CN108135923A - 靶向超氧化物歧化酶1（sod1）的核酸分子 - Google Patents

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Abstract

本发明的一些方面涉及用于治疗ALS的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的针对编码超氧化物歧化酶1(SOD1)之基因的核酸分子。

Description

靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的核酸分子
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2015年7月6日提交的题为“NUCLEIC ACIDMOLECULES TARGETING SUPEROXIDE DISMUTASE 1(SOD1)”的美国临时申请序列No.62/189,050的权益，其全部内容通过引用并入本文.
技术领域
本公开内容至少部分地涉及体内递送特性改进的靶向SOD1的核酸分子用于治疗神经病症，例如肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)的用途.
背景技术
互补性寡核苷酸序列是有前景的治疗剂以及阐明基因功能的有用研究工具.然而，现有技术的寡核苷酸分子具有可能阻碍其临床开发的多个问题，并且在体内使用这样的组合物时，经常难以取得预期的对基因表达(包括蛋白质合成)的有效抑制.
一个主要问题是将这些化合物递送至细胞和组织.常规19至29个碱基长的双链RNAi化合物形成约1.5乘10nm至15nm大小的高度带负电荷的刚性螺旋.这种棒状分子无法通过细胞膜，导致体外和体内二者情况下具有非常有限的效力.因此，所有常规RNAi化合物需要一些类型的递送载剂以促进其组织分布和细胞摄取.这被认为是RNAi技术的主要限制.
之前已经尝试对寡核苷酸进行化学修饰以改善其细胞摄取特性.一种这样的修饰是将胆固醇分子附接至寡核苷酸.Letsinger等在1989年首次报道了这种方法.随后，ISISPharmaceuticals，Inc.(Carlsbad，CA)报道了将胆固醇分子附接至寡核苷酸的更加先进的技术(Manoharan，1992).
随着九十年代末siRNA的发现，在这些分子上尝试了类似方式的修饰以增强其递送特性.文献中出现了将胆固醇分子缀合到稍微修饰的(Soutschek，2004)和大量修饰的(Wolfrum，2007)siRNA上.Yamada等，2008也报道了改进的接头化学物质的使用，其进一步改善了胆固醇介导的siRNA摄取.尽管有这些努力，但是在生物流体的存在下，这些类型化合物的摄取受到抑制，导致体内基因沉默中非常有限的效力，限制了这些化合物在临床环境中的适用性.
发明内容
在一些方面，本公开内容涉及针对超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)的分离的双链核酸分子，其包含引导链(guide strand)和负载链(passengerstrand)，其中分离的双链核酸分子包含双链区和单链区，其中所述分子的作为双链的区为8至15个核苷酸长，其中引导链包含2至14个核苷酸长的单链区，其中引导链包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个硫代磷酸酯修饰，其中负载链为8至15个核苷酸长，其中负载链包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个硫代磷酸酯修饰，并且其中分离的双链核酸分子的至少40％的核苷酸是经修饰的.
在一些实施方案中，至少60％的核苷酸是经修饰的.在一些实施方案中，分离的双链核酸分子的至少一条链包含完全硫代磷酸酯化的骨架.在一些实施方案中，分离的双链核酸分子的至少一条链是完全硫代磷酸酯化的，或者除一个残基以外是完全硫代磷酸酯化的.在一些实施方案中，经修饰的分离的双链核酸分子的至少一个核苷酸包含2’O-甲基或2’-氟修饰.
在一些实施方案中，分离的双链核酸分子针对超氧化物歧化酶1(SOD1).在一些实施方案中，分离的双链核酸分子不包含PCT公开号WO2010/033247中描述的SEQ ID NO：40的修饰模式.
在一些实施方案中，多个U和/或C包含选自甲基、异丁基、辛基、咪唑或噻吩的疏水修饰，其中所述修饰位于U和/或C的第4位或第5位.
在一些实施方案中，分离的双链核酸分子包含选自表1至表8中序列的序列的至少12个连续核苷酸，包括表1至表8中提供的修饰模式.
在一些方面，本公开内容涉及分离的双链核酸分子，其包含选自表1至表8中序列的序列的至少12个连续核苷酸，其中如果分离的双链核酸分子包含选自表2中SEQ ID NO：70、71、72、73、79、80、81、或84的序列的至少12个连续核苷酸，则引导链包含多于6个硫代磷酸酯修饰.在一些实施方案中，分离的双链核酸分子还包含附接至所述分离的双链核酸分子的疏水缀合物.
在一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：122的至少12个连续核苷酸，并且引导链包含SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：91、或SEQ ID NO：123的至少12个连续核苷酸.在一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：122，并且引导链包含SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：91、或SEQ ID NO：123.
在一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：34、或SEQ ID NO：126的至少12个连续核苷酸，并且引导链包含SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：93的至少12个连续核苷酸.在一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：34、或SEQ ID NO：126，并且引导链包含SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：93.
在一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38、或SEQ ID NO：135的至少12个连续核苷酸，并且引导链包含SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：97、或SEQ ID NO：136的至少12个连续核苷酸.在一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38、或SEQ ID NO：135，并且引导链包含SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：97、或SEQ ID NO：136.
在一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：39的至少12个连续核苷酸，并且引导链包含SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：98的至少12个连续核苷酸.在一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：39，并且引导链包含SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：98.
在一些实施方案中，分离的双链核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：127、或SEQ ID NO：137的至少12个连续核苷酸，并且引导链包含SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：128、或SEQ ID NO：138的至少12个连续核苷酸.在一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：127、或SEQ ID NO：137，并且引导链包含SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：128、或SEQ ID NO：138.
在一些实施方案中，分离的双链核酸不形成发夹(hairpin).
在一些方面，本公开内容涉及包含本公开内容描述的分离的双链核酸分子的组合物.在一些实施方案中，组合物包含赋形剂(例如，可药用载体).在一些实施方案中，组合物包含第二治疗剂，例如核酸(例如，sd-rxRNA等)、小分子、肽、或多肽(例如，抗体).
在一些方面，本公开内容涉及用于治疗ALS的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量针对编码超氧化物歧化酶1(SOD1)之基因的核酸分子.
在一些方面，本公开内容涉及用于治疗ALS的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量针对超氧化物歧化酶1(SOD1)的分离的双链核酸分子，所述分离的双链核酸分子包含引导链和负载链，其中分离的双链核酸分子包含双链区和单链区，其中所述分子的作为双链的区为8至15个核苷酸长，其中引导链包含2至14个核苷酸长的单链区，其中引导链包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个硫代磷酸酯修饰，其中负载链为8至15个核苷酸长，其中负载链包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个硫代磷酸酯修饰，其中分离的双链核酸分子的至少40％的核苷酸是经修饰的，并且其中分离的双链核酸分子包含选自表1至表8中序列的序列的至少12个连续核苷酸，包括表1至表8中提供的修饰模式.
在一些实施方案中，分离的双链核酸分子是完全硫代磷酸酯化的，或者除一个残基以外是完全硫代磷酸酯化的.在一些实施方案中，经修饰的分离的双链核酸分子的至少一个核苷酸包含2’O-甲基或2’-氟修饰.
在一些实施方案中，分离的双链核酸分子还包含附接至所述分离的双链核酸分子的疏水缀合物.
在一些实施方案中，分离的双链核酸分子被配制用于递送至中枢神经系统.
在一些实施方案中，分离的双链核酸分子通过鞘内输注和/或注射施用.
在本文所述的方法的一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：122的至少12个连续核苷酸，并且引导链包含SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：91、或SEQ ID NO：123的至少12个连续核苷酸.
在本文所述的方法的一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：122，并且引导链包含SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：91、或SEQID NO：123.
在本文所述的方法的一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：34、或SEQ ID NO：126的至少12个连续核苷酸，并且引导链包含SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：93的至少12个连续核苷酸.
在本文所述的方法的一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：34、或SEQ ID NO：126，并且引导链包含SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：93.
在本文所述的方法的一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38、或SEQ ID NO：135的至少12个连续核苷酸，并且引导链包含SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：97、或SEQ ID NO：136的至少12个连续核苷酸.
在本文所述的方法的一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38、或SEQ ID NO：135，并且引导链包含SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：97、或SEQID NO：136.
在本文所述的方法的一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：39的至少12个连续核苷酸，并且引导链包含SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：98的至少12个连续核苷酸.
在本文所述的方法的一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：39，并且引导链包含SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：98.
在本文所述的方法的一些实施方案中，分离的双链核酸分子的有义链包含SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：137的至少12个连续核苷酸，并且引导链包含SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：138的至少12个连续核苷酸.
在本文所述的方法的一些实施方案中，分离的核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：137，并且引导链包含SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：128或SEQID NO：138。
本发明的每种限制都可以涵盖本发明的多个实施方案.因此，预期涉及任何一个元素或元素的组合的本发明的每种限制都可包含在本发明的各个方面中.本发明的应用不限于在下文的说明书中给出的或在附图中示出的组件之构造和布置的细节.本发明可以是其他实施方案并且以多种方式实践或实施.
附图简述
图1.降低硫代磷酸酯含量产生体外细胞毒性降低的活性ps-rxRNA变体.上图示出了SOD1沉默且下图示出了细胞生存力.这些数据表明ps-rxRNA变体25635和25637是有效的并且与25600相比具有更有利的细胞毒性谱(体外).
图2.降低硫代磷酸酯含量产生体外细胞毒性降低的活性ps-rxRNA变体.上图示出了SOD1沉默且下图示出了细胞生存力.这些数据显示ps-rxRNA变体25645是有效的并且与25600相比具有稍微更有利的细胞毒性谱(体外).
图3.脑-小脑(大鼠中IC注射).渗透性随着化学修饰含量的变化而提高；摄取25635＜25637＜25645＜25652.＊额叶皮质，不是小脑.
图4.颈部脊髓横切.在分布方面，25637和变体25645是相似的，但是二者都小于25652.
图5.颈部脊髓纵切.在向组织中的分布方面，25637小于25652.原始fl-ps-rxRNA化合物的施用实现全脑和脊髓渗透.ps-rxRNA变体1(25635)在该特定测定中不足以实现脑或脊髓渗透.ps-rxRNA变体2和3(分别为25637和25645)二者都实现被脑和脊髓的细胞摄取，但低于原始fl-ps-rxRNA(25652).
图6.在使用植入的渗透泵在C57BL/6正常(非转基因)小鼠中14天鞘内输注靶向SOD1的sd-rxRNA之后SOD1 mRNA的减少.在正常小鼠中用寡核苷酸ID 25652沉默14天.向14天渗透泵填充100μl的10mg/ml每种化合物.将通过qPCR的基因表达分析相对于PPIB管家基因进行归一化，并相对于PBS组中的SOD1表达进行绘图.仅在脊髓的腰部区域(导管放置的区域)中观察到沉默.泵流量为0.25μl/小时；因此每天递送60μg的靶向SOD1的ps-rxRNA或非靶向对照(NTC)ps-rxRNA，持续14天(总共840μg).本研究中使用24只C57BL/6J小鼠，包括8只用于寡核苷酸ID 25652；8只用于NTC ps-rxRNA；和8只用于PBS.
图7.在正常小鼠中14天鞘内输注靶向SOD1的sd-rxRNA变体3(寡核苷酸ID 25645)之后SOD1 mRNA的减少.用植入的渗透泵在C57BL/6正常(非转基因)小鼠中进行14天的鞘内输注.向14天渗透泵填充100μl的10mg/ml每种化合物.每天施用60μg的靶向SOD1的sd-rxRNA变体或非靶向对照(NTC)sd-rxRNA变体.通过qPCR进行基因表达分析以将基因表达相对于PPIB管家基因进行归一化，并相对于PBS组中的SOD1表达绘图.仅在脊髓的腰部区域(导管放置的区域)中观察到沉默.泵流量为0.25μl/小时；因此每天递送60μg，持续14天(总共840μg).本研究中使用30只C57BL/6J小鼠，包括10只用于寡核苷酸ID 25645；10只用于NTC ps-rxRNA；和10只用于PBS.
图8描绘了使用SOD1 sd-rxRNA变体辛基修饰产生的数据.
图9描绘了使用SOD1 sd-rxRNA变体辛基修饰产生的数据.
图10描绘了使用SOD1 sd-rxRNA变体噻吩修饰产生的数据.
图11描绘了使用SOD1 sd-rxRNA变体异丁基修饰产生的数据.
发明详述
SOD1(铜/锌超氧化物歧化酶)
如本文使用的，“SOD1”是指超氧化物歧化酶1酶，其是参与将有害的超氧化物自由基转化成水的三种超氧化物歧化酶之一.所有ALS病例中的约10％是显性遗传的，并且这些中的约20％是由于胞质超氧化物歧化酶1(SOD1)的缺陷所致.此外，SOD1与非家族性(例如，散发性)ALS形式有关(Jones，C.T.，Brock，D.J.H.，Chancellor，A.M.，Warlow，C.P.，Swingler，R.J.Cu/Zn superoxide dismutase(SOD1)mutations and sporadicamyotrophic lateral sclerosis.Lancet 342：1050-1051，1993).不希望受到任何理论约束，几条研究线已经表明，SOD1的突变不会通过丧失该酶的歧化酶活性而引起ALS.相反，突变SOD1通过多种替代机制而具有神经毒性，其中许多涉及突变蛋白的构象不稳定性以及异常结合和聚集.虽然突变SOD1的毒性的确切细节还没有完全确定，但是在动物模型中降低突变SOD1蛋白的负荷显著延迟死亡是非常清楚的.这已经使用反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，ASO)(Smith等)和siRNA(Maxwell，Pasinelli等，2004))(Xia，Zhou等，2006)(Wang，Ghosh等，2008)实现.这些研究说明了基于siRNA的药物代表治疗ALS和许多其他CNS病症的潜在显著治疗进展的原理.在这两种情况下，效力都是通过在长时间内递送大量的物质来实现；这些研究表明以下观点：ASO和siRNA治疗的目前形式的主要限制是缺乏效率最佳且无毒的体内递送系统(Smith，Miller等，2006；Wang，Ghosh等，2008).
肌萎缩侧索硬化(ALS)
ALS是一种影响中枢神经系统中的运动神经元的进行性神经退行性疾病.运动神经元的退化导致瘫痪和最终死亡，通常由于呼吸衰竭.在病例的子集中，ALS是由编码胞质超氧化物歧化酶(SOD1)之基因的显性传递突变导致的.突变SOD1的转基因表达引起小鼠中ALS.
核酸分子
本文使用的“核酸分子”包括但不限于：sd-rxRNA、sd-rxRNA变体、rxRNAori、寡核苷酸、ASO、siRNA、shRNA、miRNA、ncRNA、cp-lasiRNA、aiRNA、单链核酸分子、双链核酸分子、RNA和DNA.在一些实施方案中，核酸分子是经化学修饰的核酸分子，例如经化学修饰的寡核苷酸.
sd-rxRNA分子
本发明的一些方面涉及sd-rxRNA分子.如本文使用的，“sd-rxRNA”或“sd-rxRNA分子”是指自递送RNA分子，例如通过引用并入的以下文献中描述的那些：2014年8月5日授权的题为“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS”的美国专利No.8,796,443，2015年11月3日授权的题为“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS”的美国专利No.9,175,289和2009年9月22日提交的题为“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAICOMPOUNDS”的PCT公开No.WO2010/033247(申请号PCT/US2009/005247).简单地说，sd-rxRNA(也称为sd-rxRNAnano)是分离的不对称双链核酸分子，其包含最小长度为16个核苷酸的引导链和长度为8至18个核苷酸的负载链，其中所述双链核酸分子具有双链区和单链区，单链区长度为4至12个核苷酸，并且具有至少三个核苷酸骨架修饰.在一些优选实施方案中，双链核酸分子具有一个平端，或者包含一个或两个核苷酸突出端.可以通过化学修饰，并且在一些情况下，通过附接疏水缀合物对sd-rxRNA分子进行优化.在一些实施方案中，分离的双链核酸分子不包含PCT公开号WO2010/033247中描述的SEQ ID NO：40的修饰模式.
在一些实施方案中，sd-rxRNA包含分离的双链核酸分子，所述双链核酸分子包含引导链和负载链，其中分子双链区的长度为8至15个核苷酸，其中引导链含有长度为4至12个核苷酸的单链区，其中引导链的单链区含有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个硫代磷酸酯修饰，并且其中双链核酸的至少40％核苷酸是经修饰的.
在一些实施方案中，sd-rxRNA变体包含含有长度为18至23个核苷酸的引导链(反义链)和长度为10至15个核苷酸的负载链(有义链)的sd-rxRNA.引导链和负载链可以形成不对称双链体.在一些实施方案中，引导链包含6至22个骨架修饰，包括硫代磷酸酯修饰.在一些实施方案中，负载链包含2至14个骨架修饰，包括硫代磷酸酯修饰.在一些实施方案中，负载链附接至疏水缀合物.术语“sd-rxRNA变体”在本文中可与“ps-rxRNA”互换使用.
在一些实施方案中，引导链包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个硫代磷酸酯修饰.在一些实施方案中，引导链是完全硫代磷酸酯化的.在一些实施方案中，负载链包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个硫代磷酸酯修饰.在一些实施方案中，负载链是完全硫代磷酸酯化的.本文令人惊讶地发现，高水平的硫代磷酸酯修饰可使得分离的双链核酸分子的递送增加.
与本发明有关的核酸分子在本文还是指本发明的多核苷酸、分离的双链或双链体核酸、寡核苷酸、纳米分子、纳米RNA、sd-rxRNAnano、sd-rxRNA或RNA分子.
与常规siRNA相比，sd-rxRNA有效得多地被细胞摄取.这些分子在沉默靶基因表达方面非常有效，并且相对于之前描述的RNAi分子提供了显著的优点，包括在血清存在下的高活性、有效的自递送、与多种接头的相容性、以及与毒性有关的化学修饰的存在降低或完全不存在.
与单链多核苷酸相比，双链体多核苷酸传统上难以递送到细胞，因为其具有刚性结构和大量负电荷，这使得膜转移变得困难.然而，尽管sd-rxRNA是部分双链的，但是被认为在体内是单链的，因此能够有效递送穿过细胞膜.结果，本发明的多核苷酸在许多情况下能够自递送.因此，本发明的多核苷酸可以以类似于常规RNAi剂的方式配制，或者其可以单独递送到细胞或对象(或者与非递送类型的载体一起)并且允许自递送.在本发明的一个实施方案中，提供了自递送不对称双链RNA分子，其中分子的一部分与常规RNA双链体类似，分子的第二部分是单链.
在一些方面，本发明的寡核苷酸具有不对称结构的组合，包括5个核苷酸或更长的双链区和单链区，特定的化学修饰模式，并且与亲脂性或疏水性分子缀合.这一类RNAi样化合物具有优秀的体外和体内效力.认为刚性双链体区尺寸的减小与应用于单链区的硫代磷酸酯修饰的组合导致了所观察到的优秀效力.
在一些实施方案中，与本发明有关的RNAi化合物包含不对称化合物，所述不对称化合物包含双链体区(有效RISC进入所需的8-15个碱基长度)和长度为4至12个核苷酸的单链区.在一些实施方案中，双链体区为13或14个核苷酸长.在一些实施方案中，6或7个核苷酸的单链区是优选的.在一些实施方案中，RNAi化合物包含2至12个硫代磷酸酯核苷酸间连接(称为硫代磷酸酯修饰).在一些实施方案中，6至8个硫代磷酸酯核苷酸间连接是优选的.在一些实施方案中，RNAi化合物包含独特的化学修饰模式，其提供稳定性并且与RISC进入相容.这些元件的组合已产生对于体外和体内递送RNAi试剂非常有用的预料不到的特性.
提供稳定性并且与RISC进入相容的化学修饰模式包括对有义链或负载链以及反义链或引导链的修饰.例如，负载链可以被任何赋予稳定性并且不干扰活性的化学实体修饰.这样的修饰包括2’核糖修饰(O-甲基、2’F、2脱氧等)和骨架修饰，例如硫代磷酸酯修饰.负载链中优选的化学修饰模式包括负载链内C和U核苷酸的O-甲基修饰，或者替代地负载链可以完全是O-甲基修饰的.
引导链例如也可以被任何赋予稳定性并且不干扰RISC进入的化学修饰所修饰.引导链中优选的化学修饰模式包括，大部分C和U核苷酸是2’F修饰的，并且5’端被磷酸化.引导链中的另一种优选的化学修饰模式包括第1位的2’O-甲基修饰和第11至18位中C/U以及5’端化学磷酸化.引导链中的另一种优选的化学修饰模式包括第1位的2’O-甲基修饰和第11至18位中C/U和5’端化学磷酸化，以及第2至10位中C/U的2’F修饰.在一些实施方案中，负载链和/或引导链含有至少一个5-甲基C或U修饰.
在一些实施方案中，sd-rxRNA中至少30％的核苷酸是经修饰的.例如，sd-rxRNA中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸是经修饰的.在一些实施方案中，sd-rxRNA中100％的核苷酸是经修饰的.
本发明寡核苷酸的上述化学修饰模式是良好耐受的并且实际上改善了不对称RNAi化合物的效力.在一些实施方案中，消除任何所述要素(引导链稳定性、硫代磷酸酯区段(strench)、有义链稳定性和疏水缀合物)或增加尺寸在一些情况下导致次优的效力，在一些情况下导致完全失去效力.要素的组合导致开发了在被动递送到细胞如HeLa细胞后完全活化的化合物.
在一些情况下，可以通过使用新化学物质类型改善化合物的疏水性来新一步改进sd-rxRNA.例如，一种化学物质涉及使用疏水碱基修饰.任何位置的任何碱基都可以被修饰，只要修饰导致碱基的分配系数增加即可.修饰化学物质的优选位置是嘧啶的4位和5位.这些位置的主要优点是：(a)易于合成，和(b)不干扰碱基配对以及A型螺旋的形成，其对于RISC复合物装载和靶标识别是必须的.使用其中存在多个脱氧尿嘧啶而不干扰总体化合物效力的sd-rxRNA化合物形式.另外，通过优化疏水物缀合物的结构，可以获得组织分布和细胞摄取中大的改进.在一些优选实施方案中，固醇的结构被修饰以改变(增加/减少)C17附接的链.这种类型的修饰导致细胞摄取的显著提高和体内组织摄取特性的显著改善.
根据本发明配制的dsRNA还包括rxRNAori.rxRNAori是指以下中描述并通过引用的一类RNA分子：2009年2月11日提交的题为“MODIFIED RNAI POLYNUCLEOTIDES AND USESTHEREOF”的PCT公开No.WO2009/102427(申请No.PCT/US2009/000852)，以及题为“MODIFIEDRNAI POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF”的美国专利公开No.US 2011-0039914.
