ES2799437T3 - Productos y métodos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica - Google Patents

Productos y métodos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica Download PDF

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Abstract

Un virus recombinante adenoasociado que comprende el ADN que codifica el ARNhc de la dismutasa de superóxido 1 (SOD1) CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO: 4), en donde el genoma del virus recombinante adenoasociado carece de los genes rep y cap.

Description

DESCRIPCIÓN
Productos y métodos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica
Declaración de interés del Estado
Esta invención se realizó con la subvención del Estado según los documentos del U.S. National Institutes of Health R21-NS067238, NS027036, ROI NS064492 y RC2 NS69476-01. El Estado tiene ciertos derechos en esta invención.
Material remitido por vía electrónica
Junto con el presente documento se remite una lista de secuencias de nucleótidos/aminoácidos, y se identifica como sigue: archivo ACII (Texto) de 14.350 bytes denominado "47886PCT_SeqListing.txt'', creado el 26 de agosto de 2014.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos basados en ARN para inhibir la expresión del gen de la dismutasa de superóxido 1 (SOD-1). Los virus adenoasociados recombinantes de la invención suministran ADN que codifican ARN que inactivan la expresión de la SOD-1. Los métodos tienen aplicación en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
Antecedentes
La ELA es una enfermedad neurodegenerativa de inicio en adultos, con una progresión rápida y mortal, caracterizada por la degeneración selectiva de las motoneuronas tanto superiores como inferiores. Caracterizada por primera vez por Charcot en 1869, la ELA es responsable de una de cada 2.000 muertes, afectando a casi 5 de cada 100.000 individuos. La ELA aparece cuando degeneran las células nerviosas específicas del cerebro y de la médula espinal que controlan el movimiento voluntario. Entre dos y cinco años después de su inicio clínico, la pérdida de estas motoneuronas da lugar a una atrofia progresiva de los músculos esqueléticos, lo que da como resultado una pérdida de la función muscular que conduce a parálisis, deficiencias en el habla y la muerte debida a una insuficiencia respiratoria.
La mayoría de los casos de ELA no tienen una relación genética evidente, y se denominan esporádicos, pero en el 10 % de los casos, la enfermedad es familiar con una herencia dominante. El veinte por ciento de los casos familiares están causados por mutaciones en la enzima dismutasa de superóxido 1 (SOD1), con más de 140 mutaciones distintas identificadas hasta la fecha12. Muchos esfuerzos para identificar cómo las mutaciones alteran la función de la SOD1 han producido una visión consensuada de que los mutantes de la SOD1 adquieren una o más toxicidades, cuya naturaleza sigue siendo aún controvertida3, pero existen evidencias contundentes de que una proporción de la SOD1 mutante está mal plegada, y posteriormente se agrega45. Los agregados de la SOD1 son, de hecho, uno de los rasgos histológicos característicos de los casos de ELA relacionados con la SOD14.
En los últimos 20 años se han generado múltiples modelos de animales que expresan formas mutantes de la SOD1 humana. Estos modelos recapitulan los rasgos característicos de la ELA, desarrollando una degeneración del axón motor dependiente de la edad y una desnervación muscular concomitante, inflamación glial y la posterior pérdida de la motoneurona. Los experimentos de escisión génica selectiva han determinado que la expresión de la SOD1 mutante en las propias motoneuronas contribuye al inicio de la enfermedad y a la progresión temprana de la enfermedad6, al igual que la síntesis mutante en células NG2+7 que son precursoras de los oligodendrocitos. Sin embargo, la expresión de la proteína SOD1 mutante en la microglía y los astrocitos dirige significativamente una rápida progresión de la enfermedad68, hallazgos que han dado lugar a la conclusión de que la fisiopatología de la ELA no es autónoma celular3.
Además, se ha averiguado que los astrocitos son tóxicos para las motoneuronas en múltiples modelos in vitro donde las formas mutantes de la SOD1 humana estaban sobreexpresadas9-11. Un estudio reciente extrajo astrocitos de médulas espinales cadavéricas de pacientes de ELA con o sin mutaciones de la SOD1. En todos los casos, los astrocitos de pacientes con ELA esporádica eran tan tóxicos para las motoneuronas como los astrocitos portadores de mutaciones genéticas en la SOD112. Incluso más sorprendentemente, la reducción de la SOD1 en los astrocitos extraídos de pacientes con ELA tanto esporádica como familiar disminuyó la toxicidad debida al astrocito que es selectiva para las motoneuronas, pero no para las gabérgicas. Este notable hallazgo, junto con informes de hallazgos de inclusiones de SOD1 mal plegada en las médulas espinales de pacientes con ELA familiar, así como en algunos con ELA esporádica 131415, ha proporcionado pruebas contundentes del papel patógeno de la SOD1 natural en la ELA esporádica.
A pesar de las percepciones que han proporcionado los modelos de animal que expresa la SOD1 mutante para comprender los mecanismos implicados en la degeneración de la motoneurona, se ha cuestionado su utilidad para el desarrollo de enfoques terapéuticos16, ya que ningún fármaco con un beneficio de supervivencia notificado en ratones mutantes para la SOD1G93A ha sido eficaz en ensayos clínicos con pacientes con ELA esporádica. En todos los casos excepto uno, se ha notificado que los fármacos llevados a ensayos con seres humanos solo prolongan la supervivencia del ratón mutante para la SOD1 cuando se aplican antes de los síntomas, e incluso entonces proporcionan un beneficio de supervivencia únicamente retrasando el inicio de la enfermedad, sin ningún beneficio de ralentización de la progresión de la enfermedad. La única excepción a esto fue el riluzol, al igual que la situación con seres humanos, prolongó modestamente la supervivencia de los ratones mutantes para la SOD1G93A y lo hizo ralentizando la progresión de la enfermedad17. Reconociendo que el éxito en el ensayo con seres humanos requerirá la ralentización de la progresión de la enfermedad, los ratones mutantes para la SOD1 han predicho perfectamente el éxito del riluzol y el fracaso de eficacia de cualquier otro fármaco probado en el ensayo con seres humanos. Lo que ha faltado son terapias adicionales que afecten a la progresión de la enfermedad en estos ratones.
Por lo tanto, el riluzol es el único fármaco aprobado actualmente por la FDA como terapia para la ELA, proporcionando un modesto beneficio de supervivencia21. Para el 20 % de los casos familiares causados por una mutación en la SOD1, los intentos de mejorar una terapia reduciendo en la síntesis de la SOD1 han sido el foco de múltiples enfoques de desarrollo terapéutico. Se ensayaron oligonucleótidos antisentido y ARN interferente suministrado mediante virus (ARNi) en modelos de rata23-25 y de ratón22 que desarrollan una parálisis mortal por la sobreexpresión la SOD1G93A humana. Los oligonucleótidos antisentido infundidos al inicio de la enfermedad produjeron una reducción en la SOD1 y una modesta ralentización de la progresión de la enfermedad22. Se ha ensayado clínicamente la infusión directa en el LCR de oligonucleótidos antisentido26, produciendo unos resultados esperanzadores en términos de tolerabilidad y seguridad, pero sin ninguna reducción significativa en los niveles de la SOD1 a las bajas dosis utilizadas. En cada uno de los estudios víricos previos23-25, se ha conseguido la inactivación de la SOD1 antes del inicio de la enfermedad mediante una inyección directa en el sistema nervioso o aprovechando el transporte retrógrado axonal cuando se ha inyectado intramuscularmente un virus2324. Estos estudios dieron lugar a diversos grados de éxito, prolongando la supervivencia o mejorando el comportamiento motor, dependiendo del momento del tratamiento, así como del nivel de inactivación de la SOD1 conseguido en la médula espinal. Aunque estos estudios proporcionaron una importante prueba de viabilidad, los enfoques estaban lejos de ser fácilmente traducidos a estrategias clínicas. De hecho, ha habido controvertidos informes alrededor de estos estudios iniciales de supresión mediada por virus de la SOD123-24-27-29.
Se han usado vectores de virus adenoasociados (AAV) en varios ensayos clínicos recientes para el tratamiento de trastornos neurológicos [Kaplitt et al., Lancet 369: 2097-2105 (2007); Marks et al., Lancet Neurol 7: 400-408 (2008); Worgall et al., Hum Gen Ther (2008)].
El AAV es un parvovirus de replicación deficiente, cuyo genoma de ADN monocatenario tiene aproximadamente 4,7 kb de longitud, incluyendo 145 repeticiones terminales invertidas (ITR) de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del genoma del AAV del serotipo 2 (AAV2) se presenta en Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983) corregido por Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). Las secuencias que actúan en cis dirigiendo la replicación del ADN vírico (rep), la encapsidación/empaquetamiento y la integración en el cromosoma de la célula hospedadora, están contenidas en las iTr . Tres promotores del AAV (denominados p5, p19 y p40 por sus ubicaciones relativas en el mapa) dirigen la expresión de los dos marcos abiertos de lectura internos del AAV que codifican los genes rep y cap. Los dos promotores rep (p5 y p19), acoplados con el corte y empalme diferencial del único intrón del AAV (en los nucleótidos 2107 y 2227), dan como resultado la producción de cuatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40) del gen rep. Las proteínas Rep poseen múltiples propiedades enzimáticas que son finalmente responsables de la replicación del genoma vírico. El gen cap es expresado a partir del promotor p40 y codifica las tres proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3. Un corte y empalme alternativo y unos sitios de inicio de la traducción no consenso son responsables de la producción de las tres proteínas relacionadas de la cápside. Un único sitio de poliadenilación consenso está ubicado en la posición del mapa 95 del genoma del AAV. El ciclo de vida y la genética del AAV se revisan en Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).
El AAV posee unas características únicas que lo hacen atractivo como vector para suministrar ADN foráneo a células, por ejemplo, en terapia génica. La infección por AAV de células en cultivo no es citopática, y la infección natural de seres humanos y de otros animales es silente y asintomática. Además, el AAV infecta muchas células de mamífero, permitiendo la posibilidad de dirigirse a muchos tejidos diferentes in vivo. Además, el AAV transduce lentamente células en división y en reposo, y puede persistir esencialmente durante la vida de esas células en forma de un episoma nuclear transcripcionalmente activo (elemento extracromosómico). El genoma provírico del AAV es infeccioso en forma de ADN clonado en plásmidos, lo que hace posible la construcción de genomas recombinantes. Asimismo, debido a las señales que dirigen la replicación del AAV, la encapsidación y la integración del genoma están contenidas en las ITR del genoma del AAV, algunas o todas las aproximadamente 4,3 kb internas del genoma (que codifican las proteínas de replicación y estructurales de la cápside, rep-cap) pueden ser sustituidas por ADN foráneo tal como un casete génico que contiene un promotor, un ADN de interés y una señal de poliadenilación. Las proteínas rep y cap pueden ser proporcionadas in trans. Otra característica significativa del AAV es que es un virus extremadamente estable y robusto. Soporta con facilidad las condiciones usadas para la inactivación de adenovirus (de 56° a 65 0C durante varias horas), haciendo menos critica la preservación en frío del AAV. El AAV puede incluso ser liofilizado. Finalmente, las células infectadas por AAV no son resistentes a una sobreinfección.
Existen múltiples serotipos de AAV, y ofrecen un tropismo tisular diverso. Algunos serotipos conocidos incluyen, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV11 y AAVrh74. Los avances en el suministro de AAV6 y de AAV8 han hecho posible la transducción, mediante estos serotipos, de músculo esquelético y cardíaco después de unas simples inyecciones sistémicas intravenosas o intraperitoneales. Véase Pacak et al., Circ. Res., 99 (4): 3-9 (1006) y Wang et ah, Nature Biotech., 23 (3): 321-8 (2005). El uso de AAV para dirigirse a tipos celulares dentro del sistema nervioso central ha implicado una inyección quirúrgica intraparenquimatosa. Véase, Kaplitt et ah, supra; Marks et ah, supra, y Worgall et al., supra. Con respecto al uso de AAV para dirigirse a tipos celulares dentro del sistema nervioso central, véase la Publicación Internacional n° WO 2010/ 071832. Las Publicaciones Internacionales n° WO 2009/043936 y WO 2009/013290 declaran que se refieren a la administración de genes al sistema nervioso central. La Publicación Internacional n° WO 2011/133890 declara que se refiere a virus adenoasociados recombinantes útiles para dirigir transgenes al tejido del sistema nervioso central.
Ding H et al: "Selective silencing by RNAi of dominant allele that causes amyotrophic lateral sclerosis", AGING CELL, BLACKWELL PUBLISHING, GB, vol. 2, 1 de enero de 2003 (2003-01-01), páginas 209-217 identificaron la secuencia de un ARNip y un ARNhc que puede regular por disminución selectivamente la expresión de la SOD1 mutante, pero no de la natural.
Permanece por tanto una necesidad en la técnica de métodos y materiales para el tratamiento de la ELA.
Sumario
En un primer aspecto de la presente invención se proporciona un virus recombinante adenoasociado que comprende el ADN que codifica el ARNhc de la dismutasa de superóxido 1 (SOD1) CATGGATTCCATGTTCATGA (SeQ ID NO: 4), en donde el genoma del virus recombinante adenoasociado carece de los genes rep y cap.
