ES2919880T3 - Sistemas de vectores múltiples y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

La presente invención se relaciona con construcciones, vectores, células huésped relativas y composiciones farmacéuticas que permiten una terapia génica efectiva, en particular de genes mayores de 5kb. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas de vectores múltiples y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a constructos, vectores, células huésped relativas y composiciones farmacéuticas que permiten una terapia génica eficaz, en particular de genes mayores que 5 Kb.
Antecedentes de la invención
La terapia de recuperación de la vista para muchas degeneraciones hereditarias de la retina (IRD, por sus siglas en inglés) sigue siendo una importante necesidad médica insatisfecha. La terapia génica con vectores de virus adenoasociados (AAV, por sus siglas en inglés) representa, hasta la fecha, el enfoque más prometedor para el tratamiento de muchas IRD. De hecho, años de investigación preclínica y una serie de ensayos clínicos para diferentes IRD han definido la capacidad de los AAV para entregar eficientemente genes terapéuticos a las capas de la retina enfermas [fotorreceptores (PR, por sus siglas en inglés) y epitelio pigmentario de la retina (RPE, por sus siglas en inglés)] 12 y han destacado sus excelentes perfiles de seguridad y eficacia en humanos 3-7 A pesar de ello, uno de los principales obstáculos para ampliar este éxito a otras condiciones de ceguera es la capacidad de empaquetamiento de los vectores AAV (~ 5 kb). Esto se ha convertido en un factor limitante para el desarrollo de la terapia de reemplazo de genes para las IRD comunes debido a las mutaciones en los genes con una secuencia de codificación (CDS, por sus siglas en inglés) mayor que 5 kb (en lo sucesivo también denominados genes grandes).
Por lo tanto, en los últimos años se ha dirigido un interés considerable hacia la identificación de estrategias para aumentar la capacidad de transporte de los AAV. Los vectores AAV duales, basados en la capacidad de los genomas del AAV para la concatemerización a través de la recombinación intermolecular, han sido explotados con éxito para abordar esta cuestión 14-16. Los vectores AAV duales se generan dividiendo un gran casete de expresión de transgenes en dos mitades separadas, cada una de ellas empaquetada en un único vector AAV de tamaño normal (NS; < 5 kb). La reconstitución del casete de expresión de longitud completa se consigue mediante la coinfección de la misma célula con ambos vectores AAV duales, seguida de: i) la concatemerización de la sección final a principal mediada por la repetición terminal invertida (ITR, por sus siglas en inglés) de los dos genomas de los vectores, seguida del corte y empalme (transcorte y empalme del AAV dual, TS) 15, ii) la recombinación homóloga entre las regiones superpuestas contenidas en los genomas de los dos vectores (superposición del AAV dual, OV) 15, iii) una combinación de ambos (AAV dual híbrido) 16. Otros y los inventores han demostrado recientemente el potencial de los vectores AAV duales en la retina 14, 17-19. Las regiones recombinógenas más utilizadas en el contexto de los vectores AAV duales híbridos derivan de la secuencia de 872 pb del tercio central del ADNc de la fosfatasa alcalina humana que ha demostrado conferir altos niveles de reconstitución de los vectores AAV duales híbridos 16 Los inventores demostraron que los vectores AAV duales híbridos que incluyen la secuencia AK superan a los que incluyen la secuencia de sentido de la región principal de la fosfatasa alcalina 14, que los inventores generaron basándose en la descripción proporcionada en Ghosh et al 22 Estudios adicionales han demostrado que tanto la sección principal como la final de esta región de fosfatasa alcalina confieren niveles de reconstitución de transgenes similares a los conseguidos con el tercio central de longitud completa del ADNc de la fosfatasa alcalina 22. Los inventores descubrieron que los vectores AAV duales de transcorte y empalme y los vectores AK híbridos (que contienen la secuencia recombinogénica corta AK del fago F1) transducen eficazmente la retina de ratón y de cerdo y rescatan modelos de ratón de la enfermedad de Stargardt (STGD) y de Usher 1B (USH1B) 1419 Los niveles de transducción de los PR logrados con los vectores AAV duales TS y AK híbridos dieron lugar a una mejora significativa del fenotipo retiniano de los modelos de ratón de las IRD y pueden ser eficaces para tratar las condiciones de ceguera heredadas. Además, los vectores con ITR heterólogos de los serotipos 2 y 5 (ITR2 e ITR5, respectivamente), que son altamente divergentes (58 % de homología 23), muestran tanto una capacidad reducida para formar monómeros circulares como una mayor concatemerización de la sección final a principal direccional que los vectores con ITR homólogas 24. Basándose en esto, Yan et al., han demostrado que los vectores AAV duales con ITR2 e ITR5 heterólogas reconstituyen la expresión del transgén de forma más eficiente que los vectores AAV duales con ITR homóloga 2425
Aunque estos estudios han puesto de manifiesto el potencial de los vectores AAV duales para la reconstitución de genes grandes en el tejido de interés, como la retina, también han destacado cuestiones críticas que deben abordarse antes de considerar una mayor traducción clínica de esta estrategia.
La producción de productos proteicos truncados a partir de la mitad 5' del vector que contiene la secuencia promotora y/o mitad 3' del vector debido a la baja actividad promotora de la ITR 1417, 20, 21, sigue siendo un problema importante asociado al uso de vectores duales. Hasta el momento no se han realizado estudios formales de toxicidad para evaluar los posibles efectos perjudiciales de estos productos truncados in vivo, lo que plantea una preocupación de seguridad. Por lo tanto, es muy deseable reducir o suprimir su producción. La presente invención tiene por objetivo resolver este importante problema asociado al uso de sistemas de vectores duales.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a constructos, vectores, células huésped relativas y composiciones farmacéuticas que permiten una terapia génica eficaz, en particular de genes mayores que 5Kb. Los genes grandes incluyen, entre otros:
ENFER GEN CAUSANTE CÉLULA AFECTADA TAMAÑO DE LAS CDS (kb) USH1F Relacionada a la protocadherina 15 (PCDH15) Retina neurosens 5,9 CSNB2 Canal de calcio, dependiente de voltaje, tipo L, Fotorreceptores 5,9 subunidad alfa 1F (CACNA1) RP ad Pequeña ribonucleoproteína nuclear de 200 kDa Fotorreceptores y 6,4
(SNRNP200) RP ad o Retinitis pigmentosa 1 (RP1)
Figure imgf000003_0002
Fotorreceptores 6,5 USH1B Miosina IIVA (MYO7A) Fotorreceptores y 6,7 STGD1 Casete de unión a ATP, subfamilia A, miembro 4 Fotorreceptores 6,8
Figure imgf000003_0001
(ABCA4) RP ad Factor de procesami Fotorreceptores y 7,0 homólogo (PRPF8) Distrofia macular Retinitis pigmentosa Fotorreceptores 7,2 oculta
Figure imgf000003_0003
LCA10 Proteína centrosoma Fotorreceptores 7,5 RP EYS Fotorreceptores y matriz 9,4 extracelular USH1D Cadherina 23 (CDH2 Retina neurosensorial 10 Síndrom ALMS1 Fotorreceptores 12,5 Alstrom USH2A Usherina (USH2A) Retina neurosensorial 15,6 Distrofia Hemicentina 1 (HMC Fotorreceptores y RPE 17 ad
USH2C
Figure imgf000003_0006
Receptor 98 acoplad
Figure imgf000003_0005
Retina neurosensorial
Figure imgf000003_0007
18,9
Figure imgf000003_0004
La enfermedad de Stargardt (STGD1; MIM#248200) es la forma más común de degeneración macular hereditaria causada por mutaciones en ABCA4 (CDS: 6822 pb), que codifica el transportador todo-transretinal específico de los fotorreceptores 8, 9. La distrofia de conos y bastones de tipo 3, fundus flavimaculatus, la degeneración macular asociada a la edad de tipo 2, la distrofia retiniana grave de inicio temprano y la retinosis pigmentaria de tipo 19 también están asociadas a mutaciones en ABCA4 (enfermedades asociadas a ABc A4). El síndrome de Usher tipo IB (USH1B; MIM#276900) es la forma combinada más grave de retinosis pigmentaria y sordera causada por mutaciones en MYO7A (CDS: 6648 pb)10, que codifica para un motor basado en la actina que se expresa tanto en el PR como en el RPE dentro de la retina 11-13.
Además, muchas otras enfermedades genéticas, no necesariamente causantes de síntomas retinales, se deben a mutaciones en los genes grandes. Estas incluyen, entre otras: distrofia muscular de Duchenne debido a mutaciones en DMD, fibrosis quística debido a mutaciones en CFTR, hemofilia A debido a mutaciones en F8 y disferlinopatías debido a mutaciones en el gen DYSF.
En particular, la presente invención está dirigida a disminuir la expresión de un producto proteico truncado asociado a múltiples sistemas de vectores AAV, mediante el uso de señales que median la degradación de las proteínas o evitan su traducción (en adelante, señales de degradación). Las señales de degradación nunca se han utilizado en el contexto de vectores virales múltiples. En la presente invención se encontró sorprendentemente que cuando una señal de degradación está presente en al menos un vector de un sistema de vectores múltiples, la expresión de la proteína en forma truncada disminuye significativamente, lo que conduce a un mayor rendimiento de la proteína de longitud completa.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un sistema de vectores AAV múltiples para expresar la secuencia de codificación de un gen de interés en una célula, dicha secuencia de codificación comprende una primera porción y una segunda porción, dicho sistema de vectores comprende:
a) un primer vector que comprende:
- dicha primera porción de dicha secuencia de codificación (CDS1),
- una primera secuencia de reconstitución; y
b) un segundo vector que comprende:
- dicha segunda porción de dicha secuencia de codificación (CDS2),
- una segunda secuencia de reconstitución,
en donde dichas primera y segunda secuencias de reconstitución se seleccionan del grupo de:
i] la primera secuencia de reconstitución consiste en el extremo 3' de dicha primera porción de la secuencia de codificación y la segunda secuencia de reconstitución consiste en el extremo 5' de dicha segunda porción de la secuencia de codificación, dichas primera y segunda secuencias de reconstitución son secuencias superpuestas; o
ii] la primera secuencia de reconstitución comprende una señal donante del corte y empalme (SD) y la segunda secuencia de reconstitución comprende una señal aceptora del corte y empalme (SA), opcionalmente cada una de la primera y segunda secuencia de reconstitución comprende además una secuencia recombinogénica,
caracterizada por el hecho de que uno o ambos del primero y el segundo vector, comprenden además una secuencia de nucleótidos de una señal de degradación, estando dicha secuencia situada en caso de i) en el extremo 3' de la CDS1 y/o en el extremo 5' de la CDS2 y en caso de ii) en la posición 3' respecto a SD y/o en la posición 5' respecto a SA, en donde: - la secuencia recombinogénica se selecciona del grupo que consiste en:
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID No 22, AK) o GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID NO. 23, AK), SEQ ID NO. 24 (AP1), SEQ ID NO. 25 (AP2), y SEQ ID NO. 26 (AP) y
- la secuencia de nucleótidos de la señal de degradación comprende o consiste en una secuencia que codifica la SEO ID No. 1 (CL1), SEQ ID No. 2 (CL2), SEQ ID No. 3 (CL6), SEQ ID No.4 (CL9), SEQ ID No. 5 (CL10), SEQ ID No. 6 (CL11), SEQ ID No. 7 (CL12), SEQ ID No. 8 (CL15), sEq iD No. 9 (CL16), o la secuencia de nucleótidos de una señal de degradación comprende o consiste en la SEQ ID No. 16.
Preferiblemente, tanto el primer como el segundo vector comprenden además dicha secuencia de nucleótidos de una señal de degradación, en donde la secuencia de nucleótidos de la señal de degradación en el primer vector es idéntica o difiere de la del segundo vector.
Preferiblemente, la primera secuencia de reconstitución comprende una señal donante de corte y empalme (SD) y una región recombinogénica en posición 3' con respecto a dicha SD, la segunda secuencia de reconstitución comprende una señal aceptora de corte y empalme (SA) y una secuencia recombinogénica en posición 5' con respecto a la SA; en donde dicha secuencia de nucleótidos de una señal de degradación se localiza en el extremo 5' y/o en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos de la región recombinogénica de uno o ambos del primer y segundo vector.
Preferiblemente, el primer vector comprende además una secuencia promotora unida de forma operativa a la porción del extremo 5' de dicha primera porción de la secuencia de codificación (CDS1).
Preferiblemente, tanto el primer como el segundo vector comprenden además una secuencia de nucleótidos de repetición 5' terminal (5'-TR) y una secuencia de nucleótidos de repetición 3' terminal (3'-TR), preferiblemente la 5'-TR es una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida (5'-ITR) y la 3'-TR es una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida (3'-ITR), preferiblemente las ITR derivan del mismo serotipo del virus o de diferentes serotipos del virus. Preferiblemente, la secuencia de codificación se divide en la primera porción y la segunda porción en una unión natural exón-exón.
Preferiblemente, la señal donante de corte y empalme comprende o consiste esencialmente en una secuencia que es al GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTC GAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT (SEQ ID No. 27).
menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a
Preferiblemente, la señal aceptora de corte y empalme comprende o consiste esencialmente en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ ID No. 28)
Preferiblemente, el primer vector comprende además al menos una secuencia de nucleótidos potenciadora, unida de forma operativa a la secuencia de codificación.
Preferiblemente, la secuencia de codificación codifica una proteína capaz de corregir una degeneración de la retina. Preferiblemente, la secuencia de codificación codifica una proteína capaz de corregir la distrofia muscular de Duchenne, la fibrosis quística, la hemofilia A y las disferlinopatías.
