。如图61所示GIIb类型分子不具有2’F修饰。重要的是，这对这些分子的效力无影响。
图62证明sd-rxRNA化合物与Wolfrum等Nature Biotech，2007发表的化合物相比更好的性能。本文开发的I代和II代化合物(GI和GIIa)均在减少靶基因表达中显示很好的效力。与之不同，当将Wolfrum等所述的化学结构(所有寡聚物包含缀合到有义链3’末端的胆固醇)应用于传统siRNA(19bp具有两端突出端的双链体)的相同序列上时，化合物基本无活性。这些数据强调了将本文所述的化学修饰和不对称分子组合产生高效RNA化合物的重要性。
图63显示了本文中开发的sd-rxRNA分子的定位与如Soutschek等(2004)Nature，432：173所述的那些其它RNA分子定位的比较。sd-rxRNA分子在细胞内累积，而竞争缀合RNA在细胞表面累积。重要的是，图64表明sd-rxRNA分子(而不是如Soutschek等描述的那些竞争分子)在几分钟内被内化。图65将sd-rxRNA分子的定位与通常的siRNA-胆固醇(如在Soucheck等中所述的那些)进行比较。在组织培养的RPE细胞中，在局部递送到受损皮肤后和在全身递送后进行摄取的肝中明显地检测到代表RNA分子的信号。在每种情况下，对于通常的siRNA-胆固醇分子均检测不到信号。因此，与如Soutschek等描述的常规胆固醇辍合siRNA相比，sd-rxRNA化合物具有明显更佳的细胞和组织摄取特性。摄取水平至少高一个数量级，并且至少部分是由于化学结构与缀合结构的独特组合。也在图66和67中证明了sd-rxRNA相对于之前所述的RNA分子的更好递送。
根据对本发明第二代RNA分子的分析，进行了鉴定靶向SPP1/PPIB基因的功能性分子的筛选。如图68所揭示的，鉴定出了几个有效的分子，其中14131最有效。将所述化合物加入A-549细胞而后在48小时后通过B-DNA确定SPP1/PPIB比值水平。
图69证明在几分钟的暴露中sd-rxRNA的有效细胞摄取。这是这些分子的独特特征，在其它任何RNAi化合物中未观察到。用Soutschek等的化合物作为阴性对照。图70证明多种细胞类型(包括SH-SY5Y成神经细胞瘤衍生细胞、ARPE-19(视网膜色素上皮)细胞、原代肝细胞和原代巨噬细胞)中sd-rxRNA化合物有效摄取和基因沉默。在每种情况下通过用分支DNA测定观察靶基因表达来确定沉默。
图70表明在存在和不存在血清的情况下sd-rxRNA均有活性。在存虽然在血清存在时观察到效力的微小降低(2-5倍)，这种在血清存在时效力的微小降低将sd-rxRNA分子与之前所述的分子区分开来(后者在血清存在下效力有极大的降低)。这种血清存在下的效力水平是体内效力的基础。
图72证明在单次真皮内注射后有效组织渗透和细胞摄取。该数据表明本文所述sd-rxRNA化合物在任何皮肤学应用中用于沉默基因的潜力，并且也代表了sd-rxRNA化合物局部递送的模型。图73也证明真皮内注射后sd-rxRNA有效的细胞摄取和体内沉默。通过将几个单独注射位点的生物活检样品与注射了阴性对照的位点的生物活检样品中MAP4K4敲低水平进行比较来确定沉默。图74揭示sd-rxRNA化合物在全身施用后具有改善的血液清除并在肝中诱导体内有效基因沉默。与Soutschek等所述的RNA分子相比，相同剂量水平下sd-rxRNA分子肝摄取水平至少高50倍。所述摄取导致有效的沉默。Sd-rxRNA化合物的特征还有改进的血液清除动力学。
还检测了5-甲基C修饰的作用。图75证明5-甲基C在RNAi化合物中的存在导致脂质介导转染的效率提高。这证明在RNAi化合物中C和U的疏水修饰可为有利的。可在2’核糖修饰碱基的情况下采用这种类型的修饰以保证稳定性和效力的优化。图76所显示的数据表明在一些情况下在引导链中整合5-甲基C和/或核糖胸苷降低了效力。
图77揭示在对肝的全身递送中sd-rxRNA分子比如Soutschek等所述分子的竞争分子相比更有效。在含有sd-rxRNA的样品中清晰可见代表RNA分子的信号，而在含有竞争RNA分子的样品中未见到代表RNA分子的信号。
还研究了在sd-rxRNA分子上疏水辍合物的添加(图78-83)。图78为证明5-尿苷基修饰具有改进的疏水特性的示意图。将这种修饰整合入sd-rxRNA化合物可提高细胞和组织摄取特性。图78B为可应用于化合物以提高细胞摄取和药代动力学行为的新型RNAi化合物修饰。重要的是，当用于sd-rxRNA化合物时，该种类型的修饰可使这种化合物经口获取。图79为显示合成的经修饰固醇类分子的结构的示意图，其中C17连接尾的长度和结构被改变。不希望局限于任何理论，C17连接尾的长度可提高sd-rxRNA化合物的体外和体内效力。
图80为显示用石胆酸作为长侧链胆固醇的示意图。图81为显示5-尿苷亚磷酰胺合成途径的示意图。图82显示用于3’-胆固醇连接的三功能羟基脯氨醇接头合成的示意图。图83为显示用于制造更短的不对称RNAi化合物链的固体支持物的合成示意图。
进行筛选以鉴定能有效沉默SPP1(骨桥蛋白)表达的化合物。将靶向SPP1的化合物加入A549细胞(采用被动转染)并在48小时后评价SPP1的表达水平。鉴定了在SPP1沉默中有效的几种新化合物。在SPP1沉默中有效的化合物包括14116、14121、14131、14134、14139、14149和14152(图84-86)。在该测定中最具效力的化合物为14131(图84)。独立证实了这些sd-rxRNA化合物在SPP1沉默中的效力(图85)。
进行了类似的筛选以鉴定能有效沉默CTGF表达的化合物(图86-87)。在CTGF沉默中有效的化合物包括14017、14013、14016、14022、14025、14027。
方法
sd-rxRNAnano的转染
脂质介导的转染
化学合成sd-rxRNAnano构建体(Dharmacon，Lafayette，CO)并根据生产商说明采用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染入HEK293细胞(ATCC，Manassas，VA)。简单来讲，在Opti-MEM
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1血清减少培养基(Invitrogen，Carlsbad，California)中将RNA稀释为12X浓度，而后与12X浓度的Lipofectamine RNAiMAX组合。使RNA和转染试剂在室温下复合20分钟制成6X浓度。在复合的同时，清洗HEK293细胞，用胰酶消化并计数。将细胞稀释到制造商建议和之前所述的浓度，即1×105个细胞/ml。当RNA完成与RNAiMAX转染试剂的复合时，将20ul复合物一式三份加入96孔板的适当孔中。将细胞加到每个孔中(100ul体积)以使每孔的最终细胞数为1×104个细胞/孔。细胞的体积将6X浓度的复合物稀释至1X(10-0.05nM)。将细胞在正常生长条件下孵育24小时或48小时。在24或48小时的孵育后，裂解细胞，并用QuantiGene测定(Panomics，Freemont，CA，采用bDNA杂交技术)检测基因沉默活性。根据制造商的说明进行所述测定。
被动摄取转染
化学合成sd-rxRNAnano构建体(Dharmacon，Lafayette，CO)。在转染前24小时，将HeLa细胞(ATCC，Manassas，VA)在正常生长条件下(DMEM，10％FBS和1％青霉素和链霉素)以1×104个细胞/孔铺在96孔板中。在转染HeLa细胞前，在Accell siRNA递送基质中(Dharmacon，Lafayette，CO)将sd-rxRNAnano稀释为0.01uM至1uM的终浓度。从细胞中吸出正常生长培养基并将含有适合浓度sd-rxRNAnano的100uL Accell递送培养基加入细胞。转染后48小时，从细胞中吸出递送培养基，并将正常生长培养基加入细胞并继续培养24小时。
在48或72小时的孵育后，裂解细胞，并用QuantiGene测定(Panomics，Freemont，CA)根据制造商的说明检测基因沉默活性。
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表1
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表2：有义骨架、化学修饰和序列信息。O：磷酸二酯；s：硫代磷酸酯；P：5’磷酸化；O：2’-OH；F：2’-氟；m：2’O-甲基；+：LNA修饰。序列中的大写字母表示核糖核苷酸，小写字母表示脱氧核糖核苷酸。
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表3：有义骨架、化学修饰和序列信息。O：磷酸二酯；s：硫代磷酸酯；P：5’磷酸化；O：2’-OH；F：2’-氟代；m：2’O-甲基；+：LNA修饰。序列中的大写字母表示核糖核苷酸，小写字母表示脱氧核糖核苷酸。
尽管已经描述了本发明至少一个实施方案的几个方面，应理解本领域技术人员可容易地设想多种变化、修改和改进。这些变化、修改和改进是本公开内容的一部分，并且在本发明的精神和范围内。因此，之前的说明和附图只是示例。
只采用常规试验本领域技术人员能识别或能确定本发明特定实施方案的多个等同方案。以下权利要求旨在涵盖这些等同方案。
本文公开的所有参考文献(包括专利文件)均通过全文引用并入。本申请通过引用将待批美国临时申请No.61/135,855(于2008年7月24日提交，题为“SHORT HAIRPIN RNAI CONSTRUCTS AND USESTHEROF，”)和美国临时申请No.61/197,768(于2008年10月30日提交，题为“MINIRNA CONSTRUCTS AND USES THEREOF.”)的全部内容(包括所有附图和说明书的所有部分(包括序列表或氨基酸/多核苷酸序列))并入。
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Claims (91)

1.分离的不对称核酸分子，其包含
最小长度为16个核苷酸的引导链，以及负载链，它们形成具有双链区和单链区的双链核酸，所述双链区长度为8-15个核苷酸，所述单链区长度为5-12个核苷酸，其中所述负载链与亲脂基团连接，其中所述双链核酸中至少40％的核苷酸被修饰，并且其中所述单链区具有至少2个硫代磷酸酯修饰。
2.权利要求1的分离的不对称核酸分子，其中所述引导链的1位被5’磷酸化。
3.权利要求1的分离的不对称核酸分子，其中所述引导链的1位被2’O-甲基修饰并被5’磷酸化。
4.分离的双链核酸分子，其包含
15-21个核苷酸长的较长链，其与miRNA序列互补，
8-16个核苷酸长的较短链，其在3’末端与亲脂基团连接，
其中所述较长链和负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述较长链具有2-13个核苷酸长的3’单链区，其包含至少2个硫代磷酸酯修饰，并且至少50％的核苷酸被修饰。
5.分离的双链核酸分子，其包含
17-21个核苷酸长的引导链，其与靶基因互补，
8-16个核苷酸长的负载链，其在3’末端与亲脂基团连接，
其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有2-13个核苷酸长的3’单链区，所述单链区中的每个核苷酸都具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，并且其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸包含至少一个2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰。
6.分离的双链核酸分子，其包含
17-21个核苷酸长的引导链，其与靶基因互补，
10-16个核苷酸长的负载链，其在3’末端与亲脂基团连接，
其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有5-11个核苷酸长的3’单链区，所述单链区中的至少2个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，并且其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸被2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰。
7.分离的双链核酸分子，其包含
17-21个核苷酸长的引导链，其与靶基因互补，
8-16个核苷酸长的负载链，其在3’末端与亲脂基团连接，
其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有6-8个核苷酸长的3’单链区，所述单链区中的每个核苷酸都具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，其中所述负载链包含至少2个硫代磷酸酯修饰，其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸包含2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰，并且其中所述双链核酸分子的一个末端是平末端或包含1-2个核苷酸的突出端。
8.分离的双链核酸分子，其包含
17-21个核苷酸长的引导链，其与靶基因互补，