En un aspecto adicional de la presente invención también se proporciona el virus recombinante adenoasociado de la presente invención para su uso en terapia.
En otro aspecto de la presente invención se proporciona el virus recombinante adenoasociado de la presente invención para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición que comprende el virus recombinante adenoasociado de la presente invención
La presente invención proporciona productos y su uso en métodos útiles para reducir los niveles de la proteína mutante SODI en sujetos en necesidad de los mismos. La invención proporciona la administración mediada por AAV de ARN que incluyen, pero no se limitan a, ARN horquillados cortos, para reducir la síntesis de mutantes de la SODI humana que causan la ELA en sujetos en necesidad de los mismos. Algunos AAV recombinantes (rAAV) contemplados por la invención incluyen, pero no se limitan a, rAAV9, rAAV2 y rAAVrh74. Las vías de administración contempladas por la invención incluyen, pero no se limitan a, una administración sistémica y una administración intratecal. El uso de los productos de la invención está indicado, por ejemplo, en el tratamiento de la ELA.
En un aspecto, la invención proporciona genomas de rAAV que comprenden una o más ITR del AAV que flanquean un polinucleótido que codifica uno o más ARN (que incluyen, pero no se limitan a, ARN horquillados pequeños, ARN antisentido y/o microARN) que se dirigen a polinucleótidos de SODI mutantes. Los ejemplos describen el uso de ejemplos de rAAV que codifican ARN horquillados pequeños (ARNhp). En los genomas de los rAAV, el polinucleótido que codifica el ARNhc está unido operativamente al ADN de control de la transcripción, específicamente al ADN promotor que es funcional en las células objetivo. Los proveedores comerciales tales como Ambion Inc. (Austin, TX), Darmacon Inc. (Lafayette, CO), InvivoGen (San Diego, CA) y Molecular Research Laboratories, LLC (Herndon, VA) generan moléculas inhibidoras personalizadas de ARN. Además, hay disponibles comercialmente kits para producir moléculas personalizadas de ARNip, tales como el SILENCER™ siRNA Construction Kit (Ambion Inc., Austin, TX) o el psiRNA System (InvivoGen, San Diego, CA). En la realización de la presente invención, el genoma del rAAV comprende un ADN que codifica un ARNhc de la SOD1 según se establece a continuación en SEQ ID NO: 4. La presente solicitud también divulga el genoma de un rAAV que comprende un ADN que codifica un ARNhc de la SOD1 según se establece a continuación en el resto de las secuencias:
GCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAA (SEQ ID NO: 1),
GAAGCATTAAAGGACTGACTGAA (SEQ ID NO: 2),
CTGACTGAAGGCCTGCATGGATT (SEQ ID NO: 3),
CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO: 4) ("ARNhc 130" o "ARNhc de la SODI" en el presente documento), GCATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO: 5),
GGTCTGGCCTATAAAGTAGTC (SEQ ID NO: 6),
GGGCATCATCAATTTCGAGCA (SEQ ID NO: 7),
GCAT CAT CAATTTCGAGCAGA (SEQ ID NO: 8),
GCCTGCATGGATTCCATGTTC (SEQ ID NO: 9),
GGAGGT CTGGCCTAT AAAGT A (SEQ ID NO: 10),
GATTCCAT GTT CAT GAGTTT G (SEQ ID NO: 11),
GGAGATAATACAGCAGGCTGT (SEQ ID NO: 12),
GCTTTAAAGTACCTGTAGTGA (SEQ ID NO: 13),
GCATTAAAGGACTGACTGAAG (SEQ ID NO: 14),
TCATCAATTTCGAGCAGAA (SEQ ID NO: 15),
TCGAGCAGAAGGAAAGTAA (SEQ ID NO: 16),
GCCTGCATGGATTCCATGT (SEQ ID NO: 17),
TCACTCTCAGGAGACCATT (SEQ ID NO: 18) o
GCTTT AAAGT ACCT GT AGT (SEQ ID NO: 19).
Los genomas de rAAV de la invención carecen de ADN de rep y cap del AAV. El ADN de AAV en los genomas de rAAV (por ejemplo, las ITR) puede ser de cualquier serotipo de AAV a partir del cual pueda derivar un virus recombinante, incluyendo, pero no se limitan a, los serotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 y AAV-11. Las secuencias de nucleótidos de los genomas de los serotipos de AAV son conocidas en la técnica. Por ejemplo, el genoma completo del AAV-1 se proporciona en el n° de registro de Genbank NC_002077; el genoma completo del AAV-2 se proporciona en el n° de registro de Genbank NC_001401 y en Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 {1983); el genoma completo del AAV-3 n° de registro de Genbank NC_1829; el genoma completo del AAV-4 se proporciona en el n° de registro de Genbank NC_001829; el genoma del AAV-5 se proporciona en el n° de registro de Genbank AF085716; el genoma completo del AAV-6 se proporciona en el n° de registro de Genbank NC_00 1862; al menos porciones de los genomas de AAV-7 y AAV-8 se proporcionan en los n° de registro de GenBank AX753246 y AX753249, respectivamente; el genoma del AAV -9 se proporciona en Gao et al, J. Virol, 78: 6381 -6388 (2004); el genoma del AAV-10 se proporciona en Mol. Ther., 13 (1): 67-76 (2006); y el genoma del AAV-11 se proporciona en Virology, 330 (2): 375-383 (2004). El genoma del AAVrh74 se proporciona en la Publicación Internacional n° WO 2013/078316.
En otro aspecto, la invención proporciona plásmidos de ADN que comprenden los genomas del rAAV de la invención. Los plásmidos de ADN se transfieren a células susceptibles de infección con un virus colaborador de AAV (por ejemplo, adenovirus, adenovirus delecionado en EI o herpesvirus) para el ensamblaje del genoma del rAAV en partículas víricas infecciosas. Las técnicas para producir partículas de rAAV, en las que se va a empaquetar el genoma de un AAV, los genes rep y cap, y las funciones de virus colaborador que se proporcionan a una célula son habituales en la técnica. La producción de rAAV requiere que los siguientes componentes están presentes en una única célula (denominada en el presente documento célula de empaquetamiento): el genoma de un rAAV, los genes rep y cap del AAV separados de (es decir, fuera de) el genoma del rAAV, y funciones de virus colaborador. Los genes rep y cap del AAV pueden ser de cualquier serotipo de AAV del cual pueda derivar un virus recombinante, y pueden ser de un serotipo de AAV diferente al de las ITR del genoma del rAAV, incluyendo, pero no se limitan a, los serotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 y AAV-11. La producción de rAAV seudotipado se divulga, por ejemplo, en el documento WO 01/83692, que se incorpora como referencia en su totalidad en el presente documento. En diversas realizaciones, las proteínas de la cápside del AAV pueden ser modificadas para mejorar el suministro del vector recombinante. Las modificaciones de las proteínas de la cápside son generalmente conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, los documentos US 20050053922 y US 20090202490.
Un método para generar una célula de empaquetamiento es crear una línea celular que exprese de forma estable todos los componentes necesarios para la producción de partículas del AAV. Por ejemplo, un plásmido (o múltiples plásmidos) que comprenden el genoma de un rAAV que carece de los genes rep y cap del AAV, los genes rep y cap del AAV separados del genoma del rAAV, y un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a la neomicina, están integrados en el genoma de una célula. Los genomas del AAV se han introducido en plásmidos bacterianos mediante procedimientos tales como la adición de una cola de GC (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. EE.UU., 79: 2077-2081), addition of synthetic linkers containing restriction endonuclease cleavage sites (Laughlin et al., 1983, Gene, 23: 65-73) o mediante la unión directa de extremos romos (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259: 4661-4666). Después, la línea celular de empaquetamiento es infectada con un virus colaborador tal como un adenovirus. Las ventajas de este método es que las células son seleccionables y son adecuadas para la producción a gran escala del rAAV. Otros ejemplos de métodos adecuados emplean adenovirus o baculovirus en lugar de plásmidos para introducir los genomas del rAAV y/o los genes rep y cap en las células de empaquetamiento.
Los principios generales de la producción de rAAV se revisan, por ejemplo, en Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; y Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial, and Immunol., 158: 97-129). Se describen diversos enfoques en Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 81: 6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963 (1988); y Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7: 349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63: 3822-3828); la Patente de Estados Unidos n° 5.173.414; el documento WO 95/13365 y la correspondiente Patente de Estados Unidos n° 5.658.776; el documento WO 95/13392; el documento WO 96/17947; el documento PCT/US98/18600; el documento WO 97/09441 (PCT/US96/14423); el documento WO 97/08298 (PCT/US96/13872); el documento WO 97/21825 (PCT/US96/20777); el documento WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); el documento WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13: 1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gen Therapy 4: 609-615; Clark et al. (1996) Gen Therapy 3: 1124-1132; la Patente de Estados Unidos n° 5.786.211; la Patente de Estados Unidos n° 5.871.982; y la Patente de Estados Unidos n° 6.258.595. Se contemplan específicamente rAAV monocatenarios.
La divulgación proporciona por lo tanto células de empaquetamiento que producen rAAV infecciosos. En una realización, las células de empaquetamiento pueden ser células cancerosas transformadas de forma estable, tales como células HeLa, células 293 y células PerC.6 (una línea celular 293 análoga). En otra realización, las células de empaquetamiento son células que no son células cancerosas transformadas, tales como células 293 de bajo pase (células de riñón fetal humano transformadas con EI de adenovirus), células MRC-5 (fibroblastos fetales humanos), células WI-38 (fibroblastos fetales humanos), células Vero (células de riñón de mono) y células FRhL-2 (células de pulmón fetal rhesus).
En otro aspecto más, la invención proporciona rAAV (es decir, partículas infecciosas encapsidadas de rAAV) que comprenden el genoma de un rAAV de la invención. En algunas realizaciones, el genoma del rAAV es un genoma autocomplementario. Los genomas del rAAV carecen de ADN de rep y cap del AAV, es decir, no hay ADN de rep y cap del AAV entre las ITR de los genomas. Algunas realizaciones incluyen, pero no se limitan a, el ejemplo de rAAV que incluye un genoma que codifica el ARNhc de la SOD1 denominado "AAV-SOD1-ARNhc". A continuación se establece una secuencia que incluye el genoma del AAV-SOD1-ARNhc en forma de una secuencia invertida de un plásmido usado en producción.
CARACTERÍSTICAS Ubicación/Modificadores
misc_feature 662..767
/gene="ITR mutada"
/SECDrawAs="Región"
/SECStyleId=1
CDS complement(901..965)
/gene="ARNhc de la SOD"
/SECDrawAs=" Gen"
/ SECStyleId=1
misc_feature complement(966.. 1064)
/gene="H1"
/SECDrawAs="Región"
/SECStyleId=1
misc_feature 1224..1503
/gene="potenciador del CMV"
/SECDrawAs="Región"
/SECStyleId=1
misc_feature 1510..1779
/gene="promotor de la actina B"
/product="Pollo"
/SECDrawAs="Región"
/SECStyleId=1
misc_feature 1845..1875
/gene=" SV40_late_19s_int"
/SECDrawAs="Región"
/SECStyleId=1
misc_feature 1845..1941
/gene= "modSV40 late 16s int"
/SECDrawAs="Región"
/SECStyleId=1
CDS 2015..2734
/gene="GFP"
/SECDrawAs=" Gen"
/ SECStyleId=1
misc_feature 2783..2929
/gene="BGHpA"
/SECDrawAs="Región"
/SECStyleId=1
misc_feature 3009..3149
/gene="ITR"
/SECDrawAs="Región"
/SECStyleId=1
misc_feature 3983..4843
/gene="amp r"
/SECDrawAs="Región"
/ SECStyleId=1
misc_feature 4997..5618
/gene="pBR322 ori"
/SECDrawAs="Región"
/SECStyleId=1
(SEQ ID NO: 20)
i gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgattct 61 aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg 121 cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 181 cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 241 ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 301 cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 361 ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 421 tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 481 ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 541 aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt 601 ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc 661 cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 721 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tcacgcgtgg 781 atctgaattc aattcacgcg tggtacctac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 841 gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 901 tttccaaaaa agcatggatt ccatgttcat gatctcttga atcatgaaca tggaatccat 961 ggatccgagt ggtctcatac agaacttata agattcccaa atccaaagac atttcacgtt 1021 tatggtgatt tcccagaaca catagcgaca tgcaaatatg aattcactgg ccgtcgtttt 1081 acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc 1141 ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt 1201 gcgcagcctg tggtacctct ggtcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 1261 ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 1321 atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 1381 gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 1441 cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 1501 tactcgaggc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt 1561 tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc 1621 gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg 1681 cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc 1741 ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagc gggatcagcc accgcggtgg 1801 cggcctagag tcgacgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 1861 tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 1921 ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 1981 aattgtaccc gcggccgatc caccggtcgc caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt 2041 caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag 2101 cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg 2161 caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt 2221 gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat 2281 gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac 2341 ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat 2401 cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca 2461 caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg 2521 ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat 2581 cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag 2641 caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg 2701 gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaagcggc catcaagctt atcgataccg 2761 tcgactagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt 2821 tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 2881 taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg 2941 gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggagaga 3001 tcgatctgag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct 3061 cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt 3121 gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc cccccccccc ccccccccgg cgattctctt 3181 gtttgctcca gactctcagg caatgacctg atagcctttg tagagacctc tcaaaaatag 3241 ctaccctctc cggcatgaat ttatcagcta gaacggttga atatcatatt gatggtgatt 3301 tgactgtctc cggcctttct cacccgtttg aatctttacc tacacattac tcaggcattg 3361 catttaaaat atatgagggt tctaaaaatt tttatccttg cgttgaaata aaggcttctc 3421 ccgcaaaagt attacagggt cataatgttt ttggtacaac cgatttagct ttatgctctg 3481 aggctttatt gcttaatttt gctaattctt tgccttgcct gtatgattta ttggatgttg 3541 gaatcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg 3601 gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc 3661 aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc 3721 tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc 3781 gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt 3841 ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 3901 tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 3961 ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 4021 ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 4081 tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 4141 gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 4201 gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 4261 acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 4321 tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 4381 caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 4441 gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 4501 cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 4561 tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 4621 agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 4681 tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc 4741 ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag 4801 acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 4861 ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 4921 gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 4981 gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 5041 ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 5101 gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 5161 ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 5221 cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 5281 cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 5341 ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 5401 tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 5461 cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 5521 ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 5581 aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 5641 ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 5701 tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 5761 gtcagtgagc gaggaagcgg aagagc
Los nucleótidos 901-965 del ARNhc de la SOD comprenden la totalidad de la secuencia en horquilla que incluye los brazos sentido y antisentido, la horquilla y la secuencia de terminación. La secuencia con una orientación directa (con las secuencias objetivo contra la SOD1 subrayadas) es:
5 ' ATTCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTT
G G ATTT GG G AAT CTT AT AAGTT CTGTAT G AG ACCACT CG G AT CCAT G G ATT CCAT GTT C A
T G ATT C AAG AG AT CAT G AACAT GG AAT CCAT G CTTTTTT G G AAA 3 ' (SEQ ID NO:21)
El rAAV de la invención puede ser purificado mediante métodos convencionales de la técnica, tales como una cromatografía en columna o gradientes en cloruro de cesio. Los métodos para purificar los vectores de rAAV del virus colaborador son conocidos en la técnica, e incluyen los métodos divulgados en, por ejemplo, Clark et al, Hum. Gen Ther., 10 (6): 1031-1039 (1999); Schenpp y Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002); la Patente de los Estados Unidos n.° 6.566.118 y el documento WO 98/09657.