En el caso de la degradación de la retina, preferiblemente la secuencia de codificación es la secuencia de codificación de un gen seleccionado del grupo que consiste en: ABCA4, MYO7A, CEP290, CDH23, EYS, PCDH15, CACNA1, SNRNP200, RP1, PRPF8, RP1L1, ALMS1, USH2A, GPR98, HMCN1.
En el caso de la distrofia muscular de Duchenne, la fibrosis quística, la hemofilia A y las disferlinopatías, preferiblemente la secuencia de codificación es la secuencia de codificación de un gen seleccionado del grupo que consiste en: DMD, CFTR, F8 y DYSF,
Preferiblemente, el primer vector no comprende una secuencia de nucleótidos de señal de poliadenilación.
Preferiblemente, el sistema de vectores comprende:
a) un primer vector que comprende en una dirección 5'-3':
- una secuencia de repetición terminal invertida (5'-ITR);
- una secuencia promotora;
- una porción del extremo 5' de una secuencia de codificación de un gen de interés (CDS1), estando dicha porción del extremo 5' unida de forma operativa a dicho promotor y bajo su control;
- una secuencia de nucleótidos de una señal donante de corte y empalme;
- una secuencia de nucleótidos de una región recombinogénica; y
- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR); y
b) un segundo vector que comprende en una dirección 5'-3':
- una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR);
- una secuencia de nucleótidos de una región recombinogénica; y
- una secuencia de nucleótidos de una señal aceptora de corte y empalme;
- el extremo 3' de la secuencia de codificación (CDS2);
- una secuencia de nucleótidos de la señal de poliadenilación; y
- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR),
caracterizado por comprender además una secuencia de nucleótidos de una señal de degradación, estando dicha secuencia situada en el extremo 5' o en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos de la región recombinogénica de uno o ambos del primero y segundo vector
en donde
- la secuencia recombinogénica se selecciona del grupo que consiste en:
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID No 22, AK) o GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID NO.23, AK), SEQ ID NO. 24 (AP1), SEQ ID NO 25 (AP2), y SEQ ID NO. 26 (AP) y
- la secuencia de nucleótidos de la señal de degradación comprende o consiste en una secuencia que codifica la SEQ ID No. 1 (CL1), SEQ ID No. 2 (CL2), SEQ ID No. 3 (CL6), SEQ ID No. 4 (CL9), SEQ ID No. 5 (CL10), SEQ ID No. 6 (CL11), SEQ ID No. 7 (CL12), SEQ ID No. 8 (CL15), sEq iD No. 9 (CL16), o la secuencia de nucleótidos de una señal de degradación comprende o consiste en la SEQ ID No. 16.
Preferiblemente, dicho primer y segundo vectores virales adenoasociados (AAV) se seleccionan del mismo o diferentes serotipos del AAV, preferiblemente el virus adenoasociado se selecciona del serotipo 2, serotipo 8, serotipo 5, serotipo 7 o serotipo 9.
Preferiblemente, el sistema de vectores de la invención comprende además un tercer vector que comprende una tercera porción de dicha secuencia de codificación (CDS3) y una secuencia de reconstitución, en donde el segundo vector comprende dos secuencias de reconstitución, cada secuencia de reconstitución situada en cada extremo de la CDS2.
Preferiblemente, la secuencia de reconstitución del primer vector consiste en el extremo 3' de la CDS1, las dos secuencias de reconstitución del segundo vector consisten cada una en el extremo 5' y en el extremo 3' de la CDS2, la secuencia de reconstitución del tercer vector consiste en el extremo 5' de la CDS3;
en donde dicha secuencia de reconstitución del primer vector y dicha secuencia de reconstitución del segundo vector que consiste en el extremo 5' de la CDS2 son secuencias superpuestas, y
en donde dicha secuencia de reconstitución del segundo vector consistente en el extremo 3' de la CDS2 y dicha secuencia de reconstitución de dicho tercer vector son secuencias superpuestas;
en donde dicho segundo vector comprende además una señal de degradación, estando dicha señal de degradación situada en el extremo 5' y/o en el extremo 3' de la CDS2.
Preferiblemente, el tercer vector comprende además al menos una secuencia de nucleótidos de una señal de degradación.
Preferiblemente, el segundo vector comprende además una secuencia de nucleótidos de señal de poliadenilación unida a la porción del extremo 3' de dicha secuencia de codificación (CDS2).
La presente invención proporciona una célula huésped transformada con el sistema de vectores como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, el sistema de vectores o la célula huésped de la invención es para uso médico. Preferiblemente para su uso en terapia génica. Preferiblemente para su uso en el tratamiento y/o prevención de una patología o enfermedad caracterizada por una degeneración de la retina o para su uso en la prevención y/o tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne, la fibrosis quística, la hemofilia A y las disferlinopatías.
Preferiblemente, la degeneración de la retina es hereditaria.
Preferiblemente, la patología o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en: retinosis pigmentaria (RP), amaurosis congénita de Leber (LCA), enfermedad de Stargardt (STGD), enfermedad de Usher (USH), síndrome de Alstrom, ceguera nocturna estacionaria congénita (CSNB), distrofia macular, distrofia macular oculta, una enfermedad causada por una mutación en el gen ABCA4.
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el sistema vectorial o la célula huésped como se ha definido anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona una secuencia de nucleótidos de una señal de degradación que comprende o consiste en una secuencia que codifica la SEQ ID No. 1 (CL1), SEQ ID No. 2 (CL2), SEQ ID No. 3 (CL6), SEQ ID No. 4 (CL9), SEQ ID No. 5 (CL10), SEQ ID No. 6 (CL11), SEQ ID No. 7 (CL12), SEQ ID No. 8 (CL15), SEQ ID No. 9 (CL16), o que comprenda o consista en la SEQ lD No.16 en un sistema de vectores AAV múltiples para su uso en un método para disminuir la expresión de una proteína en forma truncada o para su uso en un método para disminuir la expresión de una proteína en forma truncada que comprende insertar dicha secuencia de nucleótidos de una señal de degradación en uno o más vectores de un sistema de vectores AAV múltiples.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la invención, el sistema de vectores para expresar la secuencia de codificación de un gen de interés en una célula comprende dos vectores, cada vector comprende una porción diferente de dicha secuencia de codificación y una secuencia de reconstitución; preferiblemente, la secuencia de reconstitución del primer vector es una secuencia que comprende un donante de corte y empalme, mientras que la secuencia de reconstitución del segundo vector es una secuencia que comprende un aceptor de corte y empalme.
De acuerdo con otras realizaciones preferidas de la invención, el sistema de vectores para expresar la secuencia de codificación de un gen de interés en una célula comprende tres vectores, cada vector comprende una porción diferente de dicha secuencia de codificación y al menos una secuencia de reconstitución; preferiblemente, el primer vector comprende una secuencia de reconstitución que comprende un donante de corte y empalme en posición 3' respecto a la primera porción de la secuencia de codificación, el segundo vector comprende una secuencia de reconstitución que comprende un aceptor de corte y empalme en posición 5' respecto a la segunda porción de la secuencia de codificación y una secuencia de reconstitución que comprende un donante de corte y empalme en posición 3' respecto a la segunda porción de la secuencia de codificación, el tercer vector comprende una secuencia de reconstitución que comprende un aceptor de corte y empalme en posición 5' respecto a la tercera porción de la secuencia de codificación.
Preferiblemente, las secuencias de reconstitución del primer y del segundo vector o las secuencias de reconstitución del primer, del segundo y del tercer vector comprenden además una región recombinogénica, preferiblemente situada en posición 3' respecto al donante de corte y empalme y en posición 5' respecto al aceptor de corte y empalme.
Preferiblemente, todos los vectores del sistema de vectores de la invención comprenden además una secuencia de nucleótidos de una señal de degradación.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la invención, en donde los vectores comprenden secuencias de reconstitución que comprenden una región recombinogénica, una señal de degradación se localiza en el extremo 5' o en el extremo 3' de la secuencia de dicha región recombinogénica.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la invención, el sistema de vectores para expresar la secuencia de codificación de un gen de interés en una célula comprende dos vectores; el primer vector del sistema de vectores comprende en una dirección 5'-3':
- la porción del extremo 5' de la secuencia de codificación de un gen de interés,
- la secuencia de ácido nucleico de una señal donante de corte y empalme,
- la secuencia de ácido nucleico de una región recombinogénica, y
- la secuencia de ácido nucleico de una señal de degradación.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la invención, el sistema de vectores para expresar la secuencia de codificación de un gen de interés en una célula comprende dos vectores, el segundo vector del sistema de vectores comprende en una dirección 5'-3':
- la secuencia de ácido nucleico de la región recombinogénica,
- la secuencia de ácido nucleico de la señal de degradación,
- la secuencia de ácido nucleico de la señal aceptora de corte y empalme, y
- la porción del extremo 3' de la secuencia de codificación de un gen de interés
en donde
- la secuencia recombinogénica se selecciona del grupo que consiste en:
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID No. 22, AK) o GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID NO. 23, AK), SEQ ID NO. 24 (AP1), SEQ ID NO 25 (AP2) y la SEQ ID NO. 26 (AP) y
- la secuencia de nucleótidos de la señal de degradación comprende o consiste en una secuencia que codifica la SEQ ID No. 1 (CL1), SEQ ID No. 2 (CL2), SEQ ID No. 3 (CL6), SEQ ID No. 4 (CL9), SEQ ID No. 5 (CL10), SEQ ID No. 6 (CL11), SEQ ID No. 7 (CL12), SEQ ID No. 8 (CL15), s Eq iD No. 9 (CL16), o la secuencia de nucleótidos de una señal de degradación comprende o consiste en la SEQ ID No. 16.
Preferiblemente, el primer vector de un sistema de vectores de acuerdo con la invención comprende además una secuencia promotora, más preferiblemente dicha secuencia promotora está operablemente unida al extremo 5' de la primera porción de la secuencia de codificación de un gen de interés.
Preferiblemente, el segundo vector de un sistema de vectores compuesto por dos vectores comprende además una secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación, más preferiblemente dicha secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación está unida al extremo 3' de la segunda porción de la secuencia de codificación de un gen de interés. Preferiblemente, el primer vector de un sistema de vectores de acuerdo con la invención no comprende una secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación.
Preferiblemente, el tercer vector de un sistema de vectores que consiste en tres vectores comprende además una secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación, más preferiblemente dicha secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación está unida al extremo 3' de la tercera porción de la secuencia de codificación de un gen de interés.
Preferiblemente, al menos uno de los vectores del sistema de vectores de la invención, más preferiblemente el primer vector del sistema de vectores de la invención, comprende una señal de degradación de secuencia que comprende o consiste en una secuencia que codifica la SEQ ID No. 1 CL1 ; preferiblemente, dicha secuencia que codifica la SEQ ID No. 1 CL1 comprende o consiste en la SEQ ID No. 16.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, el sistema de vectores comprende:
a) un primer vector que comprende en una dirección 5'-3':
- una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR);
- una secuencia promotora;
- una primera porción de una secuencia de codificación de un gen de interés, siendo preferiblemente la porción del extremo 5' de dicha secuencia de codificación, estando preferiblemente dicha primera porción unida de forma operativa a dicho promotor y bajo su control;
- una secuencia de ácido nucleico de una señal donante de corte y empalme;
- una secuencia de ácido nucleico de una región recombinogénica; y
- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR); y
b) un segundo vector que comprende en una dirección 5'-3':
- una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR);
- una secuencia de ácido nucleico de una región recombinogénica; y
- una secuencia de ácido nucleico de una señal aceptora de corte y empalme;
- una segunda porción de una secuencia de codificación de un gen de interés, siendo preferiblemente la porción del extremo 3' de dicha secuencia de codificación;
- una secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación; y
- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR),
dicho primer y/o segundo vector comprende además una secuencia de ácido nucleico de una señal de degradación, estando dicha secuencia situada en el extremo 5' o en el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico de la región recombinogénica en donde
- la secuencia recombinogénica se selecciona del grupo que consiste en:
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTT AAAAAAT GAGCTGATTT AACAAAAATTT AACGC GAATTTT AACAAAAT
(SEQ ID No. 22, AK) o GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID NO. 23, AK), SEQ ID NO. 24 (AP1), SEQ ID NO. 25 (AP2) y SEQ ID NO. 26 (AP) y
- la secuencia de nucleótidos de la señal de degradación comprende o consiste en una secuencia que codifica la SEQ ID No. 1 (CL1), SEQ ID No. 2 (CL2), SEQ ID No. 3 (CL6), SEQ ID No. 4 (CL9), SEQ ID No. 5 (CL10), SEQ ID No. 6 (CL11), SEQ ID No. 7 (CL12), SEQ ID No. 8 (CL15), s Eq iD No. 9 (CL16), o la secuencia de nucleótidos de una señal de degradación comprende o consiste en la SEQ ID No. 16.
De acuerdo con una realización adicional preferida de la invención, el sistema de vectores comprende:
a) un primer vector que comprende en una dirección 5'-3':
- una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR);
- una secuencia promotora;
- una primera porción de una secuencia de codificación de un gen de interés, preferiblemente ligada de forma operativa a dicho promotor y bajo su control;
- una secuencia de ácido nucleico de una señal donante de corte y empalme;
- una secuencia de ácido nucleico de una región recombinogénica; y
- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR);
b) un segundo vector que comprende en una dirección 5'-3':
- una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR);
- una secuencia de ácido nucleico de una región recombinogénica; y
- una secuencia de ácido nucleico de una señal aceptora de corte y empalme;
- una segunda porción de una secuencia de codificación de un gen de interés;
- una secuencia de ácido nucleico de una señal donante de corte y empalme;
- una secuencia de ácido nucleico de una región recombinogénica; y
- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR); y
c) un tercer vector que comprende en una dirección 5'-3':
d)
- una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR);
- una secuencia de ácido nucleico de una región recombinogénica; y
- una secuencia de ácido nucleico de una señal aceptora de corte y empalme;
- una tercera porción de una secuencia de codificación de un gen de interés;
- una secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación; y
- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR),
dicho primer y/o segundo y/o tercer vector comprende además una secuencia de ácido nucleico de una señal de degradación, estando dicha secuencia situada en el extremo 5' o en el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico de las regiones recombinogénicas
en donde
- la secuencia recombinogénica se selecciona del grupo que consiste en:
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(S EQ ID No. 22, AK) o GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ 10 NO. 23, AK), SEQ ID NO. 24 (AP1), SEQ ID NO. 25 (AP2) y SEQ ID NO. 26 (AP) y
- la secuencia de nucleótidos de la señal de degradación comprende o consiste en una secuencia que codifica la SEQ ID No. 1 (CL1), SEQ ID No. 2 (CL2), SEQ ID No. 3 (CL6), SEQ ID No. 4 (CL9), SEQ ID No. 5 (CL10), SEQ ID No. 6 (CL11), SEQ ID No. 7 (CL12), SEQ ID No. 8 (CL15), SEQ ID No. 9 (CL16), o la secuencia de nucleótidos de una señal de degradación comprende o consiste en SEQ ID No. 16.