8-16个核苷酸长的负载链，其在3’末端与亲脂基团连接，
其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有3’单链区，所述单链区中的每个核苷酸都具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，其中所述引导链中11-18位的每个C和U核苷酸都具有2’O-甲基修饰，其中所述负载链的每个核苷酸都被2’O-甲基修饰，并且其中所述双链核酸分子的一个末端是平末端或包含1-2个核苷酸的突出端。
9.分离的双链核酸分子，其包含
17-21个核苷酸长的引导链，其与靶基因互补，
8-15个核苷酸长的负载链，其在3’末端与亲脂基团连接，其中所述亲脂基团选自胆固醇和具有5-7个或9-18个碳长度的C17多碳链的固醇类分子，
其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有3’单链区，所述单链区中的每个核苷酸都具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，其中所述引导链中11-18位的每个C和U核苷酸都具有2’O-甲基修饰，其中所述引导链中2-10位的每个C和U核苷酸具有2’F修饰，其中所述负载链的每个核苷酸都被2’O-甲基修饰，并且其中所述双链核酸分子的一个末端是平末端或包含1-2个核苷酸的突出端。
10.分离的核酸分子，其包含
与靶基因互补的引导链，
在3’末端与亲脂基团连接的负载链，
其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的核酸分子，其中所述引导链具有2-13个核苷酸长的3’单链区，所述单链区中的每个核苷酸都具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸包含至少一个2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰，并且其中所述双链核酸分子的一个末端是平末端或包含1-2核苷酸的突出端。
11.分离的双链核酸分子，其包含引导链和负载链，其中所述分子的双链区长度为8-14个核苷酸，其中所述引导链包含4-12个核苷酸长的单链区，并且其中所述引导链的单链区包含2-12个硫代磷酸酯修饰。
12.权利要求11的核酸分子，其中所述引导链包含6-8个硫代磷酸酯修饰。
13.权利要求11或12的核酸分子，其中所述引导链的单链区长度为6个核苷酸。
14.权利要求11-13中任一项的核酸分子，其中所述双链区长度为13个核苷酸。
15.权利要求11-14中任一项的核酸分子，其中所述双链核酸分子的一个末端是平末端或包含1-2个核苷酸的突出端。
16.分离的双链核酸分子，其包含
引导链，其中所述引导链为16-28个核苷酸长并与靶基因互补，其中所述引导链3’末端的10个核苷酸包含至少2个磷酸酯修饰，并且其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰并包括至少一个2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰；以及
负载链，其中所述负载链长度为8-14个核苷酸并且与所述引导链互补，其中所述负载链与亲脂基团连接，
其中所述引导链和所述负载链形成双链核酸分子。
17.权利要求1、7-10或16中任一项的核酸分子，其中所述引导链或序列的1位核苷酸具有2’-O-甲基修饰。
18.权利要求1-4、6-10或16-17中任一项的核酸分子，其中所述引导链或序列2-10位的至少一个C或U核苷酸具有2’-氟代修饰。
19.权利要求18的核酸分子，其中所述引导链2-10位的每个C和U核苷酸都具有2’-氟代修饰。
20.权利要求1-3、5、7、9或16-19中任一项的核酸分子，其中所述引导链或序列11-18位的至少一个C或U核苷酸具有2’-O-甲基修饰。
21.权利要求20的核酸分子，其中所述引导链或序列11-18位的每个C和U核苷酸都具有2’-O-甲基修饰。
22.权利要求1、2、4、5或16-21中任一项的核酸分子，其中所述引导链3’末端的10个核苷酸包含至少4个磷酸酯修饰。
23.权利要求22的核酸分子，其中所述引导链3’末端的10个核苷酸包含至少8个磷酸酯修饰。
24.权利要求16的核酸分子，其中所述引导链包含4-14个磷酸酯修饰。
25.权利要求16的核酸分子，其中所述引导链包含4-10个磷酸酯修饰。
26.权利要求1-5或16中任一项的核酸分子，其中所述引导链的3’末端6个核苷酸均包含磷酸酯修饰。
27.权利要求16-26中任一项的核酸分子，其中所述磷酸酯修饰为硫代磷酸酯修饰。
28.权利要求16-27中任一项的核酸分子，其中所述负载链的每个C和U核苷酸都具有2’-O-甲基修饰。
29.权利要求28的核酸分子，其中所述负载链的每个核苷酸都具有2’-O-甲基修饰。
30.权利要求16-30中任一项的核酸分子，其中所述负载链的至少一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰。
31.权利要求30的核酸分子，其中所述负载链的至少2个核苷酸为硫代磷酸酯修饰。
32.权利要求1-5或16-31中任一项的核酸分子，其中所述亲脂分子为固醇。
33.权利要求32的核酸分子，其中所述固醇为胆固醇。
34.权利要求16-33中任一项的核酸分子，其中所述引导链长为18-19个核苷酸。
35.权利要求16-34中任一项的核酸分子，其中所述负载链长为11-13个核苷酸。
36.权利要求16-35中任一项的核酸分子，其中所述双链核酸分子的一个末端是平末端或包含1-2个核苷酸的突出端。
37.分离的双链核酸分子，其包含引导链和负载链，其中所述引导链为16-29个核苷酸长并与靶基因基本互补，其中所述负载链为8-14个核苷酸长并与所述引导链互补，并且其中所述引导链具有至少2个化学修饰。
38.权利要求37的分离的双链核酸分子，其中所述至少2个化学修饰包括至少2个硫代磷酸酯修饰。
39.权利要求37-38中任一项的核酸分子，其中所述双链核酸分子的一个末端是平末端或包含1-2个核苷酸的突出端。
40.分离的双链核酸分子，其包含引导链和负载链，其中所述引导链为16-29个核苷酸长并与靶基因基本互补，其中所述负载链为8-14个核苷酸长并与所述引导链互补，并且其中所述引导链具有5个核苷酸长或更长的单链3’区以及1个核苷酸或更少的单链5’区。
41.权利要求40的核酸分子，其中所述单链区可包含至少2个硫代磷酸酯修饰。
42.分离的双链核酸分子，其包含引导链和负载链，其中所述引导链为16-29个核苷酸长并与靶基因基本互补，其中所述负载链为8-16个核苷酸长并与所述引导链互补，并且其中所述引导链具有5个核苷酸长或更长的单链3’区并且所述负载链具有长于9的C17连接链的固醇类分子。
43.双链体多核苷酸，其包含
第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸和靶基因互补；和
第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸比所述第一多核苷酸至少短6个核苷酸，
其中所述第一多核苷酸包含含有以下修饰的单链区，所述修饰选自40-90％疏水碱基修饰、40-90％硫代磷酸酯和40-90％核糖部分修饰或其任何组合。
44.双链体多核苷酸，其包含：
第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与第二多核苷酸和靶基因互补；以及
第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸比所述第一多核苷酸至少短6个核苷酸，
其中所述双链体多核苷酸在所述第一多核苷酸的9、11、12、13或14位核苷酸与第二多核苷酸的对应核苷酸之间包含错配。
45.在哺乳动物细胞中抑制靶基因表达的方法，其包括将所述哺乳动物细胞与权利要求1-41中任一项所述分离的双链核酸分子或权利要求43或44所述双链体多核苷酸接触。
46.在对象中诱导RNAi的方法，其包括：
向对象施用有效量的用于诱导靶基因mRNA之RNAi的权利要求1-41中任一项所述分离的双链核酸分子或权利要求43或44所述双链体多核苷酸。
47.权利要求46的方法，其中所述对象是人。
48.权利要求45的方法，其中所述靶基因是PPIB。
49.权利要求45的方法，其中所述靶基因是MAP4K4。
50.权利要求45的方法，其中所述靶基因是SOD1。
51.分离的疏水修饰多核苷酸，其包含
多核苷酸，其中所述多核苷酸为与疏水分子连接的双链RNA，其中所述疏水分子与非末端核苷酸的碱基、核糖或骨架连接，并且其中所述分离的双链核酸分子包含引导链和负载链，其中所述引导链长为16-29个核苷酸并与靶基因基本互补，其中所述负载链长为8-14个核苷酸并且与所述引导链互补。
52.权利要求51所述分离的疏水修饰多核苷酸，其中所述疏水分子与所述双链RNA的引导链连接。
53.权利要求51所述分离的疏水修饰多核苷酸，其中所述引导链的3’末端10个核苷酸包含至少2个磷酸酯修饰，并且其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰并包含至少一个2’O-甲基修饰或2’-氟代修饰。
54.权利要求51所述分离的疏水修饰多核苷酸，其中所述疏水分子与所述双链RNA的负载链连接。
55.分离的疏水修饰多核苷酸，其包含：
与疏水分子非共价复合的多核苷酸，其中所述疏水分子是多阳离子分子。
56.权利要求55所述分离的疏水修饰多核苷酸，其中所述多阳离子分子选自精蛋白、精氨酸富含肽和精胺。
57.分离的疏水修饰多核苷酸，其包含：
多核苷酸，其中所述多核苷酸为不使用接头而直接与疏水分子复合的双链RNA，其中所述疏水分子不是胆固醇。
58.组合物，其包含：
疏水修饰多核苷酸，其中所述多核苷酸是与疏水分子连接的双链RNA，其中所述双链核酸分子包含引导链和负载链，其中所述引导链为16-29个核苷酸长并与靶基因基本互补，其中所述负载链为8-14个核苷酸长并与所述引导链互补，其中所述引导链的1位被5’磷酸化或具有2’O-甲基修饰，其中所述双链核酸中至少40％的核苷酸被修饰，并且其中所述双链核酸分子的一个末端为平末端或包含1-2个核苷酸的突出端；
中性脂肪混合物；以及
任选地货物分子，
其中所述疏水修饰多核苷酸与所述中性脂肪混合物形成胶束。
59.权利要求58的组合物，其中所述负载链的3’末端与疏水分子相连接。
60.权利要求58-60中任一项的组合物，其中所述组合物为无菌的。
61.权利要求58-60中任一项的组合物，其中所述中性脂肪混合物包含DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)。
62.权利要求58-60中任一项的组合物，其中所述中性脂肪混合物包含DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)。
63.权利要求58-62中任一项的组合物，其中所述中性脂肪混合物还包含固醇。
64.权利要求62的组合物，其中所述固醇为胆固醇。
65.权利要求57-55中任一项的组合物，其中所述组合物包含至少20％的DOPC和至少20％的胆固醇。
66.权利要求57-64中任一项的组合物，其中所述疏水修饰多核苷酸中的疏水部分为固醇。
67.权利要求65的组合物，其中所述固醇为胆固醇、胆固醇基或修饰的胆固醇基残基。
68.权利要求57-64中任一项的组合物，所述疏水修饰多核苷酸中的疏水部分选自胆汁酸、胆酸或牛磺胆酸、脱氧胆酸、十八烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯、维生素、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、脂肪酸酯、甘油三酯、芘、紫菜碱、Texaphyrine、金刚烷、吖啶类、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、得克萨斯红、洋地黄皂苷配基、二甲氧三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如Cy3或Cy5)、Hoechst 33258染料、补骨脂素和布洛芬。
69.权利要求57-64或67中任一项的组合物，其中所述疏水修饰多核苷酸中的疏水部分为多阳离子分子
70.权利要求18的组合物，其中所述多阳离子分子选自精蛋白、精氨酸富含肽和精胺。
71.权利要求57-69中任一项的组合物，其中所述货物分子为脂质、肽、维生素或小分子。
72.权利要求57-69中任一项的组合物，其中所述货物分子为市售的脂肪乳剂，其用于多种选自肠胃外给养的目的。
73.权利要求71的组合物，其中所述市售的脂肪乳剂为英脱利匹特或nutralipid。
74.权利要求57-69中任一项的组合物，其中所述货物分子为含有多于74％的亚油酸的脂肪酸混合物。
75.权利要求57-69中任一项的组合物，其中所述货物分子为含有至少6％的心磷脂的脂肪酸混合物。
76.权利要求57-69中任一项的组合物，其中所述货物分子为含有至少74％的亚油酸和至少6％的心磷脂的脂肪酸混合物。
77.权利要求57-75中任一项的组合物，其中所述多核苷酸中至少40％的核苷酸被修饰。
78.权利要求57-69中任一项的组合物，其中所述货物分子为融合脂，优选地为至少10％的融合脂。
79.权利要求77的组合物，其中所述融合脂为DOPE。