En otro aspecto, la invención contempla composiciones que comprenden el rAAV de la presente invención. Las composiciones de la invención comprenden el rAAV en un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones también pueden comprender otros ingredientes tales como diluyentes y adyuvantes. Los portadores, diluyentes y adyuvantes aceptables no son tóxicos para los receptores y son preferentemente inertes a las dosis y en las concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como Tween, pluronics o polietilenglicol (PEG).
Los títulos del rAAV que se va a administrar en los usos de la invención variarán dependiendo, por ejemplo, del rAAV en particular, del modo de administración, del objetivo del tratamiento, del individuo y del (los) tipo(s) celular(es) al (los) que se dirige, y pueden ser determinados mediante los métodos convencionales de la técnica. Los títulos del rAAV pueden variar desde aproximadamente aproximadamente 1x102, aproximadamente 1x103, aproximadamente 1x104, aproximadamente 1x105, aproximadamente 1x106, aproximadamente 1x107, aproximadamente 1x108, aproximadamente 1x109, aproximadamente 1x1010, aproximadamente 1x1011, aproximadamente 1x1012, aproximadamente 1x1013 hasta aproximadamente 1x1014 o más partículas resistentes a la DNasa (DRP) por ml. Las dosis también pueden ser expresadas en unidades de genoma vírico (vg). Las dosis también pueden variar según la cronología de la administración a un ser humano. Estas dosis del rAAV pueden variar desde aproximadamente 1x104, aproximadamente 1x105, aproximadamente 1x106, aproximadamente 1x107, aproximadamente 1x108, aproximadamente 1Ix109, aproximadamente 1Ix1010, aproximadamente 1x1011, aproximadamente 1x1012, aproximadamente 1x1013, aproximadamente 1x1014, aproximadamente 1x1015, aproximadamente 1xI1016 o más genomas víricos por kilogramo de peso corporal en un adulto. Para un neonato, las dosis del rAAV pueden variar desde aproximadamente aproximadamente 1x104, aproximadamente 3x104 aproximadamente 1x105 aproximadamente 3x105 aproximadamente 1x106, aproximadamente 3x106 aproximadamente 1x107 aproximadamente 3x107, aproximadamente 1x108, aproximadamente 3x108 aproximadamente 1x109 aproximadamente 3x109, aproximadamente 1x1010, aproximadamente 3x1010 aproximadamente 1x1011 aproximadamente 3x1011 aproximadamente 1x1012, aproximadamente 3x1012 aproximadamente 1x1013 aproximadamente 3x1013 aproximadamente 1x1014, aproximadamente 3x1014 aproximadamente 1x1015 aproximadamente 3x1015, aproximadamente 1x1016 aproximadamente 3x1016 o más genomas víricos por kilogramo de peso corporal.
En otro aspecto, la invención contempla composiciones que comprenden el rAAV de la presente invención. Las composiciones de la invención comprenden el rAAV en un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones también pueden comprender otros ingredientes tales como diluyentes y adyuvantes. Los portadores, diluyentes y adyuvantes aceptables no son tóxicos para los receptores y son preferentemente inertes a las dosis y en las concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como Tween, pluronics o polietilenglicol (PEG).
En otro aspecto más, la invención proporciona usos del rAAV de la invención en métodos de transducción de una célula objetivo con un rAAV de la invención, in vivo o in vitro. Los métodos in vivo comprenden la etapa de administrar una dosis eficaz o múltiples dosis eficaces, de una composición que comprende un rAAV de la invención a un sujeto, un sujeto (incluyendo un ser humano), en necesidad del mismo. Si la dosis se administra antes del inicio/desarrollo de un trastorno/enfermedad, la administración es profiláctica. Si la dosis se administra después del inicio/desarrollo de un trastorno/enfermedad, la administración es terapéutica. En algunas realizaciones de la invención, una dosis eficaz es una dosis que alivia (elimina o reduce) al menos un síntoma asociado con el trastorno/estado patológico que se va a tratar, que ralentiza o previene la progresión hacia un trastorno/estado patológico, que ralentiza o previene la progresión de un trastorno/estado patológico, que disminuye la magnitud de la enfermedad, que da como resultado una remisión (parcial o total) de la enfermedad, y/o que prolonga la supervivencia. Un ejemplo de una enfermedad contemplada para su tratamiento con los métodos de la invención es la ELA. Un "tratamiento" según la invención, por lo tanto, alivia (elimina o reduce) al menos un síntoma asociado con el trastorno/estado patológico que se va a tratar (por ejemplo, la pérdida de peso se elimina o se reduce en al menos un 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % o más), que ralentiza o previene la progresión hacia (el inicio/desarrollo) de un trastorno/estado patológico, que ralentiza o previene la progresión de un trastorno/estado patológico, que disminuye la magnitud de la enfermedad, que da como resultado una remisión (parcial o total) de la enfermedad, y/o que prolonga la supervivencia. En algunas realizaciones, la supervivencia se prolonga al menos un 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % o más.
Las terapias de combinación también están contempladas por la invención. Según se usa en el presente documento, la combinación incluye tanto tratamientos simultáneos como tratamientos secuenciales. Se contemplan específicamente combinaciones de usos de la invención con tratamientos médicos convencionales (por ejemplo, riluzol), ya que son combinaciones con terapias novedosas.
La administración de una dosis eficaz de las composiciones puede ser mediante las vías convencionales de la técnica que incluyen, pero no se limitan a, sistémica intramuscular, parenteral, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, intracraneal, intratecal, intraósea, intraocular, rectal o vaginal. La(s) vía(s) de administración y el (los) serotipo(s) de los componentes del AAV del rAAV (en particular, las ITR del AAV y la proteína de la cápside) de la invención pueden ser elegidos y/o ajustados por los expertos en la técnica teniendo en cuenta la infección y/o el estado patológico que se va a tratar, y la(s) célula(s)/tejido(s) objetivo que va(n) a expresar los ARNhc de la SOD1. En algunas realizaciones, la vía de administración es sistémica. En algunas realizaciones, la vía de administración es intratecal. En algunas realizaciones, la vía de administración es intracerebroventricular. En algunas realizaciones, la vía de administración es la cisterna cerebelobulbar posterior. En algunas realizaciones, la vía de administración es mediante una punción lumbar.
La transducción de las células con el rAAV de la invención da como resultado la expresión sostenida de los ARNhc de la SOD1. En otro aspecto, la presente invención proporciona, por lo tanto, métodos para administrar/suministrar a un sujeto el rAAV que expresa el ARNhc de la SOD1, preferentemente un ser humano. El término "transducción" se usa para hacer referencia a la administración/suministro de los ARNhc de la SOD1 a una célula receptora tanto in vivo como in vitro, a través de un rAAV de replicación deficiente de la invención, dando como resultado la expresión de un ARNhc de la SOD1 por parte de la célula receptora.
Por lo tanto, la invención proporciona el uso del rAAV de la presente invención en métodos de administración de una dosis eficaz (o dosis administradas esencialmente simultáneamente, o dosis administradas a intervalos) del rAAV que codifica los ARNhc de la SOD1 en un sujeto en necesidad del mismo
En un aspecto, la invención proporciona el uso del rAAV de la presente invención en métodos para suministrar un polinucleótido que codifica un ARNhc de la invención a través de la BHC, que comprende la administración por vía sistémica a un sujeto de un rAAV con un genoma que incluye el polinucleótido. En algunas realizaciones, el genoma del rAAV es un genoma autocomplementario. En otras realizaciones, el genoma del rAAV es un genoma monocatenario. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAV9. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAV2. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAVrh74.
En algunas realizaciones, los métodos suministran por vía sistémica polinucleótidos a través de la BHC al sistema nervioso central y/o periférico. Por consiguiente, se proporciona un método para suministrar un polinucleótido al sistema nervioso central que comprende la administración a un sujeto por vía sistémica de un rAAV con un genoma autocomplementario que incluye el genoma. En algunas realizaciones, el polinucleótido se suministra en el cerebro. En algunas realizaciones, el polinucleótido se suministra en la médula espinal. También se proporciona un método para suministrar un polinucleótido al sistema nervioso periférico que comprende la administración a un sujeto por vía sistémica de un rAAV con un genoma autocomplementario que incluye el polinucleótido se proporciona. En algunas realizaciones, el polinucleótido se suministra en una motoneurona inferior. En algunas realizaciones, el genoma del rAAV es un genoma autocomplementario. En otras realizaciones, el genoma del rAAV es un genoma monocatenario. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAV9. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAV2. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAVrh74.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso del rAAV de la presente invención en métodos para suministrar un polinucleótido al sistema nervioso central de un sujeto en necesidad del mismo que comprende el suministro intratecal de un rAAV con un genoma que incluye el polinucleótido. En algunas realizaciones, el genoma del rAAV es un genoma autocomplementario. En otras realizaciones, el genoma del rAAV es un genoma monocatenario. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAV9. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAV2. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAVrh74. En algunas realizaciones, también se suministra al sujeto un agente de contraste no iónico de osmolaridad baja, por ejemplo, iobitridol, iohexol, iomeprol, iopamidol, iopentol, iopromida, ioversol o ioxilano.
Algunas realizaciones de la invención emplean el rAAV para suministrar polinucleótidos a las células gliales nerviosas y a las células endoteliales. En algunas realizaciones, la célula nerviosa es una motoneurona inferior y/o una motoneurona superior. En algunas realizaciones, la célula glial es una célula microglial, un oligodendrocito y/o en astrocito. En otros aspectos, el rAAV se usa para suministrar un polinucleótido a una célula de Schwann.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Patrón de transducción del AAV9 y persistencia en ratones SOD1G93A. Los ratones SOD1G93A recibieron una inyección intravenosa de AAV9-CB-GFP el P1, el P21 y se sacrificaron 21 días después de la inyección (n = 3 por punto temporal). En las médulas espirales se analiza la expresión de la GFP, de la ChAT (marcador de motoneurona) y de la GFAP (marcador de astrocito). La inyección en la vena temporal de AAV9-CB-GFP el P1 dio como resultado una transducción eficiente de las motoneuronas y la glía en ratones SOD1G93A (a, f, k, p). La inyección en la vena de la cola el P21 (b, g, l, q) se dirigió predominantemente a los astrocitos, con unas pocas motoneuronas positivas para la GFP. Para analizar la persistencia de las células transducidas, se inyectó por vía intravenosa AAV9-CB-GFP el P1 y el P21 en animales SOD1G93A que fueron sacrificados en la fase final (~P130). El análisis por inmunofluorescencia del asta anterior lumbar (c, d, h, i, m, n, r, s) demostró que se mantenía la expresión de la GFP en los astrocitos a lo largo del curso de la enfermedad. Para determinar si la inflamación y el daño a mediados por la SOD1 afectarían a la transducción del AAV9, los ratones SOD1G93A recibieron una inyección intravenosa el P85 y se recolectaron sus médulas espinales en la fase final. No se observó ninguna diferencia en el patrón de transducción de los ratones SOD1G93A tratados el P21 o el P85. Los recuadros de (r-t) muestran la colocalización entre la señal de la GFP y la de la GFAP. (u) Cuantificación de células transducidas en médulas espinales con ELA (para cada grupo, se analizaron los tejidos de 3 animales). Las columnas de la GFP y de la ChAT muestran las cifras de células contadas. Barras = 100 pm. AAV, virus adenoasociado; P1, día posnatal 1; P21, día posnatal 21; P85, día posnatal 85; GFP, proteína fluorescente verde; ChAT, acetiltransferasa de colina; GFAP, proteína ácida fibrilar glial.