在一些实施方案中，rxRNAori分子包含用于抑制靶基因表达的长度为12至35个核苷酸的双链RNA(dsRNA)构建体，其包含：具有5′端和3′端的有义链，其中所述有义链被2′-修饰的核糖高度修饰，其中有义链中央部分的3-6个核苷酸未被2′-修饰的核糖修饰，以及具有5′端和3′端的反义链，所述反义链与所述有义链以及靶基因的mRNA杂交，其中所述dsRNA以序列依赖性方式抑制靶基因的表达.
rxRNAori可以含有本文中描述的任何修饰.在一些实施方案中，rxRNAori中至少30％的核苷酸是经修饰的.例如，rxRNAori中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸是经修饰的.在一些实施方案中，sd-RNAori中100％的核苷酸是经修饰的.在一些实施方案中，仅rxRNAori的负载链含有修饰.
本发明的应用不限于在下文的描述中给出的或附图中示出的结构细节和元件布置.本发明可以是其他实施方案并且以各种方式实践或实施.另外，本文使用的词组和术语是为了描述的目的而不应解释为限制.本文中使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“包含(involve)”意指涵盖后面列出的项目及其等同物以及额外的项目.
本发明的一些方面涉及包含引导(反义)链和随从(有义)链的分离的双链核酸分子.本文使用的术语“双链”是指一种或更多种核酸分子，其中至少一部分核甘酸单体(nucleomonomer)是互补的并且氢键形成双链区.在一些实施方案中，引导链的长度为16至29个核苷酸长.在某些实施方案中，引导链为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸长.引导链对靶基因具有互补性.引导链和靶基因之间的互补性可存在于引导链的任意部分上.本文使用的互补性可以是完全互补性或不完全互补性，只要引导链与其介导RNAi的靶标足够互补即可.在一些实施方案中，互补性是指引导链和靶标之间小于25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的错配.完全互补性是指100％互补性.在一些实施方案中，还已发现相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的siRNA序列对于抑制有效.另外，并非siRNA的所有位置对于靶标识别具有相同贡献.siRNA中央的错配是最严重的，并且基本上消除了靶RNA切割.参考反义链的中央上游或切割位点上游的错配可以耐受，但是显著降低靶RNA切割.参考反义链中央或切割位点下游的错配，优选位于反义链3′端附近，例如，距离反义链的3′端1、2、3、4、5或6个核苷酸的错配是可以耐受的，并且仅稍微降低靶RNA切割.
尽管不希望受到任何特定理论的限制，在一些实施方案中，引导链长度为至少16个核苷酸并且将Argonaute蛋白锚定在RISC中.在一些实施方案中，当引导链装载入RISC时，其具有限定的种子区(seed region)，靶mRNA切割发生在引导链10至11位的对面.在一些实施方案中，引导链的5’端被磷酸化或能够被磷酸化.本文所述核酸分子可以称为最小触发RNA.
在一些实施方案中，负载链的长度为8至15个核苷酸长.在某些实施方案中，负载链为8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长.负载链与引导链有互补性.负载链与引导链之间的互补性可以存在于负载链或引导链的任意部分上.在一些实施方案中，在分子双链区内引导链和负载链之间具有100％的互补性.
本发明的一些方面涉及具有最小双链区的双链核酸分子.在一些实施方案中，所述分子的双链区为8至15个核苷酸长.在某些实施方案中，所述分子的双链区为8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长.在某些实施方案中，双链区为13或14个核苷酸长.引导链和负载链之间可以有100％的互补性，或者引导链和负载链之间可以有一个或更多个错配.在一些实施方案中，在双链分子的一端，分子是平端或具有一个核苷酸突出.在一些实施方案中，分子的单链区为4至12个核苷酸长.例如，单链区可以为4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸长.但是，在某些实施方案中，单链区也可以小于4或大于12个核苷酸长.在某些实施方案中，单链区为至少6个或至少7个核苷酸长.
与本发明有关的RNAi构建体的热力学稳定性(ΔG)可以小于-13kkal/mol.在一些实施方案中，热力学稳定性(ΔG)小于-20kkal/mol.在一些实施方案中，当(ΔG)低于-21kkal/mol时，效力有损失.在一些实施方案中，高于-13kkal/mol的(ΔG)值与本发明的一些方面兼容.不希望受到任何理论的约束，在一些实施方案中，具有相对较高(ΔG)值的分子可在相对较高浓度下变得有活性，而具有相对较低(ΔG)值的分子可在相对较低浓度下变得有活性.在一些实施方案中，(ΔG)值可高于-9kkcal/mol.由与本发明有关的包含最小双链区的RNAi构建体介导的基因沉默效果是出乎意料的，因为已经具有证明几乎相同的设计但是较低热力学稳定性的分子是无活性的(Rana等，2004).
不希望受到任何理论约束，8至10bp的dsRNA或dsDNA的区段可以在结构上被RISC的蛋白质组分或RISC的辅因子识别.另外，化合物的触发需要自由能，所述化合物可以被蛋白质组分感测和/或足够稳定以与这样的组分相互作用，从而使得其可以装载到Argonaute蛋白中.如果存在最佳热力学并且存在优选为至少8个核苷酸的双链部分，那么双链体将被识别并且装载到RNAi机器中.
在一些实施方案中，通过使用LNA碱基来增加热力学稳定性.在一些实施方案中，引入另外的化学修饰.化学修饰的数种非限制性实例包括：5’磷酸酯(5’Phosphate)、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-氟、胸腺嘧啶核糖核苷(ribothymidine)、C-5丙炔基-dC(pdC)和C-5丙炔基-dU(pdU)；C-5丙炔基-C(pC)和C-5丙炔基-U(pU)；5-甲基C、5-甲基U、5-甲基dC、5-甲基dU甲氧基、(2，6-二氨基嘌呤)，5′-二甲氧基三苯甲基-N4-乙基-2′-脱氧胞苷和MGB(小沟结合物).应理解的是，相同分子内可以组合多于一种化学修饰.
优化与本发明有关的分子以提高效力和/或降低毒性.例如，在一些方面，引导链和/或负载链的核苷酸长度，和/或引导链和/或负载链中硫代磷酸酯修饰的数目可影响RNA分子的效力，而在一些方面，将2’-氟(2’F)修饰替换成2’-O-甲基(2’OMe)修饰可影响分子的毒性.特别地，预期减少分子的2’F含量降低分子的毒性.另外，RNA分子中硫代磷酸酯修饰的数目可影响细胞对分子的摄取，例如，细胞被动摄取分子的效率.本文所述分子的优选实施方案不具有2’F修饰并且还以在细胞摄取和组织渗透性方面相等的效率为特征.这样的分子相对于现有技术(例如Accell和Wolfrum描述的用广泛使用的2’F大量修饰的分子)表现出显著改进.
在一些实施方案中，引导链的长度为约18-19个核苷酸并且具有约2至14个磷酸酯修饰.例如，引导链可以含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或多于14个磷酸酯修饰的核苷酸.引导链可以含有一个或更多个赋予提高的稳定性而不干扰RISC进入的修饰.磷酸酯修饰的核苷酸，例如硫代磷酸酯修饰的核苷酸可以在引导链的3’端、5’端或遍布引导链.在一些实施方案中，引导链3’末端的10个核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个硫代磷酸酯修饰的核苷酸.引导链还可以含有2’F和/或2’OMe修饰，其可以位于整个分子中.在一些实施方案中，引导链第1位的核苷酸(引导链最5’位置的核苷酸)是2’OMe修饰的和/或磷酸化的.引导链内的C和U核苷酸可以是2’F修饰的.例如，19nt引导链的第2至10位(或者不同长度的引导链的相应位置)的C和U核苷酸可以是2’F修饰的.引导链中的C和U核苷酸还可以是2’OMe修饰的.例如，19nt引导链的第11至18位(或者不同长度的引导链的相应位置)的C和U核苷酸可以是2’OMe修饰的.在一些实施方案中，引导链最3’端的核苷酸是未修饰的.在某些实施方案中，引导链中的大部分C和U是2’F修饰的，并且引导链5’端是磷酸化的.在另一些实施方案中，第11至18位的C或U以及第1位是2’OMe修饰的，并且引导链的5’端是磷酸化的.在另一些实施方案中，第11至18位的C或U以及第1位是2’OMe修饰的，并且引导链的5’端是磷酸化的，并且第2至10位的C或U是2’F修饰的.
在一些方面，最佳负载链的长度为约11至14个核苷酸.负载链可以含有赋予提高的稳定性的修饰.负载链中的一个或更多个核苷酸可以是2’OMe修饰的.在一些实施方案中，负载链中的一个或更多个C和/或U核苷酸是2’OMe修饰的，或者负载链中的所有C和U核苷酸是2’OMe修饰的.在某些实施方案中，负载链中的所有核苷酸都是2’OMe修饰的.负载链上的一个或更多个核苷酸也可以是磷酸酯修饰的，例如硫代磷酸酯修饰的.负载链还可以含有2’核糖、2’氟和2脱氧修饰或者上述修饰的任意组合.引导链和负载链二者上的化学修饰模式可良好耐受，并且化学修饰的组合可导致提高的RNA分子的效力和自递送.
本发明的一些方面涉及RNAi构建体，与之前用于RNAi的分子相比，其具有相对于双链区延长的单链区.可以对该分子的单链区进行修饰以促进细胞摄取或基因沉默.在一些实施方案中，单链区的硫代磷酸酯修饰影响细胞摄取和/或基因沉默.引导链的硫代磷酸酯修饰的区域可以包含在分子的单链区和双链区二者中的核苷酸.在一些实施方案中，单链区包含2至12个硫代磷酸酯修饰.例如，单链区可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个硫代磷酸酯修饰.在一些情况下，单链区包含6-8个硫代磷酸酯修饰.
还对与本发明有关的分子进行优化用于细胞摄取.在本文所述的RNA分子中，引导链和/或负载链可以附接至缀合物.在某些实施方案中，缀合物是疏水的.疏水缀合物可以是分配系数大于10的小分子.缀合物可以是固醇型分子(例如胆固醇)或者具有附接至C17的延长聚碳链的分子，缀合物的存在可以在具有或不具有脂质转染试剂的情况下影响细胞摄取RNA分子的能力.缀合物可以通过疏水接头附接至负载链或引导链.在一些实施方案中，疏水接头的长度为5至12C，和/或是基于羟基吡咯烷的.在一些实施方案中，疏水缀合物附接至负载链，并且负载链和/或引导链的CU残基是经修饰的.在一些实施方案中，负载链和/或引导链上的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CU残基是经修饰的.在一些方面，与本发明有关的分子是自递送(self-delivering，sd)的.本文使用的“自递送”是指分子不需要额外递送载体如转染试剂而被递送到细胞中的能力.
本发明的一些方面涉及选择用于RNAi的分子.在一些实施方案中，可以选择具有8至15个核苷酸之双链区的分子来用于RNAi.在一些实施方案中，基于分子的热力学稳定性(ΔG)选择分子.在一些实施方案中，选择(ΔG)小于-13kkal/mol的分子.例如，(ΔG)值可以为-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-21、-22或者小于-22kkal/mol.在另一些实施方案中，(ΔG)值可以大于-13kkal/mol.例如，(ΔG)值可以为-12、-11、-10、-9、-8、-7或者大于-7kkal/mol.应理解的是，可以使用本领域中已知的任何方法计算ΔG.在一些实施方案中，使用Mfold计算ΔG，其可以从Mfold网站(mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi)获得.用于计算ΔG的方法描述在通过引用并入的以下文献中：Zuker，M.(2003)Nucleic Acids Res.，31(13)：3406-15；Mathews，D.H.，Sabina，J.，Zuker，M.和Turner，D.H.(1999)J.Mol.Biol.288：911-940；Mathews，D.H.，Disney，M.D.，Childs，J.L.，Schroeder，S.J.，Zuker，M.和Turner，D.H.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101：7287-7292；Duan，S.，Mathews，D.H.和Turner，D.H.(2006)Biochemistry 45：9819-9832；Wuchty，S.，Fontana，W.，Hofacker，I.L.和Schuster，P.(1999)Biopolymers 49：145-165.
在某些实施方案中，多核苷酸含有5′和/或3′端突出.在多核苷酸一端上的核苷酸突出的数目和/或序列可以与多核苷酸另一端的相同或不同.在某些实施方案中，一个或更多个突出核苷酸可以含有化学修饰，例如硫代磷酸基修饰或2’-OMe修饰.
在某些实施方案中，多核苷酸是未经修饰的.在另一些实施方案中，至少一个核苷酸是经修饰的.在另一些实施方案中，修饰包括在从引导链5’端开始的第二个核苷酸处的2’-H或2’-修饰核糖.“第二个核苷酸”定义为从多核苷酸的5’-端开始的第二个核苷酸.
本文使用的“2’-修饰的核糖”包括不具有2’-OH基团的那些核糖.“2’-修饰的核糖”不包括2’-脱氧核糖(发现于未经修饰的典型DNA核苷酸中).例如，2’-修饰的核糖可以是2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸或其组合.
在某些实施方案中，2’-修饰的核苷酸是嘧啶核苷酸(例如，C/U).2’-O-烷基核苷酸的示例包括2’-O-甲基核苷酸或2′-O-烯丙基核苷酸.
在某些实施方案中，本发明的具有上文提到的5′端修饰的sd-rxRNA多核苷酸与不具有特定5′端修饰的类似构建体相比时表现出显著更低的(例如，降低至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多)“脱靶”基因沉默，因此极大改进了RNAi试剂或治疗的整体特异性.
本文使用的“脱靶”基因沉默是指由于例如反义(引导)序列和非预期靶mRNA序列之间的假序列同源性而导致的非预期的基因沉默.
根据本发明的这个方面，某些引导链修饰进一步提高核酸酶稳定性，和/或降低干扰素诱导，而不显著降低RNAi活性(或者根本不降低RNAi活性).
修饰的某些组合可以实现另一些意料之外的优点，如通过增强的抑制靶基因表达的能力、增强的血清稳定性和/或提高的靶标特异性等部分证明的.
在某些实施方案中，引导链在引导链5’端上的第二个核苷酸处包含经2’-O-甲基修饰的核苷酸，并且没有其他经修饰的核苷酸.
在另一些方面，本发明的sd-rxRNA结构通过微小RNA机制介导序列依赖性基因沉默.本文使用的术语“微小RNA”(“miRNA”)在本领域中也称为“小时序RNA”(“smalltemporal RNA，stRNA”)，其是指(例如，被病毒、哺乳动物或植物基因组)遗传编码的并且能够指导或介导RNA沉默的小(10-50个核苷酸)RNA.“miRNA病症”是指以miRNA的表达或活性异常为特征的疾病或病症.
微小RNA参与下调小鼠、虫和哺乳动物中的关键途径(例如发育和癌症)中的靶基因.借助微小RNA机制的基因沉默通过miRNA和其靶信使RNA(mRNA)之特异性的但是不完全的碱基配对实现.多种机制可用于微小RNA介导的靶mRNA表达的下调.
miRNA是约22个核苷酸的非编码RNA，其可以在植物和动物发育的过程中在转录后或翻译水平调节基因表达.miRNA的一个普遍特征是其全部从被称为前miRNA的约70个核苷酸的前体RNA茎-环上切离，可能是通过Dicer(III型RNA酶)或其同源物切离.天然存在的miRNA在体内由内源基因表达，并且通过Dicer或其他RNA酶由发夹或茎-环前体(前miRNA或pri-miRNA)加工.miRNA在体内可以短暂地以双链的双链体存在，但是仅一条链被RISC复合物摄取以指导基因沉默.
在一些实施方案中，描述了在细胞摄取和抑制miRNA活性中有效的sd-rxRNA化合物形式.基本上，化合物类似于RISC进入形式，但是主要链化学修饰模式以阻断切割的方式进行优化并且充当有效的RISC作用抑制剂.例如，化合物可以完全或大部分是O-甲基修饰的，并且具有前述硫代磷酸酯含量.在一些实施方案中，对于这些化合物类型，5’磷酸化不是必要的.双链区的存在是优选的，因为其促进细胞摄取和有效的RISC装载.
另一种使用小RNA作为序列特异性调节剂的途径是RNA干扰(RNAi)途径，其是进化保守的，响应于细胞中双链RNA(dsRNA)的存在.dsRNA被Dicer切割成约20个碱基对(bp)的小干扰RNA(siRNA)双链体.这些小RNA装配成被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的多蛋白效应子复合物.然后siRNA指导具有完全互补性的靶mRNA的切割.
siRNA途径和miRNA途径共享生物发生、蛋白质复合物和功能的一些方面.单链多核苷酸可以模拟siRNA机制中的dsRNA，或者miRNA机制中的微小RNA.
在某些实施方案中，与具有相同序列的未经修饰的RNAi构建体相比，经修饰RNAi构建体在血清和/或脑脊髓液中可具有提高的稳定性.
在某些实施方案中，在原代细胞，例如哺乳动物原代细胞(包括来自人、小鼠和其他啮齿类动物以及其他非人哺乳动物的原代细胞)中，RNAi构建体的结构不诱导干扰素响应.在某些实施方案中，RNAi构建体还可用于抑制无脊椎生物体中靶基因的表达.
为了进一步提高本发明构建体的体内稳定性，可以通过保护基封闭所述结构的3’端.例如，可以使用保护基如反向核苷酸(inverted nucleotide)、反向无碱基(abasic)部分或氨基末端修饰的核苷酸.反向核苷酸可以包含反向脱氧核苷酸.反向无碱基部分可以包含反向脱氧无碱基部分，例如3’，3’-连接的或5’，5’-连接的脱氧无碱基部分.
本发明的RNAi构建体能够抑制靶基因编码的任何靶蛋白的合成.本发明包括抑制体外或体内细胞中靶基因表达的方法.因此，本发明的RNAi构建体可用于治疗患有以过表达靶基因为特征的疾病的患者.
靶基因可以是细胞内源的或者外源的(例如，通过病毒或使用重组DNA技术引入细胞中).这样的方法可以包括以足以抑制靶基因表达的量将RNA引入到细胞中.例如，这样的RNA分子可以具有与靶基因的核苷酸序列互补的引导链，使得组合物抑制靶基因的表达.
本发明还涉及表达本发明核酸的载体，以及包含这样的载体或核酸的细胞.细胞可以是体内的或培养的哺乳动物细胞，例如人细胞.
本发明还涉及包含本发明RNAi构建体和可药用载剂或稀释剂的组合物.
所述方法可以在体外、离体或体内进行，例如在培养的哺乳动物细胞，如培养的人细胞中进行.
可以在递送试剂如脂质(例如，阳离子脂质)或脂质体的存在下接触靶细胞(例如，哺乳动物细胞).
本发明的另一个方面提供了抑制哺乳动物细胞中靶基因的表达的方法，其包括使哺乳动物细胞与表达本发明RNAi构建体的载体接触.
在本发明的一个方面，提供了更长的双链体多核苷酸，其包含：大小为约16至约30个核苷酸的第一多核苷酸；大小为约26至约46个核苷酸的第二多核苷酸，其中第一多核苷酸(反义链)与第二多核苷酸(有义链)和靶基因二者互补，其中两个多核苷酸形成双链体，其中第一多核苷酸含有长度大于6个碱基的单链区，并且被交替化学修饰模式修饰，和/或包含有助于细胞递送的缀合物部分.在该实施方案中，负载链的约40％至约90％核苷酸、引导链的约40％至约90％核苷酸、以及第一多核苷酸的单链区的约40％至约90％核苷酸是经化学修饰的核苷酸.
在一个实施方案中，多核苷酸双链体中经化学修饰的核苷酸可以是本领域已知的任何化学修饰的核苷酸，例如上文详细讨论的那些.在一个特定实施方案中，经化学修饰的核苷酸选自2’F修饰的核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸和2’脱氧核苷酸.在另一个特定实施方案中，经化学修饰的核苷酸由核苷酸碱基的“疏水修饰”造成.在另一个特定实施方案中，经化学修饰的核苷酸是硫代磷酸酯.在另一个特定实施方案中，经化学修饰的核苷酸是硫代磷酸酯、2’-O-甲基、2’脱氧、疏水修饰和硫代磷酸酯的组合.因为这些修饰分组是指核糖环、骨架和核苷酸的修饰，所以可能的是一些修饰的核苷酸具有所有三种修饰类型的组合.
在另一个实施方案中，化学修饰在双链体的多个区域是不同的.在一个具体实施方案中，第一多核苷酸(负载链)在多个位置具有大量不同的化学修饰.对于这种多核苷酸，多至90％的核苷酸可以是经化学修饰的和/或具有引入的错配.
在另一个实施方案中，第一或第二多核苷酸的化学修饰包括但不限于尿嘧啶和胞嘧啶的5’位修饰(4-吡啶基、2-吡啶基、吲哚基、苯基(C6H5OH)；色氨酰基(C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、异丁基、丁基、氨基苄基；苯基；萘基等)，其中化学修饰可以改变核苷酸的碱基配对能力.对于引导链，本发明这个方面的重要特征在于化学修饰相对于反义链序列的5’端的位置.例如，引导链5’端的化学磷酸化通常有利于效力.有义链种子区(相对于5’端的2位至7位)中的O-甲基修饰通常不能良好耐受，而2’F和脱氧良好耐受.引导链的中部和引导链的3’端更容忍所施加的化学修饰类型.引导链的3’端处不耐受脱氧修饰.
本发明这个方面的独特特征包括在碱基上使用疏水修饰.在一个实施方案中，疏水修饰优选地位于引导链的5’端附近，在另一些实施方案中，其位于引导链中部，在另一些实施方案中，其位于引导链的3’端，而在另一些实施方案中，其分布在多核苷酸的整个长度上.相同类型的模式适用于双链体的负载链.
分子的其他部分是单链区.在一些实施方案中，预期单链区为7至40个核苷酸.
在一个实施方案中，第一多核苷酸的单链区含有选自以下的修饰：40％至90％的疏水碱基修饰，40％至90％的硫代磷酸酯，40％至90％的核糖部分的修饰，以及前述的任意组合.
由于大量修饰的多核苷酸可以改变引导链(第一多核苷酸)装载入RISC复合物的效率，因此在一个实施方案中，双链体多核苷酸包含引导链(第一多核苷酸)上核苷酸9、11、12、13或14与有义链(第二多核苷酸)上的对侧核苷酸之间的错配，以促进有效的引导链装载.