Preferiblemente, la patología o enfermedad se selecciona entre: Usher tipo IF (USH1F), ceguera nocturna estacionaria congénita (CSNB2), retinitis pigmentosa (RP) autosómica dominante (ad) y/o autosómica recesiva (ar), USH1B, STGD1, amaurosis congénita de Leber tipo 10 (LCA10), RP, Usher tipo 1D (UsH1d), Usher tipo 2A (USH2A), distrofia macular autosómica dominante, Usher tipo 2C (USH2C), distrofia macular oculta, síndrome de Alstrom.
En la presente invención, el sistema de vectores significa un sistema de constructo, un sistema de plásmido y también partículas virales.
En la presente invención, el sistema de constructo o vector puede incluir más de dos vectores.
En particular, el sistema de constructo puede incluir un tercer vector que comprenda una tercera porción de la secuencia de interés.
En la presente invención, la secuencia de codificación de longitud completa se reconstituye o se obtiene cuando los diversos vectores (2, 3 o más) se introducen en la célula.
La secuencia de codificación puede estar dividida en dos. Las porciones pueden ser iguales o diferentes en longitud. La secuencia de codificación de longitud completa se obtiene cuando los vectores del sistema de vectores se introducen en la célula. La primera porción puede ser el extremo 5' de la secuencia de codificación. La segunda porción puede ser el extremo 3' de la secuencia de codificación. Además, la secuencia de codificación puede estar dividida en tres porciones. Las porciones pueden ser iguales o diferentes en longitud. La secuencia de codificación de longitud completa se obtiene cuando los vectores del sistema de vectores se introducen en la célula. La primera porción es la porción 5' de una secuencia de codificación, la segunda porción es una porción media de la secuencia de codificación, la tercera porción es la porción 3' de una secuencia de codificación.
En la presente invención la célula es preferiblemente una célula de mamífero, preferiblemente una célula humana. En la presente invención, la presencia de una señal de degradación en cualquiera de los vectores es suficiente para disminuir la producción de la proteína en forma truncada.
El término señal de degradación significa una secuencia (ya sea de nucleótidos o aminoácida), que puede mediar la degradación del ARNm/proteína en el que está incluida.
El término “proteína en forma truncada” o una “proteína truncada” es una proteína que no se produce en su forma completa, ya que presenta eliminaciones que van desde uno a muchos aminoácidos (como por ejemplo de 1 a 10, 1 a 20, 1 a 50, 100, 200, etc...).
En la presente invención, una “secuencia de reconstitución” es una secuencia que permite la reconstitución de la secuencia de codificación de longitud completa con el marco correcto, permitiendo así la expresión de una proteína funcional.
El término “señal donante/aceptora de corte y empalme” se refiere a las secuencias de nucleótidos que participan en el corte y empalme del ARNm.
En la presente invención puede utilizarse cualquier secuencia de señal donante o aceptora de corte y empalme de cualquier intrón. El experto sabe cómo reconocer y seleccionar la secuencia de señal donante o aceptora de corte y empalme apropiada mediante experimentos de rutina.
En la presente invención, dos secuencias se superponen cuando al menos una parte de cada una de dichas secuencias es homóloga a la otra. Las secuencias pueden superponerse durante al menos 1, al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 200 nucleótidos.
El término “región o secuencia recombinogénica” significa una secuencia que media la recombinación entre dos secuencias diferentes. “Región o secuencia recombinogénica” y “región de homología” se utilizan en la presente indistintamente.
El término “repetición terminal” se refiere a las secuencias que se repiten en ambos extremos de una secuencia de nucleótidos.
El término “repetición terminal invertida” se refiere a las secuencias que se repiten en ambos extremos de una secuencia de nucleótidos en la orientación opuesta (complementaria inversa).
Una señal de ubiquitinación de proteínas es una señal que media la degradación de proteínas por el proteasoma.
En la presente invención, cuando una señal de degradación comprende secuencias repetidas, siendo la misma secuencia o secuencias diferentes, dichas secuencias repetidas están preferiblemente enlazadas por un enlazador de al menos 1 nucleótido.
Un codón finalizador artificial es una secuencia de nucleótidos incluida a propósito en un transcrito para inducir la terminación prematura de la traducción de una proteína.
Una secuencia potenciadora es una secuencia que aumenta la transcripción de un gen.
Las señales de degradación pueden incluir: (i) el degron corto CL1, un péptido desestabilizador C-terminal que comparte similitudes estructurales con las proteínas mal plegadas y, por tanto, es reconocido por el sistema de ubiquitinación 31, 32, (ii) la ubiquitina, cuya fusión en el N-terminal de una proteína donante media tanto la degradación directa de la proteína como la degradación a través de la vía de la regla del extremo N 33, 34 y (iii) el degron N-terminal PB29 que es un péptido de 9 aminoácidos de longitud que, de forma similar al degron CL1, se predice que se pliega en estructuras que son reconocidas por las enzimas de la vía de ubiquitinación 35. Los inventores han descubierto que la inclusión de secuencias o señales de degradación en múltiples sistemas de vectores mitiga la expresión de proteínas truncadas. En un caso, los inventores han descubierto que la inclusión de una señal de degradación CL1 da lugar a la degradación selectiva de proteínas truncadas de la mitad 5' sin afectar a la producción de proteínas de longitud completa tanto in vitro como en la retina grande del cerdo.
Además, se pueden insertar codones finalizadores artificiales para provocar la terminación temprana de un ARNm. Las secuencias objetivo de microARN (miR), los codones finalizadores artificiales o las señales de ubiquitinación de proteínas pueden aprovecharse para mediar en la degradación de productos proteicos truncados. Una secuencia de señal de degradación puede comprender secuencias repetidas, como más de una secuencia objetivo de microARN (miR), codón finalizador artificial o señal de ubiquitinación de proteínas, siendo dichas secuencias repetidas la misma secuencia o diferentes secuencias repetidas al menos dos veces; preferiblemente, las secuencias repetidas están enlazadas por un enlazador de al menos 1 nucleótido.
Entre los miR que se expresan en la retina, miR-let7b o -26a se expresan a niveles elevados 26-29, mientras que se ha demostrado que miR-204 y -124 restringen la expresión del transgén mediada por el AAV al RPE o a los fotorreceptores 30. Karali et al30 comprobaron la eficacia de los sitios objetivos de miR para modular la expresión de un gen incluido en un único vector AAV en tipos celulares específicos. En Karali et al, los sitios objetivo de miR se incluyeron en un casete de expresión canónico (que codifica el gen reportero completo), cadenas abajo de una secuencia de codificación y antes de la señal de poliadenilación (poliA). Karali et al utilizaron sitios objetivo de miR para miR-204 o miR-124 y utilizaron 4 copias en tándem de cada miR. Los miR también pueden ser imitadores de miR (Xiao, et al. J Cell Physiol 212:285-292, 2007; Wang Z Methods Mol Biol 676:211-223, 2011). Por primera vez, los inventores aplicaron estas estrategias a construcciones de vectores múltiples y lograron silenciar la expresión de proteínas truncadas generadas a partir de dichos vectores.
Durante la última década, la terapia génica se ha aplicado al tratamiento de enfermedades en cientos de ensayos clínicos. Se han desarrollado diversas herramientas para administrar genes en células humanas. Los vehículos de entrega pueden ser administrados a un paciente. Un trabajador cualificado sería capaz de determinar el intervalo de dosis adecuado. El término “administrado” incluye la entrega mediante técnicas virales o no virales. Los mecanismos de entrega no virales incluyen, entre otros, la transfección mediada por lípidos, los liposomas, los inmunoliposomas, la lipofectina, los anfífilos faciales catiónicos (AFC) y combinaciones de los mismos. Entre las formas de entrega virales, los virus modificados genéticamente, incluidos los virus adenoasociados, se encuentran actualmente entre las herramientas más populares para la entrega de genes. El concepto de entrega de genes basada en virus consiste en diseñar el virus de manera que pueda expresar el gen o genes de interés o secuencias reguladoras como promotores e intrones. Dependiendo de la aplicación específica y del tipo de virus, la mayoría de los vectores virales contienen mutaciones que dificultan su capacidad de replicarse libremente como virus de tipo salvaje en el huésped. Los virus de varias familias diferentes han sido modificados para generar vectores virales para la entrega de genes. Estos virus incluyen retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, baculovirus, picornavirus y alfavirus. La presente invención emplea virus adenoasociados. La mayoría de los sistemas contienen vectores capaces de albergar genes de interés y células auxiliares que pueden proporcionar las proteínas estructurales virales y las enzimas para permitir la generación de partículas virales infecciosas que contienen el vector. El virus adenoasociado es una familia de virus que difiere en la secuencia de nucleótidos y aminoácidos, la estructura del genoma, la patogenicidad y el intervalo del huésped. Esta diversidad ofrece la posibilidad de utilizar virus con diferentes características biológicas para desarrollar distintas aplicaciones terapéuticas. Como ocurre con cualquier herramienta de administración, la eficacia, la capacidad de dirigirse a un determinado tejido o tipo de célula, la expresión del gen de interés y la seguridad de los sistemas basados en virus adenoasociados son importantes para el éxito de la aplicación de la terapia génica. En los últimos años se han dedicado importantes esfuerzos a estas áreas de investigación. Se han realizado varias modificaciones a los vectores basados en virus adenoasociados y a las células auxiliares para alterar la expresión del gen, la entrega del objetivo, mejorar los títulos virales y aumentar la seguridad. La presente invención representa una mejora en este proceso de diseño, ya que actúa para entregar eficazmente genes de interés en dichos vectores virales.
Un vector ideal basado en el virus adenoasociado para la entrega de genes debe ser eficiente, específico para la célula, regulado y seguro. La eficiencia de la entrega es importante porque puede determinar la eficacia de la terapia. Los esfuerzos actuales se dirigen a lograr una infección y una expresión génica específicas para cada tipo de célula con vectores virales adenoasociados. Además, se están desarrollando vectores virales adenoasociados para regular la expresión del gen de interés, ya que la terapia puede requerir una expresión duradera o regulada. La seguridad es una cuestión importante para la administración de genes virales, ya que la mayoría de los virus son patógenos o tienen un potencial patógeno. Es importante que, durante la administración del gen, el paciente no reciba inadvertidamente un virus patógeno con pleno potencial de replicación.
El virus adenoasociado (AAV) es un pequeño virus que infecta a los seres humanos y a algunas otras especies de primates. Actualmente no se sabe que el AAV cause enfermedades y, por consiguiente, el virus provoca una respuesta inmunitaria muy leve. Los vectores de terapia génica que utilizan el AAV pueden infectar tanto a las células en división como a las quiescentes y persistir en un estado extracromosómico sin integrarse en el genoma de la célula huésped. Estas características hacen que el AAV sea un candidato muy interesante para crear vectores virales para la terapia génica y para la creación de modelos isogénicos de enfermedades humanas.
El AAV de tipo salvaje ha despertado un gran interés entre los investigadores de terapia génica debido a una serie de características. La principal es la aparente falta de patogenicidad del virus. Además, puede infectar células que no se dividen y tiene la capacidad de integrarse de forma estable en el genoma de la célula huésped en un lugar específico (denominado AAVS1) del cromosoma 19 humano. Esta característica lo hace algo más predecible que los retrovirus, que presentan la amenaza de una inserción aleatoria y de mutagénesis, a la que a veces sigue el desarrollo de un cáncer. El genoma del AAV se integra con mayor frecuencia en el sitio mencionado, mientras que las incorporaciones aleatorias en el genoma tienen lugar con una frecuencia insignificante. Sin embargo, el desarrollo de los AAV como vectores de terapia génica ha eliminado esta capacidad de integración al eliminar el rep y el cap del ADN del vector. El gen deseado, junto con un promotor para impulsar la transcripción del gen, se inserta entre las ITR que ayudan a la formación de concatémeros en el núcleo después de que el ADN del vector de cadena sencilla sea convertido por los complejos de ADN polimerasa de la célula huésped en ADN de cadena doble. Los vectores de terapia génica basados en AAV forman concatémeros episomales en el núcleo de la célula huésped. En las células que no se dividen, estos concatémeros permanecen intactos durante toda la vida de la célula huésped. En las células en división, el ADN del AAV se pierde con la división celular, ya que el ADN episomal no se replica junto con el ADN de la célula huésped. La integración aleatoria del ADN del AAV en el genoma del huésped es detectable, pero se produce con una frecuencia muy baja. Los AAV también presentan una inmunogenicidad muy baja, aparentemente restringida a la generación de anticuerpos neutralizantes, mientras que no inducen ninguna respuesta citotóxica claramente definida. Esta característica, junto con la capacidad de infectar células quiescentes presentan su dominio sobre los adenovirus como vectores para la terapia génica humana.