80.在对象中诱导RNAi的方法，其包括：
向对象施用有效量的用于诱导靶基因mRNA之RNAi的权利要求1-41中任一项所述分离的双链核酸分子、或权利要求43或44所述双链体多核苷酸或权利要求57-78中任一项所述组合物，其中所述多核苷酸至少具有对应于靶基因的序列区，其中所述施用步骤为全身地、静脉内、腹膜内、真皮内、局部、鼻内、吸入、经口、粘膜内、局部注射、皮下、经口气管或眼内的。
81.权利要求79的方法，其中所述施用是全身的。
82.权利要求79的方法，其中所述施用是静脉内的。
83.权利要求79的方法，其中所述施用是腹膜内的。
84.权利要求79的方法，其中所述施用是真皮内的。
85.权利要求79的方法，其中所述施用是局部的。
86.权利要求79的方法，其中所述施用是眼内的。
87.权利要求79的方法，其中所述对象是人。
88.权利要求79的方法，其中所述靶基因是PPIB。
89.权利要求79的方法，其中所述靶基因是MAP4K4。
90.权利要求79的方法，其中所述靶基因是SOD1。
91.分离的双链核酸分子，其包含：
17-21个核苷酸长的引导链，其与靶基因互补，
10-17个核苷酸长的负载链，其在3’末端与亲脂基团连接，
其中所述引导链和所述负载链形成具有双链区和单链区的双链核酸分子，其中所述引导链具有5-11个核苷酸长的3’单链区，所述单链区中至少2个核苷酸具有硫代磷酸酯修饰，其中所述引导链具有5’磷酸酯修饰，并且其中所述双链区中至少50％的C和U核苷酸被2’O甲基修饰或2’-氟代修饰。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755620A (zh) * 2012-05-22 2015-07-01 奥利克斯医药有限公司 具有细胞内穿透能力的诱导rna干扰的核酸分子及其用途
CN106244590A (zh) * 2016-08-18 2016-12-21 广州市锐博生物科技有限公司 经修饰的siRNA分子、RNAi分子混合物及其应用
CN106498072A (zh) * 2016-11-24 2017-03-15 青岛千卓分子生物科技有限公司 一种液态产品中外源dna内标物的保护方法及其应用
CN108135923A (zh) * 2015-07-06 2018-06-08 阿克赛医药公司 靶向超氧化物歧化酶1（sod1）的核酸分子
CN112263587A (zh) * 2020-10-23 2021-01-26 河北仁博科技有限公司 miR-3065-5p在制备预防和/或治疗肾纤维化的药物中的应用

Families Citing this family (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100949791B1 (ko) * 2007-12-18 2010-03-30 이동기 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도
US20110130710A1 (en) * 2007-12-21 2011-06-02 David Lawrence Becker Treatment of abnormal or excessive scars
US10131904B2 (en) 2008-02-11 2018-11-20 Rxi Pharmaceuticals Corporation Modified RNAi polynucleotides and uses thereof
WO2010008582A2 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell drug delivery system
KR101877698B1 (ko) 2008-08-25 2018-07-12 엑스칼리아드 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 결합 조직 성장 인자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 그의 용도
US8946172B2 (en) * 2008-08-25 2015-02-03 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Method for reducing scarring during wound healing using antisense compounds directed to CTGF
AU2009293658A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 James Cardia Reduced size self-delivering RNAi compounds
US9074211B2 (en) 2008-11-19 2015-07-07 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of MAP4K4 through RNAI
JP6091752B2 (ja) * 2008-12-04 2017-03-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｅｐｏに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるエリスロポエチン（ｅｐｏ）関連疾患の治療
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
EP2542058B1 (en) 2010-03-02 2018-10-10 RXi Pharmaceuticals Corporation Effective sensitizing dose of a gelled immunomodulating topical composition
WO2011109698A1 (en) * 2010-03-04 2011-09-09 Rxi Pharmaceuticals Corporation Formulations and methods for targeted delivery to phagocyte cells
WO2011112516A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Ico Therapeutics Inc. Treating and preventing hepatitis c virus infection using c-raf kinase antisense oligonucleotides
EP2550000A4 (en) * 2010-03-24 2014-03-26 Advirna Inc RNAI COMPOUNDS OF REDUCED SIZE ADMINISTERING
CN103108642B (zh) * 2010-03-24 2015-09-23 雷克西制药公司 皮肤与纤维化症候中的rna干扰
EP2550001B1 (en) 2010-03-24 2019-05-22 Phio Pharmaceuticals Corp. Rna interference in ocular indications
WO2011130371A1 (en) * 2010-04-13 2011-10-20 Life Technologies Corporation Compositions and methods for inhibition of nucleic acids function
EP3599280B1 (en) * 2010-10-22 2022-11-02 OliX Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules inducing rna interference, and uses thereof
US10610486B2 (en) 2010-10-28 2020-04-07 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulation of a non-steroidal anti-inflammatory drug
AU2012212110A1 (en) 2011-02-02 2013-08-01 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Method of treating keloids or hypertrophic scars using antisense compounds targeting connective tissue growth factor (CTGF)
WO2012110457A2 (en) * 2011-02-14 2012-08-23 Santaris Pharma A/S Compounds for the modulation of osteopontin expression
KR102104401B1 (ko) 2011-03-29 2020-04-27 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Tmprss6 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
US8802839B2 (en) 2011-07-15 2014-08-12 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor antisense oligonucleotides
EP2780454A2 (en) * 2011-11-18 2014-09-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
JP6408380B2 (ja) * 2011-12-19 2018-10-17 ヴァリー ヘルス システム 癌を患うリスクのある被検体を診断するための方法およびキット
AU2013263349B2 (en) 2012-05-17 2016-09-08 Extend Biosciences, Inc Carriers for improved drug delivery
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
AU2014209141B2 (en) 2013-01-24 2018-05-10 Palvella Therapeutics, Inc. Compositions for transdermal delivery of mTOR inhibitors
US10731161B2 (en) 2013-03-11 2020-08-04 The Johns Hopkins University Influenza-activated constructs and methods of use thereof
PL230602B1 (pl) 2013-04-04 2018-11-30 Centrum Badan Molekularnych I Makromolekularnych Polskiej Akademii Nauk Kwas (E)-3-arylo-3-oksoprop-1-enylo-2-fosfonowy i jego pochodne, sposob ich wytwarzania oraz ich zastosowanie
KR102234623B1 (ko) 2013-05-22 2021-04-02 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｔｍｐｒｓｓ6 조성물 및 이의 사용 방법
PL223918B1 (pl) 2013-05-28 2016-11-30 Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych Polskiej Akademii Nauk 3-Arylo-2-fosforylo podstawione 1-indanony i sposób ich wytwarzania
EP3027222A1 (en) 2013-07-31 2016-06-08 QBI Enterprises Ltd. Sphingolipid-polyalkylamine-oligonucleotide compounds
CN113151180A (zh) 2013-12-02 2021-07-23 菲奥医药公司 癌症的免疫治疗
EP3077050B1 (en) * 2013-12-04 2020-10-21 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treatment of wound healing utilizing chemically modified oligonucleotides
MX2016009064A (es) 2014-01-10 2017-01-23 Glaxosmithkline Intellectual Property (No 2) Ltd Derivados de hidroxi formamida y su uso.