以下部分中描述了本发明更详细的方面.
双链体特征
本发明的双链寡核苷酸可以通过两个分开的互补核酸链形成.双链体形成可以发生在含有靶基因之细胞的内部或外部.
本文使用的术语“双链体”包含与互补序列通过氢键键合的双链核酸分子区域.本发明的双链寡核苷酸可以包含相对于靶基因有义的核苷酸序列和相对于靶基因反义的互补序列.对应于靶基因序列的有义和反义核苷酸序列，例如相同或充分相同以实现对靶基因序列的靶基因抑制(例如，约至少约98％相同、96％相同、94％、90％相同、85％相同或80％相同).
在某些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在其整个长度上是双链的，即，在分子的任一端没有突出的单链序列，即，是平端.在另一些实施方案中，独立核酸分子可以具有不同长度.换句话说，本发明的双链寡核苷酸并非在其整个长度上是双链.例如，当使用两个分开的核酸分子时，一个分子(例如包含反义序列的第一分子)可以比与其杂交的第二分子更长(保留分子的一部分为单链).同样地，当使用单个核酸分子时，分子在任一端的一部分可以保持单链.
在一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸包含错配和/或环或凸起(bulge)，但是在寡核苷酸的至少约70％的长度上是双链.在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在寡核苷酸的至少约80％的长度上是双链.在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在寡核苷酸的至少约90％至95％的长度上是双链.在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在寡核苷酸的至少约96％至98％的长度上是双链.在某些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸含有至少或多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配.
修饰
本发明的核苷酸可以在多个位置修饰，包括在糖部分、磷酸二酯连接和/或碱基处.
在一些实施方案中，核苷的碱基部分可以是经修饰的.例如，可以在嘧啶环的2、3、4、5和/或6位修饰嘧啶碱基.在一些实施方案中，胞嘧啶的环外胺基可以是经修饰的.嘌呤碱基也可以是经修饰的.例如，可以在1、2、3、6、7或8位修饰嘌呤碱基.在一些实施方案中，腺嘌呤的环外胺基可以是经修饰的.在一些情况下，碱基部分的环中的氮原子可以被另外的原子(例如碳)取代.碱基部分的修饰可以是任何合适的修饰.修饰的实例是本领域普通技术人员已知的.在一些实施方案中，碱基修饰包括烷基化的嘌呤或嘧啶、酰基化的嘌呤或嘧啶、或者其他杂环.
在一些实施方案中，嘧啶可以在5位被修饰.例如，嘧啶的5位可以被烷基、炔基、烯基、酰基或者其经取代衍生物修饰.在另一些实例中，嘧啶的5位可以被羟基或烷氧基或其经取代衍生物修饰.另外，嘧啶的N4位可以被烷基化.在另一些实施方案中，嘧啶5-6键可以是饱和的，嘧啶环中的氮原子可以被碳原子取代，和/或O2和O4原子可以被硫原子取代.应理解的是，其他修饰也是可能的.
在另一些实例中，嘌呤的N7位和/或N2和/或N3位可以被烷基或其经取代衍生物修饰.在另一些实例中，第三个环可以与嘌呤双环体系稠合，和/或嘌呤环体系中的氮原子可以被碳原子取代.应理解的是，其他修饰也是可能的.
在5位被修饰的嘧啶的非限制性实例公开在美国专利5,591,843、美国专利7,205,297、美国专利6,432,963和美国专利6,020,483中；在N4位被修饰的嘧啶的非限制性实例公开在美国专利5,580,731中；8位被修饰的嘌呤的非限制性实例公开在美国专利6,355,787和美国专利5,580,972中；在N6位被修饰的嘌呤的非限制性实例公开在美国专利4,853,386、美国专利5,789,416和美国专利7,041,824中；以及在2位被修饰的嘌呤的非限制性实例公开在美国专利4,201,860和美国专利5,587,469中，其全部通过引用并入本文.
经修饰碱基的非限制性实例包括N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶(ethanocytosine)、7-脱氮黄苷(deazaxanthosine)、7-脱氮鸟苷、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基-腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、假尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤.在一些实施方案中，碱基部分可以是嘌呤或嘧啶以外的杂环碱基.杂环碱基可以任选地经修饰和/或被取代.
糖部分包括天然未修饰的糖，例如单糖(例如，戊糖，如核糖、脱氧核糖)，经修饰的糖和糖类似物.通常，核甘酸单体，特别是糖部分的可能的修饰包括例如将一个或更多个羟基替换成卤素、杂原子、脂族基团，或者将羟基官能化为醚、胺、硫醇等.
经修饰核甘酸单体的一个特别有用的基团是2’-O-甲基核苷酸.这样的2’-O-甲基核苷酸可以称为“甲基化的”，相应核苷酸可以由未甲基化核苷酸制备然后烷基化制备，或者直接由甲基化的核苷酸试剂制备.经修饰核甘酸单体可与未经修饰核甘酸单体组合使用.例如，本发明寡核苷酸可以包含甲基化和未甲基化核甘酸单体二者.
一些示例性经修饰核甘酸单体包括糖或骨架被修饰的核糖核苷酸.经修饰核糖核苷酸可以含有非天然存在的碱基(代替天然存在的碱基)，例如在5’-位被修饰的尿苷或胞苷，例如5’-(2-氨基)丙基尿苷和5’-溴尿苷；在8位被修饰的腺苷和鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；以及N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷.另外，糖被修饰的核糖核苷酸可将2’-OH基团替换成H、烷氧基(或OR)、R或烷基、卤素、SH、SR、氨基(例如NH2、NHR、NR2)或CN基团，其中R是低级烷基、烯基或炔基.
经修饰核糖核苷酸还可以将与相邻核糖核苷酸连接的磷酸二酯基团替换成经修饰基团，例如硫代磷酸酯基团.更普遍地，多种核苷酸修饰可以组合.
尽管反义(引导)链可以与靶基因(或多个靶基因)的至少一部分基本上相同，但是至少对于碱基配对特性来说，序列不必完全相同才可用于例如抑制靶基因表型的表达.通常，更高同源性可用于弥补较短反义基因的使用.在一些情况下，反义链通常与靶基因基本相同(尽管是在反义方向).
在希望最小化细胞应激响应的情况下，使用2’-O-甲基修饰的RNA也可能是有益的.具有2’-O-甲基核甘酸单体的RNA可能不被认为是识别未经修饰RNA的细胞机器识别.2′-O-甲基化或部分2’-O-甲基化的RNA的使用可以避免对于双链核酸的干扰素响应，同时保持靶RNA抑制.这可用于例如在诱导干扰素响应的短RNAi(例如，siRNA)序列和可能诱导干扰素响应的更长RNAi序列二者情况下避免干扰素或其他细胞应激响应.
总体上，经修饰糖可以包括D-核糖、2’-O-烷基(包括2’-O-甲基和2’-O-乙基)，即2’-烷氧基、2’-氨基、2’-S-烷基、2’-卤素(包括2’-氟)、2’-甲氧基乙氧基、2’-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2’-炔丙基、2’-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基和氰基等.在一个实施方案中，糖部分可以是己糖并且并入到寡核苷酸中，如(Augustyns，K.，等，Nucl.Acids.Res.18：4711(1992))所述.示例性核甘酸单体可见于例如美国专利No.5,849,902，其通过引用并入本文.
下文更加详细地描述了特定官能团和化学术语的定义.为了本发明的目的，化学元素是根据元素周期表，CAS版，Handbook of Chemistry and Physics，第75版，内封面鉴定，特定官能团如本文中所述一般定义.另外，有机化学的一般原则以及特定官能部分和反应性描述在Organic Chemistry，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito：1999中，其全部内容通过引用并入本文.
本发明的某些化合物可以以特定几何或立体异构形式存在.本发明预期所有这样的化学物(包括顺式和反式异构体，R-和S-对映体、非对映体、(D)-异构体、(L)-异构体，其外消旋混合物及其其他混合物)落入本发明范围内.取代基如烷基中可以存在额外的不对称碳原子.所有这样的异构体及其混合物预期包括在本发明内.
可以根据本发明使用包含多种异构体比例之任一的异构混合物.例如，在仅两种异构体组合的情况下，包含50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、95∶5、96∶4、97∶3、98∶2、99∶1或100∶0异构体比例的混合物均被本发明所预期.本领域技术人员将容易理解，预期到类似比例用于更复杂的异构体混合物.
例如，如果期望本发明化合物的特定对映体，可以通过不对称合成或者利用手性助剂衍生(derivation)来制备，其中将所得非对映体混合物分离并且切割辅助基团以提供纯的期望的对映体.或者，在分子包含碱性官能团如氨基，或者酸性官能团如羧基情况下，利用合适的光学活性酸或碱形成非对映体盐，然后通过本领域周知的分级结晶或色谱手段拆分如此形成的非对映体，随后回收纯对映体.
在某些实施方案中，本发明寡核苷酸包含3’和5’末端(环形寡核苷酸除外).在一个实施方案中，寡核苷酸的3’和5’末端可以基本上被保护免受核酸酶影响，例如通过3’或5’连接的修饰(例如，美国专利No.5,849,902和WO 98/13526).例如，可以通过纳入“阻断基团”使寡核苷酸有抗性.本文使用的术语“阻断基团”是指可连接到寡核苷酸或核甘酸单体作为保护基或用于合成的偶连基团的取代基(例如，除了OH基团)(例如，FITC、丙基(CH2-CH2-CH3)、乙二醇基(-O-CH2-CH2-O-)、磷酸根(PO3 2-)、磷酸氢根(hydrogen phosphonate)或亚磷酰胺).“阻断基团”还包括保护寡核苷酸的5’和3’末端的“末端阻断基团”或“外切酶阻断基团”，包括经修饰的核苷酸和非核苷酸外切酶抗性结构.
示例性末端阻断基团(end-blocking group)包括帽结构(例如，7-甲基鸟苷帽)、反向核甘酸单体，例如具有3’-3’或5’-5’端反向(参见，例如Ortiagao等.1992.AntisenseRes.Dev.2：129)、甲基磷酸酯、亚磷酰胺、非核苷酸基团(例如，非核苷酸接头、氨基接头、缀合物)等.3’末端核甘酸单体可以包含经修饰糖部分.3’末端核甘酸单体包含3’-O，其可以任选地被阻止寡核苷酸之3’-外切酶降解的阻断基团取代.例如，3′-羟基可以通过3’→3’核苷酸间连接与核苷酸酯化.例如，烷氧基基团可以是甲氧基、乙氧基或异丙氧基，优选乙氧基.任选地，3′末端的3’→3’连接的核苷酸可以通过替代连接来连接.为了降低核酸酶降解，最5’的3′→5’连接可以是经修饰的连接，例如硫代磷酸酯或P-烷氧基磷酸三酯连接.优选地，两个最5′的3’→5’连接是经修饰连接.任选地，5’末端羟基部分可以用含磷的部分酯化，例如磷酸酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸酯.
本领域普通技术人员将理解，本文所述合成方法使用多种保护基.本文使用的术语“保护基”意指特定官能部分(例如O、S或N)被临时阻断，以使得反应可以选择性发生在多官能化合物的另一反应位点.在某些实施方案中，保护基以良好产率选择性反应，以得到对于预计的反应稳定的经保护物质；保护基应可通过不攻击其他官能团的容易获得的、优选无毒的试剂以良好产收率选择性地移除；保护基形成容易分离的衍生物(更优选地不产生新立体中心)；并且保护基具有最小的额外官能性，以避免另外的反应位点.如本文详细描述的，可以使用氧、硫、氮和碳保护基.羟基保护基包括甲基、甲氧基甲基(methoxylmethyl，MOM)、甲硫基甲基(methylthiomethyl，MTM)、叔丁硫基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基((phenyldimethylsilyl)methoxymethyl，SMOM)、苄氧基甲基(benzyloxymethyl，BOM)、对甲氧基苄氧基甲基(p-methoxybenzyloxymethyl，PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基((4-methoxyphenoxy)methyl，p-AOM)、愈创木酚甲基(guaiacolmethyl，GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基(4-pentenyloxymethyl，POM)、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(2-methoxyethoxymethyl，MEM)、2，2，2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(2-(trimethylsilyl)ethoxymethyl，SEMOR)、四氢吡喃基(tetrahydropyranyl，THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(4-methoxytetrahydropyranyl，MTHP)、4-甲氧基四氢硫代吡喃基、4-甲氧基四氢硫代吡喃基S，S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(1-[(2-chloro-4-methyl)phenyl]-4-methoxypiperidin-4-yl，CTMP)、1，4-二烷-2-基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢-7，8，8-三甲基-4，7-亚甲基苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基氢硒基)乙基(2-(phenylselenyl)ethyl)、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2，4-二硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2，6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧、二苯基甲基、p，p′-二硝基二苯甲基(p，p′-dinitrobenzhydryl)、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4′-溴苯甲酰甲基氧基苯基)二苯基甲基、4，4′，4″-三(4，5-二氯邻苯二甲酰亚氨基苯基)甲基、4，4′，4″-三(乙酰丙酰基(levulinoyl)氧基苯基)甲基、4，4′，4″-三(苯甲酰基氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)双(4′，4″-二甲氧基苯基)甲基、1，1-双(4-甲氧基苯基)-1′-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1，3-苯并二噻吩(thiolan)-2-基、S，S-二氧苯并异噻唑基、三甲基甲硅烷基(trimethylsilyl，TMS)、三乙基甲硅烷基(triethylsilyl，TES)、三异丙基甲硅烷基(triisopropylsilyl，TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(dimethylisopropylsilyl，IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(diethylisopropylsilyl，DEIPS)、二甲基己基甲硅烷基(dimethylthexylsilyl)、叔丁基二甲基甲硅烷基(t-butyldimethylsilyl，TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(t-butyldiphenylsilyl，TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三-对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(diphenylmethylsilyl，DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(t-butylmethoxyphenylsilyl，TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4，4-(乙二硫基)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫缩醛)、新戊酸酯、adamantoate、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2，4，6-三甲基苯甲酸酯(mesitoate)、烷基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯(9-fluorenylmethyl carbonate，Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、烷基2，2，2-三氯乙基碳酸酯(alkyl2，2，2-trichloroethyl carbonate，Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(2-(trimethylsilyl)ethyl carbonate，TMSEC)、2-(苯基磺酸基)乙基碳酸酯(2-(phenylsulfonyl)ethyl carbonate，Psec)、2-(三苯基磷基)乙基碳酸酯(2-(triphenylphosphonio)ethyl carbonate，Peoc)、烷基异丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基对硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基对甲氧基苄基碳酸酯、烷基3，4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基邻硝基苄基碳酸酯、烷基对硝基苄基碳酸酯、烷基S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、甲基二硫代碳酸酯、2-碘代苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲基硫甲氧基)乙基、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2，6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2，6-二氯-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2，4-双(1，1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、邻-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N，N，N’，N’-四甲基二氨基磷酸酯、烷基N-苯基氨基甲酸酯、硼酸酯、二甲基硫膦基、烷基2，4-二硝基苯基次磺酸酯、硫酸酯、甲磺酸酯(mesylate)、苄基磺酸酯和甲苯磺酸酯(tosylate，Ts).为了保护1，2-或1，3-二醇，保护基包括亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯基亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2，2，2-三氯亚乙基缩醛、丙酮化合物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对甲氧基亚苄基缩醛、2，4-二甲氧基亚苄基缩酮、3，4-二甲氧基亚苄基缩醛、2-硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基亚乙基原酸酯、1，2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基亚苄基原酸酯、1-(N，N-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(N，N’-二甲基氨基)亚苄基衍生物、2-氧杂亚环戊基原酸酯、二叔丁基亚甲硅烷基(di-t-butylsilylene group，DTBS)、1，3-(1，1，3，3-四异丙基二硅亚烷基)衍生物(1，3-(1，1，3，3-tetraisopropyldisiloxanylidene)derivative，TIPDS)、四叔丁氧基二硅氧烷-1，3-亚二基衍生物(tetra-t-butoxydisiloxane-1，3-diylidene derivative，TBDS)、环状碳酸酯、环状硼酸酯、硼酸乙酯和硼酸苯酯.氨基保护基包括氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴基甲基氨基甲酸酯(9-fluorenylmethyl carbamate，Fmoc)、9-(2-磺基)芴基甲基氨基甲酸酯、9-(2，7-二溴)芴基甲基氨基甲酸酯、2，7-二叔丁基-[9-(10，10-二氧代-10，10，10，10-四氢噻吨基)]甲基氨基甲酸酯(2，7-di-t-butyl-[9-(10，10-dioxo-10，10，10，10-tetrahydrothioxanthyl)]methyl carbamate，DBD-Tmoc)、4-甲氧基苯甲酰甲基氨基甲酸酯(4-methoxyphenacyl carbamate，Phenoc)、2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯(2-trimethylsilylethyl carbamate，Troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(2-trimethylsilylethyl carbamate，Teoc)、2-苯基乙基氨基甲酸酯(2-phenylethylcarbamate，hZ)、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(1-(1-adamantyl)-1-methylethyl carbamate，Adpoc)、1，1-二甲基-2-卤代乙基氨基甲酸酯、1，1-二甲基-2，2-二溴乙基氨基甲酸酯(1，1-dimethyl-2，2-dibromoethyl carbamate，DB-t-BOC)、1，1-二甲基-2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯(1，1-dimethyl-2，2，2-trichloroethyl carbamate，TCBOC)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基氨基甲酸酯(1-methyl-1-(4-biphenylyl)ethylcarbamate，Bpoc)、1-(3，5-二叔丁基苯基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(1-(3，5-di-t-butylphenyl)-1-methylethyl carbamate，t-Bumeoc)、2-(2′-和4′-吡啶基)乙基氨基甲酸酯(2-(2′-and 4′-pyridyl)ethyl carbamate，Pyoc)、2-(N，N-二环己基甲酰胺)乙基氨基甲酸酯、叔丁基氨基甲酸(t-butyl carbamate，BOC)、1-金刚烷基氨基甲酸酯(1-adamantylcarbamate，Adoc)、乙烯基氨基甲酰酯(vinyl carbamate，Voc)、烯丙基氨基甲酸酯(allylcarbamate，Alloc)、1-异丙基烯丙基氨基甲酸酯(1-isopropylaHyl carbamate，Ipaoc)、肉桂基氨基甲酸酯(cinnamyl carbamate，Coc)、4-硝基肉桂基氨基甲酸酯(4-nitrocinnamylcarbamate，Noc)、8-喹啉基氨基甲酸酯、N-羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫基氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯(benzyl carbamate，Cbz)、对甲氧基苄基氨基甲酸酯(p-methoxybenzyl carbamate，Moz)、对硝基苄基氨基甲酸酯、对溴苄基氨基甲酸酯、对氯苄基氨基甲酸酯、2，4-二氯苄基氨基甲酸酯、4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯(4-methylsulfinylbenzyl carbamate，Msz)、9-蒽基甲基氨基甲酸酯、二苯基甲基氨基甲酸酯、2-甲硫基乙基氨基甲酸酯、2-甲基磺酰基乙基氨基甲酸酯、2-(对甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2-(1，3-二thianyl)]甲基氨基甲酸酯([2-(1，3-dithianyl)]methyl carbamate，Dmoc)、4-甲硫基苯基氨基甲酸酯(4-methylthiophenyl carbamate，Mtpc)、2，4-二甲硫基苯基氨基甲酸酯(2，4-dimethylthiophenyl carbamate，Bmpc)、2-磷基乙基氨基甲酸酯(2-phosphonioethyl carbamate，Peoc)、2-三苯基磷基异丙基氨基甲酸酯(2-triphenylphosphonioisopropyl carbamate，Ppoc)、1，1-二甲基-2-氰基乙基氨基甲酸酯、间氯-对-酰氧基苄基氨基甲酸酯、对-(二羟基硼烷基)苄基氨基甲酸酯、5-苯并异唑基(benzisoxazolyl)甲基氨基甲酸酯、2-(三氟甲基)-6-色酮基甲基氨基甲酸酯(2-(trifluoromethyl)-6-chromonylmethyl carbamate，Tcroc)、间硝基苯基氨基甲酸酯、3，5-二甲氧基苄基氨基甲酸酯、邻硝基苄基氨基甲酸酯、3，4-二甲氧基-6-硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(邻硝基苯基)甲基氨基甲酸酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、N′-对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、N′-苯基氨基硫代羰基衍生物、叔戊基氨基甲酸酯、S-苄基硫代氨基甲酸酯、对氰基苄基氨基甲酸酯、环丁基氨基甲酸酯、环己基氨基甲酸酯、环戊基氨基甲酸酯、环丙基甲基氨基甲酸酯、对癸氧基苄基氨基甲酸酯、2，2-二甲氧基羰基乙烯基氨基甲酸酯、邻-(N，N-二甲基甲酰胺基)苄基氨基甲酸酯、1，1-二甲基-3-(N，N-二甲基甲酰胺基)丙基氨基甲酸酯、1，1-二甲基丙炔基氨基甲酸酯、二(2-吡啶基)甲基氨基甲酸酯、2-呋喃基甲基氨基甲酸酯、2-碘乙基氨基甲酸酯、异茨烷基(borynl)氨基甲酸酯、异丁基氨基甲酸酯、异烟酰基氨基甲酸酯、对-(p′-甲氧基苯基偶氮)苄基氨基甲酸酯、1-甲基环丁基氨基甲酸酯、1-甲基环己基氨基甲酸酯、1-甲基-1-环丙基甲基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(3，5-二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(对苯基偶氮苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-苯基乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、对-(苯基偶氮)苄基氨基甲酸酯、2，4，6-三叔丁基苯基氨基甲酸酯、4-(三甲基铵)苄基氨基甲酸酯、2，4，6-三甲基苄基氨基甲酸酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯基丙酰胺衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N’-二硫代苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻苯基偶氮苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻-(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺、4，5-二苯基-3-唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫杂琥珀酰亚胺(N-dithiasuccinimide，Dts)、N-2，3-二苯基马来酰亚胺、N-2，5-二甲基吡咯、N-1，1，4，4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(N-1，1，4，4-tetramethyldisilylazacyclopentane adduct，STABASE)、5-取代的1，3-二甲基-1，3，5-三氮杂环己-2-酮、5-取代的1，3-二苄基-1，3，5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3，5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲胺、N-丙烯胺、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺(N-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]methylamine，SEM)、N-3-乙酰氧基丙胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉(pyroolin)-3-基)胺、季铵盐、N-苄胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、N-5-二苯并环庚胺、N-三苯基甲胺(N-triphenylmethylamine，Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(N-[(4-methoxyphenyl)diphenylmethyl]amine，MMTr)、N-9-苯基芴基胺(N-9-phenylfluorenylamine，PhF)、N-2，7-二氯-9-芴基亚甲基胺、N-二茂铁基甲胺(N-ferrocenylmethylamino，Fcm)、N-2-吡啶甲基氨基N’-氧化物、N-1，1-二甲硫基亚甲基胺、N-亚苄基胺、N-对甲氧基亚苄基胺、N-二苯基亚甲基胺、N-[(2-吡啶基)基]亚甲基胺、N-(N’，N’-二甲基氨基亚甲基)胺、N，N’-异亚丙基二胺、N-对硝基亚苄基胺、N-亚水杨基胺、N-5-氯亚水杨基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲基胺、N-亚环己基胺、N-(5，5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基硼酸衍生物、N-[苯基(五羰基铬或钨)羰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝胺、N-亚硝胺(N-nitrosoamine)、胺N-氧化物、二苯基次膦酰胺(diphenylphosphinamide，Dpp)、二甲基硫代次膦酰胺(dimethylthiophosphinamide，Mpt)、二苯基硫代次膦酰胺(diphenylthiophosphinamide，Ppt)、二烷基氨基磷酸酯(dialkyl phosphoramidate)、二苄基氨基磷酸酯、二苯基氨基磷酸酯、苯亚磺酰胺(benzenesulfenamide)、邻硝基苯亚磺酰胺(o-nitrobenzenesulfenamide，Nps)、2，4-二硝基苯亚磺酰胺、五氯苯亚磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯亚磺酰胺、三苯基甲基亚磺酰胺、3-硝基吡啶亚磺酰胺(3-nitropyridinesulfenamide，Npys)、对甲苯磺酰胺(p-toluenesulfonamide，Ts)、苯磺酰胺、2，3，6，-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(2，3，6，-trimethyl-4-methoxybenzenesulfonamide，Mtr)、2，4，6-三甲氧基苯磺酰胺(2，4，6-trimethoxybenzenesulfonamide，Mtb)、2，6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(2，6-dimethyl-4-methoxybenzenesulfonamide，Pme)、2，3，5，6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(2，3，5，6-tetramethyl-4-methoxybenzenesulfonamide，Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(4-methoxybenzenesulfonamide，Mbs)、2，4，6-三甲基苯磺酰胺(2，4，6-trimethylbenzenesulfonamide，Mts)、2，6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(2，6-dimethoxy-4-methylbenzenesulfonamide，iMds)、2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰胺(2，2，5，7，8-pentamethylchroman-6-sulfonamide，Pmc)、甲磺酰胺(methanesulfonamide，Ms)、β-三甲基甲硅烷基乙磺酰胺(β-trimethylsilylethanesulfonamide，SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4′，8′-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(4-(4′，8′-dimethoxynaphthylmethyl)benzenesulfonamide，DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺.本文详细描述了示例性的保护基.但是，应理解的是，本发明并未旨在限于这些保护基，相反，使用上述标准可以容易鉴定多种另外的等效保护基并且用于本发明的方法.另外，多种保护基描述在Protective Groups in Organic Synthesis、第三版.Greene，T.W.和Wuts、P.G.编辑，John Wiley&Sons，New York：1999中，其全部内容通过引用整体并入本.