Figura 2. Las construcciones de ARNhc muestran una eficaz reducción de la proteína SOD1 humana in vitro e in vivo. (a) Alineaciones de la secuencia entre la SOD1 humana y la de ratón para las regiones a las que se dirigen las 4 diferentes construcciones de ARNhc analizadas. (b) Las secuencias de ARNhc se clonaron en una construcción de expresión H1 y se transfectaron temporalmente en células 293. Los lisados se recolectaron 72 horas después de la transfección y se analizaron mediante una inmunoelectrotransferencia. (c) La cuantificación de la supresión in vitro de la SOD1 humana de tres transfecciones temporales individuales mostró una reducción del > 50 % en la SOD1. (d) El ARNhc 130 se empaquetó en el AAV9 y se inyectó en los ratones SOD1G93A bien el P1 o el P21. Se recolectaron las médulas espinales (n = 3 por punto temporal) tres semanas después de la inyección y se analizaron mediante una inmunoelectrotransferencia para evaluar los niveles de la proteína SOD1 humana. (e) Cuantificación de la supresión in vivo de la SOD1 humana en la médula espinal de ratones con ELA. Las médulas espinales que recibieron inyección el P1 y el P21 mostraron unas reducciones del 60 % y del 45 % en la proteína SOD1 mutante, respectivamente. hSOD1, dismutasa de superóxido 1 humana; mSOD1, dismutasa de superóxido 1 de ratón; GAPDH, deshidrogenasa de gliceraldehído 3 fosfato.
Figura 3. El suministro intravenoso de AAV9-SOD1 -ARNhc mejora la supervivencia y el comportamiento motor en ratones SOD1G93A. Los ratones SOD1G93A recibieron una única inyección intravenosa de AAV9-SOD1-ARNhc el P1 (n = 6, verde), el P21 (n = 9, rojo) o el P85 (n = 5, azul). Los ratones tratados se monitorizaron hasta la fase final y se compararon con los ratones de control SOD1G93A que no recibieron inyección (n = 15, gris). (a, c) La inyección de AAV9-SOD1-ARNhc en ratones P1 SOD1G93A retrasó significativamente el inicio mediano de la enfermedad 39,5 días en comparación con los animales de control (que no recibieron inyección, 103d; P1, 142,5d; p < 0,05). La inyección el P21 (rojo) o el P85 (azul) en animales con ELA no tuvo ningún efecto sobre el inicio de la enfermedad (P21, 110d; P85, 105d). Sin embargo, el AAV9-SOD1 -ARNhc administrado el P1, el P21 o el P85 prolongó en todos significativamente la supervivencia mediana (b, e) (no recibieron inyección, 132d; P1, 183,5d P21, 171d; P85, 162d; todas las comparaciones con el control p < 0,001). El grupo P21 tuvo una significativa extensión en la duración mediana de la enfermedad (d) que indicaba una ralentización de la enfermedad (no recibieron inyección, 29,5d; P1, 41d; P21,49d; P85, 40d; prueba de Wilcoxon para datos emparejados p = 0,06, 0,01 y 0,12, respectivamente). (f-h) Los animales tratados el P1 y el P21 mantenían su peso, tenían una mejor fuerza de agarre de las extremidades posteriores y comportamiento en el cilindro giratorio cuando se comparaban con los controles emparejados por edades, lo que indica que los animales tratados conservaban el tono muscular y la función motora durante su supervivencia prolongada. Las líneas entre las barras de (c-e) indican diferencias estadísticamente significativas. * p < 0,05. P1, día posnatal 1; P21, día posnatal 21; P85, día posnatal 85.
Figura 4. La inyección intravenosa de AAV9-SOD1-ARNhc reduce la proteína mutante en las médulas espinales de ratones SOD1G93A. (a-d) Se capturaron imágenes de secciones de la médula espinal lumbar de ratones que no recibieron inyección (a), que recibieron inyección el P1 (b), que recibieron inyección el P21 (c) y que recibieron inyección el P85 (d) con unos ajustes idénticos del microscopio para mostrar cualitativamente los niveles de la SOD1 en la fase final. Los niveles de la SOD1 tienen una correlación inversa con la supervivencia. (e-t) El marcaje conjunto de la GFP, la ChAT y la SOD1 muestra que las motoneuronas transducidas con el AAV9 tienen una expresión reducida de la SOD1 (flechas), mientras que las células que carecían de la GFP mantenían unos elevados niveles de la proteína muíante (puntas de flecha). Según se describe en la Figura 1u, se observó una mayor transducción de la MN y la correspondiente reducción en la SOD1 en los ratones que recibieron inyección el P1 (i-l) en comparación con los ratones que recibieron inyección el P21 (m-p) y el P85 (q-t). Barra = 100 pm. P1, día posnatal 1; P21, día posnatal 21; P85, día posnatal 85; SOD1, dismutasa de superóxido 1; GFP, proteína fluorescente verde; ChAT, acetiltransferasa de colina.
Figura 5. El AAV9-SOD1-ARNhc mejora la supervivencia y el comportamiento motor en los ratones SOD1G37Rtratados después del inicio de la enfermedad. (a) No había ninguna diferencia en el inicio o mediano de la enfermedad entre los ratones tratados con AAV9-SOD1-ARNhc y los de control. (promedio de edad en el tratamiento = 215d frente al inicio mediano de 194d para los de control y de 197d para los tratados; prueba del orden logarítmico p= 0,46). (b,f) La supervivencia mediana de los ratones SOD1G37R tratados con AAV9-SOD1-ARNhc (n = 25) estaba significativamente prolongada con respecto a los ratones de control (n = 21). (control, n = 21,392d; ARNhc de la SOD1, n = 25, 478,5d; prueba del orden logarítmico p < 0,0001) (c-e) La fase temprana de la enfermedad estaba significativamente ralentizada en 73 días en los ratones tratados en comparación con los ratones de control (control, 89d; ARNhc de la SOD1, 162d; p < 0,0001 prueba de Wilcoxon para datos emparejados), mientras que la fase tardía de la enfermedad mostró una ralentización no significativa (control, 63d; ARNhc de la SOD1, 81d; p = 0,14 prueba de Wilcoxon para datos emparejados). En conjunto, esto sumaba un aumento de 66 días en la duración mediana de la enfermedad (control, 173d; ARNhc de la SOD1, 239d; p < 0,0001 prueba de Wilcoxon para datos emparejados). (g) Apareció una tendencia a una fuerza de agarre de las extremidades posteriores mejorada en los ratones tratados con AAV9-SOD1-ARNhc en comparación con los ratones de control.
Figura 6. La inyección intravenosa de AAV9 en ratones SOD1G37R adultos se dirige a los astrocitos y las motoneuronas de la médula espinal. (a-h) Los análisis de inmunofluorescencia revelaron una transducción neuronal así como glial en ambos ratones, los tratados con AAV9-CB-GFP (a-d) y con AAV9-SOD1-ARNhc (eh). (i-p) Los niveles de la SOD1 humana aparecían reducidos en los ratones tratados con AAV9-SOD1-ARNhc (o) en comparación con los ratones tratados con AAV9-GFP (k). Barra = 100 pm. GFP, proteína fluorescente verde; ChAT, acetiltransferasa de colina; GFAP, proteína ácida fibrilar glial; SOD1, dismutasa de superóxido 1.
Figura 7. La infusión intratecal de AAV9-SOD1-ARNhc en primates no humanos da lugar a una reducción eficaz en los niveles de la SOD1. (a) Un mielograma poco después de la infusión intratecal de AAV9-SOD1-ARNhc mezclado con contraste muestra un suministro apropiado en el espacio subaracnoideo de un macaco cangrejero. Las flechas muestran la difusión del agente de contraste a lo largo de la totalidad de la médula espinal. (b) Se recogieron secciones de la médula espinal lumbar de monos tratados (n = 3) dos semanas después de la inyección y se tiñeron para la GFP usando una tinción DAB. Las secciones tienen una expresión generalizada de la GFP por toda la sustancia gris y blanca. (c-e) Los análisis de inmunofluorescencia de las secciones medulares espinales lumbares mostraron una robusta expresión de la GFP (c) en las células positivas para la ChAT (d), lo que indica una transducción a la motoneurona (e, fusión), (f) Los análisis de inmunoelectrotransferencia de las médulas espinales lumbares mostraron una significativa reducción en los niveles de la SOD1 en los animales que recibieron una inyección de AAV9-SOD1-ARNhc en comparación con los controles. (g) La cuantificación in vivo de la inactivación de la SOD1 en homogeneizado de médula espinal lumbar de mono (n = 3) mostró una reducción del 87 % en los animales que recibieron el AAV9-SOD1-ARNhc en comparación con los controles que no recibieron inyección. (h) Se usó una microdisección de captura con láser para recolectar motoneuronas o neuropilos circundantes de secciones lumbares de monos que recibieron la inyección y de control. Se analizaron los niveles de SOD1 en las células recolectadas mediante una qRT-PCR. Las motoneuronas recolectadas de los animales AAV9-SOD1 -ARNhc (n = 3) tenían una reducción del 95 ± 3 % en el ARN de la SOD1. Las no neuronas tenían una reducción del 66 ± 9 % en el ARN de la SOD1 en los animales tratados con el AAV9-SOD1-ARNhc. Barras de escala: b = 100 pm; e = 50 pm. SOD1: dismutasa de superóxido 1.
Figura 8. La infusión intratecal lumbar de AAV9-SOD1-ARNhc dio lugar a una eficaz transducción de las motoneuronas y de las células no neuronales en la médula cervical, torácica y lumbar, dando lugar a una reducción en la SOD1. (a-c) Análisis de inmunofluorescencia de los tres segmentos de la médula espinal; cervical (a), torácico (b) y lumbar (c), mostraron una robusta expresión de la GFP (verde) en las células positivas para Chat (rojo), indicando la transducción de la motoneurona. (d) Los recuentos celulares de GFP+/Chat+ muestran un gradiente de caudal a rostral para la transducción de la motoneurona que varía desde un 85 % de células transducidas en la región lumbar, hasta más del 50 % en la región cervical. (e) Los niveles de ARNm de la SOD1 en homogeneizados de secciones cervicales, torácicas y lumbares de la médula espinal analizados mediante una qRT-PCR muestran una reducción significativa en el transcrito de la SOD1, coherentemente con la transducción de la motoneurona. Los niveles de la SOD1 se normalizaron a la actina p, y se compararon los animales que recibieron una inyección de AAV9-SOD1-ARNhc con un control que recibió una inyección de AAV9-CB-GFP. Barras de escala: (a-c) = 50 pm; Barras de error: (d-e) = DE.
Figura 9. Diseño de una construcción clínica de ARNhc de la SOD1. (a) La construcción original de ARNhc de la SOD1 del AAV contiene la secuencia del ARNhc contra la SOD1 humana bajo el promotor H1, seguida por el casete de expresión para la GFP que incluye el potenciador del CMV, el promotor de la CBA, el intrón del SV40 modificado y la secuencia del transgen de la g Fp seguida por un terminador de PoliA de la bGH. El casete de expresión del ARNhc de la SOD1 y el casete de expresión de la GFP están flanqueados por las ITR del AAV2 lo que asegura el empaquetamiento de la secuencia flanqueada completa en la cápside del AAV9. (b) En la construcción clínica del ARNhc de la SOD1, el casete de expresión de la GFP está sustituido por un elemento de relleno que contiene secuencias no codificantes en tándem de vacunas de ADN aprobadas por la FDA. ITR: repeticiones terminales invertidas; ARNhc, ARN horquillado pequeño; SOD1, dismutasa de superóxido 1; CMV, potenciador de citomegalovirus; CBA, promotor de la actina p de pollo; GFP, proteína fluorescente verde; pA de la bGH, terminador de poli A de la hormona de crecimiento bovina.
Figura 10. Esquema de la construcción clínica del ARNhc de la SOD1. Se colocan diferentes sitios de restricción en la construcción clínica del ARNhc de la SOD1 que permiten la clonación de múltiples casetes de expresión del ARNhc manteniendo la distancia total entre las dos ITR.