Genoma, transcriptoma y proteoma del AAV
El genoma del AAV está formado por ácido desoxirribonucleico de cadena sencilla (ADNss), de sentido positivo o negativo, que tiene una longitud de aproximadamente 4,7 kilobases. El genoma comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) en ambos extremos de la cadena de ADN, y dos marcos de lectura abiertos (ORF, por sus siglas en inglés): rep y cap. El primero está compuesto por cuatro genes superpuestos que codifican las proteínas Rep necesarias para el ciclo de vida del AAV, y el segundo contiene secuencias de nucleótidos superpuestas de las proteínas de la cápside: VP1, VP2 y VP3, que interactúan entre sí para formar una cápside de simetría icosaédrica.
Secuencias de ITR
Las secuencias de repetición terminal invertida (ITR) recibieron su nombre debido a su simetría, que se demostró necesaria para la multiplicación eficiente del genoma del AAV. Otra propiedad de estas secuencias es su capacidad para formar una horquilla, lo que contribuye a la llamada autocebado que permite la síntesis de la segunda cadena de ADN sin necesidad de cebado. También se ha demostrado que las ITR son necesarias tanto para la integración del ADN del AAV en el genoma de la célula huésped (cromosoma decimonoveno en humanos) como para su rescate, así como para la encapsidación eficiente del ADN del AAV combinada con la generación de partículas del AAV totalmente ensambladas y resistentes a la desoxirribonucleasa.
En lo que respecta a la terapia génica, las ITR parecen ser las únicas secuencias requeridas en cis junto al gen terapéutico: los genes estructurales (cap) y de empaquetamiento (rep) pueden entregarse en trans. Con este supuesto se establecieron muchos métodos para la producción eficiente de vectores AAV recombinantes (rAAV) que contienen un gen reportero o terapéutico. Sin embargo, también se publicó que las ITR no son los únicos elementos requeridos en cis para la replicación y encapsidación efectivas.
Algunos grupos de investigación han identificado una secuencia designada como elemento dependiente de la replicación en cis (CARE, por sus siglas en inglés) dentro de la secuencia de codificación del gen rep. Se ha demostrado que CARE aumenta la replicación y la encapsidación cuando está presente en cis.
Hasta 2006 se han descrito 11 serotipos del AAV, el undécimo en 2004. Todos los serotipos conocidos pueden infectar células de múltiples tipos de tejidos. La especificidad tisular viene determinada por el serotipo de la cápside y el pseudotipaje de los vectores AAV para alterar su intervalo de tropismo será probablemente importante para su uso en terapia.
Las secuencias de repetición terminal invertida (ITR) utilizadas en un sistema de vectores AAV de la presente invención pueden ser cualquier ITR del AAV. Las ITR utilizadas en un vector AAV pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, un vector puede comprender una ITR del serotipo 2 del AAV y una ITR del serotipo 5 del AAV. En una realización de un vector de la invención, una ITR es del serotipo 2, 4, 5 u 8 del AAV. En la presente invención se prefieren las ITR del serotipo 2 y del serotipo 5 del AAV. Las secuencias de la ITR de AAV son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, véase para ITR2, los números de acceso de GenBank AF043303.1 ; NC_001401.2; J01901.1 ; JN898962.1; véase para ITR5, el número de acceso de GenBank NC_006152.1).
Serotipo 2
El serotipo 2 (AAV2) ha sido el más ampliamente examinado hasta ahora. El AAV2 presenta un tropismo natural hacia los músculos esqueléticos, las neuronas, las células musculares lisas vasculares y los hepatocitos.
Se han descrito tres receptores celulares para el AAV2: el proteoglicano de heparán sulfato (HSPG, por sus siglas en inglés), la integrina avp5 y el receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR-1, por sus siglas en inglés). El primero funciona como receptor primario, mientras que los dos últimos tienen una actividad de correceptor y permiten que el AAV entre en la célula por endocitosis mediada por el receptor. Los resultados de este estudio han sido cuestionados por Qiu, Handa, et al. El HSPG funciona como receptor primario, aunque su abundancia en la matriz extracelular puede eliminar las partículas del AAV y perjudicar la eficacia de la infección.
Serotipo 2 y cáncer
Los estudios han demostrado que el serotipo 2 del virus (AAV-2) aparentemente mata las células cancerosas sin dañar las sanas. “Nuestros resultados sugieren que el virus adenoasociado de tipo 2, que infecta a la mayoría de la población, pero no tiene efectos nocivos conocidos, mata múltiples tipos de células cancerosas y, sin embargo, no tiene ningún efecto sobre las células sanas”, afirma Craig Meyers, profesor de inmunología y microbiología del Penn State College of Medicine de Pensilvania. Esto podría conducir a un nuevo agente anticancerígeno.
Otros serotipos
Aunque el AAV2 es el serotipo más popular en diversas investigaciones basadas en el AAV, se ha demostrado que otros serotipos pueden ser más eficaces como vectores de administración de genes. Por ejemplo, el AAV6 parece ser mucho mejor para infectar las células epiteliales de las vías respiratorias, el AAV7 presenta una tasa de transducción muy alta de las células musculares esqueléticas murinas (similar a la del AAV1 y el AAV5), el AAV8 es excelente para transducir los hepatocitos y los fotorreceptores y el AAV1 y el 5 demostraron ser muy eficientes en la entrega de genes a las células endoteliales vasculares. En el cerebro, la mayoría de los serotipos de AAV muestran tropismo neuronal, mientras que el AAV5 también transduce astrocitos. El AAV6, un híbrido del AAV1 y AAV2, también muestra una menor inmunogenicidad que el AAV2.
Los serotipos pueden diferir con respecto a los receptores a los que se unen. Por ejemplo, la transducción del AAV4 y AAV5 puede ser inhibida por ácidos siálicos solubles (de forma diferente para cada uno de estos serotipos), y se demostró que el AAV5 entra en las células a través del receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas. La invención en cuestión también se refiere a un sistema de vector viral que comprende un polinucleótido, un constructo de expresión o un constructo del vector de la invención. En una realización, el sistema de vectores virales es un sistema AAV. Los métodos para preparar virus y viriones que comprenden un polinucleótido o constructo heterólogo son conocidos en la técnica. En el caso del AAV, las células pueden coinfectarse o transfectarse con adenovirus o construcciones de polinucleótidos que comprenden genes de adenovirus adecuados para la función de ayudante del AAV. Los ejemplos de materiales y métodos se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses núm. 8,137,962 y 6,967,018. Un virus AAV o vector AAV de la invención puede ser de cualquier serotipo AAV, incluyendo, pero sin limitarse al, serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 y AAV11. En una realización específica, se utiliza un serotipo AAV2 o un AAV5 o un AAV7 o un AAV8 o un AAV9. En una realización, el serotipo AAV proporciona una o más mutaciones de tirosina a fenilalanina (Y-F) en la superficie de la cápside. En una realización específica, el AAV es un serotipo AAV8 que tiene una mutación de tirosina a fenilalanina en la posición 733 (Y733F).
La entrega de uno o más genes terapéuticos o secuencias reguladoras tales como promotores o intrones por un sistema de vectores de acuerdo con la presente invención puede utilizarse solo o en combinación con otros tratamientos o componentes del tratamiento.
La invención en cuestión también se refiere a una célula huésped que comprende el sistema de constructo o el sistema de vector viral de la invención. La célula huésped puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un humano. La célula huésped puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células huésped adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, células Dh5a, células E. coli, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. La célula puede ser una célula humana o de otro animal. En una realización, la célula es una célula fotorreceptora o una célula RPE. En una realización específica, la célula es una célula cono. La célula también puede ser una célula muscular, en particular una célula muscular esquelética, una célula pulmonar, una célula pancreática, una célula hepática, una célula renal, una célula intestinal, una célula sanguínea. En una realización específica, la célula es una célula cono o célula bastón humana. La selección de un huésped apropiado se considera dentro del ámbito de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. Preferiblemente, dicha célula huésped es una célula animal, y más preferiblemente una célula humana. La célula puede expresar una secuencia de nucleótidos proporcionada en el sistema de vector viral de la invención.
El experto en la técnica conoce bien los métodos estándar para la incorporación de un polinucleótido o vector en una célula huésped, por ejemplo, la transfección, la lipofección, la electroporación, la microinyección, la infección viral, el choque térmico, la transformación tras la permeabilización química de la membrana o la fusión celular. El sistema de constructo o vector de la invención también puede introducirse in vivo como ADN desnudo utilizando métodos conocidos en la técnica, como la transfección, microinyección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio y por métodos biolísticos.
Tal como se utiliza en la presente, el término “célula huésped o célula huésped modificada genéticamente” se refiere a las células huésped que han sido transducidas, transformadas o transfectadas con el sistema de constructo o con el sistema de vectores virales de la invención
Tal como se utiliza en la presente, los términos “ácido nucleico” y “secuencia de polinucleótidos” y “constructo” se refieren a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico en forma de cadena sencilla o doble.
La invención en cuestión también se refiere a un sistema constructo que puede incluir elementos reguladores que son funcionales en la célula huésped prevista en la que se va a expresar el constructo. Una persona con conocimientos ordinarios de la técnica puede seleccionar elementos reguladores para su uso en células huésped apropiadas, por ejemplo, células huésped de mamífero o humanas. Los elementos reguladores incluyen, por ejemplo, promotores, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias de terminación de la traducción, potenciadores, péptidos señal, señales de degradación y elementos de poliadenilación. Un constructo de la invención puede comprender una secuencia promotora enlazada de forma operable a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido deseado.
Los promotores contemplados para su uso en la invención en cuestión incluyen, entre otros, los promotores de genes nativos, el promotor del citomegalovirus (CMV) (KF853603. 1, pb 149-735), el promotor quimérico de CMV/beta-actina de pollo (CBA) y la forma truncada del promotor CBA (smCBA) (US8298818 y Light-Driven Cone Arrestin Translocation in Cones of Postnatal Guanylate Cyclase-1 Knockout Mouse Retina Treated with AAVGC1), promotor de la rodopsina (NG_009115, pb 4205-5010), promotor de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (NG_029718. 1, pb 4777­ 5011), promotor de la distrofia macular viteliforme 2 (NG_009033.1, pb 4870-5470), receptor cinasa 1 acoplado a proteína G humano específico del PR (hGRK1; AY327580.1 pb1793-2087 o pb 1793-1991) (Haire et al. 2006; patente estadounidense núm. 8,298,818). Sin embargo, puede utilizarse cualquier promotor adecuado conocido en la técnica. En una realización específica, el promotor es un promotor CMV o hGRK1. En una realización, el promotor es un promotor específico de tejido que muestra actividad selectiva en uno o un grupo de tejidos, pero es menos activo o no activo en otros tejidos. En una realización, el promotor es un promotor específico del fotorreceptor. En otra realización, el promotor es un promotor específico de la célula cono y/o de la célula bastón.
Los promotores preferidos son los de CMV, GRK1, CBA e IRBP. Otros promotores preferidos son los promotores híbridos que combinan elementos reguladores de varios promotores (como por ejemplo el promotor quimérico CBA que combina un potenciador del promotor CMV, el promotor CBA y el intrón quimérico Sv40, en la presente llamado promotor híbrido CBA.
Los promotores pueden incorporarse a un constructo utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. Pueden utilizarse múltiples copias de promotores o múltiples promotores en un vector de la invención. En una realización, el promotor puede situarse aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción como lo es del sitio de inicio de la transcripción en su entorno genético natural. Se permite alguna variación en esta distancia sin que se produzca una disminución sustancial de la actividad del promotor. En el sistema de la invención, un sitio de inicio de transcripción se incluye normalmente en el constructo 5' pero no en el constructo 3'. En otra realización, se puede incluir un sitio de inicio de la transcripción en el constructo 3' cadena arriba de la señal de degradación.
Un constructo de la invención puede contener opcionalmente una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia de terminación de la traducción, una secuencia de péptido señal, sitios de entrada al ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés), elementos potenciadores y/o elementos reguladores postranscripcionales como el elemento regulador postranscripcional (WPRE, por sus siglas en inglés) del virus de la hepatitis de Woodchuck (WHV, por sus siglas en inglés). Las regiones de terminación de la transcripción pueden obtenerse normalmente de la región 3' no traducida de una secuencia genética eucariótica o viral. Las secuencias de terminación de la transcripción pueden situarse cadena abajo de una secuencia de codificación para permitir una terminación eficaz. En el sistema de la invención se incluye normalmente un sitio de terminación de la transcripción en el constructo 3' pero no en el constructo 5'.
La secuencia del péptido señal es una secuencia aminoterminal que codifica la información responsable de la reubicación de un polipéptido enlazado de forma operativa a una amplia gama de destinos celulares postraduccionales, que van desde un compartimento orgánico específico hasta los sitios de acción de la proteína y el entorno extracelular. Los potenciadores son elementos de acción cis que aumentan la transcripción de los genes y también pueden incluirse en un vector. Los elementos potenciadores son conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limiten al, elemento potenciador CaMV 35S, el elemento potenciador del promotor temprano del citomegalovirus (CMV) y el elemento potenciador SV40. También pueden incluirse en un vector secuencias de ADN que dirigen la poliadenilación del ARNm codificado por el gen estructural. Preferiblemente, en la presente invención, la secuencia de codificación se divide en un primer y un segundo fragmento o porción (porción del extremo 5' y porción del extremo 3') en una unión natural exón-exón. Preferiblemente, cada fragmento o porción de la secuencia de codificación no debe superar un tamaño de 60 kb, preferiblemente cada fragmento o porción de la secuencia de codificación no debe superar un tamaño de 50 Kb, 40 Kb, 30 Kb, 20 Kb, 10 Kb. Preferiblemente, cada fragmento o porción de la secuencia de codificación puede tener un tamaño de aproximadamente 2Kb, 2,5Kb, 3Kb, 3,5Kb, 4Kb, 4,5Kb, 5Kb, 5,5 Kb, 6Kb, 6,5 Kb, 7kb, 7,5 Kb, 8 Kb, 8,5 Kb, 9Kb, 9,5 Kb o un tamaño menor.