应理解的是，本文所述化合物可以被任何数目的取代基或官能部分取代.通常，无论前面是否有术语“任选地”的术语“取代”以及在本发明式中所含的取代基，是指将给定结构中的氢基团替换成指定取代基的基团.当任意给定结构中超过一个位置可以被选自特定组的超过一个取代基取代时，每个位置的取代基可以是相同的或不同的.本文使用的术语“取代”预期包括有机化合物的所有可能的取代基.广义来讲，允许的取代基包括有化合物的无环和环形的、支链和无支链的碳环和杂环、芳族和非芳族取代基.杂原子如氮可以具有氢取代基和/或任何可能的本文所述的满足杂原子化合价的有机化合物取代基.此外，本发明并未旨在以任何方式限制有机化合物的可能的取代基.本发明预期的取代基和变量的组合优选地是导致形成可用于治疗例如感染性疾病或增殖性疾病的稳定化合物的那些.本文使用的术语“稳定”优选地是指化合物具有充分稳定性以允许制备，并且化合物的完整性保持充分的一段时间以便检测，以及优选地充分的一段时间以用于本发明详细描述的目的.
本文使用的术语“脂族(aliphatic)”包括饱和和不饱的直链(即，无支链)、支链、无环、环形或多环脂族烃，其任选地被一个或更多个功能团取代.本领域普通技术人员将理解，“脂族”在本文中旨在包括但不限于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基部分.因此，本文使用的术语“烷基”包括直链、支链和环形烷基.类似约定适用于其他通用术语，例如“烯基”、“炔基”等.另外，本发明使用的术语“烷基”、“烯基”、“炔基”等涵盖经取代的和未经取代的基团.在某些实施方案中，本文使用的“低级烷基”是指具有1至6个碳原子的那些烷基(环形、无环、经取代的、未经取代的、支链或无支链的).
在某些实施方案中，本发明中使用的烷基、烯基和炔基含有1-20个脂族碳原子.在某些另外的实施方案中，本发明中使用的烷基、烯基和炔基含有1-10个脂族碳原子.在另一些实施方案中，本发明中使用的烷基、烯基和炔基含有1-8个脂族碳原子.在又一些实施方案中，本发明中使用的烷基、烯基和炔基含有1-6个脂族碳原子.在另一些实施方案中，本发明中使用的烷基、烯基和炔基含有1-4个碳原子.因此，示例性脂族基团包括但不限于例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、-CH2-环丙基、乙烯基、烯丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、-CH2-环丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、-CH2-环戊基、正己基、仲己基、环己基、-CH2-环己基部分等，再一次，其可以具有一个或更多个取代基.烯基包括但不限于例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等.示例性炔基把包括但不限于乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等.
本发明化合物的上述脂族(及其他)部分的取代基的一些实例包括但不限于：脂族、杂脂族、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、杂烷硫基、杂芳硫基、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NO2、-CN、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2NH2、-CH2SO2CH3、-C(O)Rx、-CO2(Rx)、-CON(Rx)2、-OC(O)Rx、-OCO2Rx、-OCON(Rx)2、-N(Rx)2、-S(O)2Rx、-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx独立地包括但不限于脂族、杂脂族、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上文以及本文中所述脂族、杂脂族、芳基烷基或杂芳基烷基取代基中的任一种可以是经取代或未经取代的、支链或无支链的、环形或无环的，并且其中上文以及本文中所述芳基或杂芳基取代基中的任一种可以是经取代的或未经取代的.一般适用的取代基的额外实例通过本文的具体实施方案说明.
本文使用的术语“杂脂族(heteroaliphatic)”是指含有一个或更多个例如替代碳原子的氧、硫、氮、磷或硅原子的脂族部分.杂脂族部分可以是支链、无支链、环形或无环的，并且包括饱和和不饱和杂环，例如吗啉基、吡咯烷基等.在某些实施方案中，杂脂族部分通过将其上面的一个或更多个氢原子独立地替换成一个或更多个包括但不限于以下的部分而被取代：脂族、杂脂族、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、杂烷硫基、杂芳硫基、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NO2、-CN、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2NH2、-CH2SO2CH3、-C(O)Rx、-CO2(Rx)、-CON(Rx)2、-OC(O)Rx、-OCO2Rx、-OCON(Rx)2、-N(Rx)2、-S(O)2Rx、-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx独立地包括但不限于脂族、杂脂族、芳基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上文以及本文中所述脂族、杂脂族、芳基烷基或杂芳基烷基取代基中的任一种可以是经取代或未经取代的、支链或无支链的、环形或无环的，并且其中上文以及本文中所述芳基或杂芳基取代基中的任一种可以是经取代的或未经取代的.一般适用的取代基的额外实例通过本文描述的具体实施方案说明.
本文使用的术语“卤代”和“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子.
术语“烷基”包括饱和的脂族基团，包括直链烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛集、壬基、癸基等)、支链烷基(异丙基、叔丁基、异丁基等)、环烷基(脂环族)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代的环烷基以及环烷基取代的烷基.在某些实施方案中，直链或支链烷基在其骨架中具有6或更少个碳原子(例如，直链为C1-C6，支链为C3-C6)，更优选地4个或更少个.同样地，优选的环烷基在其环结构中具有3至8个碳原子，更优选的在环结构中具有5或6个碳原子.术语C1-C6包括含有1至6个碳原子的烷基.
另外，除非另有说明，否则术语烷基包括“未经取代烷基”和“经取代烷基”，后者是指具有独立选择的取代基的烷基部分，所述取代基替代烃骨架的一个或更多个碳原子上的氢.这样的取代基可以包括例如烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根合(phosphonato)、次膦酸根合(phosphinato)、氰基、氨基(包括烷基烷基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根合(sulfonato)、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳族或杂芳族部分.环烷基可以进一步被例如上述取代基取代.“烷基芳基”或“芳基烷基”部分是芳基取代的烷基(例如，苯甲基(苄基)).术语“烷基”还包含天然和非天然氨基酸的侧链.术语“正烷基”意指直链(即，无分枝)未经取代的烷基.
术语“烯基”包括在长度和可能的取代方面与上述烷基类似但是包含至少一个双键的不饱和脂族基团.例如，术语“烯基”包括直链烯基(例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)、支链烯基、环烯基(脂环族)基团(环丙烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基)、烷基或烯基取代的环烯基、以及环烷基或环烯基取代的炔基.在某些实施方案中，直链或支链烯基在其骨架中具有6个或更少的碳原子(即，直链为C2-C6、支链为C3-C6).同样地，环烯基在其环结构中可以具有3至8个碳原子，更优选地在环结构中具有5或6个碳.术语C2-C6包括含有2至6个碳原子的烯基.
另外，除非另有说明，术语烯基包括“未经取代的烯基”和“经取代的烯基”，后者是指具有独立选择的取代基的烯基部分，所述取代基替代烃骨架的一个或更多个碳原子上的氢.这样的取代基可以包括例如烷基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根合、次膦酸根合、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根合、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳族或杂芳族部分.
术语“炔基”包括在长度和可能的取代方面与上述烷基类似但是含有至少一个三键的不饱和脂族基团.例如，术语“炔基”包括直链炔基(例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)、支链炔基、以及环烷基或环烯基取代的炔基.在某些实施方案中，直链或支链炔基在其骨架中具有6个或更少的碳原子(即，直链为C2-C6、支链为C3-C6).术语C2-C6包括含有2至6个碳原子的炔基.
另外，除非另有说明，术语烯基包括“未经取代的炔基”和“经取代的炔基”，后者是指具有独立选择的取代基的炔基部分，所述取代基替代烃骨架的一个或更多个碳原子上的氢.这样的取代基可以包括例如烷基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯(carboxylate)、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根合、次膦酸根合、氰基、氨基(包括烷基烷基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根合、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳族或杂芳族部分.
除非另外说明碳的数目，否则本文使用的“低级烷基”意指上文定义烷基，但是在其骨架结构中具有1至5个碳原子.“低级烯基”和“低级炔基”的链长为例如2至5个碳原子.
术语“烷氧基”包括与氧原子共价连接的经取代和未经取代的烷基、烯基和炔基.烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基.经取代的烷氧基的实例包括卤代烷氧基.烷氧基可以被独立选择的基团取代，例如烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根合、次膦酸根合、氰基、氨基(包括烷基烷基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根合、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳族或杂芳族部分.卤素取代的烷氧基的实例包括但不限于氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基等.
术语“杂原子”包括碳或氢以外任何元素的原子.优选的杂原子是氮、氧、硫和磷.
术语“氢氧基”或“羟基”包括具有-OH或-O-(具有合适的抗衡离子)的基团.
术语“卤素”包括氟、溴、氯、碘等.术语“全卤化”通常是指其中所有氢被卤素原子取代的部分.
术语“经取代”包括独立选择的取代基，所述取代基可以位于所述部分上并且允许分子执行其预期功能.取代基的实例包括烷基、烯基、炔基、芳基、(CR′R″)0-3NR′R″、(CR′R″)0-3CN、NO2、卤素、(CR′R″)0-3C(卤素)3、(CR′R″)0-3CH(卤素)2、(CR′R″)0-3CH2(卤素)、(CR′R″)0-3CONR′R″、(CR′R″)0-3S(O)1-2NR′R″、(CR′R″)0-3CHO、(CR′R″)0-3O(CR′R″)0-3H、(CR′R″)0- 3S(O)0-2R′、(CR′R″)0-3O(CR′R″)0-3H、(CR′R″)0-3COR′、(CR′R″)0-3CO2R′或(CR′R″)0-3OR′基团；其中每个R′和R″各自独立地为氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基或芳基，或者R′和R″一起为亚苄基或-(CH2)2O(CH2)2-基团.
术语“胺”或“氨基”包括其中氮原子与至少一个碳或杂原子共价结合的化合物或部分.术语“烷基氨基”包括其中氮与至少一个另外的烷基结合的基团和化合物.术语“二烷基氨基”包括其中氮原子与至少两个另外的烷基结合的基团.
术语“醚”包括含有与两个不同碳原子或杂原子键合的氧的化合物或部分.例如，术语“烷氧基烷基”是指与氧原子共价键合的烷基、烯基或炔基，所述氧与另一个烷基共价结合.
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”是指两个或更多个核苷酸的聚合物.多核苷酸可以是DNA、RNA或其衍生物或经修饰形式.多核苷酸可以是单链或双链.多核苷酸可以例如在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架上修饰以改善分子的稳定性、其杂交参数等.多核苷酸可以包含经修饰碱基部分，所述经修饰碱基部分选自包括但不限于以下的组：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、wybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤.多核苷酸可以包含经修饰糖部分(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、2′-O-甲基胞苷、阿拉伯糖和己糖)和/或经修饰磷酸酯部分(例如，硫代磷酸酯和5′-N-亚磷酰胺连接).核苷酸序列通常携带遗传信息，包括细胞机器用于产生蛋白质和酶的信息.这些术语包括双链和单链基因组和cDNA、RNA、任何合成和遗传操作的多核苷酸以及有义和反义多核苷酸.这包括单链和双链分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂交体，以及通过碱基与氨基酸骨架缀合形成的“蛋白质核酸(protein nucleic acids，PNA)”.
术语“碱基”包括已知的嘌呤和嘧啶杂环碱基、脱氮嘌呤及其类似物(包括杂环取代的类似物，例如氨基乙氧基吩嗪)、衍生物(例如，1-烷基-、1-烯基-、杂芳族-和1-炔基衍生物)和互变异构体.嘌呤的实例包括腺嘌呤、鸟嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和黄嘌呤，及其类似物(例如，8-氧代-N6-甲基腺嘌呤或7-二氮杂黄嘌呤)和衍生物.嘧啶包括例如胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶，及其类似物(例如，5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(1-丙炔基)尿嘧啶、5-(1-丙炔基)胞嘧啶和4，4-桥亚乙基胞嘧啶).合适的碱基的其他实例包括非嘌呤基和非嘧啶基碱基，例如2-氨基吡啶和三嗪类.
在一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸的核甘酸单体是RNA核苷酸.在另一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸的核甘酸单体是经修饰RNA核苷酸.因此，寡核苷酸包含经修饰RNA核苷酸.
术语“核苷”包含与糖部分、优选核糖或脱氧核糖共价连接的碱基.优选核苷的实例包括核糖核苷和脱氧核糖核苷.核苷还包括与氨基酸或氨基酸类似物连接的碱基，所述氨基酸或氨基酸类似物可以包含游离羧基、游离氨基或保护基.合适的保护基是本领域中周知的(参见P.G.M.Wuts和T.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”，第2版，Wiley-Interscience，New York，1999).
术语“核苷酸”包括进一步包含磷酸基团(phosphate group)或磷酸类似物的核苷.
核酸分子可以与疏水部分缔合用于将分子靶向和/或递送至细胞.在某些实施方案中，疏水部分通过接头与核酸分子缔合.在某些实施方案中，缔合通过非共价相互作用.在另一些实施方案中，缔合通过共价键.本领域已知的任何接头可用于使核酸与疏水部分缔合.本领域中已知的接头描述在公开的国际PCT申请WO 92/03464、WO 95/23162、WO2008/021157、WO 2009/021157、WO 2009/134487、WO 2009/126933、美国专利申请公开2005/0107325、美国专利5,414,077、美国专利5,419,966、美国专利5,512,667、美国专利5,646,126和美国专利5,652,359中，其通过引用并入本文.接头可以从简单至共价键合到多原子(multi-atom)接头.接头可以是环形的或无环的.接头可以是任选经取代的.在某些实施方案中，接头能够从核酸切掉.在某些实施方案中，接头能够在生理条件下水解.在某些实施方案中，接头能够通过酶(例如酯酶或磷酸二酯酶)切掉.在某些实施方案中，接头包含用于将核酸与疏水部分分隔开的间隔元件.间隔元件可以包含1至30个碳或杂原子.在某些实施方案中，接头和/或间隔元件包含可质子化官能团.这样的可质子化官能团可以促进核酸分子的内体逃逸(endosomal escape).可质子化官能团还可能有助于将核酸递送至细胞，例如中和分子的全部电荷.在另一些实施方案中，接头和/或间隔元件是生物学惰性的(即，不影响所得核酸分子的生物学活性或功能).
在某些实施方案中，具有接头和疏水部分的核酸分子是本文所述的式.在某些实施方案中，核酸分子是下式：
其中
X是N或CH；
A是键；经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族；
R1是疏水部分；
R2是氢；氧保护基；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的脂族；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的杂脂族；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的杂芳基；并且
R3是核酸.
在某些实施方案中，分子是下式：
在某些实施方案中，分子是下式：
在某些实施方案中，分子是下式：
在某些实施方案中，分子是下式：
在某些实施方案中，X是N.在某些实施方案中，X是CH.
在某些实施方案中，A是键.在某些实施方案中，A是经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族.在某些实施方案中，A是无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的脂族.在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、支链或无支链的脂族.在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的脂族.在某些实施方案中，A是无环的、经取代、无支链的烷基.在某些实施方案中，A是无环的、经取代、无支链的C1-20烷基.在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的C1-12烷基.在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的C1-10烷基.在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的C1-8烷基.在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的C1-6烷基.在某些实施方案中，A是经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族.在某些实施方案中，A是无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的杂脂族.在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、支链或无支链的杂脂族.在某些实施方案中，A是无环的、经取代的、无支链的杂脂族.
在某些实施方案中，A是下式：
在某些实施方案中，A是下式之一：
在某些实施方案中，A是下式之一：
在某些实施方案中，A是下式之一：
在某些实施方案中，A是下式：
在某些实施方案中，A是下式：
在某些实施方案中，A是下式：
其中
每次出现的R独立地为天然或非天然氨基酸的侧链；并且
n是1至20的整数并且包括1和20.在某些实施方案中，A是下式：
在某些实施方案中，每次出现的R独立地为天然氨基酸的侧链.在某些实施方案中，n是1至15的整数并且包括1和15.在某些实施方案中，n是1至10的整数并且包括1和10.在某些实施方案中，n是1至5的整数并且包括1和5.
在某些实施方案中，A是下式：
其中n是1至20的整数并且包括1和20.在某些实施方案中，A是下式：
在某些实施方案中，n是1至15的整数并且包括1和15.在某些实施方案中，n是1至10的整数并且包括1和10.在某些实施方案中，n是1至5的整数并且包括1和5.
在某些实施方案中，A是下式：
其中n是1至20的整数并且包括1和20.在某些实施方案中，A是下式：
在某些实施方案中，n是1至15的整数并且包括1和15.在某些实施方案中，n是1至10的整数并且包括1和10.在某些实施方案中，n是1至5的整数并且包括1和5.
在某些实施方案中，分子是下式：
其中X、R1、R2和R3如本文所定义；并且
A′是经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族.
在某些实施方案中，A′是下式之一：
在某些实施方案中，A是下式之一：
在某些实施方案中，A是下式之一：
在某些实施方案中，A是下式：
在某些实施方案中，A是下式：
在某些实施方案中，R1是类固醇.在某些实施方案中，R1是胆固醇.在某些实施方案中，R1是亲脂性维生素.在某些实施方案中，R1是维生素A.在某些实施方案中，R1是维生素E.
在某些实施方案中，R1是下式：
其中RA是经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族.
在某些实施方案中，R1是下式：
在某些实施方案中，R1是下式：
在某些实施方案中，R1是下式：
在某些实施方案中，R1是下式：
在某些实施方案中，R1是下式：
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
其中
X是N或CH；
A是键；经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族；
R1是疏水部分；
R2是氢；氧保护基；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的脂族；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的杂脂族；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的杂芳基；并且
R3是核酸.
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
其中
X是N或CH；
A是键；经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族；
R1是疏水部分；
R2是氢；氧保护基；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的脂族；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的杂脂族；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的杂芳基；并且
R3是核酸.
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
其中
X是N或CH；
A是键；经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的脂族；或者经取代或未经取代的、环形或无环的、支链或无支链的杂脂族；
R1是疏水部分；
R2是氢；氧保护基；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的脂族；环形或无环的、经取代或未经取代的、支链或无支链的杂脂族；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的芳基；经取代或未经取代的、支链或无支链的杂芳基；并且
R3是核酸.在某些实施方案中，核酸分子是下式：
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
其中R3是核酸.
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
其中R3是核酸；并且
n是1至20的整数并且包括1和20.
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
在某些实施方案中，核酸分子是下式：
本文使用的术语“连接(linkage)”包括共价偶连相邻核甘酸单体的天然存在的未经修饰的磷酸二酯部分(-O-(PO2-)-O-).本文使用的术语“替代连接(substitutelinkage)”包括共价偶连相邻核甘酸单体的天然磷酸二酯基团的任何类似物或衍生物.替代连接包括磷酸二酯类似物，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，和P-乙氧基磷酸二酯、P-乙氧基磷酸二酯、P-烷氧基磷酸三酯、甲基磷酸酯以及不含磷的(nonphosphoruscontaining)连接，例如缩醛和酰胺.这样的替代连接是本领域中已知的(例如，Bjergarde等.1991.Nucleic Acids Res.19：5843；Caruthers等.1991.NucleosidesNucleotides.10：47).在某些实施方案中，优选不可水解连接，例如硫氮磷酸酯连接.