Figura 11. La transfección in vitro de la construcción clínica del ARNhc de la SOD1 reduce eficazmente la proteína SOD1 humana en células HEK293. Los campos microscópicos representativos muestran imágenes de campo claro de células HEK 293 de control no transfectadas (a), transfectadas con el ARNhc de la SOD1 del AAV (b) y transfectadas con el vector lanzadera pJet del ARNhc de la SOD1 (c, d), 72 h después de la transfección. Las correspondientes imágenes de fluorescencia revelan la ausencia de fluorescencia de la GFP de las células HEK 293 transfectadas con el pJet del ARNhc de la SOD1 (g, h) en comparación con las células transfectadas con el ARNhc de la SOD1 del AAV (f). (i) El análisis de inmunoelectrotransferencia de los lisados celulares confirma la eficiente inactivación de la proteína SOD1 humana en células transfectadas con el pJet del ARNhc de la SOD1 en comparación con las células de control no transfectadas. El análisis de inmunotransferencia también confirma la eliminación del transgen de la GFP de la construcción del pJet del ARNhc de la SOD1. (j) Cuantificación de la regulación por disminución in vitro de la SOD1 por el pJet del ARNhc de la SOD1. El pJet del ARNhc de la SOD1 reduce los niveles de la proteína SOD1 humana en prácticamente el 50 % en las células HEK 293 en comparación con el control. Esta reducción es similar a la conseguida con la construcción del ARNhc de la SOD1 del AAV.
Figura 12. Esquema de la estrategia de clonación del vector clínico del ARNhc de la SOD1 del AAV. La construcción clínica de ARNhc de la SOD1 se clonó en el vector AAV CB MCS usando los sitios Kpn1/SPh1. El doble digerido Kpn1/SPh1 del plásmido AAV CB MCS da como resultado la liberación del casete de expresión del transgen completo a partir de este vector, que está adicionalmente sustituido con la construcción clínica del ARNhc de la SOD1 portadora del casete de expresión del ARNhc de la SOD1 y de la secuencia de relleno.
Figura 13. El ARNhc de la SOD1 del AAV clínico reduce eficazmente los niveles de la SOD1 humana in vitro. Se transfectaron células HEK293 con el plásmido clínico de ARNhc de la SOD1 del AAV mediante el método del fosfato de calcio. Los campos microscópicos representativos muestran imágenes de campo claro de controles no transfectados (a), de células transfectadas con el ARNhc de la SOD1 del AAV y con el ARNhc de la SOD1 del AAV clínico, respectivamente, 72 h después de la transfección (a-c). La eliminación con éxito de la GFP del ARNhc de la SOD1 del AAV clínico se confirmó por la ausencia de expresión de la GFP en células transfectadas con el ARNhc de la SOD1 del AAV clínico (f, g). (g) Los análisis de inmunoelectrotransferencia de los lisados celulares, recolectados 72 h después de la transfección, confirmaron la eficaz regulación por disminución de la SOD1 en células transfectadas con el ARNhc de la SOD1 del AAV clínico en comparación con el control. El ARNhc de la SOD1 del AAV se usó como control positivo. (h) Cuantificación de la inactivación in vitro de la SOD1 mediante el ARNhc de la SOD1 del AAV clínico.
Figura S1. La administración del AAV9-ARNhc-SOD1 es bien tolerada en ratones naturales. Los animales naturales hembras y machos recibieron una inyección de AAV9-SOD1-ARNhc el P1 o el P21 y se monitorizaron hasta los 6 meses de edad. (a, b) Los ratones tratados, tanto machos como hembras, mostraron un aumento estable en la masa corporal en comparación con los animales de control. (c,d) El comportamiento de rotación y la fuerza de agarre de la extremidad posterior (e, f) no se vieron afectados por el tratamiento el P1 o el P21 en ambos grupos en comparación con los respectivos controles. n = 5 por grupo. WT, natural; P1, día posnatal 1; P21, día posnatal 21.
Figura S2. Hematología y bioquímica sérica de los animales naturales tratados con el AAV9-SOD1-ARNhc. (a-m) Se recogió sangre de animales tratados el P1 (verde) o el P21 (rojo) y naturales de control (gris) a los 150 días de edad para los animales de control. No se observaron diferencias significativas entre los animales tratados y los de control. (n-w) Las muestras de suero recogidas a los 180 días de edad no mostraron diferencias significativas en el perfil bioquímico del suero. Media ± EEM. n = 5 por grupo. P1, día posnatal 1; P21, día posnatal 21.
Figura S3. El tratamiento con AAV9-SOD1-ARNhc en ratones con la SOD 1G93A reduce la astrogliosis. Se recogieron secciones en la fase final de los animales de control y de los tratados con AAV9-SOD1-ARNhc y se tiñeron para GFAP, un marcador de activación de astrocitos. Los ratones que recibieron la inyección el P1 (b) y el P85 (d) mostraron unos niveles reducidos de astrogliosis en comparación con los ratones de control (a), mientras que los ratones que recibieron la inyección el P21(c) mostraron la reducción máxima. Esto era coherente con el porcentaje de transducción de los astrocitos conseguido en estos ratones (Figura 1 u). Sin embargo, no se observó ningún efecto sobre la reactividad de la microglía (e-h). Barra = 100 pm. P1, día posnatal 1; P21, día posnatal 21; P85, día posnatal 85.
Figura S4. La inyección intravenosa de AAV9-SOD1-ARNhc reduce eficazmente los niveles de la proteína SOD1 mutante en las médulas espinales de los ratones SOD1G37R. (a) Después del inicio de la enfermedad, se inyectó AAV9-CB-GFP o AAV9-SOD1-ARNhc en ratones SOD1G37R, y las médulas espinales se recogieron en la fase final y se analizaron mediante una inmunoelectrotransferencia para evaluar los niveles de la proteína SOD1 humana. (b) La cuantificación de a) muestra la supresión de la SOD1 humana en las médulas espinales de los ratones SOD1G37R (n=4 por grupo). hSOD1, dismutasa de superóxido 1 humana; GAPDH, deshidrogenasa de gliceraldehído 3 fosfato.
Figura S5. El ARNhc 130 reduce eficazmente los niveles de la SOD1 de mono in vitro. (a) Alineación de la secuencia de la región a la que se dirige el ARNhc 130 de la SOD1 y un único emparejamiento incorrecto en la secuencia de mono. La secuencia de mono se corresponde con la secuencia de la SOD1 del macaco de la India (NM 001032804.1), del macaco cangrejero (secuenciada internamente) y del cercopiteco verde. (b) El casete de expresión del ARNhc 130 se clonó en un vector lentivírico y se usó para infectar células Cos-7. Los lisados se analizaron 72 horas después de la infección mediante una qRT PCR para la SOD1. El ARNhc 130 redujo los niveles de transcrito de la SOD1 en un 75 % en células Cos-7.
Ejemplos
La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos. Aunque la presente invención se ha descrito en términos de diversas realizaciones y ejemplos, se entenderá que para los expertos en la materia serán evidentes variaciones y mejoras. Por lo tanto, en la invención únicamente se debe dejar constancia de dichas limitaciones, como aparecen en las reivindicaciones.
Ejemplo 1
Patrón de transducción del AAV9 y persistencia en ratones SOD1G93A
En primer lugar, evaluamos la eficacia de la transcripción del AAV9 en el modelo de ratón de SOD1G93A que desarrolla una enfermedad paralítica mortal. Se obtuvieron ratones con muchas copias de la SOD1G93A en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) y se criaron en el Kaspar lab. Los animales se genotiparon antes del tratamiento para obtener ratones que expresan la SOD1G93A y sus hermanos naturales. En los experimentos de la SOD1G93A únicamente se incluyeron ratones hembra. Los animales recibieron una inyección intravenosa el día 1 o el día 21 posnatal (denominados respectivamente P1 y P21) con el AAV9 autocomplementario que expresa la GFP del potenciador del CMV/promotor de la actina beta (CB) (AAV9-CB-GFP) (n = 3 por grupo). T res semanas después de la inyección, los animales fueron sacrificados y se analizó la expresión de la GFP en las médulas espinales (Figs. 1 a-u).
Todos los procedimientos con animales descritos en el presente documento se realizaron según las directrices de los NIH y fueron aprobados por el Research Institute at Nationwide Children's Hospital (Columbus, OH), la Universidad de California (San Diego, CA) o los Mannheimer Foundation (Homestead, FL) Institutional Animal Care and Use Committees.
La eficacia de la transcripción era alta en los astrocitos con la SOD1G93A, con la GFP expresada en un 34 ± 2 % y en un 54 ± 3 %, respectivamente, de los astrocitos de la sustancia gris de la médula espinal que recibió una inyección el P1 y el P21 (definida por la inmunorreactividad para la GFAP). Esta eficacia era similar a nuestro informe previo del 64 ± 1 % en animales naturales que recibieron inyección el P2118. Las motoneuronas eran un tipo celular destacado transducido a todos los niveles de las médulas espinales de los animales que recibieron inyección de SOD1G93A el P1 (62 ± 1 %), en comparación con el significativamente menor direccionamiento a las motoneuronas en los animales que recibieron inyección el P21 (8 ± 1 %).
Aunque previamente hemos notificado que los astrocitos transducidos en las médulas espinales naturales persisten con una acumulación continua de la GFP durante al menos 7 semanas después de la inyección18, no se analizó la longevidad de los astrocitos SOD1 mutantes (ni su síntesis continua de los genes codificados por el episoma AAV9) durante la enfermedad activa de tipo ELA. Por lo tanto, los ratones SOD1G93A recibieron inyecciones de AAV9-CB-GFP el P1 y el P21 y continuaron hasta la fase final (~P130, n=3 por grupo) (Figs. 1c, d, h, i, m, n, r, s). El análisis de inmunofluorescencia de las médulas espinales SOD1G93A en la fase final de los animales que recibieron inyección el P1 y el P21 mostraron un número comparable de astrocitos que expresan la GFP a los que se encontraron 21 días después de la inyección del AAV9 (P1: 42 ± 2 %, P21: 61 ± 2 %). Estos datos son coherentes con la supervivencia de los astrocitos transducidos para la duración de la enfermedad (~110 días después de la inyección el P21) en ratones SOD1G93A y que se mantiene la expresión del gen codificado por el AAV9.
Además, reconociendo que el daño mediado por la SOD1 mutante, incluyendo la activación astrocítica y microglial y cambios tempranos en la barrera hematoencefálica, se desarrolla durante la enfermedad en los ratones en los ratones mutantes para la SOD120, analizamos si este daño afectaba a la transducción del AAV9. Los ratones SOD1G93A recibieron una inyección de AAV9-CB-GFP el P85 y fueron sacrificados en la fase final (n = 3) (Figs. 1e, j, o, t). El análisis de las médulas espinales reveló que el patrón de transducción observado en los animales P85 era similar al de los animales tratados el P21, con los astrocitos como el tipo celular predominante transducido a todos los niveles (51 ± 6 % de células GFP+/GFAP+ en la sustancia gris lumbar).
Ejemplo 2
Desarrollo de una secuencia de ARNhc específica para la SOD1 humana
Para dirigirse específicamente al ARNm de la SOD1 humana, se generaron cuatro construcciones de ARNhc que se dirigen a la SOD1 humana y se obtuvieron con la herramienta de diseño de Life Technologies. Las construcciones que tenían un mínimo de cuatro emparejamientos incorrectos de bases en comparación con la secuencia de ARNm de ratón (Fig. 2a). Los números de bases de las secuencias humanas mostradas se corresponden con el número de registro CCDS33536.1 de la base de datos del NCBI CCDS. Estas construcciones se clonaron en pSilencer 3.1 (Genscript) bajo el promotor H1 humano y se analizaron in vitro. El ARNhc 130 junto con el promotor H1 se clonó adicionalmente en un vector de AAV junto con una GFP indicadora bajo el promotor de la actina beta de pollo para identificar las células transducidas. Las células 293 humanas se transfectaron con cada casete. Las células HEK-293 se mantuvieron en medio IMDM que contenía FBS al 10 %, L-glutamina al 1 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Tras alcanzar una confluencia del ~60 %, las células se transfectaron con pSilencer 3.1, que contenía los ARNhc que se iban analizar. Los lisados de proteína se prepararon 72 horas después de la transfección, y los niveles de SOD1 se analizaron mediante una inmunoelectrotransferencia. Las cuatro secuencias redujeron los niveles de la proteína SOD1 en > 50 % (Figs. 2b, c).
El ARNhc130 fue seleccionado para experimentos adicionales porque producía la inactivación más coherente en los tres experimentos individuales de transfección. Se clonó en un vector de AAV9 autocomplementario que también contenía un gen de la GFP cuya expresión identificaría las células transducidas (denominado AAV9-SOD1-ARNhc). El AAV9-SOD1 -ARNhc autocomplementario se produjo mediante procedimientos de transfección temporal usando un vector bicatenario de CB-GFP basado en AAV2-ITR, con un plásmido que codifica la secuencia Rep2Cap9 como se ha descrito previamente, junto con un plásmido colaborador adenovírico pHelper (Stratagene, Santa Clara, CA) en células 29318.