US20160333346A1 (en) 2014-01-17 2016-11-17 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Nucleic acid capable of inhibiting expression of beta-2gpi
US10087444B2 (en) 2014-02-13 2018-10-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System MicroRNA composition for the treatment of neuroblastoma
US20170137808A1 (en) * 2014-03-20 2017-05-18 Oommen Varghese Improved small interfering ribonucleic acid molecules
US11318206B2 (en) 2014-03-28 2022-05-03 Aposense Ltd Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
KR20160138210A (ko) * 2014-03-28 2016-12-02 아포센스 엘티디. 분자의 막횡단 전달을 위한 화합물 및 방법
EP3733856A1 (en) 2014-04-18 2020-11-04 University of Massachusetts Exosomal loading using hydrophobically modified oligonucleotides
CA2947270A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating cancer using nucleic acids targeting mdm2 or mycn
CA2947619A1 (en) * 2014-05-01 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treatment of disorders in the front of the eye utilizing nucleic acid molecules
US20170114341A1 (en) * 2014-06-06 2017-04-27 Solstice Biologics, Ltd. Polynucleotide constructs having bioreversible and non-bioreversible groups
EP3156503B1 (en) 2014-06-16 2019-12-11 Toray Industries, Inc. Stomach cancer biomarker and detection method
US10900039B2 (en) 2014-09-05 2021-01-26 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating aging and skin disorders using nucleic acids targeting Tyr or MMP1
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
WO2016065042A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
CA3193811A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2016077689A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
WO2016085852A1 (en) 2014-11-24 2016-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof
CA2969590A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for the treatment of alopecia areata utilizing gene modulation approaches
DK3277815T3 (da) 2015-04-03 2021-12-13 Univ Massachusetts Oligonukleotidforbindelser til behandling af præeklampsi og andre angiogene lidelser
JP6892433B2 (ja) * 2015-04-03 2021-06-23 ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ 十分に安定化された非対称ｓｉｒｎａ
US9809817B2 (en) 2015-04-03 2017-11-07 University Of Massachusetts Oligonucleotide compounds for targeting huntingtin mRNA
WO2017007825A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
US10633653B2 (en) 2015-08-14 2020-04-28 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
EP3365446A4 (en) * 2015-10-19 2019-06-26 Phio Pharmaceuticals Corp. SELF ADMINISTRATION-REDUCED SIZE NUCLEIC ACID COMPOUNDS TARGETING LONGS NON-CODING LONGS
US10059949B2 (en) 2015-11-16 2018-08-28 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of age-related macular degeneration using RNA complexes that target MYD88 or TLR3
CA3007984A1 (en) * 2015-12-08 2017-06-15 Solstice Biologics, Ltd. Polynucleotide constructs having an auxiliary moiety non-bioreversibly linked to an internucleoside phosphate or phosphorothioate
JP2019503394A (ja) 2016-01-31 2019-02-07 ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ 分岐オリゴヌクレオチド
CA3022877A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of angiogenesis-associated diseases using rna complexes that target angpt2 and pdgfb
US10358648B2 (en) 2016-02-02 2019-07-23 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of atopic dermatitis and asthma using RNA complexes that target IL4Rα, TRPA1, or F2RL1
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
MA45349A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques egfr et leurs utilisations
MA45470A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques kras et leurs utilisations
MA45469A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques de bêta-caténine et leurs utilisations
JP7049262B2 (ja) 2016-04-11 2022-04-06 オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 結合組織成長因子を標的とするｒｎａ複合体を用いた特発性肺胞線維症の治療
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
WO2018022927A1 (en) * 2016-07-27 2018-02-01 BioAxone BioSciences, Inc. TREATMENT OF CNS INJURY WITH RNAi THERAPEUTICS
US11753638B2 (en) 2016-08-12 2023-09-12 University Of Massachusetts Conjugated oligonucleotides
US11246905B2 (en) 2016-08-15 2022-02-15 President And Fellows Of Harvard College Treating infections using IdsD from Proteus mirabilis
JP2019532027A (ja) * 2016-08-17 2019-11-07 ソルスティス バイオロジクス，リミティッド ポリヌクレオチド構築物
IT201600093825A1 (it) * 2016-09-19 2018-03-19 Fondazione St Italiano Tecnologia Composizione farmaceutica di miRNA e suoi usi terapeutici.
US11260134B2 (en) 2016-09-29 2022-03-01 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Double-stranded nucleic acid complex having overhang
CN108070610B (zh) * 2016-11-08 2021-11-09 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 植物基因组定点敲入方法
CN109983013A (zh) 2016-11-18 2019-07-05 帕西拉制药有限公司 美洛昔康锌复合物微粒多囊脂质体制剂及其制备方法
WO2018129364A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Palvella Therapeutics Llc Anhydrous compositions of mtor inhibitors and methods of use
US11230710B2 (en) 2017-01-09 2022-01-25 Aposense Ltd Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
MX2019008413A (es) 2017-01-13 2019-09-13 Univ California Celulas pluripotentes inmunodiseñadas.
KR20190108167A (ko) 2017-02-10 2019-09-23 성균관대학교산학협력단 Rna 간섭을 위한 긴 이중가닥 rna
CA3055715A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nucleic acid capable of inhibiting expression of masp2
US11414660B2 (en) 2017-04-05 2022-08-16 Silence Therapeutics Gmbh Products and compositions
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
WO2018221649A1 (ja) 2017-05-31 2018-12-06 協和発酵キリン株式会社 Ａｐｃｓの発現を抑制する核酸
US11597744B2 (en) 2017-06-30 2023-03-07 Sirius Therapeutics, Inc. Chiral phosphoramidite auxiliaries and methods of their use
US20200215113A1 (en) * 2017-08-07 2020-07-09 Phio Pharmaceuticals Corp. Chemically modified oligonucleotides
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
JP2021502060A (ja) 2017-10-16 2021-01-28 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
BR112020009663A2 (pt) 2017-11-17 2020-11-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. método para a expansão de linfócitos infiltrantes de tumor (tils) em uma população terapêutica de tils, método para o tratamento de um indivíduo com câncer, composição
JP2021503885A (ja) 2017-11-22 2021-02-15 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 末梢血からの末梢血リンパ球（ｐｂｌ）の拡大培養
MX2020005860A (es) 2017-12-06 2020-09-09 Avidity Biosciences Inc Composiciones y metodos de tratamiento de atrofia muscular y distrofia miotonica.
WO2019136459A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
CA3087771A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
WO2019169380A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 The Regents Of The University Of California Stem cell-derived exosomes for the treatment of corneal scarring
EP3773506A4 (en) 2018-03-29 2021-12-22 Technion Research & Development Foundation Limited VESICLES INCLUDING A PTEN INHIBITOR AND THEIR USES
WO2019209956A1 (en) * 2018-04-25 2019-10-31 University Of Massachusetts Artificial exosome composition and related methods
CA3103963A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
WO2020010073A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Palvella Therapeutics, Inc. ANHYDROUS COMPOSITIONS OF mTOR INHIBITORS AND METHODS OF USE
KR20210093227A (ko) 2018-08-10 2021-07-27 유니버시티 오브 매사추세츠 Snp를 표적화하는 변형된 올리고뉴클레오티드
WO2020041769A1 (en) * 2018-08-23 2020-02-27 University Of Massachusetts O-methyl rich fully stabilized oligonucleotides
JOP20210094A1 (ar) 2018-11-05 2023-01-30 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات لإنتاج الخلايا الليمفاوية للورم الارتشاحي واستخداماتها في العلاج المناعي
EP3877511A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
MX2021004953A (es) 2018-11-05 2021-08-11 Iovance Biotherapeutics Inc Seleccion de celulas t reactivas al tumor mejoradas.
EP3876957A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients refractory for anti-pd-1 antibody
TW202028222A (zh) 2018-11-14 2020-08-01 美商Ionis製藥公司 Foxp3表現之調節劑
EP3888663A1 (en) 2018-11-30 2021-10-06 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nucleic acid complex
CA3123392A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
CA3131305A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2020181107A1 (en) * 2019-03-05 2020-09-10 MiRagen Therapeutics, Inc. Microrna mimics and uses thereof
US11162079B2 (en) 2019-05-10 2021-11-02 The Regents Of The University Of California Blood type O Rh-hypo-immunogenic pluripotent cells
US20220249559A1 (en) 2019-05-13 2022-08-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
EP3990627A4 (en) 2019-06-26 2023-07-19 The Regents of The University of California SIRP-ALPHA SILENCED NATURAL KILLER CELLS (NK)
BR112022007795A2 (pt) * 2019-11-06 2022-07-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc Administração extra-hepática
CA3160657A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Phio Pharmaceuticals Corp. Chemically modified oligonucleotides targeting bromodomain containing protein 4 (brd4) for immunotherapy
WO2021118990A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same
WO2021138537A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Phio Pharmaceuticals Corp. Chemically modified oligonucleotides with improved systemic delivery
US11525137B2 (en) 2020-03-19 2022-12-13 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
TW202208617A (zh) 2020-05-04 2022-03-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於產生腫瘤浸潤性淋巴球的過程及其在免疫療法中的用途
TW202208616A (zh) 2020-05-04 2022-03-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 改良之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇
US11459567B2 (en) 2020-06-24 2022-10-04 Patricia Virginia Elizalde Specific siRNA molecules, composition and use thereof for the treatment of triple negative breast cancer
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
EP4225330A1 (en) 2020-10-06 2023-08-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
CA3201818A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Maria Fardis Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
AU2021401302A1 (en) 2020-12-17 2023-07-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
EP4262827A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
BR112023021665A2 (pt) 2021-04-19 2023-12-19 Iovance Biotherapeutics Inc Método para tratar um câncer, e, composição
KR20240001207A (ko) 2021-04-26 2024-01-03 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 막관통 프로테아제, 세린 6(TMPRSS6) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법
IL309334A (en) 2021-06-23 2024-02-01 Univ Massachusetts Anti-FLT1 optimized oligonucleotide compounds for the treatment of preeclampsia and other angiogenic disorders
WO2023009716A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
WO2023015264A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 Phio Pharmaceuticals Corp. Immunotherapy of cancer utilizing natural killer cells treated with chemically modified oligonucleotides
WO2023015265A2 (en) 2021-08-04 2023-02-09 Phio Pharmaceuticals Corp. Chemically modified oligonucleotides
AR127482A1 (es) 2021-10-27 2024-01-31 Iovance Biotherapeutics Inc Sistemas y métodos para coordinar la fabricación de células para inmunoterapia específica de paciente
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