在某些实施方案中，本发明寡核苷酸包含疏水修饰的核苷酸或“疏水修饰”.本文使用的“疏水修饰”是指经修饰以使得如下的碱基：(1)碱基的整体疏水性显著增加，和/或(2)碱基依然能够形成接近常规的沃森-克里克相互作用.碱基修饰的多种非限制性实例包括5位尿苷和胞苷修饰，如苯基、4-吡啶基、2-吡啶基、吲哚基和异丁基、苯基(C6H5OH)；色氨酰基(C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、异丁基、丁基、氨基苄基；苯基；和萘基.
可以连接在sd-rxRNA的末端(3’或5’末端)、环区域或任何其他部分的另外类型的缀合物可包括固醇、固醇型分子、肽、小分子、蛋白质等.在一些实施方案中，sd-rxRNA可以含有超过一种缀合物(化学性质相同或不同).在一些实施方案中，缀合物是胆固醇.
提高靶基因特异性或者减少脱靶沉默效果的另一种方法是在对应于引导序列的第二个5’端核苷酸的位置引入2’修饰(例如，2’-O甲基修饰).本发明的反义(引导)序列可以是包含RNA样区域和DNA样区域的“嵌合寡核苷酸”.
专用语“RNA酶H激活区域”包括能够募集RNA酶H以切割寡核苷酸所结合的靶RNA链的寡核苷酸(例如，嵌合寡核苷酸)区域.通常，RNA酶激活区域包含DNA或DNA样核甘酸单体的最小核心(至少约3至5、通常约3至12、更通常约5至12、以及更优选约5至10个连续核甘酸单体)(参见，例如美国专利No.5,849,902).优选地，RNA酶激活区域包含约9个连续的含脱氧核糖的核甘酸单体.
专用语“非激活区域”包括不能募集或激活RNA酶H的反义序列(例如，嵌合寡核苷酸)区域.优选地，本发明的非激活区域不包含硫代磷酸酯DNA.本发明的寡核苷酸区域包含至少一个非激活区域.在一个实施方案中，非激活区域对于核酸酶可以是稳定的，或者可以通过与靶标互补并同待与寡核苷酸结合的靶核酸分子形成氢键来提供靶标特异性.
在一个实施方案中，连续多核苷酸的至少一部分通过替代连接(例如，硫代磷酸酯连接)连接.
在某些实施方案中，引导链(2’-修饰的或未修饰的)以外的大部分或全部核苷酸通过硫代磷酸酯连接进行连接.由于对于血清蛋白质的更高亲和力，这样的构建体倾向于具有改善的药代动力学.一旦引导链装载入RISC，多核苷酸的非引导序列部分中的硫代磷酸酯连接通常不干扰引导链活性.本文令人惊讶地证明，高水平的硫代磷酸酯修饰可以实现改进的递送.在一些实施方案中，引导链和/或负载链是完全硫代磷酸酯化的.
本发明的反义(引导)序列可以包含“吗啉代寡核苷酸”.吗啉代寡核苷酸是非离子的并且通过不依赖于RNA酶H的机制起作用.吗啉代寡核苷酸的四种遗传碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶)中的每一种都与6元吗啉环连接.通过将4种不同亚基类型经例如非离子的二氨基磷酸盐亚基间连接进行连结来制备吗啉代寡核苷酸.吗啉代寡核苷酸具有许多优点，包括：完全抗核酸酶(Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1996.6：267)；可预测的靶向性(Biochemica Biophysica Acta.1999.1489：141)；细胞中的可靠活性(Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1997.7：63)；优异序列特异性(Antisense&Nucl.AcidDrug Dev.1997.7：151)；最小非反义活性(Biochemica Biophysica Acta.1999.1489：141)；以及简单的渗透或刮擦递送(Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1997.7：291).吗啉代寡核苷酸还由于其在高剂量时无毒性而成为优选的.关于吗啉代寡核苷酸的制备的讨论可见于Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.1997.7：187.
基于本文描述的数据，认为本文所述的化学修饰促进单链多核苷酸装载入RISC.已经表明单链多核苷酸在装载入RISC中时有活性并且诱导基因沉默.但是与双链体多核苷酸比较时，单链多核苷酸的活性水平似乎低2至4个数量级.
本发明提供了对化学修饰模式的描述，其可以(a)显著提高单链多核苷酸的稳定性，(b)促进多核苷酸有效装载入RISC复合物，以及(c)提高细胞对单链核苷酸的摄取.化学修饰模式可以包括核糖、骨架、疏水核苷和缀合物类型之修饰的组合.另外，在一些实施方案中，单多核苷酸的5’端可以是化学磷酸化的.
在另一些实施方案中，本发明提供了对化学修饰模式的描述，其改善RISC抑制多核苷酸的功能.已经表明单链多核苷酸通过底物竞争机制抑制预装载的RISC复合物的活性.对于这些类型的分子(通常称为拮抗剂)，活性通常需要高浓度，并且体内递送不是非常有效.本发明提供了对化学修饰模式的描述，其可以(a)显著提高单链多核苷酸的稳定性，(b)促进作为底物的多核苷酸被RISC有效识别，和/或(c)提高细胞对单链核苷酸的摄取.化学修饰模式可以包括核糖、骨架、疏水核苷和缀合物类型之修饰的组合.
本发明提供的修饰适用于所有多核苷酸.这包括单链RISC进入多核苷酸、单链RISC抑制多核苷酸、可变长度(15至40bp)的常规双链体多核苷酸、不对称双链多核苷酸等.多核苷酸可以以多种化学修饰模式进行修饰，包括5’端、核糖、骨架和疏水核苷修饰.
本发明的一些方面涉及经硫代磷酸酯骨架修饰高度修饰的核酸分子.在PCT公开No.WO2011/119852中公开了高度活性的完全硫代磷酸酯化化合物(21552)，其通过引用并入本文.令人感兴趣的是，包含经完全硫代磷酸酯修饰的21mer引导链的化合物是活性的，然而，将引导链长度减少两个核苷酸，例如19mer引导链(21550)，导致活性降低.不希望受到任何理论约束，将引导链从19个核苷酸增加到21个核苷酸(完全硫代磷酸酯化引导链)可以提高引导链与mRNA之间的解链温度，实现增强的沉默活性.改变13mer负载链上的硫代磷酸酯含量使得其被完全硫代磷酸酯修饰或含有6个硫代磷酸酯修饰不会导致活性改变(如PCT公开No.WO2011/119852中公开的21551相对于21556).
过去几个小组曾试图开发完全硫代磷酸酯化的RNAi化合物.缺乏单链区的完全硫代磷酸酯化双链体之前已经设计并测试，但是这些化合物没有证实可接受的药代动力学曲线.先前也已经设计了完全硫代磷酸酯化的单链RNAi化合物，但是这些化合物没有有效地进入RISC.PCT公开No.WO2011/119852(其通过引用整体并入本文)公开了高效进入RISC并且包含完全硫代磷酸酯化骨架的杂交RNAi化合物.
在一些方面，本公开内容涉及具有高度硫代磷酸酯化骨架(例如，具有至少一个具有完全硫代磷酸酯化骨架或几乎完全硫代磷酸酯化骨架(例如，具有一个未硫代磷酸酯化残基)的链)的分离的双链核酸分子的发现.本文令人惊讶地发现，相对于具有较少硫代磷酸酯修饰(例如，不具有至少一个完全硫代磷酸酯化或几乎完全硫代磷酸酯化的链)的分离的双链核酸分子，高水平的硫代磷酸酯修饰介导提高中枢神经系统(CNS)中分离的双链核酸分子的细胞摄取水平.
合成
本发明的寡核苷酸可以通过本领域中已知的任何方法合成，例如使用酶促合成和/或化学合成.寡核苷酸可以在体外(例如，使用酶促合成和化学合成)或体内(使用本领域公知的重组DNA技术)合成.
在一个优选实施方案中，将化学合成用于经修饰的多核苷酸.线性寡核苷酸的化学合成是本领域中公知的并且可以通过溶液相或固相技术实现.优选地，通过固相方法合成.可以使用多种不同合成方法中的任一种制备寡核苷酸，包括亚磷酰胺、亚磷酸三酯、H-膦酸酯和磷酸三酯方法，通常通过自动合成方法进行.
寡核苷酸合成方案是本领域中公知的，可以见于例如：美国专利No.5,830,653；WO98/13526；Stec等.1984.J.Am.Chem.Soc.106：6077；Stec等.1985.J.Org.Chem.50：3908；Stec等.J.Chromatog.1985.326：263；LaPlanche等.1986.Nucl.Acid.Res.1986.14：9081；Fasman G.D.，1989.Practical Handbook of Biochemistry and MolecularBiology.1989.CRC Press，Boca Raton，Fla.；Lamone.1993.Biochem.Soc.Trans.21：1；美国专利No.5,013,830；美国专利No.5,214,135；美国专利No.5,525,719；Kawasaki等.1993.J.Med.Chem.36：831；WO 92/03568；美国专利No.5,276,019；和美国专利No.5,264,423.
所选择的合成方法可取决于期望的寡核苷酸长度，并且这样的选择在本领域一般技术人员能力之内.例如，亚磷酰胺和亚磷酸三酯方法可以产生具有175或更多个核苷酸的寡核苷酸，而H-膦酸酯方法很好的用于小于100个核苷酸的寡核苷酸.如果向寡核苷酸中并入经修饰碱基，特别是如果使用经修饰磷酸二酯连接，则根据需要按照已知流程改变合成流程.在这一点上，Uhlmann等.(1990，Chemical Reviews 90：543-584)提供了用于制备具有经修饰碱基和经修饰磷酸二酯连接的寡核苷酸的参考和概括流程.用于制备寡核苷酸的其他示例性方法在Sonveaux.1994.“Protecting Groups in OligonucleotideSynthesis”；Agrawal.Methods in Molecular Biology 26：1中教导.示例性合成方法还在“Oligonucleotide Synthesis-A Practical Approach”(Gait，M.J.IRL Press at OxfordUniversity Press.1984)中教导.另外，限定序列的线性寡核苷酸，包括具有经修饰核苷酸的一些序列，可以从多种商业来源容易获得.
寡核苷酸可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者通过多种色谱方法(包括凝胶色谱和高压液相色谱)之任一来纯化.为了确认核苷酸序列，尤其是未经修饰的核苷酸序列，可以通过任意已知方法对寡核苷酸进行DNA测序，包括Maxam和Gilbert测序、Sanger测序、毛细管电泳测序、漂移斑点测序方法(wandering spot sequencing procedure)或者通过使用与Hybond纸结合的寡核苷酸的选择性化学降解.还可以通过激光解吸质谱或快原子轰击来分析短寡核苷酸的序列(McNeal，等.，1982，J.Am.Chem.Soc.104：976；Viari，等.，1987，Biomed.Environ.Mass Spectrom.14：83；Grotjahn等.，1982，Nuc.Acid Res.10：4671).测序方法也适用于RNA寡核苷酸.
可以通过毛细管电泳测试寡核苷酸和使用例如Bergot和Egan.1992.J.Chrom.599：35之方法的变性强阳离子HPLC(SAX-HPLC)来确认合成的寡核苷酸的质量.
其他示例性合成技术是本领域中公知的(参见，例如，Sambrook等.，MolecularCloning：a Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，第I和II卷(DNGlover Ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M J Gait Ed，1984；Nucleic AcidHybridisation(B D Hames and S J Higgins eds.1984)；A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；或者Methods in Enzymology系列(Academic Press，Inc.)).
在某些实施方案中，本发明RNAi构建体或者其至少一部分转录自编码本发明构建体的表达载体.任何本领域认识的载体都可用于该目的.转录的RNAi构建体可以被分离和纯化，之后进行期望的修饰(例如，将未经修饰的有义链替换成经修饰的有义链，等等).
细胞对寡核苷酸的摄取
寡核苷酸和寡核苷酸组合物接触(即，使接触，在本文中也称为施用或递送到)一个/种或更多个/种细胞或细胞裂解物并且被其摄取.术语“细胞”包括原核细胞和真核细胞，优选脊椎动物细胞，更优选哺乳动物细胞.在一个优选实施方案中，使本发明的寡核苷酸组合物接触人细胞.
本发明的寡核苷酸组合物可以在体外(例如在试管或培养皿中)(并且可以引入或不引入对象)或者在体内(例如在对象如哺乳动物对象中)接触细胞.在一些实施方案中，局部或通过电穿孔施用寡核苷酸.细胞通过内吞作用以低的速度摄取寡核苷酸，但是内吞的寡核苷酸通常被隔绝并且不能用于例如与靶核酸分子杂交.在一个实施方案中，可以通过电穿孔或磷酸钙沉淀促进细胞摄取.但是，这些方法仅可用于体外或离体实施方案，不方便并且在一些情况下与细胞毒性有关.
在另一个实施方案中，可以通过合适的本领域认可的方法增强寡核苷酸向细胞的递送，包括磷酸钙、DMSO、甘油或右旋糖酐、电穿孔，或者通过例如使用阳离子、阴离子或中性脂质组合物或者脂质体使用本领域中已知方法的转染(参见，例如WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；美国专利No.4,897,355；Bergan等.1993.Nucleic AcidsResearch.21：3567).寡核苷酸的增强的递送也可以使用载体(参见，例如Shi，Y.2003.Trends Genet 2003 Jan.19：9；Reichhart J M等.Genesis.2002.34(1-2)：1604，Yu等.2002.Proc.Natl.Acad Sci.USA 99：6047；Sui等.2002.Proc.Natl.Acad Sci.USA99：5515)、病毒、多胺或聚阳离子缀合物，使用化合物例如多赖氨酸、鱼精蛋白或Ni，N12-双(乙基)精胺(参见，例如参见，例如Bartzatt，R.等.1989.Biotechnol.Appl.Biochem.11：133；Wagner E.等.1992.Proc.Natl.Acad.Sci.88：4255)来介导.
在某些实施方案中，本发明的sd-rxRNA可以使用多种含β-葡聚糖的颗粒来递送，所述颗粒被称为GeRP(封装有葡聚糖的负载RNA的颗粒)，描述在通过引用并入的2010年3月4日提交的题为“Formulations and Methods for Targeted Delivery to PhagocyteCells.”的美国临时申请No.61/310,611中.这样的颗粒还描述在通过引用并入的美国专利公开US 2005/0281781 A1和US 2010/0040656，美国专利No.8,815,818以及PCT公开WO2006/007372和WO 2007/050643中.sd-rxRNA分子可以是疏水修饰的并且任选地可以与脂质和/或两亲性肽缔合.在某些实施方案中，β-葡聚糖颗粒来源于酵母.在某些实施方案中，有效负载捕获分子是聚合物，例如分子量为至少约1000Da、10,000Da、50,000Da、100kDa、500kDa等的那些.优选的聚合物包括(但不限于)阳离子聚合物、壳聚糖或PEI(聚乙烯亚胺)等.
葡聚糖颗粒可以来源于真菌细胞壁(如酵母细胞壁)的不溶性组分.在一些实施方案中，酵母是Baker酵母.酵母来源的葡聚糖分子可以包含β-(1，3)-葡聚糖、β-(1，6)-葡聚糖、甘露聚糖和几丁质中的一种或更多种.在一些实施方案中，葡聚糖颗粒包含中空酵母细胞壁，从而使颗粒保持类似细胞的三维结构，其中其可以络合(complex)或封装分子如RNA分子.与使用酵母细胞壁颗粒有关的一些优点是组分的可用性、其可生物降解性质及其靶向吞噬细胞的能力.
在一些实施方案中，葡聚糖颗粒可以通过从细胞壁中提取不可溶组分来制备，例如通过用1M NaOH/pH 4.0 H2O提取Baker酵母(Fleischmann’s)，然后洗涤并且干燥.制备酵母细胞壁颗粒的方法在通过引用并入的以下文献中讨论：美国专利4,810,646、4,992,540、5,082,936、5,028,703、5,032,401、5,322,841、5,401,727、5,504,079、5,607,677、5,968,811、6,242,594、6,444,448、6,476,003，US专利公开2003/0216346、2004/0014715和2010/0040656，以及PCT公开申请WO02/12348.
用于制备葡聚糖颗粒的方案还描述在通过引用并入的以下文献中：Soto和Ostroff(2008)，“Characterization of multilayered nanoparticles encapsulated inyeast cell wall particles for DNA delivery.”Bioconjug Chem 19(4)：840-8；Soto和Ostroff(2007)，“Oral Macrophage Mediated Gene Delivery System，”Nanotech，第2卷，第5章(“Drug Delivery”)，第378-381页；以及Li等.(2007)，“Yeast glucan particlesactivate murine resident macrophages to secrete proinflammatory cytokines viaMyD88-and Syk kinase-dependent pathways.”Clinical Immunology 124(2)：170-181.
包含葡聚糖的颗粒，例如酵母细胞壁颗粒还可以从商业获得.若干非限制性实例包括：Nutricell MOS 55，来自Biorigin(Sao Paolo，Brazil)、SAF-Mannan(SAF Agri，Minneapolis，Minn.)、Nutrex(Sensient Technologies，Milwaukee，Wis.)，碱提取的颗粒，例如Nutricepts(Nutricepts Inc.，Burnsville，Minn.)和ASA Biotech生产的那些，来自Biopolymer Engineering的酸提取的WGP颗粒，以及有机溶剂提取颗粒，例如来自Alpha-beta Technology，Inc.(Worcester，Mass.)的AdjuvaxTM以及来自Novogen(Stamford，Conn.)的微粒葡聚糖.
根据生产和/或提取方法，葡聚糖颗粒，例如酵母细胞壁颗粒可以具有不同的纯度水平.在一些情况下，将颗粒碱提取、酸提取或有机溶剂提取以移除细胞内组分和/或细胞壁的外甘露糖蛋白层.这样的方案可以产生葡聚糖(w/w)含量为50％至90％的颗粒.在一些情况下，可优选的是较低纯度的颗粒，意味着较低葡聚糖w/w含量，而在另一些实施方案中，可优选较高纯度的颗粒，意味着较高葡聚糖w/w含量.
葡聚糖颗粒，例如酵母细胞壁颗粒，可以具有天然脂质含量.例如，颗粒可以含有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或大于20％w/w的脂质.在实施例部分，测试了两个葡聚糖颗粒批次的效力：YGP SAF和YGP SAF+L(含有天然脂质).在一些情况下，天然脂质的存在可有助于RNA分子的络合(complexation)或捕获.
含葡聚糖的颗粒的直径通常为约2微米至4微米，但是直径小于2微米或大于4微米的颗粒也适用于本发明的一些方面.
待递送的RNA分子络合或“捕获”在葡聚糖颗粒的壳内.可以对颗粒的壳或RNA组分标记以用于可视化，例如通过引用并入的Soto和Ostroff(2008)Bioconjug Chem 19：840中描述的.下面将进一步讨论负载GeRP的方法.
用于摄取寡核苷酸的最佳方案取决于多种因素，最关键的是所使用的细胞的类型.对于摄取来说重要的其他因素包括但不限于寡核苷酸的性质和浓度、细胞的汇合、细胞所处的培养类型(例如悬浮培养或平板)以及细胞生长的培养基的类型.
包封剂
包封剂将寡核苷酸截留到囊泡中.在本发明的另一个实施方案中，如本领域技术人员理解的，寡核苷酸可以与载体或载剂(例如脂质体或胶束)缔合，但是可以使用其他载体.脂质体是由脂双层制备的具有类似于生物膜的结构的囊泡.这样的载体可用于促进寡核苷酸的细胞摄取或靶向性，或者改善寡核苷酸药代动力学或毒物学特性.
例如，本发明的寡核苷酸也可以封装在脂质体、药物组合物中施用，其中活性成分包含在(分散在或以不同方式存在于)由粘附在脂质层上的水性同心层组成的小体(corpuscles)中.根据溶解性，寡核苷酸可以存在于水性层和脂质层二者中，或者存在于通常被称为脂质体悬液的状态中.疏水层(通常但不排他地)包含：磷脂，例如卵磷脂和鞘磷脂，类固醇，例如胆固醇，或多或少的离子表面活性剂，例如二乙酰基磷酸酯、十八胺或磷脂酸，或者其他疏水性物质.脂质体的直径通常为约15nm至约5微米.
使用脂质体作为药物递送载剂提供了多种优点.脂质体提高细胞内稳定性、提高摄取效率并且改善生物活性.脂质体是由脂质组成的中空球状囊泡，所述脂质以类似于构成细胞膜的那些脂质的方式排列.其具有用于截留水溶性化合物的内部水性空间，直径大小为0.05微米至数微米.多个研究已经表明，脂质体可以向细胞递送核酸并且核酸保持生物活性.例如，最初被设计为研究工具的脂质递送载剂，例如Lipofectin或LIPOFECTAMINETM2000可以向细胞递送完整核酸分子.
使用脂质体的具体优点包括以下：其为非毒性的并且在组成上生物可降解；其表现出长的循环半衰期；并且识别分子可以容易地连接到其表面以用于靶向组织.最后，无论是在液体悬液还是在冻干产品中，制备基于脂质体之药物的成本效益已经证明了这种技术组作为可接受的药物递送系统的可行性.
在一些方面，可以针对与本发明有关的制剂选择一类天然存在的或化学合成或修饰的饱和和不饱和脂肪酸残基.脂肪酸可以以甘油三酯、甘油二酯或独立脂肪酸的形式存在.在另一个实施方案中，可以使用充分确认的目前在药理学中使用的用于肠外营养药物的脂肪酸和/或脂肪乳剂的混合物.
基于脂质体的制剂广泛用于寡核苷酸递送.但是，大部分市售脂质或脂质体制剂含有至少一种带正电荷的脂质(阳离子脂质).这种带正电荷的脂质的存在被认为是获得高寡核苷酸负载度和增强脂质体融合特性所必需的.已经进行和公开了若干方法来鉴定最佳的带正电荷的脂质化学物质.但是，含有阳离子脂质的市售脂质体制剂以高的毒性水平为特征.体内有限的治疗指数已经揭示，在比实现RNA沉默所需浓度稍高的浓度下，含有带正电荷脂质的脂质体制剂与毒性有关(即，肝酶升高).
与本发明有关的核酸可以疏水修饰并且可以包含在中性纳米运载体中.中性纳米运载体的进一步描述在通过引用并入的2009年9月22日提交的题为“NeutralNanotransporters”的PCT申请PCT/US2009/005251中.这样的颗粒能够量化并入不带电荷的脂质混合物中的寡核苷酸.这种中性纳米运载体中没有毒性水平的阳离子脂质是重要特征.