Para confirmar que el ARNhc podría suprimir la acumulación de la SOD1 humana, los ratones SOD1G93A (n = 3) recibieron una inyección intravenosa de AAV9-SOD1-ARNhc bien el P1 o el P21. Para las inyecciones de ratones se utilizaron crías SOD1G93A los días posnatales 1-2. Se inyectó un volumen total de 50 pl que contiene 5X1011 partículas víricas resistentes a la DNAsa de AAV9-SOD1-ARNhc (Virapur LLC, San Diego, CA) a través de la vena temporal, como se ha descrito previamente18. Se verificó una inyección correcta notando la palidez de la vena. Después de la inyección, las crías se devolvieron a su jaula. Los animales fueron sacrificados tres semanas después de la inyección, y las médulas espinales se recogieron y se analizaron mediante inmunotransferencia para ambas proteínas SOD1 humana (mutante) y murina (natural). Las médulas espinales que recibieron inyección el P1 y el P21 mostraron unas reducciones del 60 % y del 45 % en la proteína SOD1 mutante, respectivamente (Figs. 2d,e). Los niveles de la SOD1 murina permanecieron sin cambios en respuesta a la inactivación de la SOD1 humana.
Ejemplo 3
El AAV9-SOD1-ARNhc es seguro y bien tolerado en ratones naturales
Para determinar si sería segura una dosis mayor del AAV9-SOD1-ARNhc, ratones normales de ambos sexos recibieron una inyección intravenosa el P1 o el P21 (PI = 5 machos, 5 hembras a 5x1011vg; P21 = 5 machos, 5 hembras a 2x1012 genomas del vector (vg)) y después se monitorizaron hasta los 6 meses de edad. Los ratones que recibieron la inyección tanto el P1 como el P21 mostraron un aumento constante en la masa corporal similar a los ratones sin tratar (Figura S1). En los análisis de comportamiento semanales no se observaron diferencias significativas entre los grupos que recibieron inyecciones y los de control en las habilidades motoras (medidas mediante el cilindro giratorio), así como en la fuerza de agarre de la extremidad posterior. A los 150 y 180 días de edad, se recogieron muestras de sangre. Los hologramas completos y diferenciales de ambos grupos tratados y sin tratar mostraron unos parámetros similares de la bioquímica de la sangre (Figura S2). Las muestras séricas de ambos grupos no mostraron diferencias significativas en los niveles de fosfatasa alcalina, creatinina, nitrógeno ureico en sangre, potasio, sodio y cloruro. Finalmente, todos los animales fueron sacrificados a la edad de 180 días. Los análisis histopatológicos de un histopatólogo desconocedor del grupo de tratamiento no revelaron alteraciones significativas en los animales tratados con AAV9-SOD1-ARNhc en comparación con los controles que no recibieron inyección (datos no mostrados). Concluimos que tanto la administración del AAV9 como la expresión sostenida del ARNhc eran aparentemente seguras y bien toleradas.
Ejemplo 4
Prolongación a la supervivencia de ratones SOD1G93A por una reducción mediada por el AAV9 en la SOD1 mutante incluso cuando se ha iniciado la enfermedad intermedia
Para analizar la eficacia a en la reducción de la SOD1 mediada por el AAV9, tratamos cohortes de ratones SOD1G93Acon una única inyección intravenosa de AAV9-SOD1-ARNhc antes (P1, Sx1011vg, n = 6 y P21, 2x1012vg, n = 9) o después (P85, 3x1012vg, n = 5) del inicio, reconociendo que muchos astrocitos, pero pocas motoneuronas, serían transducidos en los dos últimos puntos temporales. Para las inyecciones en la arena de la cola de los adultos, los animales se colocaron en un corsé que posicionaba la cola del ratón en un canal iluminado caliente. La cola se limpió con algodón con alcohol, y después se le inyectó por vía intravenosa el AAV9-SOD1 -ARNhc.
El inicio de la enfermedad (medido por la pérdida de peso debida a la atrofia muscular inducida por la desnervación) se retrasó significativamente en una mediana de 39,5 días (Fig. 3a, c; no recibieron inyección, 103d; P1, 142,5d; p < 0,05, prueba de Wilcoxon para datos emparejados) en la cohorte que recibió inyección el P1, pero no estaba afectada por ninguna de las últimas inyecciones (P21,110d; P85, 105d). Los animales tratados el P1 y el P21 mantenían su peso, tenían un mejor comportamiento en el cilindro giratorio y fuerza de agarre de la extremidad posterior cuando se comparaban con los controles emparejados por edades, lo que indica que los animales tratados mantenían el tono muscular y la función motora durante su supervivencia prolongada (Figs. 3f-h). La supervivencia era prolongada significativamente por la inyección de AAV9 en las tres edades, produciendo unos tiempos de supervivencia 30-51,5 días más allá de los ratones SOD1G93A que no recibieron inyección (no recibieron inyección, 132d; P1, 183,5d; P21, 171d; P85, 162d; prueba del orden logarítmico p= < 0,0001, 0,0003 y 0,001, respectivamente) (Figs. 3b, e). La definición de la duración de la enfermedad como el tiempo entre el inicio y la fase final reveló que el grupo de tratamiento P21 tenía una duración significativamente aumentada, indicativa de la ralentización de la progresión de la enfermedad, en comparación con los controles que no recibieron inyección (no recibieron inyección, 29,5d; P21,49d; prueba de Wilcoxon para datos emparejados p = 0,01), con una tendencia a la ralentización de la progresión en los animales que recibieron inyección en las otras dos edades (P1, 41d; P85, 40d; p = 0,06 y 0,12, respectivamente) (Fig. 3d). El menor porcentaje de direccionamiento a células no neuronales el P1 con respecto a las direccionadas el P21 (Figura 1u) sugiere que debe direccionarse un número mínimo de células no neuronales para ralentizar la progresión de la enfermedad en el modelo progresivo rápido de SOD1G93A (Fig. 1u).
Ejemplo 5
Reducción de la SOD1 mutante en células infectadas por el AAV9 en ratones SOD1G93A tratados
Se usó una inmunofluorescencia indirecta con un anticuerpo que reconoce la SOD1 humana, pero no la de ratón, para determinar los niveles de SOD1 mutante acumulada en las médulas espinales de la fase final de los ratones tratados y de control. Los niveles de la SOD1 humana en las secciones de médula espinal de la fase final se correlacionan inversamente con el aumento en la supervivencia (Figs. 4a-d). En la fase final, P1 (Fig. 4b), P21 (Fig. 4c) y P85 (Fig. 4d) los animales que recibieron inyecciones de AAV9-SOD1 -ARNhc tenían unos niveles menores de la SOD1 mutante cuando se comparaban con los animales SOD1G93A que no recibieron inyección (Fig. 4a). La expresión de la SOD1 en las motoneuronas transducidas (identificadas por las células que expresan la GFP y la ChAT) estaba reducida en comparación con las neuronas circundantes que no habían sido transducidas para expresar la GFP vírica codificada (Figs. 4h, l, p, t; flechas con respecto a puntas de flecha). Además, las imágenes de inmunofluorescencia de las médulas espinales de la fase final revelaron una correspondiente reducción en la astrogliosis, pero ninguna diferencia en la microgliosis en los animales tratados con el AAV9-SOD1-ARNhc con respecto a los controles (Figura S3).
Ejemplo 6
Ralentización terapéutica de la progresión de la enfermedad con la inyección periférica de AAV9 después del inicio
Para determinar si la reducción en la SOD1 mutante mediada por el AAV9 ralentizaría la progresión de la enfermedad, una cohorte de ratones SOD1G37R 6 recibió inyecciones intravenosas de AAV9-SOD1-ARNhc después del inicio de la enfermedad (edad promedio en el tratamiento = 215d con respecto al inicio mediano de 197d en los animales tratados; prueba del orden logarítmico p= 0,46; Fig. 5a). Los ratones con ELA /oxSOD1G37R, portadores de un transgen humano mutante SOD1G37R flanqueado por sitios lox p bajo su promotor endógeno, se mantuvieron como se ha descrito previamente37. Como controles se usaron una combinación de hermanos AAV9-CB-GFP (n = 9) y que no recibieron inyección (n = 12).
El análisis a posteriori no mostró diferencias entre los animales GFP y los que no recibieron inyección, por lo tanto, los grupos que se recopilaron como "control" en la Fig. 5. El peso corporal y la fuerza de agarre de la extremidad posterior de los animales se evaluaron semanalmente y se monitorizaron hasta la fase final. El tratamiento con el AAV9-SOD1 -ARNhc después del inicio de la enfermedad prolongó significativamente la supervivencia mediana en 86,5 días con respecto a los animales de control (control, n = 21, 392d; ARNhc de la SOD1, n = 25, 478,5d; prueba del orden logarítmico p < 0,0001). La duración de la enfermedad temprana, definida por el tiempo entre el pico de peso y una pérdida de peso del 10 %, disminuyó significativamente (control, 89d; ratones tratados con el ARNhc de la SOD1, 162 días; prueba de Wilcoxon para datos emparejados p < 0,01; Fig. 5c). También se observó una continua tendencia hacia la ralentización de la enfermedad tardía (10 % de pérdida de peso hasta la fase final) (control, 63d; ratones tratados con el ARNhc de la SOD1, 81d; prueba de Wilcoxon para datos emparejados p = 0,1389; Fig. 5d). La duración global de la enfermedad después de la terapia con el AAV9-SOD1-ARNhc se elevó hasta 239d después del inicio de la enfermedad con respecto a 173d en los ratones de control (prueba de Wilcoxon para datos emparejados p < 0,0001; Fig. 5e). De forma coherente con la progresión ralentizada, la terapia con AAV9 mantenía la fuerza de agarre con respecto a los animales de control mutantes para la SOD1 (Fig. 5g). La extensión de 86,5 días en la supervivencia sobrepasó la extensión de 62 días observada en los estudios transgénicos que usaban la expresión de Cre específica del astrocito para inactivar el transgen8 mutante SOD1G37R, reflejando presumiblemente la eficaz transducción del AAV9 de los astrocitos después del suministro periférico y la posible transducción de otros tipos celulares (especialmente la microglía6), cuya síntesis de la SOD1 mutante acelera la progresión de la enfermedad.
El análisis histológico de los animales SOD1G37R tratados de fase final reveló unos niveles similares de transducción celular intraespinal en los animales tratados con AAV9-SOD1 -ARNhc o con AAV9-GFP (Figura 6). La expresión de la GFP se observó predominantemente en las motoneuronas y los astrocitos de ambos grupos, y la expresión de la SOD1 disminuyó de una forma detectable únicamente en los animales que recibieron el AAV9-SOD1-ARNhc (Figs.
6k, o). La inmunotransferencia de extractos de médula espinal completa de los ratones SOD1G37R de fase final reveló una reducción del 80 % en los niveles de la proteína hSOD1 en los animales tratados con el AAV9-SOD1-ARNhc en comparación con los controles (Figura S4).
Ejemplo 7
Supresión mediada por el AAV9 de la SOD1 en primates no humanos
Para analizar si los niveles de la SOD1 podrían ser eficazmente reducidos usando el AAV9 en la médula espinal de un primate no humano, se inyectó el AAV9 por vía intratecal a través de una punción lumbar. Se eligió este método con respecto al suministro sistémico para disminuir la cantidad de virus necesaria y para minimizar cualquier efecto por la reducción de la SOD1 en tejidos periféricos. Para este estudio se usaron macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) de un año de edad con un peso corporal promedio de 2 kg en la Mannheimer Foundation. La monitorización regular de la salud general y el peso corporal se realizó antes y después de las inyecciones para evaluar el bienestar de los animales.
La secuenciación del ADNc copiado del ARNm aislado a partir del cercopiteco verde (células COS) y del macaco cangrejero verificó que el 130 ARNhc tenía un único emparejamiento incorrecto de base con cualquiera de las secuencias (Figura S5). El casete de expresión del 130 ARNhc se insertó en un vector lentivírico que después se usó para transducir las células COS. Las células Cos-7 se mantuvieron en DMEM con un 10 % de FBS y un 1 % de penicilina/estreptomicina. Las células se infectaron con un vector lentivírico que expresa el ARNhc 130 de la SOD1 bajo el promotor H1 y RFP bajo el promotor CMV. Se extrajo el ARN de células infectadas y no infectadas 72 horas después de la infección usando un RNAeasy Kit (Qiagen). El ADNc se preparó usando un kit de síntesis de primera hebra RT2 (SABiosciences). Los niveles de transcrito de la SOD1 se analizaron mediante una qRT-PCR, lo que reveló que el ARNm de la SOD1 se redujo en un ~75 % en las células transducidas con el 130 ARNhc en comparación con las células de control con una transducción simulada (Figura S5).
Se infundió el virus AAV9-SOD1-ARNhc (1x1013 vg/kg) junto con un agente de contraste a través de una punción lumbar en el espacio subaracnoideo de tres macacos cangrejeros macho, y a un sujeto de control se le inyectó AAV9-CB-GFP (1x1013 vg/kg) (Fig. 7a). Cada inyección intratecal se realizó mediante una punción lumbar en el espacio subaracnoideo del saco tecal lumbar. El AAV9 se resuspendió en omnipaque (iohexol), un compuesto yodado usado habitualmente en el ámbito clínico. El iohexol se usa para validar la canulación con éxito del espacio subaracnoideo, y se administró a una dosis de 100 mg/kg. El sujeto se colocó en decúbito lateral y se identificó el sitio de inyección en la línea media posterior a nivel de ~L4/5 (por debajo del cono de la médula espinal). En condiciones estériles se insertó una aguja espinal con estilete, y la canulación subaracnoidea se confirmó por el flujo del LCR transparente desde la aguja. Con objeto de reducir la presión en el espacio subaracnoideo, se drenaron 0,8 ml de LCR, seguido inmediatamente por la inyección de una mezcla que contiene 0,7 ml de iohexol (formulación de 300 mg/ml ) mezclado con 2,1 ml de virus (2,8 ml en total).