Los intrones espliceosomales suelen residir dentro de la secuencia de los genes eucariotas codificadores de proteínas. Dentro del intrón, se requiere un sitio donante (extremo 5' del intrón), un sitio de ramificación (cerca del extremo 3' del intrón) y un sitio aceptor (extremo 3' del intrón) para el corte y empalme. El sitio donante de corte y empalme incluye una secuencia GU casi invariable en el extremo 5' del intrón, dentro de una región más grande y menos conservada. El sitio aceptor de corte y empalme en el extremo 3' del intrón termina el intrón con una secuencia AG casi invariable. Cadena arriba (5'-hacia delante) del AG hay una región rica en pirimidinas (C y U), o tracto de polipirimidina. Cadena arriba del tracto de polipirimidina se encuentra el punto de ramificación, que incluye un nucleótido de adenina. La señal aceptora de corte y empalme y la señal donante de corte y empalme también pueden ser elegidas por el experto en la técnica entre secuencias conocidas en la técnica.
Las señales que median la degradación de las proteínas y que nunca se han utilizado antes en el contexto de un sistema viral múltiple incluyen, pero no se limitan a: degrones cortos como CL1, CL2, CL6, CL9, CL10, CL11, CL12, CL15, CL16, SL17, un péptido desestabilizador C-terminal que comparte similitudes estructurales con las proteínas mal plegadas y, por lo tanto, es reconocido por el sistema de ubiquitinación, la ubiquitina, cuya fusión en el N-terminal de una proteína donante media tanto la degradación directa de la proteína como la degradación a través de la vía de la regla N-terminal, el degron N-terminal PB29 que es un péptido de 9 aminoácidos de longitud que, de forma similar al degron CL1, se predice que se pliega en estructuras que son reconocidas por las enzimas de la vía de ubiquitinación, codones finalizadores artificiales que causan la terminación temprana de un ARNm, secuencias objetivo de microARN (miR).
Como los expertos en la técnica pueden apreciar fácilmente, puede haber un número de secuencias variantes de una proteína que se encuentran en la naturaleza, además de aquellas variantes que pueden ser creadas artificialmente por el experto en el laboratorio. La divulgación incluye además secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos divulgados en la presente. Estas secuencias de nucleótidos pueden ser construidas fácilmente por los expertos en la técnica que conozcan las secuencias de proteínas y aminoácidos que se divulgan en la presente. Como puede apreciar un experto en la técnica, la degeneración del código genético permite al experto construir una variedad de secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido o proteína particular. La elección de una secuencia de nucleótidos particular podría depender, por ejemplo, del uso de codones de un sistema de expresión o célula huésped particular. Por ejemplo, los aminoácidos no naturales pueden ser sustituidos por los aminoácidos de un polipéptido siempre que el polipéptido que tenga aminoácidos sustituidos conserve sustancialmente la misma actividad que el polipéptido en el que los aminoácidos no han sido sustituidos. Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, ornitina, citrulina, hidroxiprolina, homoserina, fenilglicina, taurina, yodotirosina, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-amino butírico, ácido Y-amino butírico, ácido £-amino hexanoico, ácido 6-amino hexanoico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, norleucina, norvalina, sarcosina, homocitrulina, ácido cisteico, T-butilglicina, T-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos de diseño como los pmetilaminoácidos, C-metilaminoácidos, N-metilaminoácidos y los análogos de los aminoácidos en general. Los aminoácidos no naturales también incluyen aminoácidos con grupos laterales derivados. Además, cualquiera de los aminoácidos de la proteína puede tener la forma D (dextrorotaria) o L (levorotaria). Los aminoácidos pueden clasificarse generalmente en las siguientes clases: no polares, polares sin carga, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las que un polipéptido que tiene un aminoácido de una clase se sustituye por otro aminoácido de la misma clase se divulgan en la presente siempre que el polipéptido que tiene la sustitución siga conservando sustancialmente la misma actividad biológica que un polipéptido que no tiene la sustitución. La tabla 1 proporciona un listado de ejemplos de aminoácidos pertenecientes a cada clase.
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Los polinucleótidos descritos en la presente también pueden definirse en términos de intervalos de identidad y/o similitud más particulares con los ejemplificados en la presente. La identidad de secuencia será normalmente mayor que el 60 %, preferiblemente mayor que el 75 %, más preferiblemente mayor que el 80 %, incluso más preferiblemente mayor que el 90 %, y puede ser mayor que el 95 %. La identidad y/o similitud de una secuencia puede ser 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 % o mayor en comparación con una secuencia ejemplificada en la presente. A menos que se especifique lo contrario, tal y como se utiliza en la presente el porcentaje de identidad de secuencia y/o la similitud de dos secuencias puede determinarse utilizando el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), modificado como en Karlin y Altschul (1993). Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLa St y XBLAST de Altschul et al. (1990). Las búsquedas BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias con el porcentaje de identidad de secuencia deseado. Para obtener alineaciones separadas con fines de comparación, se puede utilizar el programa Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997). Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (NBLAST y XBLAST). Véase el sitio web del NCBI/N1H.
La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden el sistema de vectores o el sistema de vectores virales o las células huésped de la invención, opcionalmente en combinación con un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse teniendo en cuenta la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica habitual. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, como portador, excipiente o diluyente, o además de ellos, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente de solubilización y otros agentes portadores que puedan ayudar o aumentar la entrada del virus en el sitio objetivo (como, por ejemplo, un sistema de administración de lípidos). El constructo o vector puede administrarse in vivo o ex vivo.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica o parenteral, que comprenden una cantidad de un compuesto, constituyen una realización preferida de la invención. Para la administración parenteral, las composiciones pueden utilizarse mejor en forma de solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o monosacáridos para que la solución sea isotónica con la sangre. La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a la retina preferiblemente a través de la inyección subretiniana o también puede prepararse en forma de suspensión inyectable, loción ocular o pomada oftálmica que puede administrarse a la retina con un procedimiento no invasivo.
La dosis administrada a un paciente, en particular a un ser humano, en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para lograr una respuesta terapéutica en el paciente durante un periodo de tiempo razonable, sin toxicidad letal, y preferiblemente sin causar más que un nivel aceptable de efectos secundarios o morbilidad. Un experto en la técnica reconocerá que la dosis dependerá de una serie de factores que incluyen la condición (salud) del sujeto, el peso corporal del sujeto, el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento, la proporción terapéutica, así como la gravedad y la etapa de la condición patológica.
Los métodos descritos en la presente pueden utilizarse con seres humanos y otros animales. En la presente, los términos “paciente” y “sujeto” se utilizan indistintamente y pretenden incluir dichas especies humanas y no humanas. Asimismo, los métodos in vitro pueden llevarse a cabo en células de dichas especies humanas y no humanas.
La divulgación también se refiere a kits que comprenden el sistema de constructo o el sistema de vectores virales o las células huésped de la invención en uno o más contenedores. Los kits pueden incluir opcionalmente portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. En una realización, un kit incluye uno o más componentes, complementos o adyuvantes como se describe en la presente. En una realización, un kit incluye instrucciones o materiales de envasado que describen cómo administrar un sistema vectorial del kit. Los contenedores del kit pueden ser de cualquier material adecuado, por ejemplo, vidrio, plástico, metal, etc., y de cualquier tamaño, forma o configuración adecuados. En una realización, el sistema de constructo o el sistema de vector viral o las células huésped de la invención se proporcionan en el kit como un sólido. En otra realización, el sistema de constructo o el sistema de vectores virales o las células huésped de la invención se proporcionan en el kit como un líquido o solución. En una realización, el kit comprende una ampolla o jeringa que contiene el sistema de constructo o el sistema de vectores virales o las células huésped de la invención en forma líquida o de solución.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para tratar a un individuo mediante terapia génica, en donde la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del sistema de constructo o sistema de vector viral o célula huésped de la presente invención que comprende uno o más transgenes terapéuticos y/o de diagnóstico entregables o una partícula viral producida u obtenida a partir del mismo. La composición farmacéutica puede ser para uso humano o animal. Normalmente, un clínico experto determinará la dosis real que será más adecuada para un sujeto individual y variará con la edad, el peso y la respuesta del individuo particular y la vía de administración. Se espera que un intervalo de dosis entre 1x10e10 y 1*10e15 copias del genoma de cada vector/kg, preferiblemente entre 1x10e11 y 1x10e13 copias del genoma de cada vector/kg sea eficaz en humanos. Se espera que un intervalo de dosis entre 1x10e10 y 1x10e15 copias del genoma de cada vector/ojo, preferiblemente entre 1x10e1o y 1x10e13 sea eficaz para la administración ocular.
Los regímenes de dosificación y las cantidades efectivas que deben administrarse pueden ser determinados por clínicos normalmente capacitados. La administración puede ser en forma de dosis única o de dosis múltiples. Los métodos generales para realizar la terapia génica utilizando polinucleótidos, construcciones de expresión y vectores son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Gene Therapy: Principles and Applications, Springer Verlag 1999; y la patente estadounidense no. 6,461 ,606; 6,204,251 y 6,106,826). La divulgación también se refiere a métodos para expresar un polipéptido seleccionado en una célula. En una realización, el método comprende incorporar en la célula el sistema de vectores de la invención que comprende secuencias de polinucleótidos que codifican el polipéptido seleccionado y expresar las secuencias de polinucleótidos en la célula. El polipéptido seleccionado puede ser uno que sea heterólogo para la célula. En una realización, la célula es una célula de mamífero. En una realización, el sujeto es una célula humana. En una realización, la célula es una célula fotorreceptora o una célula RPE. La célula también puede ser una célula muscular, en particular una célula muscular esquelética, una célula pulmonar, una célula pancreática, una célula hepática, una célula renal, una célula intestinal, una célula sanguínea. En una realización específica, la célula es una célula cono o una célula bastón. En una realización específica, la célula es una célula cono o célula bastón humana.