CN114767703B (zh) * 2022-06-20 2022-09-02 山东恺悌生物制品有限公司 miR-4311模拟物在制备肺癌治疗药物中的应用
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005019430A2 (en) * 2003-08-22 2005-03-03 Research Development Foundation In vitro selection of aptamer beacons
WO2005079533A2 (en) * 2004-02-17 2005-09-01 University Of Massachusetts Methods and compositions for mediating gene silencing
US20080020990A1 (en) * 2003-05-30 2008-01-24 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Oligo Double-Stranded Rna Inhibiting the Expression of Bcl-2 and Pharmaceutical Composition Containing the Same
WO2008036825A2 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference

Family Cites Families (443)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
DE2010115A1 (de) 1970-03-04 1971-09-16 Farbenfabriken Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur Herstellung von Mikrogranulaten
JPS523342B2 (zh) 1972-01-26 1977-01-27
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4201860A (en) 1978-05-09 1980-05-06 Bristol-Myers Company Purine derivatives
US4384975A (en) 1980-06-13 1983-05-24 Sandoz, Inc. Process for preparation of microspheres
US4389330A (en) 1980-10-06 1983-06-21 Stolle Research And Development Corporation Microencapsulation process
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) * 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
JPS60100516A (ja) 1983-11-04 1985-06-04 Takeda Chem Ind Ltd 徐放型マイクロカプセルの製造法
US5643889A (en) 1984-07-11 1997-07-01 Temple University-Of The Commonwealth System Of Pennsylvania Cholesterol conjugates of 2'5'-oligoadenylate derivatives and antiviral uses thereof
US5700785A (en) 1984-07-11 1997-12-23 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education 3'-deoxy or 3'-O-substituted-2',5'-oligoadenylates as antiviral agents
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US6005094A (en) 1986-10-28 1999-12-21 Genta Incorporated Oligonucleotide analogues having improved stability at acid pH
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
ATE151467T1 (de) 1987-11-30 1997-04-15 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5750666A (en) 1988-05-26 1998-05-12 Competitve Technologies, Inc. Polynucleotide phosphorodithioate compounds
US5149782A (en) 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
EP0471036B2 (en) 1989-05-04 2004-06-23 Southern Research Institute Encapsulation process
US5051257A (en) 1989-05-09 1991-09-24 Pietronigro Dennis D Antineoplastic solution and method for treating neoplasms
US5162115A (en) 1989-05-09 1992-11-10 Pietronigro Dennis D Antineoplastic solution and method for treating neoplasms
ZA902710B (en) 1989-05-22 1991-12-24 Univ Georgia Res Found Enzyme luminescence assay
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
JPH0383914A (ja) 1989-08-18 1991-04-09 W R Grace & Co ドラッグキャリアー
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
ATE190981T1 (de) 1989-10-24 2000-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte nukleotide
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5495009A (en) 1989-10-24 1996-02-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs containing thioformacetal linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US6395492B1 (en) 1990-01-11 2002-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US6399754B1 (en) 1991-12-24 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5670633A (en) * 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5514786A (en) 1990-01-11 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting RNA activity
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US6358931B1 (en) 1990-01-11 2002-03-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating RNA
US5914396A (en) 1990-01-11 1999-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-modified nucleosides and phosphoramidites
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5658731A (en) 1990-04-09 1997-08-19 Europaisches Laboratorium Fur Molekularbiologie 2'-O-alkylnucleotides as well as polymers which contain such nucleotides
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
EP0544824B1 (en) 1990-07-27 1997-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
DK0549615T3 (da) 1990-08-13 2006-07-03 Isis Pharmaceuticals Inc Sukkermodificerede oligonukleotider der påviser og modulerer genekspression
US6262241B1 (en) 1990-08-13 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compound for detecting and modulating RNA activity and gene expression
JP3256539B2 (ja) 1990-08-28 2002-02-12 エポック・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 連結分子を介する３’―尾分子付オリゴヌクレオチドの固体支持体合成
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
JP3507486B2 (ja) 1991-03-15 2004-03-15 アムジエン・インコーポレーテツド 顆粒球コロニー刺激因子の肺内投与
WO1994008003A1 (en) 1991-06-14 1994-04-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5214135A (en) 1991-08-30 1993-05-25 Chemgenes Corporation N-protected-2'-O-methyl-ribonucleosides and N-protected 2'-O-methyl-3'-cyanoethyl-N-,N-diisopropyl phosphoramidite ribonucleosides
US5770209A (en) * 1991-08-30 1998-06-23 University Of South Florida Acceleration of wound healing using connective tissue growth factor
US5525719A (en) 1991-08-30 1996-06-11 Chemgenes Corporation N-protected-2'-O-methyl-and N-protected-3'-O-methyl-ribonucleosides and their phosphoramidite derivatives
US7384634B2 (en) * 1991-08-30 2008-06-10 University Of South Florida Connective tissue growth factor
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5607923A (en) 1991-10-15 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating cytomegalovirus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5599797A (en) 1991-10-15 1997-02-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5661134A (en) 1991-10-15 1997-08-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5856455A (en) 1991-12-24 1999-01-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2'-modified oligonucleotides
NZ245720A (en) 1992-01-22 1995-12-21 Hoechst Ag Oligonucleotide analogues; use as gene expression inhibitor or dna probe
US6113946A (en) 1992-04-03 2000-09-05 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5817781A (en) 1992-06-01 1998-10-06 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages (II)
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
CA2159350A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sudhir Agrawal Modified oligonucleotides having improved anti-influenza activity
CA2159629A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
FR2705099B1 (fr) 1993-05-12 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation.
DE59407895D1 (de) 1993-05-12 1999-04-15 Novartis Ag Nukleoside und Oligonukleotide mit 2'-Ethergruppen
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US5428149A (en) 1993-06-14 1995-06-27 Washington State University Research Foundation Method for palladium catalyzed carbon-carbon coulping and products
US5580972A (en) 1993-06-14 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Purine nucleoside modifications by palladium catalyzed methods
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5532130A (en) 1993-07-20 1996-07-02 Dyad Pharmaceutical Corporation Methods and compositions for sequence-specific hybridization of RNA by 2'-5' oligonucleotides
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5614621A (en) 1993-07-29 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing oligonucleotides using silyl-containing diamino phosphorous reagents
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
US5808036A (en) 1993-09-01 1998-09-15 Research Corporation Technologies Inc. Stem-loop oligonucleotides containing parallel and antiparallel binding domains
ATE227342T1 (de) 1993-09-02 2002-11-15 Ribozyme Pharm Inc Enzymatische nukleiksaüre die nicht-nukleotide enthaltet
EP0728139B1 (en) 1993-09-03 2003-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
GB9320782D0 (en) 1993-10-08 1993-12-01 Univ Leeds Innovations Ltd Stabilising of proteins on solution
AU8088694A (en) 1993-10-27 1995-05-22 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-amido and 2'-peptido modified oligonucleotides
WO1995013833A1 (en) 1993-11-16 1995-05-26 Genta Incorporated Synthetic oligomers having phosphonate internucleosidyl linkages of undefined chirality mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
US6060456A (en) 1993-11-16 2000-05-09 Genta Incorporated Chimeric oligonucleoside compounds
US20030130324A1 (en) 1993-11-19 2003-07-10 Johnston W. Mcavoy Method for preventing or controlling cataract
JPH09510954A (ja) 1993-12-17 1997-11-04 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティー エイコサノイド生成を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
DE69500618D1 (de) 1994-02-18 1997-10-02 Hybridon Inc Oligonukleotide mit wirkung gegen das respiratorische synzytial virus
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5646126A (en) 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5651981A (en) 1994-03-29 1997-07-29 Northwestern University Cationic phospholipids for transfection
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5777153A (en) 1994-07-08 1998-07-07 Gilead Sciences, Inc. Cationic lipids
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5681940A (en) 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
US5767099A (en) 1994-12-09 1998-06-16 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing amino acid or dervatized amino acid groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5948767A (en) 1994-12-09 1999-09-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphile/DNA complexes
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
AUPN166195A0 (en) 1995-03-13 1995-04-06 Norvet Research Pty Limited Process for glucan extraction
US5674683A (en) 1995-03-21 1997-10-07 Research Corporation Technologies, Inc. Stem-loop and circular oligonucleotides and method of using
WO1996033761A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Medtronic, Inc. Intraparenchymal infusion catheter system
US6420549B1 (en) 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
US5851548A (en) 1995-06-07 1998-12-22 Gen-Probe Incorporated Liposomes containing cationic lipids and vitamin D
US5976567A (en) 1995-06-07 1999-11-02 Inex Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
AU5979296A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6221911B1 (en) * 1995-06-07 2001-04-24 Karo Bio Ab Uses for thyroid hormone compounds or thyroid hormone-like compounds
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
WO1997014709A1 (en) 1995-10-13 1997-04-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Antisense oligomers
US5734041A (en) 1995-10-20 1998-03-31 Mcgill University Preparation of chiral phosphorothioate oligomers
US5705621A (en) 1995-11-17 1998-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric phosphite, phosphodiester, Phosphorothioate and phosphorodithioate compounds and intermediates for preparing same
US6344436B1 (en) 1996-01-08 2002-02-05 Baylor College Of Medicine Lipophilic peptides for macromolecule delivery
US5684143A (en) 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
US6331617B1 (en) 1996-03-21 2001-12-18 University Of Iowa Research Foundation Positively charged oligonucleotides as regulators of gene expression
US6299895B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Neurotech S.A. Device and method for treating ophthalmic diseases