No se identificaron efectos secundarios por los tratamientos. Dos semanas después de la inyección, las médulas espinales se recolectaron para el análisis de la expresión de la GFP y los niveles de ARN de la SOD1. La expresión de la GFP se observó ampliamente en las células neuronales y astrocíticas por toda la sustancia gris y blanca de la médula espinal lumbar, el área más próxima al lugar de la inyección (Figs. 7b-e). La inmunotransferencia de extractos de la médula espinal lumbar reveló una reducción del 87 % en los niveles de la proteína SOD1 de mono (Figs. 7f, g). Después se usó una microdisección de captura con láser para aislar el ARN total de las motoneuronas así como de la glía en los neuropilos circundantes. El análisis mediante una RT-PCR cuantitativa usando cebadores específicos para la SOD1 de mono (y normalizada a la actina) confirmaron una inactivación del 95 ± 3 % en el grupo de motoneuronas y una inactivación del 66 ± 9 % en el grupo de neuropilos cuando se comparaban con las muestras de un animal de control (Fig 7h).
A continuación, analizamos el nivel de transducción celular en toda la médula espinal, incluyendo segmentos cervicales, torácicos y lumbares. Se averiguó que la GFP era ampliamente expresada en todas las secciones analizadas (Figs. 8a-c). Los recuentos de motoneuronas revelaron un gradiente de caudal a rostral en la transducción celular, mostrando la región cervical más de un 50 % de motoneuronas GFP/Chat+, aumentando hasta un 65 % en la región torácica y alcanzando un notable 80 % en la región lumbar (Fig 8d). Con objeto de determinar el nivel global de inactivación de la SOD1 conseguido con este patrón de transducción, se realizó una qRT-PCR para la SOD1 en homogeneizados de secciones completas de segmentos medulares cervicales, torácicos y lumbares. Los resultados confirmaron una robusta reducción de la SOD1 en los tres niveles de la médula espinal, que variaban desde una disminución del 60 % en el segmento cervical, una disminución del 70 % en la región torácica y una disminución del 88 % en la región lumbar (Fig 8e), coherentes con la proporción de células transducidas en cada región.
Debate
Los ejemplos anteriores muestran que la administración intravenosa de AAV9-SOD1 -ARNhc es segura y bien tolerada en ratones naturales, con ausencia de efectos adversos después de una valoración a largo plazo. Esta estrategia ha conseguido una de las prolongaciones más largas en la supervivencia jamás notificada para el modelo de ratón SOD1G93A de progresión rápida de ELA (aumentando la supervivencia en un 39 % cuando el tratamiento se inicia al nacer). Incluso más esperanzador, se observa una progresión de la enfermedad notablemente ralentizada incluso cuando la terapia con el AAV9 para reducir la síntesis de la SOD1 mutante se aplica después del inicio de la enfermedad en ratones SOD1G37R, prolongando por tanto significativamente la supervivencia. Por lo tanto, el paradigma de suministro vascular en ratones representa una validación de que la inactivación de la SOD1 mutante después del inicio de la enfermedad puede ser beneficiosa en ambos modelos de progresión rápida y más lenta de ELA en puntos clínicamente relevantes de la enfermedad. En conjunto, estos datos muestran que el robusto direccionamiento y supresión de los niveles de la SOD1 a través del suministro de ARNhc mediado por el AAV9 es eficaz en la ralentización de la progresión de la enfermedad en modelos de ratón de ELA, críticamente incluso cuando el tratamiento comienza después del inicio.
Múltiples estudios recientes han adelantado la hipótesis de que la SOD1 natural puede contribuir a través de un mal plegamiento al (los) mecanismo(s) patógeno(s) que subyace(n) en la ELA esporádica a través de una ruta similar a la desencadenada por la SOD11430-32 mutante. En este conjunto de datos se incluyen nuestra propia demostración de que los astrocitos producidos a partir de pacientes con ELA esporádica son tóxicos para las cocultivadas motoneuronas, y que la toxicidad es aliviada por la reducción mediada por un ARNip en la SOD130 natural. Estos datos crean la posibilidad de que una proporción de pacientes con ELA esporádica también podría beneficiarse de una estrategia de reducción en la SOD1 mediada por el AAV9 que hemos demostrado que es eficaz para ralentizar la progresión de la enfermedad en ratones que desarrollan una enfermedad mortal de tipo ELA al expresar las mutaciones en la SOD1 que causan la ELA.
Finalmente, para la traducción de una supresión mediada por el AAV9 de la síntesis de la SOD1 al entorno humano, hemos determinado que la infusión directa en el LCR a nivel lumbar en un primate no humano produce una reducción sustancial de la SOD1 mediante un direccionamiento tanto a motoneuronas como a células no neuronales. Este resultado proporciona un fuerte respaldo para ampliar estos esfuerzos a un adulto humano mediante la inyección directa en el LCR, como se ha propuesto previamente3334, de forma que 1) se limite el coste de la producción vírica, 2) se reduzca la posibilidad de que la supresión crónica de la SOD1 en la periferia pueda tener consecuencias perjudiciales, y 3) se reduzca la exposición vírica al sistema inmunitario periférico33. Estos datos señalan fuertemente al AAV9-SOD1-ARNhc como un tratamiento para la ELA.
Técnicas/métodos usados en los ejemplos 1-7
Perfusión y procesamiento de tejidos. Los ratones SOD1G93A de control y tratados se sacrificaron bien 21 días después de la inyección o bien en la fase final, para un análisis inmunohistoquímico. Los animales se anestesiaron con un cóctel de xilacina/ketamina, se perfundieron transcardiacamente con solución salina al 0,9 %, seguido de paraformaldehído al 4 %. Se recogieron las médulas espinales, se cortaron en bloques de tejido de 5-6 mm de longitud, y después se cortaron en secciones transversales de 40 pm de grosor con un vibratomo (Leica, Bannockburn, IL). Las sucesivas secciones se conservaron en una placa de 96 pocillos que contenía paraformaldehído al 4 % y se almacenaron a 4 0C. Los ratones foxSOD1G37R en la fase final se anestesiaron usando isoflurano y se perfundieron con paraformaldehído al 4 %. Se diseccionaron segmentos de la médula espinal, incluyendo segmentos cervicales, torácicos y lumbares. Después de una crioprotección con sacarosa al 20 %/paraformaldehído al 4 % hasta el día siguiente, las médulas espinales se congelaron en isopentano a -65 0C, y se recolectaron cortes frontales sucesivos de 30 pm en flotación libre usando un microtomo deslizante.
Para los estudios de seguridad, los ratones P1, P21 tratados y naturales de control se sacrificaron a los 180 días de edad. Los animales se anestesiaron usando un cóctel de xilacina/ketamina y se perfundieron con solución salina al 0,9 %. Se extrajeron los diferentes tejidos y se conservaron en formalina tamponada al 10 %. Estos tejidos se procesaron adicionalmente, se bloquearon y se montaron para una tinción con hematoxilina y eosina por parte del Nationwide Children's Hospital Morphology Core.
Los macacos cangrejeros que recibieron inyección de virus se sacrificaron 2 semanas después de la inyección. Los animales se anestesiaron con pentobarbital sódico a la dosis de 80 - 100 mg/kg por vía intravenosa y fueron perfundidos con solución salina. La disección del cerebro y la médula espinal se realizó inmediatamente, y los tejidos se procesaron adicionalmente para el aislamiento de los ácidos nucleicos (congelación instantánea) o se posfijaron en paraformaldehído al 4 % y posteriormente se crioprotegieron con sacarosa al 30 % y se congelaron en isopentano a -65 0C. Se recolectaron cortes frontales de 12 pm de la médula lumbar usando un criostato para la inmunotinción de flotación libre.
Inmunohistoquímica. Las médulas espinales de los ratones se tiñeron en forma de secciones en flotación. Los tejidos se lavaron tres veces durante 10 minutos cada una con TBS, después se bloquearon con una solución que contiene suero de burro al 10 %, Triton X-100 al 1 % y penicilina/estreptomicina al 1 % durante dos horas a la temperatura ambiente. Todos los anticuerpos se diluyeron con la solución de bloqueo. Los anticuerpos primarios usados eran como sigue: anti-GFP de conejo (1:400, Invitrogen, Carlsbad, CA), anti-SOD1 de conejo (1:200, Cell signaling, Danvers, MA), anti-ChAT de cabra (1:50 Millipore, Billerica, MA), anti-GFAP de ratón (1:200, Millipore, Billerica, MA), anti-GFAP de pollo (1:400, Abcam, Cambridge, MA) y anti-Iba1 de conejo (1:400, Wako, Richmond VA). Los tejidos se incubaron en anticuerpo primario a 4 0C durante 48-72 horas, después se lavaron tres veces con TBS. Después del lavado, los tejidos se incubaron durante 2 horas a la temperatura ambiente en los apropiados anticuerpos secundarios conjugados con FITC-, Cy3- o Cy5 (1:200 Jackson Immunoresearch, Westgrove, Pa ) y DAPI (1:1.000, Invitrogen, Carlsbad, CA). Después, los tejidos se lavaron tres veces con TBS, se montaron en portaobjetos y se cubrieron con PVA-DABCO. Todas las imágenes se capturaron con un microscopio confocal de barrido por láser Zeiss.
Para la tinción DAB, las secciones de médula espinal de mono se lavaron tres veces con TBS, se bloquearon durante 2 h a la TA en suero de burro al 10 % y Triton X-100 al 1 %. Después, las secciones se incubaron hasta el día siguiente a 4 0C con anticuerpo primario anti-GFP de conejo (1:1.000 Invitrogen, Carlsbad, CA) diluido en tampón de bloqueo. Al día siguiente, los tejidos se lavaron 3 veces con TBS, se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado anti-conejo (1:200 Jackson Immunoresearch, Westgrove, PA) en tampón de bloqueo durante 30 min a la TA, se lavaron 3 veces con TBS y se incubaron durante 30 min a la TA con ABC (Vector, Burlingame, CA). Después, las secciones se lavaron 3 veces con TBS y se incubaron durante 2 min con solución DAB a la TA y se lavaron con agua destilada. Éstas se montaron después en portaobjetos y se cubrieron con cubreobjetos en medio de montaje. Todas las imágenes se capturaron con el Zeiss Axioscope.
Cuantificación de las motoneuronas y los astrocitos. Para la cuantificación de las MN, las secciones sucesivas de médula espinal lumbar de 40 pm de grosor, separadas entre sí 480 pm, se marcaron como se describió para la expresión de la GFP y de la ChAT. Las secciones teñidas se montaron sucesivamente en portaobjetos de rostral a caudal, después se cubrieron. Las secciones se evaluaron usando microscopía confocal (Zeiss) con un objetivo 40x y FITC simultáneo y filtros Cy3. El número total de células positivas para ChAT encontrado en las astas anteriores con un soma definido se contó mediante un análisis cuidadoso a lo largo de la totalidad de la magnitud z de la sección. Las células marcadas con GFP se cuantificaron de la misma forma, comprobando la colocalización con la ChAT. Para la cuantificación de los astrocitos, al igual que de las MN, las secciones sucesivas se tiñeron para la GFP, la GFAP y después se montaron. Usando microscopía confocal con un objetivo 63x y FITC simultáneo y filtros Cy5, se seleccionaron campos aleatorios en las astas anteriores de las secciones de médula espinal lumbar de los animales que recibieron inyecciones en la vena de la cola. Las cifras totales de células positivas para GFP y para GFAP se contaron a partir de un mínimo de al menos 24 campos por animal con un enfoque a lo largo de la totalidad de la magnitud z de la sección. Se analizaron secciones de médula espinal de 3 animales por grupo para la cuantificación de las MN y de los astrocitos.
Análisis de inmunotransferencia. Se recogieron las médulas espinales de ratones que recibieron inyecciones el P1, el P21 y SOD1G93A de control 21 días después de la inyección, y de monos tratados y de control 2 semanas después de la inyección del AAV9-SOD1-ARNhc. Se homogeneizaron las médulas espinales y se prepararon lisados de proteínas usando T-Per (Pierce) con cóctel inhibidor de la proteasa. Las muestras se resolvieron con una SDS-PAGE según las instrucciones del fabricante. Se usaron anticuerpos primarios anti-SOD1 de conejo (1:750, Cell signaling, Danvers, MA) anti-SOD1 de ratón (1:750, Millipore, Billerica, mA), anti-SOD1 de conejo (1:1.000, Abcam, Cambridge, MA), antiactina de conejo (1:1.000, Abcam, Cambridge, Ma ) y anti-GAPDH de ratón (1:1.000, Millipore, Billerica, MA). Los anticuerpos secundarios usados eran anti-HRP de conejo (1:10.000-1:50.000) y anti-HRP de ratón (1:10.000). El análisis densitométrico se realizó usando el programa informático Image J.