Secuencias
AP1 (SEQ ID No. 24)
AP2 (SEQ ID No. 25)
AK seqA (SEQ ID No. 22)
AK seqB (SEQ ID No. 23)
AP (SEQ ID No. 26)
ITR2 izquierda (SEQ ID No. 29)
ITR2 derecha (SEQ ID No. 30)
ITR5 izquierda (SEQ ID No. 31)
ITR5 derecha (SEQ ID No. 32)
CMV
Potenciador de CMV (SEQ ID No. 33)
Promotor de CMV (SEQ ID No. 34)
Intrón quimérico (intrón del SV40) (SEQ ID No. 35)
Promotor de hGRKI (SEQ ID No. 36)
Promotor híbrido de CBA
Potenciador de CMV (SEQ ID No. 37)
Promotor de CBA (SEQ ID No. 38)
IRBP (SEQ ID No. 39)
Señal donante de corte y empalme (SEQ ID No. 27)
Señal de degradación de miR-let 7b (SEQ ID No. 40)
Señal de degradación de 4xmiR-let 7b (SEQ ID No. 41)
Señal de degradación de miR-26a (SEQ ID No. 13)
Señal de degradación de 4xmiR-26a (SEQ ID No. 18)
Señal de degradación de miR-204 (SEQ ID No. 11)
Señal de degradación de miR-124 (SEQ ID No. 12)
Señal de degradación de 3xmiR-204+ 3xmiR-124 (SEQ ID No. 17)
Señal de degradación de CL1 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 16)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 1)
Señal de degradación de CL2 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 42)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 2)
Señal de degradación de CL6 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 43)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 3)
Señal de degradación de CL9 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 44)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 4)
Señal de degradación de CL10 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 45)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 5)
Señal de degradación de CL11 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 46)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 6)
Señal de degradación de CL12 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 47)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 7)
Señal de degradación de CL15 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 48)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 8)
Señal de degradación de CL16 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 49)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 9)
Señal de degradación de SL17 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 50)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 10)
Señal de degradación de PB29 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 19)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 15)
Señal corta de degradación de PB29 (degron)
Secuencia de nucleótidos: (SEQ ID No. 20)
Secuencia de aminoácidos: (SEQ ID No. 14)
Señal de degradación de 3x PB29 (degron) (SEQ ID No. 21)
Codones finalizadores artificiales (SEQ ID No. 51)
Señal aceptora de corte y empalme (SEQ ID No. 28)
Poli A SV40 (SEQ ID No. 52)
ABCA4 5' (SEQ ID No. 53)
Secuencia de longitud completa de hGRK1-5' ABCA4+AK+CL1 (SEQ ID No. 54) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCC GGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTtgtagt taatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcttcaatattggccattagccatattattcattggttatat agcataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgcc atgttggcangattattgactagtgggccccagaagcctggtggttgtttgtccttctcaggggaaaagtgaggcggccccttgg aggaaggggccgggcagaatgatctaatcggattccaagcagctcaggggattgtctttttctagcaccttcttgccactcctaa gcgtcctccgtgaccccggctgggatttagcctggtgctgtgtcagccccgggctcccaggggcttcccagtggtccccaggaacc ctcgacagggccagggcgtctctctcgtccagcaagggcagggacgggccacaggcaagggcgcggccgccatgggcttcgtg agacagatacagcttttgctctggaagaactggaccctgcggaaaaggcaaaagattcgctttgtggtggaactcgtgtggcctttatct ttatttctggtcttgatctggttaaggaatgccaacccgctctacagccatcatgaatgccatttccccaacaaggcgatgccctcagcag gaatgctgccgtggctccaggggatcttctgcaatgtgaacaatccctgttttcaaagccccaccccaggagaatctcctggaattgtgtc aaactataacaactccatcttggcaagggtatatcgagattttcaagaactcctcatgaatgcaccagagagccagcaccttggccgtat ttggacagagctacacatcttgtcccaattcatggacaccctccggactcacccggagagaattgcaggaagaggaattcgaataagg gatatcttgaaagatgaagaaacactgacactatttctcattaaaaacatcggcctgtctgactcagtggtctaccttctgatcaactctc aagtccgtccagagcagttcgctcatggagtcccggacctggcgctgaaggacatcgcctgcagcgaggccctcctggagcgcttcatc atcttcagccagagacgcggggcaaagacggtgcgctatgccctgtgctccctctcccagggcaccctacagtggatagaagacactct gtatgccaacgtggacttcttcaagctcttccgtgtgcttcccacactcctagacagccgttctcaaggtatcaatctgagatcttggggag gaatattatctgatatgtcaccaagaattcaagagtttatccatcggccgagtatgcaggacttgctgtgggtgaccaggcccctcatgc agaatggtggtccagagacctttacaaagctgatgggcatcctgtctgacctcctgtgtggctaccccgagggaggtggctctcgggtgc tctccttcaactggtatgaagacaataactataaggcctttctggggattgactccacaaggaaggatcctatctattcttatgacagaag aacaacatccttttgtaatgcattgatccagagcctggagtcaaatcctttaaccaaaatcgcttggagggcggcaaagcctttgctgat gggaaaaatcctgtacactcctgattcacctgcagcacgaaggatactgaagaatgccaactcaacttttgaagaactggaacacgtta ggaagttggtcaaagcctgggaagaagtagggccccagatctggtacttctttgacaacagcacacagatgaacatgatcagagatac cctggggaacccaacagtaaaagactttttgaataggcagcttggtgaagaaggtattactgctgaagccatcctaaacttcctctacaa gggccctcgggaaagccaggctgacgacatggccaacttcgactggagggacatatttaacatcactgatcgcaccctccgccttgtca atcaatacctggagtgcttggtcctggataagtttgaaagctacaatgatgaaactcagctcacccaacgtgccctctctctactggagg aaaacatgttctgggccggagtggtattccctgacatgtatccctggaccagctctctaccaccccacgtgaagtataagatccgaatgg acatagacgtggtggagaaaaccaataagattaaagacaggtattgggattctggtcccagagctgatcccgtggaagatttccggtac atctggggcgggtttgcctatctgcaggacatggttgaacaggggatcacaaggagccaggtgcaggcggaggctccagttggaatct acctccagcagatgccctacccctgcttcgtggacgattctttcatgatcatcctgaaccgctgtttccctatcttcatggtgctggcatgga tctactctgtctccatgactgtgaagagcatcgtcttggagaaggagttgcgactgaaggagaccttgaaaaatcagggtgtctccaatg cagtgatttggtgtacctggttcctggacagcttctccatcatgtcgatgagcatcttcctcctgacgatattcatcatgcatggaagaatc ctacattacagcgacccattcatcctcttcctgttcttgttggctttctccactgccaccatcatgctgtgctttctgctcagcaccttcttctc caaggccagtctggcagcagcctgtagtggtgtcatctatttcaccctctacctgccacacatcctgtgcttcgcctggcaggaccgcatg accgctgagctgaagaaggctgtgagcttactgtctccggtggcatttggatttggcactgagtacctggttcgctttgaagagcaaggc ctggggctgcagtggagcaacatcgggaacagtcccacggaaggggacgaattcagcttcctgctgtccatgcagatgatgctccttga tgctgctgtctatggcttactcgcttggtaccttgatcaggtgtttccaggagactatggaaccccacttccttggtactttcttctacaaga gtcgtattggcttggcggtgaagggtgttcaaccagagaagaaagagccctggaaaagaccgagcccctaacagaggaaacggagg atccagagcacccagaaggaatacacgactccttctttgaacgtgagcatccagggtgggttcctggggtatgcgtgaagaatctggta aagatttttgagccctgtggccggccagctgtggaccgtctgaacatcaccttctacgagaaccagatcaccgcattcctgggccacaat ggagctgggaaaaccaccaccttgtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacag agaagactcttgcgtttctGGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAAT TTAACGCGAATTTTAACAAAATattaacgtttataatttcaggtggcatctttcccqccfqcqqqqqcfqqffcqqcqqccfqq qccqctfcqtqqtccqccfqcaattgAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTC GCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGC GAGCGAGCGCGCAG
Leyenda:
ITR: mayúsculas en negritas
Promotor de hGRK: minúsculas en negritas y cursiva
ABCA45': minúsculas en subrayado
SDS: minúsculas en negritas
AK: mayúsculas
CL1: minúsculas en cursiva y subrayado
ABCA4_3' (SEQ ID No. 55)
Secuencia de longitud completa de ABCA4-5'+AK_SV40 (SEQ ID No. 56) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCC GGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTggatcc G GG ATTTTTCCG ATTT CGG CCT ATT G GTT AAAAAAT G AG CT G ATTT AAC AAAAATTT AACG CG AATTTT A ACAAAATattaacgtttataatttcaggtggcatctttcgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacagg tccatcctgacgggtctgttgccaccaacctctgggactgtgctcgttgggggaagggacattgaaaccagcctggatgcagtccggcag agccttggcatgtgtccacagcacaacatcctgttccaccacctcacggtggctgagcacatgctgttctatgcccagctgaaaggaaag tcccaggaggaggcccagctggagatggaagccatgttggaggacacaggcctccaccacaagcggaatgaagaggctcaggaccta tcaggtggcatgcagagaaagctgtcggttgccattgcctttgtgggagatgccaaggtggtgattctggacgaacccacctctggggtg gacccttactcgagacgctcaatctgggatctgctcctgaagtatcgctcaggcagaaccatcatcatgtccactcaccacatggacgag gccgacctccttggggaccgcattgccatcattgcccagggaaggctctactgctcaggcaccccactcttcctgaagaactgctttggca caggcttgtacttaaccttggtgcgcaagatgaaaaacatccagagccaaaggaaaggcagtgaggggacctgcagctgctcgtctaa gggtttctccaccacgtgtccagcccacgtcgatgacctaactccagaacaagtcctggatggggatgtaaatgagctgatggatgtagt tctccaccatgttccagaggcaaagctggtggagtgcattggtcaagaacttatcttccttcttccaaataagaacttcaagcacagagc atatgccagccttttcagagagctggaggagacgctggctgaccttggtctcagcagttttggaatttctgacactcccctggaagagatt tttctgaaggtcacggaggattctgattcaggacctctgtttgcgggtggcgctcagcagaaaagagaaaacgtcaacccccgacaccc ctgcttgggtcccagagagaaggctggacagacaccccaggactccaatgtctgctccccaggggcgccggctgctcacccagagggc cagcctcccccagagccagagtgcccaggcccgcagctcaacacggggacacagctggtcctccagcatgtgcaggcgctgctggtca agagattccaacacaccatccgcagccacaaggacttcctggcgcagatcgtgctcccggctacctttgtgtttttggctctgatgctttct attgttatccctccttttggcgaataccccgctttgacccttcacccctggatatatgggcagcagtacaccttcttcagcatggatgaacc aggcagtgagcagttcacggtacttgcagacgtcctcctgaataagccaggctttggcaaccgctgcctgaaggaagggtggcttccgg agtacccctgtggcaactcaacaccctggaagactccttctgtgtccccaaacatcacccagctgttccagaagcagaaatggacacag gtcaacccttcaccatcctgcaggtgcagcaccagggagaagctcaccatgctgccagagtgccccgagggtgccgggggcctcccgc ccccccagagaacacagcgcagcacggaaattctacaagacctgacggacaggaacatctccgacttcttggtaaaaacgtatcctgc tcttataagaagcagcttaaagagcaaattctgggtcaatgaacagaggtatggaggaatttccattggaggaaagctcccagtcgtcc ccatcacgggggaagcacttgttgggtttttaagcgaccttggccggatcatgaatgtgagcgggggccctatcactagagaggcctcta aagaaatacctgatttccttaaacatctagaaactgaagacaacattaaggtgtggtttaataacaaaggctggcatgccctggtcagct ttctcaatgtggcccacaacgccatcttacgggccagcctgcctaaggacagaagccccgaggagtatggaatcaccgtcattagccaa cccctgaacctgaccaaggagcagctctcagagattacagtgctgaccacttcagtggatgctgtggttgccatctgcgtgattttctcca tgtccttcgtcccagccagctttgtcctttatttgatccaggagcgggtgaacaaatccaagcacctccagtttatcagtggagtgagccc caccacctactgggtaaccaacttcctctgggacatcatgaattattccgtgagtgctgggctggtggtgggcatcttcatcgggtttcag aagaaagcctacacttctccagaaaaccttcctgcccttgtggcactgctcctgctgtatggatgggcggtcattcccatgatgtacccag catccttcctgtttgatgtccccagcacagcctatgtggctttatcttgtgctaatctgttcatcggcatcaacagcagtgctattaccttcat cttggaattatttgagaataaccggacgctgctcaggttcaacgccgtgctgaggaagctgctcattgtcttcccccacttctgcctgggc cggggcctcattgaccttgcactgagccaggctgtgacagatgtctatgcccggtttggtgaggagcactctgcaaatccgttccactgg gacctgattgggaagaacctgtttgccatggtggtggaaggggtggtgtacttcctcctgaccctgctggtccagcgccacttcttcctctc ccaatggattgccgagcccactaaggagcccattgttgatgaagatgatgatgtggctgaagaaagacaaagaattattactggtgga aataaaactgacatcttaaggctacatgaactaaccaagatttatccaggcacctccagcccagcagtggacaggctgtgtgtcggagt tcgccctggagagtgctttggcctcctgggagtgaatggtgccggcaaaacaaccacattcaagatgctcactggggacaccacagtga cctcaggggatgccaccgtagcaggcaagagtattttaaccaatatttctgaagtccatcaaaatatgggctactgtcctcagtttgatgc aatcgatgagctgctcacaggacgagaacatctttacctttatgcccggcttcgaggtgtaccagcagaagaaatcgaaaaggttgcaa actggagtattaagagcctgggcctgactgtctacgccgactgcctggctggcacgtacagtgggggcaacaagcggaaactctccaca gccatcgcactcattggctgcccaccgctggtgctgctggatgagcccaccacagggatggacccccaggcacgccgcatgctgtggaa cgtcatcgtgagcatcatcagagaagggagggctgtggtcctcacatcccacagcatggaagaatgtgaggcactgtgtacccggctgg ccatcatggtaaagggcgcctttcgatgtatgggcaccattcagcatctcaagtccaaatttggagatggctatatcgtcacaatgaaga tcaaatccccgaaggacgacctgcttcctgacctgaaccctgtggagcagttcttccaggggaacttcccaggcagtgtgcagagggag aggcactacaacatgctccagttccaggtctcctcctcctccctggcgaggatcttccagctcctcctctcccacaaggacagcctgctca tcgaggagtactcagtcacacagaccacactggaccaggtgtttgtaaattttgctaaacagcagactgaaagtcatgacctccctctgc accctcgagctgctggagccagtcgacaagcccaggactgagcggccgcffcqqqcqqqcqfqqtaqqqfqcqffqqfqqqfttqq acaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagct gcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagatgtgggaggttttttaaagcaagt qqqqccfcfocqqqfgfggfqqqqfcgqfqqggqfcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaac tacaAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGG CGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
Leyenda:
ITR: mayúsculas en negritas y subrayado
AK: mayúsculas
SAS: minúsculas en negritas
ABCA4 3': minúsculas en subrayado
SV40 poliA: minúsculas negritas cursivas
Secuencia de longitud completa de CMV 5' ABCA4-SD-AK (SEQ ID No. 57) Secuencia de longitud completa de AK-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 (SEQ ID No. 58). Secuencia de longitud completa de CMV 5' ABCA4-SD-AP1 (SEQ ID No. 59) Secuencia de longitud completa de AP1-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 (SEQ ID No. 60) Secuencia de longitud completa de CMV 5' ABCA4-SD-AP2 (SEQ ID No. 61) Secuencia de longitud completa de AP2-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 (SEQ ID No. 62) Secuencia de longitud completa de CMV 5' ABCA4-SD-AP (SEQ ID No. 63) Secuencia de longitud completa de AP-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 (SEQ ID No. 64) Secuencia de longitud completa de hGRKI 5' ABCA4-SD-AP1 (SEQ ID No. 65) Secuencia de longitud completa de GRK1 5' ABCA4-SD-AP2 (SEQ ID No. 66) Secuencia de longitud completa de ITR5-CMV 5' ABCA4-SD-AK-ITR2 (SEQ ID No. 67) Secuencia de longitud completa de ITR2-AK-SA-3' ABCA4-SV40-ITR5 (SEQ ID No. 68) Secuencia de longitud completa de ITR5-CBA 5' MYO7A-SD-AK-ITR2 (SEQ ID No. 69)
Secuencia de longitud completa de ITR2-AK-SA-3' MYO7A-HA-BGH-ITR5 (SEQ ID No. 70)
Secuencia de longitud completa de CMV 5' ABCA4-3XFLAG-SD-AK-4xmiR26a (SEQ ID No. 71)
Secuencia de longitud completa de CMV 5' ABCA4-3XFLAG-SD-AK-3xmiR204+3xmir124 (SeQ ID No.72) Secuencia de longitud completa de CMV 5' ABCA4-3XFLAG-SD-AK-CL1 (SEQ ID No. 73)
Secuencia de longitud completa de AK-STOP-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 (SEQ ID No. 74)
Secuencia de longitud completa de AK-PB29-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 (SEQ ID No. 75)
Secuencia de longitud completa de AK-3XPB29-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 (SEQ ID No. 76)
Secuencia de longitud completa de AK-UBIQUITIN-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 (SEQ ID No. 77).
La presente invención se ilustrará ahora por medio de ejemplos no limitativos en referencia a los siguientes dibujos.