US5735814A (en) 1996-04-30 1998-04-07 Medtronic, Inc. Techniques of treating neurodegenerative disorders by brain infusion
US6444806B1 (en) 1996-04-30 2002-09-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Conjugates and methods of forming conjugates of oligonucleotides and carbohydrates
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US6506564B1 (en) 1996-07-29 2003-01-14 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US5789416B1 (en) 1996-08-27 1999-10-05 Cv Therapeutics Inc N6 mono heterocyclic substituted adenosine derivatives
US6111085A (en) 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US6977244B2 (en) * 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
FR2755976B1 (fr) 1996-11-15 1999-01-15 Idm Immuno Designed Molecules Nouveaux complexes d'acides nucleiques et de polymere substitue par des residus entrainant la destabilisation des membranes cellulaires
US6248878B1 (en) 1996-12-24 2001-06-19 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside analogs
US7789841B2 (en) 1997-02-06 2010-09-07 Exogen, Inc. Method and apparatus for connective tissue treatment
US5955594A (en) 1997-04-30 1999-09-21 Mishra; Lopa Nucleic acids encoding proteins for early liver development
AU733310C (en) 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
DE69834038D1 (de) 1997-07-01 2006-05-18 Isis Pharmaceutical Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US6025140A (en) 1997-07-24 2000-02-15 Perseptive Biosystems, Inc. Membrane-permeable constructs for transport across a lipid membrane
CN100391542C (zh) 1997-09-15 2008-06-04 遗传免疫有限公司 向抗原呈递细胞递送基因的药物组合物及其用途
US6028183A (en) 1997-11-07 2000-02-22 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives and oligonucleotides containing same
US6432963B1 (en) 1997-12-15 2002-08-13 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Pyrimidine-5-carboxamide derivatives
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AU1682699A (en) * 1997-12-25 1999-07-19 Japan Tobacco Inc. Monoclonal antibody against connective tissue growth factor and medicinal uses thereof
US6020475A (en) 1998-02-10 2000-02-01 Isis Pharmeuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
AU3751299A (en) 1998-04-20 1999-11-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression
EP1469009A2 (en) 1998-05-21 2004-10-20 Isis Parmaceuticals, Inc. Compositions and methods for non-parenteral delivery of oligonucleotides
US20040241845A1 (en) 1998-05-22 2004-12-02 Luc Desgroseillers Mammalian staufen and use thereof
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6277967B1 (en) 1998-07-14 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
AU747597B2 (en) 1998-07-20 2002-05-16 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
US6271358B1 (en) 1998-07-27 2001-08-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. RNA targeted 2′-modified oligonucleotides that are conformationally preorganized
US6378526B1 (en) 1998-08-03 2002-04-30 Insite Vision, Incorporated Methods of ophthalmic administration
US20040009938A1 (en) * 1998-08-07 2004-01-15 Muthiah Manoharan Methods of enhancing renal uptake of oligonucleotides
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
US6344323B1 (en) 1998-09-16 2002-02-05 Vitagenix, Inc. Compositions and methods for inhibiting cox-2 expression and treating cox-2 associated disorders by using cox-2 antisense oligonucleotides
US6020483A (en) 1998-09-25 2000-02-01 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside modifications by palladium catalyzed methods
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6475490B1 (en) 1998-10-19 2002-11-05 Fordham University Compositions and methods for promoting tissue repair using heat shock proteins
US6328765B1 (en) 1998-12-03 2001-12-11 Gore Enterprise Holdings, Inc. Methods and articles for regenerating living tissue
CN1187370C (zh) * 1998-12-14 2005-02-02 迈阿密大学 结缔组织生长因子片段及其方法和用途
US7115390B1 (en) * 1998-12-14 2006-10-03 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor fragments and methods and uses thereof
US6455586B1 (en) 1998-12-15 2002-09-24 Leonard L. Kaplan Topical immunomodulating compositions for treatment of aids, Hepatitis B & C, other infectious diseases, and cancer
EP1621212B1 (en) 1999-01-27 2011-11-16 Coda Therapeutics, Inc. Formulations comprising antisense nucleotides to connexins
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
US6207819B1 (en) 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
IL144338A0 (en) 1999-02-12 2002-05-23 Sankyo Co Nucleoside and oligonucleotide analogues and pharmaceutical compositions containing the same
WO2000050050A1 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Multiparticulate formulation
US6121437A (en) 1999-03-16 2000-09-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphate and thiophosphate protecting groups
US20020049173A1 (en) 1999-03-26 2002-04-25 Bennett C. Frank Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6706491B1 (en) * 1999-04-09 2004-03-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by p21
US6492497B1 (en) 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
US6033910A (en) 1999-07-19 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of MAP kinase kinase 6 expression
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US6331313B1 (en) 1999-10-22 2001-12-18 Oculex Pharmaceticals, Inc. Controlled-release biocompatible ocular drug delivery implant devices and methods
GB9925459D0 (en) 1999-10-27 1999-12-29 Plant Bioscience Ltd Gene silencing
JP2001206899A (ja) * 1999-11-18 2001-07-31 Japan Tobacco Inc ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
US20040072785A1 (en) 1999-11-23 2004-04-15 Wolff Jon A. Intravascular delivery of non-viral nucleic acid
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
DE10160151A1 (de) 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
US7098030B2 (en) 1999-12-31 2006-08-29 Mirus Bio Corporation Polyampholytes for delivering polyions to a cell
US20050032733A1 (en) * 2001-05-18 2005-02-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SiNA)
AU2001245793A1 (en) 2000-03-16 2001-09-24 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for rna interference
EP2028278B1 (en) 2000-03-30 2014-03-19 Whitehead Institute For Biomedical Research RNA sequence-specific mediators of RNA interference
US7108721B2 (en) 2000-05-11 2006-09-19 Massachusetts Institute Of Technology Tissue regrafting
US7175844B2 (en) * 2000-07-18 2007-02-13 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of modulating fibrosis
CA2416442C (en) 2000-07-24 2010-06-08 Krenitsky Pharmaceuticals, Inc. Substituted 5-alkynyl pyrimidines having neurotrophic activity
US6346416B1 (en) 2000-08-29 2002-02-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of HPK/GCK-like kinase expression
US6794137B2 (en) 2000-09-08 2004-09-21 New York University Gene markers useful for detecting skin damage in response to ultraviolet radiation
US6559279B1 (en) 2000-09-08 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds
US6753321B2 (en) * 2000-09-15 2004-06-22 Genvec, Inc. Method of modulating neovascularization
US20020081736A1 (en) 2000-11-03 2002-06-27 Conroy Susan E. Nucleic acid delivery
US20020132788A1 (en) 2000-11-06 2002-09-19 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
DK2813582T3 (en) * 2000-12-01 2017-07-31 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wss E V Small RNA molecules that mediate RNA interference
FR2818642B1 (fr) 2000-12-26 2005-07-15 Hoechst Marion Roussel Inc Nouveaux derives de la purine, leur procede de preparation, leur application a titre de medicaments, compositions pharmaceutiques et nouvelle utilistion
CA2433680A1 (en) 2000-12-28 2002-08-01 Gregory M Arndt Double-stranded rna-mediated gene suppression
DE10100127A1 (de) 2001-01-03 2002-10-02 Henkel Kgaa Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut
US7507724B2 (en) 2001-01-16 2009-03-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US7906492B2 (en) 2001-01-16 2011-03-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US7044945B2 (en) * 2001-03-30 2006-05-16 Sand Bruce J Prevention of regression in thermal ciliary muscle tendinoplasty
US20030077829A1 (en) 2001-04-30 2003-04-24 Protiva Biotherapeutics Inc.. Lipid-based formulations
GB0111279D0 (en) * 2001-05-10 2001-06-27 Nycomed Imaging As Radiolabelled liposomes
CA2526831C (en) 2001-05-18 2012-07-31 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (sina)
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20070032441A1 (en) 2001-05-18 2007-02-08 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (sina)
WO2003070884A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20050239731A1 (en) 2001-05-18 2005-10-27 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of MAP kinase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1404698A4 (en) 2001-06-21 2004-12-22 Isis Pharmaceuticals Inc ANTI-SENSE MODULATION OF SOLUBLE SUPEROXIDE DISMUTASE 1 EXPRESSION
US20050019915A1 (en) 2001-06-21 2005-01-27 Bennett C. Frank Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
DE10131458A1 (de) * 2001-06-29 2003-01-09 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Therapie von Alterungsprozessen des Herz-Kreislauf Systems
US20030158403A1 (en) * 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
DE10133858A1 (de) 2001-07-12 2003-02-06 Aventis Pharma Gmbh Synthetische doppelsträngige Oligonucleotide zur gezielten Hemmung der Genexpression
AU2002329667A1 (en) 2001-07-30 2003-02-17 Uta Griesenbach Specific inhibition of gene expression by small double stranded rnas
WO2003024308A2 (en) * 2001-09-18 2003-03-27 Fibrogen, Inc. Methods of assaying connective tissue growth factor
EP1438413A4 (en) * 2001-10-03 2006-06-07 Selective Genetics Inc CROSSING OF NUCLEIC ACID MOLECULES IN A FLUID SPACE AND EXPRESSION IN REPAIR CELLS
WO2003035876A1 (de) * 2001-10-26 2003-05-01 Ribopharma Ag Verwendung einer doppelsträngigen ribonukleinsäure zur behandlung einer infektion mit einem (+)-strang-rna-virus
JP2005512976A (ja) 2001-10-26 2005-05-12 リボファーマ アーゲー Ｒｎａ干渉により線維化疾患を処置するための医薬
AU2002368202B2 (en) 2001-11-02 2008-06-05 Insert Therapeutics, Inc Methods and compositions for therapeutic use of RNA interference
US20040063654A1 (en) 2001-11-02 2004-04-01 Davis Mark E. Methods and compositions for therapeutic use of RNA interference
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
ATE526041T1 (de) 2001-12-11 2011-10-15 Fibrogen Inc Verfahren zur hemmung okularer vorgänge
WO2003064621A2 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Ambion, Inc. HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
WO2003064441A2 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Mcgill University Oligonucleotides comprising alternating segments and uses thereof
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
EP2221377B2 (en) 2002-02-01 2017-05-17 Life Technologies Corporation Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency
US6923833B2 (en) 2002-04-09 2005-08-02 Ray C. Wasielewski Biologically reabsorbable acetabular constraining components and materials for use with a hip replacement prosthesis and bioreabsorbable materials to augment hip replacement stability and function
EP1495121A2 (en) 2002-04-18 2005-01-12 Lynkeus Biotech GmbH Means and methods for the specific inhibition of genes in cells and tissue of the cns and/or eye