如PCT/US2009/005251中证明的，寡核苷酸可以有效并入不含阳离子脂质的脂质混合物中，并且这样的组合物可以以功能性方式向细胞有效递送治疗性寡核苷酸.例如，当脂质混合物由磷脂酰胆碱碱基脂肪酸和固醇如胆固醇构成时，观察到高的活性水平.例如，中性脂肪酸的一种优选制剂由至少20％DOPC或DSPC以及至少20％固醇如胆固醇构成.发现即使低至1∶5的脂质寡核苷酸比对于寡核苷酸在不带电荷的制剂中的完全封装也是足够的.
中性纳米运载体组合物能够将寡核苷酸有效负载到中性脂肪制剂中.这些组合物包含以一定方式修饰的寡核苷酸，以使得分子的疏水性升高(例如，将疏水性分子连接(共价或非共价)到寡核苷酸末端或非末端核苷酸、碱基、糖或骨架上的疏水性分子上)，经修饰寡核苷酸与中性脂肪制剂(例如，含有至少25％胆固醇和25％DOPC或其类似物)混合.货物分子，例如另外的脂质，也可以包含在组合物中.这种组合物(其中制剂的一部分被构建到寡核苷酸本身中)能够将寡核苷酸有效封装到中性脂质颗粒中.
在一些方面，在疏水寡核苷酸与优选制剂络合后，可以形成大小为50nm至140nm的稳定颗粒.有趣的是需提到，制剂本身通常不形成小颗粒，而是形成团聚体，其在添加经疏水修饰的寡核苷酸后转化成稳定的50nm至120nm颗粒.
本发明的中性纳米运载体组合物包含经疏水修饰的多核苷酸、中性脂肪混合物和任选的货物分子.本文使用的“经疏水修饰的多核苷酸”是具有至少一个修饰的本发明的多核苷酸(即，sd-rxRNA)，所述修饰使多核苷酸比修饰前的多核苷酸疏水性更高.可以通过向多核苷酸连接(共价或非共价)疏水分子来实现修饰.在一些情况下，疏水分子是或包含亲脂性基团.
术语“亲脂性基团”意指对于脂质的亲和力比其对于水的亲和力更高的基团.亲脂性基团的实例包括但不限于：胆固醇、胆甾烯基或经修饰的胆甾烯基残基、金刚烷(adamantine)、双氢睾酮(dihydrotesterone)、长链烷基、长链烯基、长链炔基、油烯基-石胆酸(olely-lithocholic)、胆烯基(cholenic)、油酰基-胆烯基、棕榈基、十七基、肉豆蔻基、胆汁酸、胆酸或牛黄胆酸、脱氧胆酸盐、油烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯、例如类固醇、维生素，例如维生素E、饱和或不饱和脂肪酸，脂肪酸酯如甘油三酯，芘、卟啉、Texaphyrine、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、Texas-Red、洋地黄毒苷、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，Cy3或Cy5)、Hoechst 33258染料、补骨脂素或布洛芬.胆固醇部分可以是还原的(例如，在胆甾烷中)或可以是取代的(例如，通过卤素).一个分子中不同亲脂性基团的组合也是可能的.
疏水分子可以连接在多核苷酸的多个位置.如上所述的，疏水分子可以连接至寡核苷酸的末端残基，例如多核苷酸的3’端或5’端.或者，其可以连接至多核苷酸的内部核苷酸或支链上的核苷酸.疏水分子可以连接至例如核苷酸的2′位置.疏水分子也可以连接至多核苷酸的核苷酸的杂环碱基、糖或骨架.
疏水分子可以通过接头部分连接至多核苷酸.任选地，接头部分是非核苷酸接头部分.非核苷酸接头是例如无碱基残基(dSpacer)；寡聚乙二醇(oligoethyleneglycol)，例如三乙二醇(间隔物9)或六乙二醇(间隔物18)；或烷烃二醇，例如丁二醇.间隔物单元优选地通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键连接.接头单元可以在分子中仅出现一次，或者可以并入多次，例如通过磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯或酰胺连接.
通常缀合方案涉及合成在序列的一个或更多个位置具有氨基接头的多核苷酸，但是接头不是必须的.然后使用合适的偶联剂或活化剂使氨基与缀合的分子反应.缀合反应可以在多核苷酸依然结合在固相支持物上或者在溶液相中切割多核苷酸后进行.通常通过HPLC纯化经修饰多核苷酸导致纯的材料.
在一些实施方案中，疏水分子是固醇型缀合物、植物固醇(PhytoSterol)缀合物、胆固醇缀合物、具有改变的侧链长度的固醇型缀合物、脂肪酸缀合物、任何其他疏水基团缀合物、和/或内部核苷的疏水修饰，其提供足够的疏水性以并入胶束.
为了本发明的目的，术语“固醇”或类固醇醇(steroid alcohol)是指在A环的3位具有羟基的类固醇亚类.其为通过HMG-CoA还原酶途径由乙酰辅酶A合成的两亲性脂质.整体分子是相当平的.A环上的羟基部分是极性的.脂族链的其余部分是非极性的.通常，固醇被认为在位置17具有8碳链.
为了本发明的目的，术语“固醇型分子”是指在结构上与固醇类似的类固醇醇.主要差异是环的结构和位置21连接的侧链中碳的数目.
为了本发明的目的，术语“植物固醇”(也称为植物甾醇)是植物中天然存在的一类类固醇醇(植物化学物质).有超过200种不同的已知植物固醇.
为了本发明的目的，术语“固醇侧链”是指连接在固醇型分子的位置17处的侧链的化学组成.在标准定义中，固醇限于在位置17携带8碳链的4环结构.在本发明中，描述了具有比常规更长和更短侧链的固醇型分子.侧链可以是分枝的或者包含双骨架.
因此，可用于本发明的固醇例如包括胆固醇，以及其中位置17连接有2至7个碳或大于9个碳之侧链的独特固醇.在一个具体实施方案中，聚碳尾的长度为5至9个碳不等.这样的缀合物可以具有显著更好的体内效力，特别是向肝脏递送.与和常规胆固醇缀合的寡核苷酸相比，预期这些分子类型以低5至9倍的浓度工作.
或者，多核苷酸可以与作为疏水分子的蛋白质、肽或带正电荷的化学物质结合.蛋白质可以选自鱼精蛋白、dsRNA结合结构域和富含精氨酸的肽.示例性的带正电荷的化学物质包括精氨、亚精胺、尸胺和腐胺.
在另一个实施方案中，当疏水分子缀合物与多核苷酸的最佳化学修饰模式(如本文详细描述的)组合时，其可以表现出甚至更高的效力，所述化学修饰包括但不限于疏水修饰、硫代磷酸酯修饰和2’核糖修饰.
在另一个实施方案中，固醇型分子可以是天然存在的植物固醇.聚碳链的长度可以大于9，并且可以是直链、支链和/或含有双键.在向多种组织递送多核苷酸时，一些含有植物固醇的多核苷酸缀合物可显著更有效且更有活性.一些植物固醇可表现出组织偏向性，因此用作向特定组织特异性递送RNAi的方法.
将疏水修饰多核苷酸与天然脂肪混合物混合以形成胶束.中性脂肪酸混合物是在生理pH下或生理pH附近为净中性或稍微带净负电荷的脂肪混合物，其可以与疏水修饰的多核苷酸形成胶束.为了本发明的目的，术语“胶束”是指由不带电荷的脂肪酸和磷脂的混合物形成的小纳米颗粒.中性脂肪混合物可以包含阳离子脂质，只要其以不引起毒性的量存在即可.在一些优选实施方案中，中性脂肪混合物不含阳离子脂质.不含阳离子脂质的混合物是其中小于1％、并且优选0％的总脂质为阳离子脂质的混合物.术语“阳离子脂质”包括在生理pH下或生理pH附近具有净正电荷的脂质和合成脂质.术语“阴离子脂质”包括在生理pH下或生理pH附近具有净负电荷的脂质和合成脂质.
中性脂肪通过强的但是非共价吸引力(例如，静电力、范德华力、π-堆叠等相互作用)与本发明寡核苷酸结合.
中性脂肪混合物可以包括选自一类天然存在的或者化学合成或修饰的饱和和不饱和脂肪酸残基的制剂.脂肪酸可以以甘油三酯、甘油二酯或独立脂肪酸的形式存在.在另一个实施方案中，可以使用充分确认的当前在药理学中用于肠外营养的脂肪酸和/或脂肪乳剂的混合物.
中性脂肪混合物优选为基于胆碱的脂肪酸和固醇的混合物.基于胆碱的脂肪酸包括例如合成磷酸胆碱衍生物，例如DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC和DEPC.DOPC(化学物质注册号4235-95-4)是二油酰基磷脂酰胆碱(也称为二反油酰基磷脂酰胆碱(dielaidoylphosphatidylcholine)、二油酰基-PC、二油酰基磷酸胆碱、二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、二油烯基磷脂酰胆碱).DSPC(化学品注册号816-94-4)是二硬脂酰基磷脂酰胆碱(也称为1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱).
中性脂肪混合物中的固醇可以是例如胆固醇.中性脂肪混合物可以完全由基于胆碱的脂肪酸和固醇组成，或者其可以任选地包含货物分子.例如，中性脂肪混合物可以具有至少20％或25％脂肪酸以及20％或25％固醇.
为了本发明的目的，术语“脂肪酸”涉及脂肪酸的常规描述.其可以作为独立实体或者以甘油二酯和甘油三酯的形式存在.为了本发明目的，术语“脂肪乳剂”是指向不能在其饮食中获得足够脂肪的对象皮下施用的安全的脂肪制剂.其为大豆油(或其他天然存在油)和卵磷脂的乳剂.脂肪乳剂被用于一些不溶性麻醉剂的制剂.在本公开中，脂肪乳剂可以是市售制剂(例如Intralipid、Liposyn、Nutrilipid)、经修饰的市售制剂的一部分，其中其富含特定脂肪酸，或者是脂肪酸和磷脂的完全从头配制的组合.
在一个实施方案中，使待与本发明寡核苷酸组合物接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质(例如上文所述脂质或脂质组合物之一)的混合物接触约12小时至约24小时.在另一个实施方案中，使待与寡核苷酸组合物接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质(例如上文所述脂质或脂质组合物之一)的混合物接触约1天至约5天.在一个实施方案中，使细胞与包含脂质和寡核苷酸的混合物接触约3天至长至约30天.在另一个实施方案中，使包含脂质的混合物保持与细胞接触至少约5天至约20天.在另一个实施方案中，使包含脂质的混合物与细胞保持接触至少约7天至约15天.
制剂的50％至60％可以是任意其他脂质或分子.这样的脂质或分子在本文中称作货物脂质(cargo lipid)或货物分子.货物分子包括但不限于intralipid、小分子、融合肽或脂质或者可以添加以改变细胞摄取、内体释放或组织分布特性的其他小分子.耐受货物分子的能力对于调节这些颗粒的特性很重要，如果期望这样的特性的话.例如，一些组织特异性代谢物的存在可以彻底改变组织分布谱.例如，富含不同饱和度的较短或较长脂肪链的Intralipid型制剂的使用影响这些制剂类型的组织分布谱(及其负载).
根据本发明有用的货物脂质的一个实例是融合脂质(fusogenic lipid).例如，两性离子型脂质DOPE(化学物质注册号4004-5-1，1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)是优选的货物脂质.
Intralipid可以由以下组分组成：1 000mL含有：纯化大豆油90g，纯化卵磷脂12g，无水甘油22g，注射用水适量加至1 000mL.用氢氧化钠将pH调节至约8的pH.能量含量/L：4.6MJ(190kcal).重量摩尔渗透压浓度(约)：300mOsm/kg水.在另一个实施方案中，脂肪乳剂是Liposyn，其含有注射用水中的5％红花油、5％大豆油、作为乳化剂添加的至多1.2％卵磷脂，以及2.5％甘油.其还可以包含氢氧化钠用于pH调节.pH 8.0(6.0-9.0).Liposyn的重量摩尔渗透压浓度为276m Osmol/升(实际).
货物脂质的身份、量和比例的不同影响这些化合物的细胞摄取和组织分布特性.例如，脂质尾的长度和饱和度水平将影响肝、肺、脂肪和心肌细胞中的差异摄取.添加特定的疏水分子如维生素或不同形式的固醇可有利于分布到参与特定化合物之代谢的特定组织.在一些实施方案中，使用维生素A或E.在不同寡核苷酸浓度形成络合物，浓度越高越有利于有效的络合物形成.
在另一个实施方案中，脂肪乳剂基于脂质的混合物.这样的脂质可以包括天然化合物、化学合成化合物、纯化的脂肪酸或者任意其他脂质.在另一个实施方案中，脂肪乳剂组合物是完全人造的.在一个特定实施方案中，脂肪乳剂是大于70％亚油酸.在另一个特定实施方案中，脂肪乳剂的至少1％是心磷脂.亚油酸(LA)是不饱和的ω-6脂肪酸.其为由具有18碳的链和两个顺式双键的羧酸制造的无色流体.
在本发明的另一个实施方案中，脂肪乳剂的组成的改变被用于改变经疏水修饰的多核苷酸的组织分布.这种方法提供了多核苷酸向特定组织的特异性递送.
在另一个实施方案中，货物分子之脂肪乳剂包含超过70％的亚油酸(C18H32O2)和/或心磷脂.
脂肪乳剂(例如intralipid)之前已经用作一些非水溶性药物的递送制剂(例如，Propofol，重构为Diprivan).本发明的独特特征包括(a)将经修饰多核苷酸与疏水化合物组合的理念，因此其可以并入到脂肪胶束中，以及(b)将其与脂肪乳剂混合以提供可逆载体.在注射到血流中后，胶束通常与血清蛋白质(包括白蛋白、HDL、LDL等)结合.这种结合是可逆的并且最终脂肪被细胞吸收.然后将作为胶束的一部分并入的多核苷酸递送到细胞表面，在这之后，可以通过不同机制发生细胞摄取，包括但不限于固醇型递送.
络合剂(Complexing Agent)
络合剂与本发明寡核苷酸通过强的非共价吸引力(例如，静电力、范德华力、π-堆叠等相互作用)结合.在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可以与络合剂络合以增加寡核苷酸的细胞摄取.络合剂的实例包括阳离子脂质.阳离子脂质可用于向细胞递送寡核苷酸.但是，如上文讨论的，不含阳离子脂质的制剂在一些实施方案中是优选的.
术语“阳离子脂质”包括具有极性和非极性结构域的脂质和合成脂质，其能够在生理pH下或附近带正电荷，与聚阴离子(如核酸)结合并且促进向细胞递送核酸.通常，阳离子脂质包括饱和和不饱和烷基醚和脂环族醚以及胺、酰胺的酯，或其衍生物.阳离子脂质的直链和支链烷基和烯基可以含有例如1至约25个碳原子.优选的直链或支链烷基或烯基具有6个或更多个碳原子.脂环族基团包括胆固醇和其他类固醇基团.阳离子脂质可以利用多种抗衡离子(阴离子)制备，包括例如Cl-、Br-、I-、F-、乙酸根、三氟乙酸根、硫酸根、亚硝酸根和硝酸根.
阳离子脂质的实例包括聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺(polyamidoamine，PAMAM)星放射状树枝状分子、Lipofectin(DOTMA和DOPE的组合)、Lipofectase、LIPOFECTAMINETM(例如，LIPOFECTAMINETM 2000)、DOPE、Cytofectin(Gilead Sciences，Foster City，Calif.)和Eufectins(JBL，San Luis Obispo，Calif.).示例性阳离子脂质体可以由N-[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(N-[1-(2，3-dioleoloxy)-propyl]-N，N，N-trimethylammonium chloride，DOTMA)、N-[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基胺硫酸甲酯(N-[1-(2，3-dioleoloxy)-propyl]-N，N，N-trimethylammonium methylsulfate，DOTAP)、3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(3β-[N-(N′，N′-dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol，DC-Chol)、2，3，-二油酰氧基-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(2，3，-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N，N-dimethyl-1-propa naminium trifluoroacetate，DOSPA)、1，2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；和二甲基双十八烷基溴化铵(dimethyldioctadecylammonium bromide，DDAB).发现例如阳离子脂质N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基三甲基氯化铵(DOTMA)使硫代磷酸酯寡核苷酸的反义效果提高1000倍(Vlassov等.，1994，Biochimica et Biophysica Acta 1197：95-108).寡核苷酸还可与例如聚(L-赖氨酸)或抗生素蛋白络合，并且这种混合物包含或不包含脂质，例如甾醇基(steryl)-聚(L-赖氨酸).
阳离子脂质已经在本领域中用于向细胞递送寡核苷酸(参见，例如美国专利No.5,855,910；5,851,548；5,830,430；5,780,053；5,767,099；Lewis等.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：3176；Hope等.1998.Molecular Membrane Biology15：1).可用于促进本发明寡核苷酸摄取的其他脂质组合物可以结合权利要求的方法使用.除了上文列出的那些外，其他脂质组合物也是本领域中已知的，并且包括例如以下专利中教导的那些：美国专利No.4,235,871；美国专利No.4,501,728；4,837,028；4,737,323.
在一个实施方案中，脂质组合物还可以包含试剂(agent)如病毒蛋白质以增强脂质介导的寡核苷酸转染(Kamata，等.，1994.Nucl.Acids.Res.22：536).在另一个实施方案中，使作为包含寡核苷酸、肽和脂质的组合物的一部分的寡核苷酸与细胞接触，如例如美国专利5,736,392中教导的.已经描述了血清抗性的经改良脂质(Lewis，等.，1996.Proc.Natl.Acad.Sci.93：3176).阳离子脂质和其他络合剂用于增加通过内吞作用进入细胞的寡核苷酸的数目.
在另一个实施方案中，N取代的甘氨酸寡核苷酸(拟肽)可用于优化寡核苷酸的摄取.拟肽已经被用于产生用于转染的阳离子脂质样化合物(Murphy，等.，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.95：1517).拟肽可以使用标准方法合成(例如，Zuckermann，R.N.，等.1992.J.Am.Chem.Soc.114：10646；Zuckermann，R.N.，等.1992.Int.J.PeptideProtein Res.40：497).阳离子脂质和拟肽的组合(liptoid)也可用于优化目标寡核苷酸的摄取(Hunag，等.，1998.Chemistry and Biology.5：345).Liptoid可以通过阐述拟肽寡核苷酸并且将氨基末端亚单体通过其氨基与脂质偶联来合成(Hunag，等.，1998.Chemistryand Biology.5：345).
本领域中已知带正电荷的氨基酸可用于产生高活性阳离子脂质(Lewis等.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.93：3176).在一个实施方案中，用于递送本发明寡核苷酸的组合物包含与亲脂性部分连接的多个精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸残基(参见，例如美国专利No.5,777,153).
在另一个实施方案中，用于递送本发明寡核苷酸的组合物包含具有约1至约4个碱性残基的肽.这些碱性残基可以负载在例如肽的氨基末端、C末端或内部区域.本领域中定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族.这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸(也可以认为是非极性的)、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸.除了碱性氨基酸以外，肽的大部分或全部其他残基可以选自非碱性氨基酸，例如除赖氨酸、精氨酸或组氨酸以外的氨基酸.优选地，主要使用具有长中性侧链的中性氨基酸.
在一个实施方案中，用于递送本发明寡核苷酸的组合物包含具有一个或更多个γ羧基谷氨酸残基或γ-Gla残基的天然或合成多肽.这些γ羧基谷氨酸残基能够使多肽彼此结合并且与膜表面结合.换言之，具有一系列γ-Gla的多肽可用作通用递送形式，其帮助RNAi构建体粘附在RNAi构建体将接触的无论什么样的膜上.这可以至少减慢RNAi构建体从血流中的清除，并且增加其到达靶标的机会.
γ羧基谷氨酸残基可以存在于天然蛋白质中(例如，凝血酶原具有10个γ-Gla残基).或者，可以使用例如维生素K依赖性羧化酶通过羧化将其引入到纯化的、重组产生的或化学合成的多肽中.γ羧基谷氨酸残基可以是连续的或不连续，多肽中这样的γ羧基谷氨酸残基的总数和位置可以调节/微调以取得不同的多肽“粘性”水平.
在一个实施方案中，使待与本发明寡核苷酸组合物接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质(例如上文所述脂质或脂质组合物之一)的混合物接触约12小时至约24小时.在另一个实施方案中，使待与寡核苷酸组合物接触的细胞与包含寡核苷酸的混合物和包含脂质(例如上文所述脂质或脂质组合物之一)的混合物接触约1天至约5天.在一个实施方案中，使细胞与包含脂质和寡核苷酸的混合物接触约3天至长至约30天.在另一个实施方案中，使包含脂质的混合物与细胞保持接触至少约5天至约20天.在另一个实施方案中，使包含脂质的混合物与细胞保持接触至少约7天至约15天.
例如，在一个实施方案中，在脂质(如细胞转染剂CS或GSV(购自Glen Research；Sterling，Va.)、GS3815、GS2888)的存在下，使寡核苷酸组合物可以与细胞接触本文所述的延长的孵育时间.
在一个实施方案中，用包含脂质和寡核苷酸组合物的混合物孵育细胞不降低细胞的存活力.优选地，在转染期后，细胞基本是活的.在一个实施方案中，在转染后，至少约70％至至少约100％的细胞是活的.在另一个实施方案中，至少约80％至至少约95％的细胞是活的.在另一个实施方案中，至少约85％至至少约90％的细胞是活的.
在一个实施方案中，通过连接向细胞中转运寡核苷酸的肽序列(在本文中称为“转运肽”)来对寡核苷酸进行修饰.在一个实施方案中，组合物包含与编码蛋白质的靶核酸分子互补的并且与转运肽共价连接的寡核苷酸.
专用语“转运肽”包含有利于向细胞中转运寡核苷酸的氨基酸序列.有利于向细胞中转运其连接的部分的示例性肽是本领域中已知的，包括例如HIV TAT转录因子、乳铁蛋白、疱疹VP22蛋白和成纤维细胞生长因子2(Pooga等.1998.Nature Biotechnology.16：857；和Derossi等.1998.Trends in Cell Biology.8：84；Elliott和O′Hare.1997.Cell88：223).
可以使用已知技术将寡核苷酸连接至转运肽，例如(Prochiantz，A.1996.Curr.Opin.Neurobiol.6：629；Derossi等.1998.Trends Cell Biol.8：84；Troy等.1996.J.Neurosci.16：253)，Vives等.1997.J.Biol.Chem.272：16010).例如，在一个实施方案中，具有活性巯基的寡核苷酸通过该巯基与转运肽上存在的半胱氨酸(例如，触角足同源结构域的第二和第三螺旋之间的β转角中存在的半胱氨酸，如在例如Derossi等.1998.Trends Cell Biol.8：84；Prochiantz.1996.Current Opinion in Neurobiol.6：629；Allinquant等.1995.J Cell Biol.128：919中教导的)连接.在另一个实施方案中，Boc-Cys-(Npys)OH基团可以与转运肽连接作为最后的(N-末端)氨基酸，具有SH基团的寡核苷酸可以与肽偶连(Troy等.1996.J.Neurosci.16：253).