Microdisección de captura con láser. Se recolectaron secciones congeladas de médula espinal lumbar 12hm en portaobjetos de membrana PEN (Zeiss, Munich, Alemania) y se tiñeron con violeta de cresilo al 1 % (Sigma, St. Louis, MO) en metanol. Las secciones se secaron al aire y se conservaron a -80 0C. Después de la descongelación, las motoneuronas se recolectaron en 30 min desde la tinción usando un microdisector de captura con láser PALM Robo3 Zeiss) usando los siguientes ajustes: energía de corte: 48, energía de LPC: 20, foco de corte: 80/81, foco de LPC: 1, velocidad de posición: 100, velocidad de corte: 50. Se recolectaron aproximadamente 500 MN por animal. Las células no neuronales de las astas anteriores se recolectaron desde las mismas secciones después de la recolección de las motoneuronas.
qRT-PCR. Se aisló el ARN de las células capturadas con láser o de las secciones de médula espinal completa a partir de los segmentos cervical, torácico y lumbar, usando el RNaqueous Micro Kit (Ambion, Grand Island, NY) según las instrucciones del fabricante. Después, el ARN se retrotranscribió en ADNc usando el RT2 HT First Strand Kit (SABiosciences, Valencia, CA). Se usaron 12,5 ng de ARN en cada reacción de Q-PCR usando SyBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA) para establecer la cantidad relativa del transcrito endógeno de la SOD1 de mono en los animales que habían recibido el AAV9-SOD1-ARNhc en comparación con los animales que habían recibido únicamente el AAV9-GFP. Cada muestra se analizó por triplicado y se calculó la concentración relativa usando los valores de ddCt normalizados al transcrito endógeno de la actina.
Análisis del comportamiento y de la supervivencia. Los cambios en la masa corporal de los ratones SOD1G93A tratados y de control se monitorizaron dos veces por semana. Los ratones /oxSOD1G37R se pesaron semanalmente. La coordinación motora se registró usando un instrumento de cilindro giratorio (Columbus Instruments, Columbus, OH). Cada sesión semanal consistía en tres pruebas en el cilindro giratorio en aceleración, comenzando a 5 rpm/min. Se registró el tiempo que permanecía cada ratón en el rodillo. Tanto los ratones SOD1G93A como los /oxSOD1G37R se sometieron a una evaluación semanal de la fuerza de agarre de las extremidades posteriores usando un medidor de la fuerza de agarre (Columbus Instruments, Columbus, OH). Cada sesión semanal consistía en 3 (ratones SOD1G93A) o 5 (ratonesloxSOD1G37R) análisis por animal. El análisis de supervivencia se realizó usando un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. La fase final se definió como un punto de muerte artificial, cuando los animales ya no podían "darse la vuelta" por sí mismos 30 s después de haber sido colocados boca arriba. El inicio y la progresión de la enfermedad se determinaron a partir del análisis retrospectivo de los datos. El inicio de la enfermedad se define como la edad a la cual el animal alcanza su peso máximo. La duración de la enfermedad se define como el periodo de tiempo entre el inicio de la enfermedad y la fase final. La duración de la enfermedad temprana es el periodo entre el peso máximo y la pérdida de un 10 % de peso corporal, mientras que la duración de la enfermedad tardía se define como el periodo entre la pérdida de un 10 % de peso corporal hasta la fase final de la enfermedad. Debido a la esperanza de vida más corta de los animales SOD1G93A, no evaluamos la distinción entre la progresión temprana y tardía.
Para los análisis de toxicidad después de la inyección el P1 o el P21, los ratones tratados y los naturales de control se sometieron a un análisis de comportamiento comenzando a los -30 días de edad y monitorizado hasta los 6 meses. La masa corporal se registró semanalmente, mientras que el comportamiento en el cilindro giratorio y la fuerza de agarre de las extremidades posteriores se registraron cada dos semanas.
Estudios hematológicos y séricos. Las muestras sanguíneas se recogieron en tubos microtainer (BD) de (K2) EDTA de los ratones tratados y los naturales de control a los 150 días de edad mediante una punción en la vena mandibular. A los mismos animales se les extrajeron muestras de sangre a los 180 días de edad y la sangre se recogió en tubos de microtainer con separador de suero. La sangre se dejó coagular durante una hora y después se centrifugó a 10.000 rpm durante 5 minutos. La fase superior transparente (suero) se recogió y se congeló -80 0C. Los análisis hematológicos y séricos fueron realizados por Ani Lytics Inc, Gaithersburg, MD.
Análisis estadístico. Todos los análisis estadísticos se realizaron usando el paquete informático GraphPad Prism (San Diego, CA). Los análisis de supervivencia de Kaplan Meier se analizaron mediante la prueba del orden logarítmico. Las comparaciones entre las duraciones medianas de la enfermedad y los tiempos de supervivencia se analizaron mediante la prueba de Wilcoxon para datos emparejados.
Ejemplo 8
Desarrollo de una construcción clínica de ARNhc de la SOD1
El vector del ARNhc de la SOD1 del AAV descrito en el Ejemplo 2 porta el ARNhc contra la secuencia de la SOD1 humana bajo el promotor H1 promotor (Figura 9a). El mismo vector también contiene un casete de expresión de la GFP que expresa la GFP bajo un promotor de la CBA. Los demás elementos reguladores presentes en este casete incluyen el potenciador del CMV, el intrón del SV40 y una secuencia de terminación de PoliA de la bGH. En el presente documento demostramos que la administración del ARNhc de la SOD1 del AAV9 da como resultado una eficaz regulación por disminución de la SOD1, junto con una robusta expresión de la GFP in vitro así como en in vivo. No se observaron alteraciones significativas después de la evaluación a largo plazo de los ratones naturales que recibieron el AAV9 con el ARNhc de la SOD1. Estos resultados sugirieron que no hay efectos inespecíficos evidentes debido a la expresión a largo plazo del ARNhc de la SOD1, así como de la sobreexpresión de la GFP. Aunque no encontramos toxicidad por la GFP en nuestros ratones, numerosos informes han mostrado los efectos adversos de la sobreexpresión de la GFP in vitro e in vivo. Por lo tanto, para eliminar completamente la posibilidad de toxicidad por la GFP, la construcción de ARNhc de la SOD1 del Ejemplo 2 se modificó sustituyendo el casete de expresión de la GFP por una secuencia de relleno no codificante manteniendo el tamaño total de la construcción de ADN flanqueada por las ITR (Figura 9b). Esto es importante, ya que la distancia entre las dos secuencias de ITR afecta en gran medida a la capacidad de empaquetamiento de la construcción flanqueada en las cápsides del AAV9 [321-324].
Hasta ahora, ninguna de las secuencias de relleno aprobadas por la FDA están fácilmente disponibles. Hay, sin embargo, varios esqueletos de plásmido que están aprobados por la FDA para su administración a seres humanos. Se escogieron pequeños fragmentos de ADN de estos plásmidos que no se corresponden con ninguna secuencia de ADN esencial necesaria para la selección y la replicación del plásmido o de los elementos de las unidades de transcripción. Los esqueletos de plásmido se indican en la Tabla 1. Los elementos del ADN de diferentes plásmidos se dispusieron en tándem para generar una secuencia de relleno completa de 1.607 pb (SEQ ID NO: 22). Finalmente, se sintetizó una construcción de ADN que contiene el casete de expresión del ARNhc de la SOD1, seguida por la secuencia de relleno, en Genscript.
Tabla 1
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La construcción clínica de ARNhc de la SOD1 tiene ARNhc contra la SOD1 humana bajo el promotor H1 que está seguido por la secuencia de relleno no codificante. Esta construcción está diseñada de tal forma que pueden añadirse múltiples casetes de expresión del ARNhc al vector final mediante la eliminación simultánea de la secuencia de relleno. Se han añadido sitios de endonucleasa de restricción a la secuencia de relleno, de forma que parte del relleno pueda ser eliminado cuando se añada otro casete de expresión de ARNhc (Figura 10). Esta eliminación y adición simultánea de secuencias de ADN ayudaría a mantener el tamaño óptimo de la construcción completa entre las ITR (~2,0 kb) para conseguir un empaquetamiento eficaz.
La construcción clínica de ARNhc de la SOD1 de Genscript se clonó en el vector lanzadera pJet1.2 a través de EcoRV. Este clon parental se cribó usando diversas endonucleasas de restricción diseñadas en la construcción para confirmar el clon correcto. La doble digestión con Kpn1/Sph1 del pJet del ARNhc de la SOD1 confirmó la presencia de la construcción completa (2.023 pb), mientras que la digestión con Xbal confirmó la presencia del casete de expresión de la ARNhc de la SOD1 (414 pb) y del elemento de relleno, junto con el esqueleto del pJet (~3.000 pb). La doble digestión con EcoRV/Pme1 también reveló la presencia del elemento de relleno.
Ejemplo 9
El ARNhc de la SOD1 clínico reduce eficazmente los niveles de la proteína SOD1 humana in vitro
Para determinar la eficacia de la construcción del ARNhc de la SOD1 sintetizada de novo para regular por disminución los niveles de la SOD1, se transfectaron células HEK 293 con el plásmido pJet del ARNhc de la SOD1 usando el método del fosfato de calcio. El plásmido del ARNhc de la SOD1 del AAV se usó como control positivo. El análisis de inmunofluorescencia de las células HEK 293, 72 h después de la transfección, reveló la ausencia de fluorescencia de la GFP nativa de las células transfectadas con el pJet del ARNhc de la SOD1 en comparación con las células transfectadas con el ARNhc de la SOD1 del AAV9. El análisis de inmunotransferencia de los lisados celulares de estas células confirmaron adicionalmente la sustitución con éxito de la GFP desde el plásmido pJet del ARNhc de la SOD1. De manera importante, el pJet del ARNhc de la SOD1 dio como resultado una eficaz regulación por disminución de los niveles de la proteína SOD1 (> 50 %), similar al plásmido de ARNhc de la SOD1 del AAV. Véase la Figura 11.
Ejemplo 10
Generación del ARNhc de la SOD1 del AAV clínico
La construcción clínica de ARNhc de la SOD1 se clonó adicionalmente en un vector AAV.CB.MCS usando sitios Kpn1/Sph1 para generar el plásmido clínico de ARNhc de la SOD1 del AAV (Figura 12). El AAV.CB.MCS se generó a partir del plásmido AAV.CB.GFP obtenido en merion Scientific sustituyendo la GFP por un sitio de clonación múltiple (MCS). La clonación de la construcción clínica del ARNhc de la SOD1 en los sitios Kpn1/Sph1 la coloca entre dos ITR del AAV2, lo que facilita el empaquetamiento de la construcción en cápsides víricas del AAV9. Véase la Figura 12.
El plásmido del ARNhc de la SOD1 del AAV clínico se cribó con endonucleasas de restricción para confirmar la presencia del casete de expresión del ARNhc de la SOD1 (digerido de Xbal), la secuencia de relleno (doble digerido de EcoRV/Pmel) y también las secuencias ITR intactas (digerido de Sma1).
Ejemplo 11
El ARNhc de la SOD1 del AAV clínico reduce eficazmente los niveles de la proteína SOD1 humana in vitro
El plásmido del ARNhc de la SOD1 del AAV clínico se transfectó en células HEK 293 para determinar su eficacia de inactivación. De forma similar al plásmido pJet del ARNhc de la SOD1, las células transfectadas con el ARNhc de la SOD1 del AAV clínico estaban desprovistas de cualquier expresión de la GFP, como se hizo evidente mediante el ensayo de inmunofluorescencia (Figura 13a-f) y de inmunotransferencia (Figura 13g). Más importante aún, el ARNhc de la SOD1 del AAV clínico redujo eficazmente los niveles de la proteína SOD1 humana en células HEK 293 en más del 50 % (Figura 13g, h). En conjunto, estos resultados confirmaron la generación satisfactoria del vector del ARNhc de la SOD1 del AAV clínico con un casete de expresión funcional del ARNhc de la SOD1 y la completa eliminación del casete de expresión del transgen.
Documentos referenciados
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Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un virus recombinante adenoasociado que comprende el ADN que codifica el ARNhc de la dismutasa de superóxido 1 (SOD1) CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO: 4), en donde el genoma del virus recombinante adenoasociado carece de los genes rep y cap.
2. Una composición que comprende el virus recombinante adenoasociado de la reivindicación 1.
3. Un virus recombinante adenoasociado para su uso en terapia, que comprende el ADN que codifica el ARNhc de la SOD1 CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO: 4), en donde el genoma del virus recombinante adenoasociado carece de los genes rep y cap.
4. Un virus recombinante adenoasociado para el uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), que comprende el ADN que codifica el ARNhc de la SOD1 CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO: 4), en donde el genoma del virus recombinante adenoasociado carece de los genes rep y cap.
5. El virus recombinante adenoasociado para el uso de las reivindicaciones 3 o 4, en donde el virus recombinante adenoasociado es para su administración sistémica.
6. El virus recombinante adenoasociado para el uso de las reivindicaciones 3 o 4, en donde el virus recombinante adenoasociado es para su administración intratecal.
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