WO2003099840A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having modified nucleoside units
FR2840217B1 (fr) 2002-06-03 2005-06-24 Oreal Compositions cosmetiques comprenant au moins un oligonucleotide d'arn double brin (dsrna)et leurs utilisations
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
SI3222724T1 (sl) 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
DE10238298A1 (de) 2002-08-21 2004-03-04 Beiersdorf Ag Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden zur Behandlung von degenerativen Hauterscheinungen
AU2003273336A1 (en) 2002-09-18 2004-04-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Efficient reduction of target rna's by single- and double-stranded oligomeric compounds
WO2004029212A2 (en) * 2002-09-25 2004-04-08 University Of Massachusetts In vivo gene silencing by chemically modified and stable sirna
AU2003279004B2 (en) 2002-09-28 2009-10-08 Massachusetts Institute Of Technology Influenza therapeutic
US20060035344A1 (en) 2002-10-18 2006-02-16 Pachuk Catherine J Double-stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
US7309361B2 (en) 2002-10-23 2007-12-18 Wasielewski Ray C Biologic modular tibial and femoral component augments for use with total knee arthroplasty
EP1575574A4 (en) 2002-10-30 2007-11-07 Blood Res Center METHOD FOR TREATING AND PREVENTING APOPTOSIS-BASED DISEASES BY MEANS OF RNA INTERFERENCE AGENTS
EP1562970A4 (en) 2002-11-01 2006-04-12 Univ Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING HIF-1 ALPHA WITH ARNS
US7892793B2 (en) 2002-11-04 2011-02-22 University Of Massachusetts Allele-specific RNA interference
AU2003290586B2 (en) 2002-11-04 2009-07-02 University Of Massachusetts Allele-specific RNA interference
US9150605B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
ES2440284T3 (es) * 2002-11-14 2014-01-28 Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc. ARNip dirigido a tp53
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
DE10254214A1 (de) 2002-11-20 2004-06-09 Beiersdorf Ag Oligoribonukleotide zur Behandlung von degenerativen Hauterscheinungen durch RNA-Interferenz
CA2506714A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 University Of Massachusetts Delivery of sirnas
WO2004065600A2 (en) 2003-01-17 2004-08-05 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference by palindromic or modified rna molecules
EP1606301A4 (en) 2003-01-21 2006-06-14 Archemix Corp APTAMERIC THERAPEUTICS FOR MEDICINAL THERAPY FOR EYES
DE10302421A1 (de) 2003-01-21 2004-07-29 Ribopharma Ag Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit
AU2004211949A1 (en) * 2003-02-05 2004-08-26 University Of Massachusetts RNAi targeting of viruses
US20060247193A1 (en) * 2003-02-10 2006-11-02 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Regulation of gene expression by dna interference
US20040162235A1 (en) 2003-02-18 2004-08-19 Trubetskoy Vladimir S. Delivery of siRNA to cells using polyampholytes
US20040167090A1 (en) 2003-02-21 2004-08-26 Monahan Sean D. Covalent modification of RNA for in vitro and in vivo delivery
WO2004078950A2 (en) 2003-03-05 2004-09-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTIVE RNAi MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION IN MAMMAL CELLS
US6962331B2 (en) 2003-03-06 2005-11-08 Canon Kabushiki Kaisha Sheet stacking apparatus
EP2216407B1 (en) 2003-03-07 2016-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
EP1608733B1 (en) 2003-04-02 2011-12-07 Dharmacon, Inc. Modified polynucleotides for use in rna interference
WO2004094595A2 (en) * 2003-04-17 2004-11-04 Alnylam Pharmaceuticals Inc. MODIFIED iRNA AGENTS
WO2004099372A2 (en) 2003-05-01 2004-11-18 University Of Florida Anti-scarring ribozymes and methods
US20060178327A1 (en) * 2003-05-30 2006-08-10 Yeung Wah Hin A Inhibition of gene expression by delivery of specially selected double stranded or other forms of small interfering RNA precursors enabling the formation and function of small interfering RNA in vivo and in vitro
US7750144B2 (en) 2003-06-02 2010-07-06 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNA silencing
US8309704B2 (en) 2003-06-02 2012-11-13 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNAi
US7405274B2 (en) * 2003-06-04 2008-07-29 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor antibodies
GB2417727B (en) 2003-06-13 2008-01-16 Alnylam Europe Ag Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
US20050026823A1 (en) 2003-06-20 2005-02-03 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
AU2004257373B2 (en) 2003-07-16 2011-03-24 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
WO2005024033A2 (en) 2003-09-11 2005-03-17 Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Lübeck Nucleotide sequences promoting the trans-membrane transport of nucleic acids
US7803397B2 (en) 2003-09-15 2010-09-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
EP1687410A4 (en) 2003-10-07 2008-04-09 Isis Pharmaceuticals Inc ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES OPTIMIZED TO TARGET THE KIDNEY
BRPI0416920A (pt) 2003-11-24 2007-01-23 Canji Inc redução de cicatriz dérmica
US8034789B2 (en) 2003-12-03 2011-10-11 Coda Therapeutics, Inc. Antisense compounds targeted to connexins and methods of use thereof
US20080254487A1 (en) 2004-01-16 2008-10-16 Fibrogen, Inc. Connective Tissue Growth Factor Signaling
EP2123759B1 (en) 2004-02-06 2014-01-15 Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc. Stabilized RNAS as transfection controls and silencing reagents
WO2005078096A2 (en) 2004-02-09 2005-08-25 University Of Massachusetts Dual functional oligonucleotides for use in repressing mutant gene expression
WO2005080582A1 (ja) 2004-02-20 2005-09-01 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 細胞質局在化ｄｎａ及びｒｎａ
EP1737956A2 (en) 2004-03-01 2007-01-03 Massachusetts Institute of Technology Rnai-based therapeutics for allergic rhinitis and asthma
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
WO2005098041A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 University Of Florida Research Foundation, Inc. Detection and treatment of fibrotic disorders
KR101147147B1 (ko) * 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
WO2005096781A2 (en) 2004-04-06 2005-10-20 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating gain-of-function disorders using rna interference
US20050265957A1 (en) 2004-04-08 2005-12-01 Monahan Sean D Polymerized formamides for use in delivery of compounds to cells
CA2564616C (en) * 2004-04-20 2016-08-30 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Methods and compositions for enhancing delivery of double-stranded rna or a double-stranded hybrid nucleic acid to regulate gene expression in mammalian cells
US8168600B2 (en) 2004-04-23 2012-05-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for topical delivery of oligonucleotides
EP1784501B1 (en) 2004-05-14 2015-11-18 Rosetta Genomics Ltd VIRAL AND VIRUS ASSOCIATED MicroRNAS AND USES THEREOF
PT1753529E (pt) 2004-05-20 2013-11-18 Eden Research Plc Composições contendo uma partícula oca de glucano ou uma partícula de parede celular encapsulando um componente de terpeno, e métodos para a sua produção e utilização
EP1765415A4 (en) * 2004-06-03 2010-03-24 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGOMERIC COMPOUNDS FACILITATING THE "RISC" LOAD
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
US7740861B2 (en) 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
PT1781787T (pt) 2004-08-23 2017-07-17 Sylentis Sau Tratamento de distúrbios oculares caracterizados por uma pressão intraocular elevada por meio de arnsis
US20060211766A1 (en) 2004-09-30 2006-09-21 Kaplan Leonard L Gelled immunomodulating topical compositions and a method of treating warts and other human papilloma virus skin infections
US8138161B2 (en) 2004-10-01 2012-03-20 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Modified small interfering RNA molecules and methods of use
AU2005311684A1 (en) 2004-12-02 2006-06-08 University Of Massachusetts Glucose-transport related genes, polypeptides, and methods of use thereof
US20100069620A1 (en) * 2004-12-02 2010-03-18 Rxi Pharmaceuticals Corp. Novel compositions of chemically modified small interfering rna
CN101242834A (zh) 2004-12-15 2008-08-13 默克公司 Akt活性抑制剂
US20060229268A1 (en) 2004-12-16 2006-10-12 Alsgen, Llc Small interference RNA (siRNA) molecules for modulating superoxide dismutase (SOD)
TWI386225B (zh) 2004-12-23 2013-02-21 Alcon Inc 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子（ＣＴＧＦ）ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制技術
US20060142228A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Ambion, Inc. Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference
US20060171943A1 (en) 2005-02-01 2006-08-03 Amgen Inc. Compositions and methods of treating fibrotic disorders
JP2008536874A (ja) * 2005-04-15 2008-09-11 ボード オブ リージェンツ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム 中性脂質組成物によるｓｉＲＮＡの送達
WO2006128141A2 (en) 2005-05-27 2006-11-30 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (sdf-1) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
RS53329B (en) 2005-06-09 2014-10-31 Meda Ab PROCEDURE AND MIXTURE FOR TREATMENT OF INFLAMMATORY DISORDERS
AU2006280600B2 (en) 2005-08-17 2012-01-19 Bioneer Corporation Sirna-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of siRNA and method thereof
EP1937066A4 (en) 2005-08-18 2008-12-24 Alnylam Pharmaceuticals Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF NERVOUS DISEASES
US20090018097A1 (en) 2005-09-02 2009-01-15 Mdrna, Inc Modification of double-stranded ribonucleic acid molecules
US20090209624A1 (en) 2005-10-24 2009-08-20 University Of Massachusetts Compositions and their uses for gene therapy of bone conditions
FR2894582B1 (fr) 2005-12-12 2008-02-22 Fabre Pierre Dermo Cosmetique Sirna anti myosine va et depigmentation de la peau
EP1968643A2 (en) 2005-12-16 2008-09-17 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering of nucleic acids into a cell
US20120115923A1 (en) * 2005-12-30 2012-05-10 Intradigm Corporation Sirna Compositions Promoting Scar-Free Wound Healing of Skin and Methods for Wound Treatment
US7825099B2 (en) 2006-01-20 2010-11-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
WO2007084797A1 (en) 2006-01-23 2007-07-26 Abbott Laboratories Chemically modified polycation polymer for sirna delivery
WO2007089607A2 (en) 2006-01-26 2007-08-09 University Of Massachusetts Rna silencing agents for use in therapy and nanotransporters for efficient delivery of same
JP5244087B2 (ja) 2006-03-23 2013-07-24 サンタリス ファーマ アー／エス 低分子内部セグメント化干渉ｒｎａ
MY162210A (en) 2006-04-03 2017-05-31 Roche Innovation Ct Copenhagen As Pharmaceutical composition
AU2007253909B2 (en) 2006-05-05 2012-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of GCCR
EP2584048B1 (en) 2006-05-11 2014-07-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene
WO2007146953A2 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Exegenics, Inc., D/B/A Opko Health, Inc. Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
LT2712618T (lt) 2006-06-23 2017-02-27 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd. Vaistų, terapinių nukleorūgščių ir funkcinių nukleorūgščių tikslinis įvedimas į žinduolio ląsteles per nepažeistas žuvusias bakterines ląsteles
US20080039415A1 (en) 2006-08-11 2008-02-14 Gregory Robert Stewart Retrograde transport of sirna and therapeutic uses to treat neurologic disorders