在一个实施方案中，连接基团可以与核甘酸单体连接，转运肽可以与接头共价连接.在一个实施方案中，接头可以作为转运肽的连接位点并且可以提供针对核酸酶的稳定性.合适的接头的实例包括经取代的或未经取代的C1-C20烷基链、C2-C20烯基链、C2-C20炔基链、肽和杂原子(例如，S、O、NH等).其他示例性接头包括双官能交联剂，例如磺基琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)(参见，例如Smith等.Biochem J 1991.276：417-2).
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸作为分子缀合物合成，所述分子缀合物使用受体介导的内吞机制将基因递送到细胞中(参见，例如Bunnell等.1992.Somatic Celland Molecular Genetics.18：559，以及其中引用的参考文献).
靶向剂
可以通过将寡核苷酸靶向细胞受体来改善寡核苷酸的递送.靶向部分可以与寡核苷酸缀合或者连接至与寡核苷酸连接的载体基团(即，聚(L-赖氨酸)或脂质体).这种方法很好地适用于表现出特定的受体介导的内吞作用的细胞.
例如，与游离寡核苷酸相比，表达甘露糖-6-磷酸特异性受体的细胞对与6-磷酸甘露糖化蛋白质缀合的寡核苷酸的内化更有效20倍.还可以使用可生物降解的接头将寡核苷酸与细胞受体的配体偶连.在另一个实例中，递送构建体是甘露糖基化链霉亲和素，其与生物素化寡核苷酸形成紧密络合物.发现甘露糖基化链霉亲和素使生物素化寡核苷酸的内化提高20倍(Vlassov等.1994.Biochimica et Biophysica Acta 1197：95-108).
另外，特定配体可以与基于聚赖氨酸的递送系统的聚赖氨酸组分缀合.例如，运铁蛋白-聚赖氨酸、腺病毒-聚赖氨酸和流感病毒血凝素HA-2 N末端融合肽-聚赖氨酸缀合物极大地增强了真核细胞中受体介导的DNA递送.肺泡巨噬细胞中已经利用与聚(L-赖氨酸)缀合的甘露糖基化糖蛋白来增强寡核苷酸的细胞摄取.Liang等.1999.Pharmazie 54：559-566.
由于恶性细胞对于必需营养成分如叶酸和运铁蛋白的需求增加，这些营养成分可用于将寡核苷酸靶向癌细胞.例如，当叶酸与聚(L-赖氨酸)连接时，在早幼粒细胞白血病(HL-60)细胞和人黑素瘤(M-14)细胞中发现了增强的寡核苷酸摄取.Ginobbi等.1997.Anticancer Res.17：29.在另一个实例中，包被有马来酰化牛血清白蛋白、叶酸或铁原卟啉IX的脂质体在小鼠巨噬细胞、KB细胞和2.2.15人肝癌细胞中表型出增强的寡核苷酸细胞摄取.Liang等.1999.Pharmazie 54：559-566.
脂质体天然积累在肝、脾和网状内皮系统中(所谓的被动靶向性).通过使脂质体与多种配体(如抗体)和蛋白A偶连，其可以主动靶向特定细胞群.例如，用H-2K特异性抗体预处理具有蛋白A的脂质体，所述抗体靶向L细胞上表达的小鼠主要组织相容性复合物编码的H-2K蛋白.(Vlassov等.1994.Biochimica et Biophysica Acta 1197：95-108).
RNAi试剂的另外的体外和/或体内递送是本领域中已知的，并且可用于递送本发明的RNAi构建体.参见，例如美国专利申请公开20080152661、20080112916、20080107694、20080038296、20070231392、20060240093、20060178327、20060008910、20050265957、20050064595、20050042227、20050037496、20050026286、20040162235、20040072785、20040063654、20030157030、WO 2008/036825、WO04/065601和AU2004206255B2，仅列出一些(均通过引用并入).
施用
寡核苷酸的最佳施用或递送过程可以根据期望的结果和/或被治疗对象改变.本文使用的“施用”是指使细胞与寡核苷酸接触，并且可以在体外或体内进行.可以调节寡核苷酸的剂量以最佳地减少由靶核酸分子翻译的蛋白质的表达，例如通过RNA稳定性的读出或通过治疗响应测量的，而不需要过多试验.
例如，可以测量核酸靶标编码的蛋白质的表达以确定给药方案是否需要相应调整.另外，可以使用本领域中公认的技术测量细胞中或由细胞产生的RNA或蛋白质水平的提高或降低.通过确定转录是否已经降低，可以确定寡核苷酸在诱导靶RNA切割中的有效性.
任何上述寡核苷酸组合物可以单独使用或者与可药用载体一起使用.本文使用的“可药用载体”包括合适的溶剂、分散介质、包衣料、抗菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等.用于药物活性物质的这样的介质和试剂的使用是本领域中公知的.任何常规介质或试剂可用于治疗组合物，除非其与活性成分不相容.辅助活性成分(supplementary activeingredient)也可以并入到组合物中.
在一些实施方案中，本公开内容涉及包含寡核苷酸(例如，分离的双链核酸分子)的组合物(例如，药物组合物).在一些实施方案中，组合物包含另外的治疗剂.另外的治疗剂的非限制性实例包括但不限于核酸(例如，sd-rxRNA等)、小分子(例如，可用于治疗癌症、神经退行性疾病、感染性疾病、自身免疫病等的小分子)、肽(例如，可用于治疗癌症、神经退行性疾病、感染性疾病、自身免疫病等的肽)和多肽(例如，可用于治疗癌症、神经退行性疾病、感染性疾病、自身免疫病等的抗体).在一些实施方案中，本公开内容的组合物可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种另外的治疗剂.在一些实施方案中，组合物包含多于10种另外的治疗剂.
寡核苷酸可以并入到脂质体或用聚乙二醇修饰的脂质体中或者与阳离子脂质混合以用于胃肠外施用.向脂质体中并入额外的物质(例如对特定靶细胞上存在的膜蛋白有反应性的抗体)可以有助于将寡核苷酸靶向至特定细胞类型.
对于体内应用，本发明制剂可以以适合于所选施用途径的多种形式向患者施用，例如肠胃外、经口或腹膜内、输注、鞘内递送、实质递送、静脉内递送或直接注射到脑或脊髓中.
本发明的一些方面涉及将核酸分子(例如sd-rxRNA或sd-rxRNA变体)递送至神经系统.例如，sd-rxRNA或sd-rxRNA变体可以递送至脑或脊髓.可以应用用于将sd-rxRNA变体递送至脑或脊髓的任何合适的递送机制.在一些实施方案中，通过输注、鞘内递送、实质递送、静脉内递送或直接注射到脑或脊髓中发生到脑或脊髓的递送.在一些实施方案中，sd-rxRNA或sd-rxRNA变体递送至脑的特定区域.sd-rxRNA或sd-rxRNA变体可以被适当地修饰或配制以穿过血脑屏障.在另一些实施方案中，sd-rxRNA或sd-rxRNA变体以使得其不需要穿过血脑屏障的方式施用.在一些实施方案中，sd-rxRNA或sd-rxRNA变体通过泵或导管系统递送到脑或脊髓中.这种递送的实例由美国专利No.6,093,180(Elsberry)通过引用并入.用于将药物输注入脑的技术还由美国专利No.5,814014(Elsberry等)通过引用并入.
在一些实施方案中，核酸通过肠胃外施用而施用，其包括通过以下途径施用：静脉内；肌内；间隙内(interstitially)；动脉内；皮下；眼内；滑膜内；经上皮(transepithelial)，包括经皮(transdermal)；通过吸入的经肺部；眼部；舌下和颊；局部，包括眼部；皮肤；眼；直肠；和通过吹入法的鼻吸入.在一些实施方案中，sd-rxRNA分子通过皮内注射或皮下施用.
用于施用的药物制剂可包括水溶性或水分散性形式的活性化合物的水溶液.另外，可以施用作为合适的油性注射混悬剂的活性化合物的混悬剂.合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯.水性注射混悬剂可以包含提高混悬剂的粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐，任选地，混悬剂还可以包含稳定剂.本发明的寡核苷酸可以配制在液体溶液中，优选的在生理相容性缓冲液(例如Hank溶液或Ringer溶液)中.另外，寡核苷酸可以配制成固体形式，并且在临使用前再溶解或悬浮.冻干形式也包括在本发明内.
用于施用的药物制剂还可包括经皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、喷雾剂、栓剂、液体和散剂.另外，常规药物载体、水性、粉末或油性基质或者增稠剂可用于局部施用的药物制剂.
用于经口施用的药物制剂还可包括散剂或颗粒剂、水或非水性介质中的混悬剂或溶液剂、胶囊剂、囊剂(sachet)或片剂.另外，增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可用于经口施用的药物制剂.
对于经粘膜或经皮施用，适合于待渗透之屏障的渗透剂用于制剂.这样的渗透剂是本领域中已知的，并且例如对于经粘膜施用，包括胆盐和梭链孢酸衍生物，以及洗涤剂.经粘膜施用可以通过鼻用喷雾剂或使用栓剂.对于经口施用，将寡核苷配制成常规经口施用形式，例如胶囊剂、片剂和补药(tonic).对于局部施用，本发明的寡核苷酸配制成本领域中已知的软膏剂、油膏(salve)、凝胶剂或乳膏剂.
可以选择药物递送载剂，例如用于体外施用、用于全身施用或用于局部施用.这些载剂可以设计成作为缓释储库或将其内容物直接递送到靶细胞.使用一些直接递送药物载剂的优点是每次摄取递送的多个分子.已经表明这样的载剂提高药物的循环半衰期，否则的话所述药物将会被迅速从血流中清除.落入该分类中的这样的专用药物递送载剂的一些实例是脂质体、水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊和生物粘附微球.
所述寡核苷酸可以向对象全身性施用.全身性吸收是指药物进入血流然后分布在整个身体中.导致全身性吸收的施用途径包括：静脉内、皮下、腹膜内和鼻内.这些施用途径中的每一种均向可接近的疾病细胞递送寡核苷酸.在皮下施用后，治疗剂流入局部淋巴结并且通过淋巴网络进入循环.已经表明进入循环的速率是分子量或大小的函数.脂质体或其他药物载体的使用使寡核苷酸定位于淋巴结.可以修饰寡核苷酸以扩散到细胞中，或者脂质体可以直接参与将未经修饰或经修饰寡核苷酸递送到细胞中.
所选择的递送方法将导致进入细胞中.在一些实施方案中，优选的递送方法包括脂质体(10nm至400nm)、水凝胶、控释聚合物和其他药学上适用的载剂，以及显微注射或电穿孔(用于离体处理).
本发明药物制剂可以制备和配制为乳剂.乳剂通常是一种液体以直径通常超过0.1μm的小滴的形式分散在另一种液体中的非均相体系.本发明乳剂可以包含赋形剂，例如乳化剂、稳定剂、染料、脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、润湿剂、亲水胶体、防腐剂，并且抗氧化剂也可根据需要存在乳剂中.这些赋形剂可以在水相、油相中作为溶液存在或者自身作为独立相.
可用在本发明的乳剂制剂中的天然存在的乳化剂的实例包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶.细碎固体也用作良好乳化剂，尤其是与表面活性剂组合以及在粘性制剂中.可用作乳化剂的细碎固体的实例包括极性无机固体，例如重金属氢氧化物，不膨胀黏土，例如膨润土、硅镁土(attapulgite)、锂蒙脱石(hectorite)、高岭土、蒙脱石(montrnorillonite)、胶体状硅酸铝和胶体状硅酸镁铝、色素和非极性固体，例如碳或三硬脂酸甘油酯.
可以包含在乳剂制剂中的防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸的脂和硼酸.可以包含在乳剂制剂中的抗氧化剂的实例包括自由基清除剂，例如生育酚、没食子酸烷基酯、丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯或还原剂，例如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，以及抗氧化剂增效剂，例如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂.
在一个实施方案中，寡核苷酸组合物配制成微乳剂.微乳剂是水、油和两亲分子的体系，其为单一的光学上各向同性的且热力学稳定的液体溶液.通常微乳剂通过首先使油分散在表面活性剂水溶液中，然后加入足量的第四种组分以形成透明体系来制备，所述第四种组分一般为中等链长度的醇.
可用于制备微乳剂表面活性剂包括但不限于离子表面活性剂、非离子表面活性剂、Brij 96、聚氧乙烯油烯基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(S0750)、十甘油十油酸酯(DA0750)、其单独或与助表面活性剂组合.由于表面活性剂分子之间产生的空隙，助表面活性剂(通常为短链醇，例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇)用于通过渗入表面活性剂膜并随后产生无序膜来提高界面流动性.
但是，可以不使用助表面活性剂来制备微乳剂，并且不含醇的自乳化微乳剂体系是本领域中已知的.水相通常是但不限于水、药物、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、聚乙二醇和乙二醇的衍生物的水溶液.油相可以包含但不限于材料如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯，中链(C8-C12)单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯，聚氧乙烯化甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇甘油酯(polyglycolized glyceride)、饱和聚乙二醇C8-C10甘油酯、植物油和硅油(silicone oil).
从药物增溶和增强药物吸收的角度来看，微乳剂特别让人感兴趣.已经提出用基于脂质的微乳剂(油/水和水/油二者)来增强药物的经口生物利用度.
微乳剂提供了改善的药物增溶、保护药物免于酶促水解、由于表面活性剂诱导的膜流动性和渗透性的改变导致的可能的药物吸收增强、易于制备、易于通过固体剂型经口施用、改善的临床效力和降低的毒性(Constantinides等.，Pharmaceutical Research，1994，11：1385；Ho等.，J.Pharm.Sci.，1996，85：138-143).在化妆品和药物应用二者中，微乳剂在活性组分的经皮递送中也有效.预期本发明的微乳剂组合物和制剂将有利于提高寡核苷酸从胃肠道的全身性吸收，以及改善胃肠道、阴道、口腔和其他施用区域中寡核苷酸的局部细胞摄取.
在一个实施方案中，本发明使用多种渗透增强剂(penetration enhancer)来实现核酸，特别是寡核苷酸向动物皮肤的有效递送.如果用渗透增强剂处理待穿过的膜，即使非亲脂性药物也能够穿过细胞膜.除了提高非亲脂性药物穿过细胞膜的扩散外，渗透促进剂还起到增强亲脂性药物的渗透性的作用.
可用于本发明的五类渗透增强剂包括：表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂.可用于增强所施用的寡核苷酸之渗透的其他试剂包括：二醇，例如乙二醇和丙二醇；吡咯，例如2-15吡咯；氮酮(azone)和萜烯，例如柠檬烯和薄荷酮.
寡核苷酸(尤其是在液体制剂中时)也可以通过用阳离子脂质制剂涂覆医学装置(例如，导管，例如血管成形术球囊导管)来施用.可以通过例如将医学装置浸渍在脂质制剂或者脂质制剂和合适溶剂的混合物中来实现涂覆，所述合适的溶剂为例如水基缓冲液、水溶剂、乙醇、二氯甲烷、氯仿等.将一定量制剂自然粘附到装置的表面，随后根据情况向患者施用所述装置.或者，脂质制剂的冻干混合物可以特异性地结合于装置的表面.这样的结合技术描述在例如K.Ishihara等.，Journal of Biomedical Materials Research，第27卷，第1309-1314页(1993)中，其公开内容通过引用整体并入本文.
对于本领域技术人员将显而易见的是，待施用的有用剂量和特定的施用方式将根据以下因素变化，例如细胞类型，或者对于体内使用而言：年龄、体重和待治疗的特定动物及其区域；所使用的特定寡核苷酸和递送方法；预期的治疗或诊断用途；制剂的形式，例如混悬剂、乳剂、胶束或脂质体.通常，以较低水平施用剂量，并且提高剂量直到实现期望效果.当使用脂质递送寡核苷酸时，施用的脂质化合物的量可以不同，并且通常取决于施用的寡核苷酸药剂的量.例如，脂质化合物与寡核苷酸药剂的重量比优选为约1∶1至约15∶1，更优选的重量比为约5∶1至约10∶1.通常，施用的阳离子脂质化合物的量为约0.1毫克(mg)至约1克(g)不等.按照一般指导，通常每千克患者体重施用约0.1mg至约10mg的特定寡核苷酸药剂，以及约1mg至约100mg的脂质组合物，但是更高或更低的量也可以使用.
向对象施用的或者与细胞接触适合于药学施用的生物学相容形式的本发明药剂.“适合于施用的生物学相容形式”意指以寡核苷酸的治疗效果超过任何毒性效果的形式施用寡核苷酸.在一个实施方案中，可以向对象施用寡核苷酸.对象的实例包括哺乳动物，例如人和其他灵长类动物；牛、猪、马和农场(农业)动物；狗、猫和其他家养宠物；小鼠、大鼠和转基因的非人动物.
有效量的本发明寡核苷酸的施用定义为在取得预期结果必需的剂量和时间段方面有效的量.例如，寡核苷酸的有效量可以根据以下因素变化，例如细胞类型，所使用的寡核苷酸，以及用于体内使用的个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及寡核苷酸在个体中引起期望应答的能力.细胞内寡核苷酸的治疗水平的确立取决于摄取速率以及流出或降解.降解成度的降低延长了寡核苷酸的细胞内半衰期.因此，经化学修饰的寡核苷酸(例如具有磷酸酯骨架修饰)可能需要不同的给药.
寡核苷酸的精确剂量和施用的剂量数目取决于实验和临床试验产生的数据.若干因素如预期效果、递送载剂、疾病指征和施用途径将影响剂量.本领域普通技术人员可以容易地确定剂量并且配制成本发明的药物组合物.优选地，治疗的持续时间将延长至少贯穿疾病症状的进程.
可以调节给药方案以提供最佳治疗响应.例如，寡核苷酸可以重复施用，例如根据治疗情况的紧急状态的指示每天施用若干剂量或者按比例降低剂量.无论是向细胞还是向对象施用寡核苷酸，本领域技术人员将能够容易地确定本发明寡核苷酸的合适剂量和施用方案.
可以通过测试给药方案来优化sd-rxRNA施用.在一些实施方案中，单次施用是足够的.为了进一步延长所施用sd-rxRNA的效果，如本领域技术人员熟悉的，可以在缓释制剂或装置中施用sd-rxRNA.sd-rxRNA化合物的疏水性质可以使得能够使用多种聚合物，其中的一些与常规寡核苷酸递送不相容.
在另一些实施方案中，多次施用sd-rxRNA.在一些情况下，其以如下的频率施用：每天、每周两次、每周、每两周、每三周、每月、每两个月、每三个月、每四个月、每五个月、每六个月或者比每六个月更低的频率.在一些情况下，其每天、每周、每月和/或每年多次施用.例如，其可以每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时或超过12小时施用.其可以每天施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或超过10次.
本发明的一些方面涉及向对象施用sd-rxRNA分子.在一些情况下，对象是患者，施用sd-rxRNA分子涉及在医生办公室施用sd-rxRNA分子.
在一些实施方案中，同时施用多于一种sd-rxRNA分子.例如，可以施用包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种不同sd-rxRNA分子的组合物.在某些实施方案中，组合物包含2或3种不同sd-rxRNA分子.当组合物包含多于一种sd-rxRNA时，组合物中的sd-rxRNA分子可以针对相同基因或不同基因.
在一些情况下，递送的sd-rxRNA的有效量为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或大于100mg/kg，包括任何中间的值.
在一些情况下，递送的sd-rxRNA的有效量为至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或大于950μg，包括任何中间的值.
通过本文所述的方法施用的sd-rxRNA分子可有效地靶向神经系统中的所有细胞类型.
本公开内容考虑了将核酸引入对象(例如，对象的细胞)的各种形式.例如，可以将核酸(例如，包含核酸的溶液)注射到对象中(例如，注射到细胞中)或者可通过由核酸覆盖的颗粒轰击对象(例如，细胞).在一些实施方案中，将细胞或生物体浸泡在核酸的溶液中.在一些实施方案中，通过在核酸存在下对细胞膜进行电穿孔来将核酸引入生物体或细胞中.在一些实施方案中，将包含核酸的病毒构建体包装在病毒颗粒中并实现将核酸引入细胞中和核酸转录.用于将核酸引入对象(例如，对象的细胞)中的方式的另一些实例包括但不限于脂质介导的载体转运、化学介导的转运(例如，磷酸钙)等.
可以将核酸与另外的组分一起引入.例如，在一些实施方案中，将核酸与增强细胞对核酸摄取的组分一起引入.在一些实施方案中，将核酸与抑制单链退火的组分一起引入.在一些实施方案中，将核酸与稳定核酸分子或者另外提高靶基因抑制的组分一起引入.
核酸可以直接引入到细胞中(即，细胞内)；或者在细胞外引入腔、组织间隙空间、生物体的循环系统、经口引入，或者可以通过在含有核酸的溶液中洗浴细胞或生物体来引入.血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊髓液是可以引入核酸的部位.
在一些实施方案中，具有靶基因的细胞可以来源于任何生物体.在一些实施方案中，具有靶基因的细胞可以包含在(例如，居住或者存在于)任何生物体中.例如，生物体可以是植物、动物、原生生物、细菌、病毒、或真菌.植物可以是单子叶植物、双子叶植物或裸子植物；动物可以是脊椎动物或无脊椎动物.优选的微生物是用于农业或工业的那些，以及对于植物或动物有致病性的那些.
或者，可以使用本领域认可的技术将载体如编码本发明siRNA的转基因工程化到宿主细胞或转基因动物中.
本发明药剂(或者编码其的载体或转基因)的另一个优选用途是在真核细胞或真核非人生物体中进行功能分析，优选哺乳动物细胞或生物体，最优选人细胞，例如诸如HeLa或293的细胞系，或啮齿动物，例如大鼠和小鼠.通过施用与靶mRNA序列充分互补的合适致敏剂(priming agent)/RNAi剂以指导靶特异性RNA干扰，可以在靶细胞中(例如细胞培养物中)或靶生物体中获得特异性敲除或敲减表型.
因此，本发明的另一个主题是表现出靶基因特异性敲除或敲减表型的真核细胞或真核非人生物体，其包括至少一种内源靶基因的完全或至少部分缺陷的表达，其中用包含编码RNAi剂的DNA的至少一种载体转染所述细胞或生物体，所述RNAi剂能够抑制该靶基因的表达.应注意的是，由于RNAi剂的特异性，本发明允许多种不同内源基因的靶特异性敲除或敲减.