Figura 1. Representación esquemática de las estrategias de vectores múltiples de los ejemplos de la presente invención.
ITR: repeticiones terminales invertidas; Prom: promotor; CDS, secuencia de codificación; SD, señal donante de corte y empalme; RR: regiones recombinantes, AK o de fosfatasa alcalina (AP1, AP2 y AP); Deg Sig; señales de degradación (véase la Tabla 2); SA, señal aceptora de corte y empalme; pA, señal de poliadenilación. A y C: Estrategia de vectores híbridos (duales o triples), incluyendo regiones transcorte y empalme y recombinantes, de acuerdo con una realización preferida de la invención B y D: Estrategia de vectores (duales o triples) superpuestos. Para ejemplos adicionales, véanse las Figs. 12-14.
Figura 2. Expresión eficiente de la proteína ABCA4 utilizando las regiones de homología AK, AP1 y AP2 (a, c) análisis de transferencia Western representativo de (a) células HEK293 (50 microgramos/carril) infectadas con vectores AAV2/2 duales (serotipo 2 del AAV, con ITR homóloga del AAV2) o (c) retinas C57BL/6 (lisados de retina enteros) inyectadas con vectores AAV2/8 duales (serotipo 8 del AAV, con ITR homólogo del AAV2) que codifican para ABCA4. Las flechas indican las proteínas de longitud completa, la escalera de peso molecular se representa a la izquierda. (b) Cuantificación de las bandas de proteína ABCA4 del análisis de transferencia Western en (a). La intensidad de las bandas de ABCA4 en (a) se dividió por la intensidad de las bandas de filamina A. Los histogramas muestran la expresión de las proteínas como un porcentaje relativo a los vectores AAV duales híbridos AK, el valor medio se representa sobre la barra correspondiente. Los valores se representan como: media ± s.e.m. (error estándar de la media). *pANOVA < 0,05; el asterisco indica diferencias significativas con AK, AP1 y AP2. (a-c) AK: células infectadas u ojos inyectados con vectores AAV duales híbridos AK; AP1: células infectadas u ojos inyectados con vectores AAV duales híbridos AP1; AP2: células infectadas u ojos inyectados con vectores AAV duales híbridos AP2; AP: células infectadas con vectores AAV duales híbridos AP; neg: células infectadas u ojos inyectados con la mitad 3 de los vectores o vectores que expresan EGFP, como controles negativos. a-3xflag: Transferencia Western con anticuerpos anti-3xflag; a-filamina A, transferencia Western con anticuerpos anti-filamina A, utilizado como control de carga; a-disferlina, transferencia Western con anticuerpos antidisferlina, utilizado como control de carga.
Figura 3. Genoma y eficiencia de transducción de los vectores con ITR2 e ITR5 heterólogas. (a) análisis de transferencia Southern alcalino del ADN extraído de 3 * 1010 GC de los vectores 5'- y 3'-ABCA4 con ITR homóloga (2:2) o heteróloga (5:2 o 2:5), y de una preparación del AAV de control con ITR2 homóloga (CTRL). El tamaño esperado de cada genoma se representa debajo de cada carril. El marcador de peso molecular (kb) se representa a la izquierda 5': Mitad 5' del vector; 3': Mitad 3' del vector, (b-d) Análisis representativo de transferencia Western y cuantificación de células HEK293 infectadas con vectores AAV2/2 duales híbridos ABCA4 con ITR2 e ITR5 heterólogas o ITR2 homólogas a m.o.i. basado en el título de la ITR2 (b y c) o del transgén (b y d). Las imágenes de transferencia Western (b) son representativas de n = 3 experimentos independientes; las cuantificaciones (c y d) son de n = 3 experimentos independientes. (b) La flecha superior indica la proteína ABCA4 de longitud completa, la flecha inferior indica las proteínas truncadas; la escalera de peso molecular se representa a la izquierda. Los microgramos de proteínas cargados se representan debajo de la imagen. a-3*flag: transferencia Western con anticuerpos anti-3*flag; a-filamina A: transferencia Western con anticuerpos antifilamina A, utilizado como control de carga. (c y d) Cuantificación de las bandas de proteína ABCA4 de longitud completa y truncada a partir del análisis de transferencia Western de células infectadas con una dosis de vector basada en el título de la ITR2 (c) o del transgén (d). Los histogramas muestran la intensidad de las bandas de proteína de longitud completa y truncada dividida por la de las bandas de filamina A o la intensidad de las bandas de proteína de longitud completa dividida por la de las bandas de proteína truncada en el carril correspondiente. Análisis representativo de transferencia Western y cuantificación de células HEK293 infectadas con vectores AAV2 duales híbridos (serotipo 2 del AAV) con ITR2 e ITR5 heterólogas o ITR2 homólogas que codifican para MYO7A (e, f). Las imágenes de transferencia Western (e) son representativas y las cuantificaciones (f) proceden de n=3 experimentos independientes. (e) Las flechas superiores indican proteínas de longitud completa, las flechas inferiores indican proteínas truncadas, la escalera de peso molecular se representa a la izquierda. Los microgramos de proteínas cargados se representan debajo de la imagen. (f) Cuantificación de las bandas de proteína MYO7A del análisis de transferencia Western.
El valor medio se representa encima de la barra correspondiente. Los valores se representan como: media ± s.e.m. *p Prueba t de Student < 0,05.
2:22:2: células infectadas con vectores AAV duales híbridos con ITR homóloga del AAV2; 5:22:5: células infectadas con vectores AAV duales híbridos con ITR heteróloga del AAV2 y AAV5; neg: células infectadas con vectores que expresan EGFP, como controles negativos.
Figura 4. La inclusión de sitios objetivo de miR en la mitad 5 ’ de los vectores no da lugar a una reducción significativa de los productos proteicos truncados
Análisis representativo de transferencia Western de células HEK293 infectadas con vectores AAV2/2 duales híbridos (serotipo 2 del AAV) que codifican para ABCA4, que contienen sitios objetivo de miR para miR-let7b (panel izquierdo), miR-204+124 (panel central) o miR-26a (panel derecho). La flecha superior indica las proteínas ABCA4 de longitud completa, la flecha inferior indica las proteínas truncadas; la escalera de peso molecular se representa a la izquierda. Los microgramos de proteínas cargados se representan debajo de la imagen. 5'+3': células coinfectadas con mitad 5' de los vectores sin sitios objetivo de miR y mitad 3' de los vectores; 5'+3'+combinación: células coinfectadas con mitad 5' de los vectores sin sitios objetivo de miR y mitad 3' de los vectores en presencia de imitadores combinados de miR; 5'mir+3': células coinfectadas con mitad 5' de los vectores que contienen sitios objetivo de miR y mitad 3' de los vectores; 5'mir+3'+ combinación: células coinfectadas con mitad 5' de los vectores que contienen sitios objetivo de miR y mitad 3' de los vectores en presencia de imitadores de miR combinado; 5'mir+3'+imitador let7b: células coinfectadas con mitad 5' de los vectores que contienen sitios objetivo de miR y mitad 3' de los vectores en presencia de imitadores de mir-let7b; 5': células infectadas con vectores 5'-half sin sitios objetivo de miR; 5'mir: células infectadas con la mitad 5' de los vectores que contienen sitios objetivo de miR en presencia de imitadores de miR combinado; 5'mir+imitador let7b: Células infectadas con la mitad 5' de los vectores que contienen sitios objetivo de miR en presencia de imitadores de mir-let7b; neg: Células de control infectadas con la mitad 3' de los vectores o vectores que expresan EGFP; 5'mir+3'+imitador 204+124: Células coinfectadas con la mitad 5' de los vectores que contienen sitios objetivo de miR y la mitad 3' de los vectores en presencia de imitadores de mir-204 y 124; 5'mir+imitador 204+124 células infectadas con mitad 5' de los vectores que contienen sitios objetivo de miR en presencia de imitadores mir-204 y 124; 5'mir+3'+imitador 26a: células coinfectadas con mitad 5' de los vectores que contienen sitios objetivo de miR y mitad 3' de los vectores en presencia de imitadores mir-26a; 5'mir+imitador 26a: células infectadas con mitad 5' de los vectores que contienen sitios objetivo de miR en presencia de imitadores mir-26a. a-3xflag: Transferencia Western con anticuerpos anti-3xflag; a-filamina A, transferencia Western con anticuerpos anti-filamina A, utilizado como control de carga
La secuencia de combinación corresponde a la secuencia de un miRNA diferente, por ejemplo, en el experimento con los imitadores de mir-let7b la secuencia de combinación fue la de miR26a.
Figura 5. La inclusión de la señal de degradación de CL1 en la mitad 5' de los vectores da lugar a una reducción significativa de los productos proteicos truncados
Análisis representativo de transferencia Western de (a) células HEK293 infectadas con vectores AAV2/2 duales híbridos (serotipo 2 del AAV, con ITR homólogo del AAV2) o (b) ojos de cerdo (RPE+retina) un mes después de la inyección de vectores AAV2/8 duales híbridos (serotipo 8 del AAV, con ITR homólogo del AAV2) que codifican para ABCA4 y que contienen o no la señal de degradación de CL1. Las flechas superiores indican la proteína ABCA4 de longitud completa, las flechas inferiores indican la proteína truncada de la mitad 5' del vector; la escalera de peso molecular se representa a la izquierda. Los microgramos de proteínas cargados se muestran debajo de cada imagen. 5'+3': células coinfectadas u ojos coinfectados con mitad 5' de los vectores sin CL1 y mitad 3' de los vectores; 5'-CL1+3': células coinfectadas u ojos coinfectados con mitad 5' de los vectores que contienen CL1 y mitad 3' de los vectores; 5': células infectadas con la mitad 5' de los vectores sin CL1; 5'-CL1: células infectadas con la mitad 5' de los vectores que contienen CL1; neg: células de control infectadas u ojos de control inyectados con la mitad 3' de los vectores o con vectores que expresan EGFP, como controles negativos; a-3xflag: Transferencia Western con anticuerpos anti-3xflag; a-filamina A: Transferencia Western con anticuerpos anti-filamina A, utilizado como control de carga; a-disferlina: Transferencia Western con anticuerpos antidisferlina, utilizado como control de carga, (a) la imagen de transferencia Western es representativa de n = 3 experimentos independientes, (b) la imagen de transferencia Western es representativa de n= 5 ojos inyectados con vectores 5'+3', n=2 ojos inyectados con vectores 5'-CL1+3' y n=5 de ojos inyectados con la mitad 3' de los vectores o vectores que expresan EGFP como controles negativos.
Figura 6. La inclusión de señales de degradación en la mitad 3' de los vectores da lugar a una ligera reducción de los productos proteicos truncados
Análisis representativo de transferencia Western de células HEK293 infectadas con vectores AAV2/2 duales híbridos que codifican para ABCA4 y contienen diferentes señales de degradación. La flecha superior indica la proteína ABCA4 de longitud completa, la flecha inferior indica los productos proteicos truncados; la escalera de peso molecular se representa a la izquierda. Los microgramos de proteínas cargados se muestran debajo de cada imagen. 5'+3': células coinfectadas con la mitad 5' y 3' de los vectores sin señales de degradación; 5': células infectadas con la mitad 5' de los vectores; 3' (sin etiqueta): células infectadas con la mitad 3' de los vectores sin señales de degradación; finalizador: células infectadas con la mitad 3' de los vectores que contienen codones finalizadores; PB29: células infectadas con la mitad 3' de los vectores que contienen la señal de degradación de PB29; 3xPB29: células infectadas con la mitad 3' de los vectores que contienen 3 copias en tándem de la señal de degradación de PB29; ubiquitina: células infectadas con la mitad 3' de los vectores que contienen la señal de degradación de ubiquitina. a-3xflag: Transferencia Western con anticuerpos anti-3xflag; a-filamina A: Transferencia Western con anticuerpos anti-filamina A, utilizado como control de carga.
Figura 7: Representación esquemática de las regiones AP, AP1 y AP2 de homología derivadas de la ALPP (fosfatasa alcalina placentaria) utilizadas en realizaciones preferidas de la presente invención. CDS: secuencia de codificación
Figura 8: La administración subretiniana de vectores AAV duales mejorados da lugar a la expresión de ABCA4 en los fotorreceptores del ratón y a una reducción significativa de la acumulación de lipofuscina en la retina del ratón ABCA4-/-. (a) Análisis representativo de la transferencia Western de retinas C57BL/6 (lisados de retina entera) inyectadas con vectores AAV2/8 duales híbridos ABCA4 (5' 3') o con controles negativos (neg). Las flechas indican las proteínas de longitud completa, la escalera de peso molecular se representa a la izquierda. a-3*flag: Transferencia Western con anticuerpos anti-3*flag; a-disferlina: Transferencia Western con anticuerpos anti-disferlina, utilizado como control de carga. (b y c) Imágenes representativas (b) y cuantificación (c) de la autofluorescencia de lipofuscina (señal roja) en las retinas (RPE o RPE OS) de ratones ABCA4+/- pigmentados no inyectados o inyectados con AAV como control (ABCA4+/-) o de ratones ABCA4-/- pigmentados no inyectados (ABCA4-/-) o inyectados con vectores AAV duales híbridos ABCA4 (ABCA4-/- AAV5'+3'). (b) La barra de escala (75 |jm) se representa en la imagen. RPE: epitelio pigmentario de la retina; ONL: capa nuclear externa; INL: capa nuclear interna; GCL: capa de células ganglionares. Las flechas indican la señal de lipofuscina. (c) Autofluorescencia media de lipofuscina en el lado temporal de tres secciones para cada muestra. La autofluorescencia media en cada sección se normalizó para la longitud del RPE subyacente. El valor medio se representa encima de la barra correspondiente. Los valores se representan como media ± s.e.m. ***p ANOVA < 0,0001. n = 4 ojos para cada grupo. (d) Número medio de gránulos de lipofuscina del RPE contados en al menos 40 campos (25 jm2)/retina de ratones albinos ABCA4+/+ no inyectados (ABCA4+/+ no inyectado) o inyectados con PBS (ABCA4+/+ PBS), y de ratones albinos ABCA4-/- inyectados con PBS (ABCA4-/- PBS) o con vectores AAV duales híbridos ABCA4 (ABCA4-/- AAV5'+3'). El valor medio se representa encima de la barra correspondiente. Los valores se representan como media ± s.e.m. *pANOVA < 0,05; **pANoVA <0,01. n = 4 ojos de ABCA4+/+ no inyectados; n = 4 ojos de ABCA4+/+ PBS; n = 3 ojos de ABCA4-/- PBS; n = 3 ojos de ABCA4-/- AAv5'+ 3'.