CA2660842C (en) 2006-08-18 2012-03-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
US20080193443A1 (en) * 2006-10-30 2008-08-14 Oxana Beskrovnaya Methods and compositions for the treatment of polycystic diseases
US8039010B2 (en) 2006-11-03 2011-10-18 Allergan, Inc. Sustained release intraocular drug delivery systems comprising a water soluble therapeutic agent and a release modifier
JP2010511692A (ja) 2006-12-05 2010-04-15 アイゲート ファーマ エスエーエス イオントフォレシスを通じての核酸の強化された網膜送達
US20090010948A1 (en) 2006-12-15 2009-01-08 The University Of Hong Kong Anti-tumor vaccines delivered by dendritic cells devoid of interleukin-10
US8530436B2 (en) 2007-01-29 2013-09-10 Transderm, Inc. Methods and compositions for transdermal delivery of nucleotides
WO2008109353A1 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting map2k gene expression and uses thereof
US20080311040A1 (en) 2007-03-06 2008-12-18 Flagship Ventures METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVED THERAPEUTIC EFFECTS WITH siRNA
WO2008124634A1 (en) * 2007-04-04 2008-10-16 Massachusetts Institute Of Technology Polymer-encapsulated reverse micelles
WO2009005813A1 (en) 2007-07-02 2009-01-08 Wyeth Modulators of axl for use in treating bone disorders
US9884899B2 (en) 2007-07-06 2018-02-06 Promedior, Inc. Methods for treating fibrosis using CRP antagonists
JP5241718B2 (ja) 2007-08-06 2013-07-17 千寿製薬株式会社 ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α発現阻害物質含有医薬
WO2009020344A2 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Postech Acad Ind Found Small interfering rnas (sirnas) controlling multiple target genes and method for preparing the same
US20090069623A1 (en) * 2007-08-21 2009-03-12 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Methods and compositions for treatment or prevention of radiation-induced fibrosis
EP2193140B1 (en) 2007-08-27 2016-11-02 1Globe Health Institute LLC Compositions of asymmetric interfering rna and uses thereof
CA2702028A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-09 Rxi Pharmaceuticals Corp. Tripartite rnai constructs
JP5646997B2 (ja) 2007-10-03 2014-12-24 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 新規ｓｉＲＮＡ構造
JP6035010B2 (ja) * 2007-10-04 2016-11-30 ロシュ・イノベーション・センター・コペンハーゲン・アクティーゼルスカブＲｏｃｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ａ／Ｓ マイクロｍｉｒ
US7935816B2 (en) 2007-10-25 2011-05-03 Gene Tools, Llc Molecular transporter compositions comprising dendrimeric oligoguanidine with a triazine core that facilitate delivery into cells in vivo
US20090247608A1 (en) 2007-12-04 2009-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting Lipids
KR100949791B1 (ko) 2007-12-18 2010-03-30 이동기 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도
EP2242854A4 (en) 2008-01-15 2012-08-15 Quark Pharmaceuticals Inc COMPOUNDS AND USES THEREOF
US10131904B2 (en) 2008-02-11 2018-11-20 Rxi Pharmaceuticals Corporation Modified RNAi polynucleotides and uses thereof
WO2009109665A1 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
CA2721183C (en) 2008-04-11 2019-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
CA2729834A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Aspreva International Ltd. Formulations for treating eye disorders
US20110218334A1 (en) 2008-07-11 2011-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PHOSPHOROTHIOATE OLIGONUCLEOTIDES AND NON-NUCLEOSIDIC PHOSPHOROTHIOATES AS DELIVERY AGENTS FOR iRNA AGENTS
CA2728467A1 (en) 2008-07-15 2010-01-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for inhibiting expression of tgf-beta receptor genes
WO2010008582A2 (en) * 2008-07-18 2010-01-21 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell drug delivery system
CA2731779A1 (en) 2008-07-24 2010-01-28 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rnai constructs and uses therof
KR101877698B1 (ko) * 2008-08-25 2018-07-12 엑스칼리아드 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 결합 조직 성장 인자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 그의 용도
WO2010027830A2 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulation of connective tissue growth factor expression by administering antisense oligonucleotides through a delivery system so as to reduce scarring from wound healing and threat fibrotic diseases
ES2657696T3 (es) 2008-08-25 2018-03-06 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Método para reducir la cicatrización durante la curación de una herida utilizando compuestos antisentido dirigidos al CTGF
US8946172B2 (en) 2008-08-25 2015-02-03 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Method for reducing scarring during wound healing using antisense compounds directed to CTGF
AU2009293658A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 James Cardia Reduced size self-delivering RNAi compounds
US20110288147A1 (en) 2008-09-22 2011-11-24 Bob Dale Brown Compositions and methods for the specific inhibition of gene expression by DSRNA containing a tetraloop
EP2346883B1 (en) 2008-09-23 2016-03-23 Scott G. Petersen Self delivering bio-labile phosphate protected pro-oligos for oligonucleotide based therapeutics and mediating rna interference
US8822425B2 (en) 2008-11-14 2014-09-02 Antisense Pharma Gmbh Dosage of oligonucleotides suitable for the treatment of tumors
US9074211B2 (en) * 2008-11-19 2015-07-07 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of MAP4K4 through RNAI
US8470792B2 (en) 2008-12-04 2013-06-25 Opko Pharmaceuticals, Llc. Compositions and methods for selective inhibition of VEGF
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
WO2010135207A1 (en) 2009-05-16 2010-11-25 Agave Pharma, Incorporated Compositions comprising cationic amphiphiles and colipids for delivering therapeutics molecules
US8486909B2 (en) * 2009-06-24 2013-07-16 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory disorders and fibrotic disease
JP2013506697A (ja) 2009-10-06 2013-02-28 アンジオケム インコーポレーテッド 治療薬を輸送するための組成物と方法
EP2542058B1 (en) 2010-03-02 2018-10-10 RXi Pharmaceuticals Corporation Effective sensitizing dose of a gelled immunomodulating topical composition
WO2011109698A1 (en) 2010-03-04 2011-09-09 Rxi Pharmaceuticals Corporation Formulations and methods for targeted delivery to phagocyte cells
EP2550000A4 (en) 2010-03-24 2014-03-26 Advirna Inc RNAI COMPOUNDS OF REDUCED SIZE ADMINISTERING
EP2550001B1 (en) 2010-03-24 2019-05-22 Phio Pharmaceuticals Corp. Rna interference in ocular indications
CN103108642B (zh) 2010-03-24 2015-09-23 雷克西制药公司 皮肤与纤维化症候中的rna干扰
WO2012040101A1 (en) 2010-09-21 2012-03-29 University Of Miami Compositions and methods for inducing migration by dendritic cells and an immune response
US9283271B2 (en) 2010-12-17 2016-03-15 Neurimmune Holding Ag Human anti-SOD1 antibodies
AU2012212110A1 (en) 2011-02-02 2013-08-01 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Method of treating keloids or hypertrophic scars using antisense compounds targeting connective tissue growth factor (CTGF)
US20140072613A1 (en) 2012-09-10 2014-03-13 Cynthia Lander Compositions and Methods for Treating Cutaneous Scarring
EP3004170A1 (en) 2013-05-28 2016-04-13 VIB vzw Single domain antibodies against sod1 and their use in medicine
PL3702466T3 (pl) 2013-08-27 2023-04-24 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Produkty i sposoby do leczenia stwardnienia zanikowego bocznego
EP3043826A4 (en) 2013-09-13 2017-05-24 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
CN113151180A (zh) 2013-12-02 2021-07-23 菲奥医药公司 癌症的免疫治疗
EP3077050B1 (en) 2013-12-04 2020-10-21 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treatment of wound healing utilizing chemically modified oligonucleotides
CA2947270A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating cancer using nucleic acids targeting mdm2 or mycn
CA2947619A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treatment of disorders in the front of the eye utilizing nucleic acid molecules
US10900039B2 (en) 2014-09-05 2021-01-26 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating aging and skin disorders using nucleic acids targeting Tyr or MMP1
CA2969590A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for the treatment of alopecia areata utilizing gene modulation approaches
US9809817B2 (en) 2015-04-03 2017-11-07 University Of Massachusetts Oligonucleotide compounds for targeting huntingtin mRNA
DK3277815T3 (da) 2015-04-03 2021-12-13 Univ Massachusetts Oligonukleotidforbindelser til behandling af præeklampsi og andre angiogene lidelser
JP6892433B2 (ja) 2015-04-03 2021-06-23 ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ 十分に安定化された非対称ｓｉｒｎａ
WO2017007825A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
EP3319614B1 (en) 2015-07-06 2020-12-23 Phio Pharmaceuticals Corp. Nucleic acid molecules targeting superoxide dismutase 1 (sod1)
US20190029974A1 (en) 2015-09-11 2019-01-31 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating skin disorders and conditions utilizing haptens
WO2017048824A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Compass Therapeutics Llc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CANCER VIA ANTAGONISM OF THE CD155/TIGIT PATHWAY AND TGF-β
EP3365446A4 (en) 2015-10-19 2019-06-26 Phio Pharmaceuticals Corp. SELF ADMINISTRATION-REDUCED SIZE NUCLEIC ACID COMPOUNDS TARGETING LONGS NON-CODING LONGS
US20190117799A1 (en) 2016-04-01 2019-04-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
WO2018195355A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Rxi Pharmaceuticals Corporation Topical delivery of nucleic acid compounds
US20200215113A1 (en) 2017-08-07 2020-07-09 Phio Pharmaceuticals Corp. Chemically modified oligonucleotides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080020990A1 (en) * 2003-05-30 2008-01-24 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Oligo Double-Stranded Rna Inhibiting the Expression of Bcl-2 and Pharmaceutical Composition Containing the Same
WO2005019430A2 (en) * 2003-08-22 2005-03-03 Research Development Foundation In vitro selection of aptamer beacons
WO2005079533A2 (en) * 2004-02-17 2005-09-01 University Of Massachusetts Methods and compositions for mediating gene silencing
WO2008036825A2 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAYDA M.ELBASHIR: "Functional anatomy of siRNAs for mediating ef®cient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate", 《THE EMBO JOURNAL》 *
YURIY FEDOROV: "Off-target effects by siRNA can induce toxic phenotype", 《RNA》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755620A (zh) * 2012-05-22 2015-07-01 奥利克斯医药有限公司 具有细胞内穿透能力的诱导rna干扰的核酸分子及其用途
CN108148838A (zh) * 2012-05-22 2018-06-12 奥利克斯医药有限公司 具有细胞内穿透能力的诱导rna干扰的核酸分子及用途
CN108135923A (zh) * 2015-07-06 2018-06-08 阿克赛医药公司 靶向超氧化物歧化酶1（sod1）的核酸分子
CN108135923B (zh) * 2015-07-06 2021-03-02 菲奥医药公司 靶向超氧化物歧化酶1（sod1）的核酸分子
CN106244590A (zh) * 2016-08-18 2016-12-21 广州市锐博生物科技有限公司 经修饰的siRNA分子、RNAi分子混合物及其应用
CN106244590B (zh) * 2016-08-18 2019-10-01 广州市锐博生物科技有限公司 经修饰的siRNA分子、RNAi分子混合物及其应用
CN106498072A (zh) * 2016-11-24 2017-03-15 青岛千卓分子生物科技有限公司 一种液态产品中外源dna内标物的保护方法及其应用
CN106498072B (zh) * 2016-11-24 2019-09-10 青岛千卓分子生物科技有限公司 一种液态产品中外源dna内标物的保护方法及其应用
CN112263587A (zh) * 2020-10-23 2021-01-26 河北仁博科技有限公司 miR-3065-5p在制备预防和/或治疗肾纤维化的药物中的应用

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Publication number Publication date
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