细胞或非人生物体的(尤其是人细胞或非人哺乳动物的)基因特异性敲除或敲减表型可用于程序的分析，例如复杂生理过程的功能和/或表型分析，例如基因表达谱和/或蛋白质组的分析.优选地，使用基于寡核苷酸的芯片通过高通量方法进行分析.
治疗用途
通过抑制基因表达，本发明的寡核苷酸组合物可用于治疗涉及蛋白质表达的任何疾病，例如神经退行性疾病.
本发明的一些方面涉及核酸分子(例如sd-rxRNA或sd-rxRNA变体sd-rxRNA)在治疗影响神经系统的病症中的用途.在一些实施方案中，sd-rxRNA用于治疗神经退行性病症.如本文使用的，术语“神经退行性病症”是指由神经系统的细胞和组织组分衰退引起的障碍、疾病或病症.神经退行性病症的一些非限制性实例包括卒中、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、亨廷顿病(Huntington′sdisease)、室周白质软化(Peri ventricular leukomalacia，PVL)、肌萎缩侧索硬化(ALS，“洛盖赫里格病(Lou Gehrig′s disease)”)，关岛型ALS-帕金森病-痴呆综合症(ALS-Parkinson′s-Dementia complex of Guam)、弗里德赖希共济失调(Friedrich′s Ataxia)、威尔逊病(Wilson′s disease)、多发性硬化、大脑性瘫痪、进行性核上麻痹(斯-里综合征(Steel-Richardson syndrome))、延髓性和假延髓性麻痹、糖尿病性视网膜病变、多发性梗死性痴呆(multi-infarct dementia)、黄斑变性、皮克病(Pick′s disease)、弥漫性Lewy体疾病(diffuse Lewy body disease)、朊病毒病(例如克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、库鲁病(Kuru)和致死性家族性失眠)、原发性侧索硬化、退行性共济失调、马-约病(Machado-Joseph disease)/脊髓小脑型共济失调3型和橄榄桥脑小脑变性、脊髓和脊髓延髓肌萎缩(肯尼迪病(Kennedy′sdisease))、家族性痉孪性截瘫、Wohlfart-Kugelberg-Welander病、泰-萨病(Tay-Sachs’disease)、多系统变性(Shy-Drager综合征)、日勒德拉图雷特病(Gilles De La Tourette′s disease)、家族性自主神经功能异常(赖-戴综合征(Riley-Day syndrome))、Kugelberg-Welander疾病、亚急性硬化性全脑炎、韦-霍病(Werdnig-Hoffmann disease)、共核蛋白病(synucleinopathies)(包括多系统萎缩)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、皮层基底变性、痉挛性下肢轻瘫、原发性进行性失语、进行性多灶性脑白质病、纹状体黑质变性、家族性痉挛性疾病、与神经变性相关的慢性癫痫性病症、宾斯旺格病(Binswanger′s disease)、和痴呆(包括痴呆的所有潜在病因).
在一些实施方案中，所述病症是帕金森病、亨廷顿病或ALS.在某些实施方案中，所述病症是ALS，并且sd-rxRNA或sd-rxRNA变体靶向SOD1(超氧化物歧化酶).
神经退行性病症也可能是脑损伤或创伤的结果，包括由卒中、头部或脊髓损伤、或者急性缺血性损伤引起的脑损伤或创伤.缺血性损伤是指在脑接受血流量不足时出现的情况.在一些实施方案中，对脑或神经系统的损伤可由创伤性损伤引起，或者可以是感染、辐射、化学或毒性损害的结果.可以是弥漫性或局限性的在脑和神经系统内的损伤包括颅内或脊椎内病变或出血、脑缺血或梗死(包括栓塞性阻塞和血栓形成性阻塞)、围产期缺氧-缺血性损伤、挥鞭伤(whiplash)、婴儿震颤综合征(shaken infant syndrome)、急性缺血后再灌注、或心脏停搏.
在一个实施方案中，体外用寡核苷酸处理细胞可用于从对象移出的细胞的离体治疗(例如，用于治疗白血病或病毒感染)或者用于处理不来源于对象但是待向对象施用的细胞(例如，以消除待移植到对象中的细胞上移植抗原的表达).此外，细胞的体外处理可用于非治疗环境，例如评估基因功能，研究基因调控和蛋白质合成，或者用于评估对设计成用于调节基因表达或蛋白质合成之寡核苷酸做出的改善.细胞的体内处理可用于期望抑制蛋白质表达的某些临床环境.已经报道了反义治疗适合的多种医学病症(参见，例如美国专利No.5,830,653)以及呼吸道合胞病毒感染(WO 95/22,553)、流感病毒(WO 94/23,028)和恶性肿瘤(WO 94/08,003).反义序列的临床应用的其他实例综述在例如Glaser.1996.Genetic Engineering News 16：1中.寡核苷酸切割的示例性靶标包括例如蛋白激酶Ca、ICAM-1、c-raf激酶、p53、c-myb和发现于慢性髓细胞性白血病中的bcr/abl融合基因.
本发明核酸可用于具有RNAi途径的任何动物中的基于RNAi的治疗，例如人、非人灵长类动物、非人哺乳动物、非人脊椎动物、啮齿动物(小鼠、大鼠、仓鼠、兔等)、家畜动物、宠物(猫、狗等)、非洲蟾蜍属、鱼、昆虫(果蝇(Drosophila)等)和虫(线虫(C.elegans))等.
本发明提供了预防对象中与异常或有害的靶基因表达或活性有关的疾病或病症的方法，其通过向对象施用治疗剂(例如，RNAi剂或者编码其的载体或转基因)来实现.如果合适，首先用致敏剂处理对象，以使得更好的响应随后的RNAi治疗.可以通过例如本文所述的诊断或预后测定中的任一种或组合鉴定处于由异常或有害的靶基因表达或活性造成或促成的疾病的风险之下的对象.预防性药剂的施用可以发生在以靶基因异常为特征的症状表现之前，以预防疾病或病患，或者延迟其发展.根据靶基因异常的类型，例如，靶基因、靶基因激动剂或靶基因拮抗剂可用于治疗所述对象.
在另一个方面，本发明涉及用于治疗目的的调节靶基因表达、蛋白质表达或活性的方法.因此，在一个示例性实施方案中，本发明的调节方法涉及使能够表达靶基因的细胞与对靶基因或蛋白质有特异性(例如，对于由所述基因编码或指示所述蛋白质的氨基酸序列的mRNA有特异性)的本发明的治疗剂接触，以调节靶蛋白的表达或者一种或更多种活性.这些调节方法可以在体外(例如，用药剂培养细胞)、体内(例如，向对象施用药剂)或离体进行.通常，首先用致敏剂处理对象，以使得更好地响应随后的RNAi治疗.因此，本发明提供了治疗受以靶基因多肽或核酸分子的异常或有害的表达或活性为特征的疾病或病患影响的个体的方法.在靶基因异常地不受调控和/或其中降低靶基因活性可能具有有益效果的情况下，靶基因活性的抑制是期望的.
可以向个体施用本发明的治疗剂以治疗(预防性或治疗性)与异常或有害的靶基因活性有关的病患.可以考虑药物基因组学(即，个体基因型与个体对外来化合物或药物的响应之间的关系的研究)与这样的治疗一起组合.通过改变药学活性药物的剂量和血液浓度之间的关系，治疗剂代谢的差异可导致严重的毒性或者治疗失败.因此，医生或临床医生可能考虑使用在相关药物基因组学中获得的知识来确定是否施用治疗剂以及修正利用治疗剂的治疗的剂量和/或治疗方案.由于受影响人中改变的药物分布(drug disposition)和异常的作用，药物基因组学解决响应于药物的临床上显著的遗传变异.参见例如Eichelbaum，M.等.(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23(10-11)：983-985和Linder，M.W.等.(1997)Clin.Chem.43(2)：254-266.
还通过以下实施例进一步说明了本发明，所述实施例绝不应解释为进一步的限制.贯穿本申请引用的所有参考文献(包括文献参考、授权的专利、公开的专利申请和共同待决的专利申请)的全部内容明确地通过引用并入本文.
实施例
实施例1：靶向SOD1的sd-rxRNA变体的鉴定
在体外设计，合成并筛选靶向SOD1的sd-rxRNA变体以确定sd-rxRNA变体降低靶基因mRNA水平的能力.在HeLa细胞(人宫颈癌细胞系，10,000个细胞/孔，96孔板)中测试sd-rxRNA变体的活性.在含血清的培养基中用不同浓度的靶向SOD1的sd-rxRNA变体或非靶向对照的组处理HeLa细胞.测试的浓度为5μM、1μM和0.1μM.非靶向对照sd-rxRNA与靶向SOD1的sd-rxRNA变体具有类似的结构，并且在两条链中含有类似的稳定化修饰.在施用后48小时，裂解细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix，Santa Clara，CA)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定确定mRNA水平.示例性有义序列和反义序列在下面的表1和表2中给出.图1和图2表明靶向SOD1的sd-rxRNA变体显著降低HeLa细胞中的体外靶基因mRNA水平.将数据相对于管家基因(PPIB)归一化并相对于非靶向对照作图.误差条表示与生物学重复的平均值的标准偏差.对应于图1和图2的序列分别可见于表3和表4.
表1.示例性有义寡核苷酸
表2.示例性反义寡核苷酸
人SOD1序列由以下列出的GenBank登录号NM_000454.4(SEQ ID NO：119)表示.已经鉴定了SOD1序列的多种突变(Rosen等(1993)Nature；Deng等(1993)Science；DeBelleroche等(1995)J Med Genet.；Orrel等(1997)J Neurol.；Cudkowicz(1997)Ann.Neurol.；以及Anderson等(1995)Nature Genet.)并且其也可以使用本申请中概述的序列进行靶向：
GTTTGGGGCCAGAGTGGGCGAGGCGCGGAGGTCTGGCCTATAAAGTAGTCGCGGAGACGGGGTGCTGGTTTGCGTCGTAGTCTCCTGCAGCGTCTGGGGTTTCCGTTGCAGTCCTCGGAACCAGGACCTCGGCGTGGCCTAGCGAGTTATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGAAGGTGTGGGGAAGCATTAAAGGACTGACTGAAGGCCTGCATGGATTCCATGTTCATGAGTTTGGAGATAATACAGCAGGCTGTACCAGTGCAGGTCCTCACTTTAATCCTCTATCCAGAAAACACGGTGGGCCAAAGGATGAAGAGAGGCATGTTGGAGACTTGGGCAATGTGACTGCTGACAAAGATGGTGTGGCCGATGTGTCTATTGAAGATTCTGTGATCTCACTCTCAGGAGACCATTGCATCATTGGCCGCACACTGGTGGTCCATGAAAAAGCAGATGACTTGGGCAAAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGACAGGAAACGCTGGAAGTCGTTTGGCTTGTGGTGTAATTGGGATCGCCCAATAAACATTCCCTTGGATGTAGTCTGAGGCCCCTTAACTCATCTGTTATCCTGCTAGCTGTAGAAATGTATCCTGATAAACATTAAACACTGTAATCTTAAAAGTGTAATTGTGTGACTTTTTCAGAGTTGCTTTAAAGTACCTGTAGTGAGAAACTGATTTATGATCACTTGGAAGATTTGTATAGTTTTATAAAACTCAGTTAAAATGTCTGTTTCAATGACCTGTATTTTGCCAGACTTAAATCACAGATGGGTATTAAACTTGTCAGAATTTCTTTGTCATTCAAGCCTGTGAATAAAAACCCTGTATGGCACTTATTATGAGGCTATTAAAAGAATCCAAATTCAAACTAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：119)
表3.降低硫代磷酸酯含量产生体外细胞毒性降低的活性ps-rxRNA变体(对应于图1的序列)
表4.降低硫代磷酸酯含量产生体外细胞毒性降低的活性ps-rxRNA变体(对应于图2的序列)
应理解的是，尽管表1至表8中提供的一些序列被描述为附接至染料DY547，但是表1至表8中提供的所有序列在本文中也在不存在DY547的情况下被公开.
实施例2：CNS中的sd-rxRNA变体摄取
图3至图5表明，具有不同硫代磷酸酯水平的sd-rxRNA化学变体被摄取并递送至CNS中的细胞.为了确定sd-rxRNA化学变体的组织分布，用15μL的15mg/mL溶液通过脑池内注射(IC注射)将靶向SOD1的荧光标记化合物施用于Sprague Dawley大鼠.在注射后24小时，收获组织并进行共焦显微术处理.共焦成像用于检测sd-rxRNA变体的细胞摄取.硫代磷酸酯含量的水平与观察到的CNS中细胞摄取水平相关(例如，硫代磷酸酯含量的水平提高实现更大的摄取).
实施例3：CNS中SOD1的sd-rxRNA变体沉默
图6示出了在鞘内施用靶向SOD1的sd-rxRNA变体(寡核苷酸ID 25652)14天后的体内SOD1沉默(小鼠，腰脊髓(LSC)).与非靶向对照相比，在用靶向SOD1的sd-rxRNA变体处理的小鼠中观察到SOD1 mRNA水平的37％降低(图6).
方法：使用渗透泵(填充有100μL的10mg/mL化合物溶液)通过鞘内输注施用靶向SOD1的sd-rxRNA变体或非靶向对照(NTC)14天.在第14天收获脊髓的终末活检样品.分离RNA并通过qPCR进行基因表达分析.将数据相对于亲环蛋白B(PPIB)管家基因的水平归一化，并相对于非靶向对照(设定为1.0)绘图.误差条表示各个活检样品之间的标准偏差.对于靶向SOD1的sd-rxRNA变体-处理组相对于PBS组，p值为＊p＜0.001.
实施例4：CNS中SOD1的sd-rxRNA变体沉默
图7示出了在鞘内施用靶向SOD1的sd-rxRNA变体(寡核苷酸ID 25645)14天后的体内SOD1沉默(小鼠，腰脊髓(LSC)).与非靶向对照相比，在用靶向SOD1的sd-rxRNA变体处理的小鼠中观察到SOD1 mRNA水平的统计学显著24％降低(图9).
方法：使用渗透泵(填充有100μL的10mg/mL化合物溶液)通过鞘内输注施用靶向SOD1的sd-rxRNA变体或非靶向对照(NTC)14天.在第14天收获脊髓的终末活检样品.分离RNA并通过qPCR进行基因表达分析.将数据相对于亲环蛋白B(PPIB)管家基因的水平归一化，并相对于非靶向对照(设定为1.0)绘图.误差条表示各个活检样品之间的标准偏差.对于靶向SOD1的sd-rxRNA变体-处理组相对于非靶向对照组，p值为＊p＜0.01.
实施例5：靶向SOD1的sd-rxRNA变体的鉴定
在体外设计，合成并筛选靶向SOD1的在碱基的第4位或第5位上包含疏水修饰的sd-rxRNA变体以确定sd-rxRNA变体降低靶基因mRNA水平的能力.在HeLa细胞(人宫颈癌细胞系，10,000个细胞/孔，96孔板)中测试sd-rxRNA变体的活性.在含血清的培养基中用不同浓度的靶向SOD1的sd-rxRNA变体或非靶向对照的组处理HeLa细胞.测试的浓度为5μM、1μM和0.1μM.非靶向对照sd-rxRNA与靶向SOD1的sd-rxRNA变体具有类似的结构，并且在两条链中含有类似的稳定化修饰.在施用后48小时，裂解细胞，并使用基因特异性探针(Affymetrix，Santa Clara，CA)根据制造商的方案通过Quantigene分支DNA测定确定mRNA水平.图8至图11表明，在碱基的第4位或第5位上包含疏水修饰的靶向SOD1的sd-rxRNA变体显著降低HeLa细胞中的体外靶基因mRNA水平.对应于图8至图11的序列可分别见于表5至表8.将数据相对于管家基因(PPIB)归一化并相对于非靶向对照作图.误差条表示与生物学重复的平均值的标准偏差.
表5. SOD1 sd-rxRNA变体辛基修饰
表6. SOD1 sd-rxRNA变体辛基修饰
表7. SOD1 sd-rxRNA变体噻吩修饰
表8. SOD1 sd-rxRNA变体异丁基修饰
等同方案
本领域技术人员将意识到或者能够仅使用常规实验确定本文所述本发明的具体实施方案的许多等同方案.这样的等同方案旨在由所附权利要求涵盖.
本文公开的所有参考文献(包括专利文件)通过引用整体并入本文.本申请通过引用并入以下文献的全部内容，包括所有附图和说明书的所有部分(包括序列表或氨基酸/多核苷酸序列)：2009年9月22日提交的题为“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAICOMPOUNDS”的PCT公开No.WO2010/033247(申请No.PCT/US2009/005247)；2014年8月5日授权的美国专利No.8,796,443，其于2012年2月16日公布为US 2012/0040459，题为“REDUCEDSIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS”；于2015年11月3日授权的题为“REDUCED SIZESELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS”的美国专利No.9,175,289；2009年2月11日提交的题为“MODIFIED RNAI POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF”的PCT公开No.WO2009/102427(申请No.PCT/US2009/000852)；和2011年2月17日公开的题为“MODIFIED RNAIPOLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF”的美国专利公开No.2011/0039914；2011年3月24日提交的题为“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS”的PCT公开No.WO 2011/119852；以及2015年7月14日授权的题为“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAICOMPOUNDS”的美国专利No.9,080,171。

Claims (26)

1.针对超氧化物歧化酶1(SOD1)的分离的双链核酸分子，其包含引导链和负载链，其中所述分离的双链核酸分子包含双链区和单链区，其中所述分子的作为双链的区为8至15个核苷酸长，其中所述引导链含有2至14个核苷酸长的单链区，其中所述引导链含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个硫代磷酸酯修饰，其中所述负载链为8至15个核苷酸长，其中所述负载链含有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个硫代磷酸酯修饰，其中所述分离的双链核酸分子的至少40％的核苷酸是经修饰的，并且其中所述分离的双链核酸分子包含选自表1至8中序列的序列的至少12个连续核苷酸，包括表1至表8中提供的修饰模式。
2.权利要求1所述的分离的双链核酸分子，其中至少60％的核苷酸是经修饰的。
3.权利要求1或权利要求2所述的分离的双链核酸分子，其中经修饰的所述分离的双链核酸分子的至少一个核苷酸包含2’O-甲基或2’-氟修饰。
4.权利要求1至3中任一项所述的分离的双链核酸分子，其中所述分离的双链核酸分子的至少一条链是完全硫代磷酸酯化的，或者除一个残基以外是完全硫代磷酸酯化的。
5.权利要求1至4中任一项所述的分离的双链核酸分子，其中多个U和/或C包含选自甲基、异丁基、辛基、咪唑或噻吩的疏水修饰，并且其中所述修饰位于U和/或C的第4位或第5位。
6.分离的双链核酸分子，其包含选自表1至表8中序列的序列的至少12个连续核苷酸，其中如果所述分离的双链核酸分子包含选自表2中SEQ ID NO：70、71、72、73、79、80、81或84的序列的至少12个连续核苷酸，则所述引导链含有多于6个硫代磷酸酯修饰。
7.权利要求1至6中任一项所述的分离的双链核酸分子，其中所述分离的双链核酸分子还包含附接至所述分离的双链核酸分子的疏水缀合物。
8.权利要求1至7中任一项所述的分离的双链核酸分子，其中有义链包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：122，并且所述引导链包含SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：91、或SEQ ID NO：123。
9.权利要求1至7中任一项所述的分离的双链核酸分子，其中有义链包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：34、或SEQ ID NO：126，并且所述引导链包含SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：93。
10.权利要求1至7中任一项所述的分离的双链核酸分子，其中有义链包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38、或SEQ ID NO：135，并且所述引导链包含SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：97、或SEQ ID NO：136。
11.权利要求1至7中任一项所述的分离的双链核酸分子，其中有义链包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：39，并且所述引导链包含SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：98。
12.权利要求1至7中任一项所述的分离的双链核酸分子，其中有义链包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：127、或SEQ ID NO：137，并且所述引导链包含SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：128、或SEQ ID NO：138。
13.组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的分离的双链核酸分子。
14.权利要求13所述的组合物，其还包含可药用载体。
15.权利要求13或权利要求14所述的组合物，其还包含第二治疗剂。
16.用于治疗ALS的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的分离的双链核酸分子或根据权利要求13至15中任一项所述的组合物。
17.用于治疗ALS的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的针对超氧化物歧化酶1(SOD1)的分离的双链核酸分子，所述分离的双链核酸分子包含引导链和负载链，其中所述分离的双链核酸分子包含双链区和单链区，其中所述分子的作为双链的区为8至15个核苷酸长，其中所述引导链含有2至14个核苷酸长的单链区，其中所述引导链含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个硫代磷酸酯修饰，其中所述负载链为8至15个核苷酸长，其中所述负载链含有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个硫代磷酸酯修饰，其中所述分离的双链核酸分子的至少40％的核苷酸是经修饰的，并且其中所述分离的双链核酸分子包含选自表1至表8中序列的序列的至少12个连续核苷酸，包括表1至8中提供的修饰模式。
18.权利要求17所述的方法，其中所述分离的双链核酸分子还包含附接至所述分离的双链核酸分子的疏水缀合物。
19.权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述分离的双链核酸分子的至少一条链是完全硫代磷酸酯化的，或者除一个残基以外是完全硫代磷酸酯化的。
20.权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述分离的双链核酸分子被配制用于递送至中枢神经系统。
21.权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述分离的双链核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32、或SEQ ID NO：122，并且所述分离的双链核酸分子的引导链包含SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：91、或SEQ ID NO：123。
22.权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述分离的双链核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：34、或SEQ ID NO：126，并且所述分离的双链核酸分子的引导链包含SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：93。
23.权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述分离的双链核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：38、或SEQ ID NO：135，并且所述分离的双链核酸分子的引导链包含SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：97、或SEQ ID NO：136。
24.权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述分离的双链核酸分子的有义链包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：39，并且所述分离的双链核酸分子的引导链包含SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：98。
25.权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述分离的双链核酸的有义链包含SEQID NO：5、SEQ ID NO：127、或SEQ ID NO：137，并且所述分离的双链核酸的引导链包含SEQID NO：64、SEQ ID NO：128、或SEQ ID NO：138。
26.权利要求17至25中任一项所述的方法，其中所述分离的双链核酸分子通过鞘内输注和/或注射施用。
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