Figura 9: Actividad eléctrica similar entre los ojos de ratones y cerdos tratados con el control negativo o con el AA V dual mejorado. (a) Amplitudes medias de las ondas a (panel de la izquierda) y b (panel de la derecha) de ratones C57BL/6 1 mes después de la inyección de vectores AAV duales híbridos ABCA4 (AAV5'+ 3') o controles negativos (es decir, vectores AAV de control negativo o PBS; neg). Los datos se presentan como media ± s.e.m.; n indica el número de ojos analizados. (b) Amplitudes medias de las ondas b (jV ) en pruebas ERG escotópicas, de respuesta máxima, fotópicas y de parpadeo en cerdos 1 mes después de la inyección de vectores AAV duales híbridos ABCA4 AAV5'+ 3') o PBS. n = 5 ojos inyectados con vectores AAV duales híbridos ABCA4; n = 4 inyectados con PBS; *: n = 2.
Figura 10: Expresión de la proteína EGFP a partir de los promotores de IRBP y GRK1 en fotorreceptores conos y bastones de cerdo. Se inyectaron ratones, cerdos Large White de tres meses de edad por vía subretiniana con 1X1011 GC/ojo de cada uno de los vectores AAV2/8-IRBP- o AAV2/8-GRK1-EGFP. Se obtuvieron criosecciones de la retina 4 semanas después de la inyección y se analizó la EGFP mediante microscopía de fluorescencia. (a-b) Imágenes representativas (a) y cuantificación (b) de la intensidad de fluorescencia en la capa PR. La intensidad de la fluorescencia se cuantificó para cada grupo de animales en criosecciones (seis campos diferentes/ojo; aumento de 20x), (c-d) imágenes representativas (c) y cuantificación (d) de la eficiencia de transducción de conos. La eficiencia de la transducción de conos se evaluó en criosecciones (seis campos diferentes/ojo; aumento de 63x) inmunizadas con un anticuerpo anti-LUMIf-hCAR, y se expresa como el número de conos que expresan EGFP (EGFP+/CAR+) sobre el número total de conos (CAR+) en cada campo. (a, c) La barra de escala se representa en la imagen. (b-d) n=3 ojos inyectados con vectores AAV2/8-IRBP-EGFP; n=3 ojos inyectados con vectores AAV2/8-GRK1-EGFP. Los valores se representan como media ± s.e.m. No se encontraron diferencias significativas mediante la prueba t de Student. OS: segmentos externos; ONL: capa nuclear externa; EGFP: fluorescencia nativa de EGFP; CAR: tinción anticono arrestina; DAPI: tinción con 4',6'-diamidino-2-fenilindol. Las flechas señalan los conos transducidos.
Figura 11: La administración subretiniana de vectores AAV duales mejorados da lugar a una reducción significativa de la acumulación de lipofuscina en la retina del ratón ABCA4-/-. Montaje de imágenes del lado temporal (inyectado) de cortes transversales de la retina que muestran la autofluorescencia de la lipofuscina (señal roja) en las retinas (RPE o RPE OS) de ratones ABCA4+/- pigmentados no inyectados o inyectados con AAV como control (ABCA4+/-) o de ratones ABCA4-/-pigmentados no inyectados (ABCA4-/-) o inyectados con vectores AAV duales híbridos ABCA4 (ABCA4-/- AAV5'+3'). n= 4 ojos para cada grupo. T: lado temporal; N: lado nasal.
Figura 12: Actividad eléctrica similar entre los ojos de control negativo o los ojos tratados con AAV dual mejorado en ratones y cerdos. (a) Trazos representativos de ERG de ratones C57BL/6 un mes después de la inyección de vectores AAV duales híbridos ABCA4 (AAV5'+3') o controles negativos (es decir, vectores AAV de control negativo o PBS; neg). (b) Rastros representativos de pruebas ERG escotópicas, de respuesta máxima, fotópicas y de parpadeo en cerdos un mes después de la inyección de vectores AAV duales híbridos ABCA4 (AAV5'+3') o pBs.
Figura 13. Representación esquemática de las estrategias del sistema de vectores, de acuerdo con ejemplos de la invención. (A) Representación esquemática de un sistema de vectores que consiste en dos vectores, de acuerdo con realizaciones preferidas de la invención: un primer vector comprende una primera porción de la secuencia de codificación (porción CDS1), un segundo vector comprende una segunda porción (porción CDS2) de la secuencia de codificación. (A1) las secuencias de reconstitución del sistema vectorial consisten en los extremos superpuestos de las porciones de la secuencia de codificación. (A2) , las secuencias de reconstitución del primer y segundo vector consisten respectivamente en una secuencia donante de corte y empalme y una secuencia aceptora de corte y empalme. (A3) cada secuencia de reconstitución comprende el donante/aceptor de corte y empalme, dispuesto como en A2 y comprende además una región recombinante. Al menos uno de los vectores contiene una señal de degradación. La figura muestra para cada vector todas las posiciones potenciales de la de una o más señales de degradación del sistema de vectores, de acuerdo con realizaciones preferidas no limitantes de la invención.
(B) Representación esquemática de un sistema vectorial que consta de tres vectores, de acuerdo con realizaciones preferidas de la invención: un primer vector comprende una primera porción (porción CDS1) de la secuencia de codificación, un segundo vector comprende una segunda porción (porción CDS2) de la secuencia de codificación y un tercer vector comprende una tercera porción (porción CDS3) de la secuencia de codificación. (B1) las secuencias de reconstitución del sistema de vectores consisten en la superposición de los extremos de las porciones de la secuencia de codificación (el extremo 3' de la CDS1 se superpone con el extremo 5' de la CDS2; el extremo 3' de la CDS2 se superpone con el extremo 5' de la CDS3). (B2) la secuencia de reconstitución del primer vector consiste en un donante de corte y empalme, la secuencia de reconstitución del primer vector consiste en un donante de corte y empalme; el segundo vector comprende una primera secuencia de reconstitución en el extremo 5' de la CDS2 y una segunda secuencia de reconstitución en el extremo 3' de la CDS2, siendo la primera secuencia de reconstitución un aceptor de corte y empalme y la segunda un donante de corte y empalme; la secuencia de reconstitución del tercer vector consiste en un aceptor de corte y empalme. (B3) cada secuencia de reconstitución comprende el donante/aceptor de corte y empalme dispuesto como en B2 y comprende además una región recombinante. Al menos uno de los vectores contiene una señal de degradación. La figura muestra para cada vector todas las posiciones potenciales de una o más señales de degradación del sistema de vectores, de acuerdo con realizaciones preferidas no limitantes de la invención.
CDS, secuencia de codificación; SD, señal donante de corte y empalme; RR: regiones recombinógenas; Deg Sig; señales de degradación (véase la Tabla 2); SA, señal aceptora de corte y empalme.
Figura 14. Representación esquemática de las estrategias basadas en vectores múltiples del estado de la técnica para la transducción de genes grandes. CDS: secuencia de codificación; pA: señal de poliadenilación; SD: señal donante de corte y empalme; SA: señal aceptora de corte y empalme; AP: región recombinogénica de la fosfatasa alcalina; AK: Región recombinante del fago F1. Las líneas punteadas muestran el corte y empalme que se produce entre SD y SA, las líneas punteadas muestran las regiones superpuestas disponibles para la recombinación homóloga. Los plásmidos de vectores AAV de tamaño normal y de gran tamaño contenían casetes de expresión de longitud completa que incluían el promotor, la CDS del transgén de longitud completa y la señal de poliadenilación (pA). Los dos plásmidos de vectores AAV separados (5' y 3') necesarios para generar vectores AAV duales contenían el promotor seguido de la porción N-terminal de la CDS del transgén (plásmido 5') o la porción C-terminal de la CDS del transgén seguida de la señal pA (plásmido 3').
Descripción detallada de la invención
Materiales y métodos
Generación de plásmidos
Los plásmidos utilizados para la producción de vectores AAV se derivaron todos de los plásmidos de vectores AK duales híbridos que codifican el ABCA4 humano, el MYO7A humano o la proteína reportera EGFP que contiene las repeticiones terminales invertidas (ITR) del serotipo 2 del AAV 14
La secuencia recombinogénica AK 14 contenida en los plásmidos vectoriales que codifican ABCA4 fue sustituida por tres secuencias recombinantes diferentes derivadas del gen de la fosfatasa alcalina: AP (NM_001632, bp 823-1100,14); AP1 (XM_005246439.2, bp1802-151620); AP2 (XM_005246439.2, bp 1225-93820).
Los plásmidos de vectores AAV duales que llevan ITR heteróloga del serotipo 2 del AAV (ITR2) e ITR del serotipo 5 del AAV (ITR5) en la configuración 5:2-2:5 se generaron sustituyendo la ITR2 izquierda en el plásmido de la mitad 5' del vector y la ITR2 derecha en los plásmidos de la mitad 3' del vector, respectivamente, por ITR5 (NC_006152.1, pb 1-175). Los plásmidos de vectores AAV duales que llevan ITR2 e ITR5 heterólogas en las configuraciones 2:5 o 5:2 se generaron sustituyendo la ITR2 derecha o la izquierda por la ITR5, respectivamente. El plásmido de empaquetamiento pAAV5/2 que contiene Rep5 (NC_006152. 1, pb 171-2206) y los genes Cap del AAV2 (AF043303 pb2203-2208) (Rep5Cap2), se obtuvo a partir del plásmido de empaquetamiento pAAV2/2, que contiene los genes Rep (AF043303 pb321-1993) y Cap (AF043303 pb2203-2208) del AAV2 (Rep2Cap2), sustituyendo el gen Rep2 por el marco de lectura abierta Rep5 del AAV5 (NC_006152. 1, pb 171-2206).
El plásmido pZac5:5-CMV-EGFP que contiene el casete de expresión de EGFP con la ITR5 se generó a partir del plásmido pAAV2.1-CMV-EGFP, que contiene la ITR2 flanqueando el casete de expresión de EGFP 45
Las señales de degradación se clonaron en vectores AAV duales híbridos que codifican para ABCA4 de la siguiente manera: en los plásmidos de la mitad 5' del vector entre la secuencia AK y la iTR2 derecho; en los plásmidos de la mitad 3' del vector entre la secuencia AK y la señal aceptora de corte y empalme. Los detalles de las secuencias de señales de degradación se encuentran en la Tabla 2.
Tabla 2. Señales de degradación utilizadas en este studio
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Las secuencias subrayadas corresponden a las señales de degradación; en el caso de las señales de degradación que incluyen secuencias repetidas, se muestran los nucleótidos no destacados que se han incluido entre las secuencias repetidas a efectos de clonación.
La proteína ABCA4 expresada a partir de vectores AAV duales está etiquetada con 3xflag tanto en el N- (posición aminoacídica 590) como en el C-terminal para los experimentos mostrados en las Fig. 3 y 4 y en la Fig. 6, y sólo en el C-terminal para los experimentos de la Fig. 2 y 8a.
Los conjuntos de vectores híbridos AAV duales que codifican para ABCA4 utilizados en este estudio incluían los promotores de CMV ubicuos 46 o los promotores de la quinasa del receptor humano acoplado a la proteína G (GRK1)47 específicos de PR, mientras que los vectores AAV duales híbridos que codifican para MYO7A incluían el promotor ubicuo CBA 39
Producción y caracterización del vector AAV
Las grandes preparaciones de vectores AAV fueron producidas por el núcleo de vectores AAV de TIGEM mediante la triple transfección de células HEK293, seguida de dos rondas de purificación de CsC12. Los vectores AAV con ITR2 homóloga se obtuvieron como se ha descrito previamente 48.
Para obtener vectores AAV con ITR2 e ITR5 heterólogas, se transfectó una suspensión de 1,1*109 células HEK293 de bajo paso mediante fosfato de calcio con 500 |jg de plásmido ayudante pDeltaF6, que contiene los genes ayudantes Ad 49, 260 |jg de plásmido cis pAAV y diferentes cantidades de construcciones de empaquetamiento Rep2Cap2 y Rep5. La cantidad de construcciones de empaquetamiento Rep2Cap2 y Rep5 fue la siguiente:
(i) PROTOCOLO A: 130 jg de cada Rep5 y Rep2Cap2 (proporción 1:1)
(ii) PROTOCOLO B: 90 jg de Rep5 y 260 jg de Rep2cap2 (proporción 1:3)
(iii) PROTOCOLO C: 26 jg de Rep5 y 260 jg de Rep2Cap2 (proporción 1:10)
Después, cada preparación del AAV se purificó de acuerdo con el protocolo publicado 48.
Los protocolos descritos a continuación se utilizaron para los experimentos de competencia con Rep:
1- para evaluar la competencia de Rep5 con Rep2 en la producción de vectores AAV con ITR2, las células HEK293 se transfectaron cuádruplemente mediante fosfato de calcio con pDeltaF6, pAAV2.1-CMV-EGFP cis, las construcciones Rep2Cap2 y Rep5Cap2 en una proporción de peso de 2:1:1.5:15 o, como control, la cuádruple transfección con el pDeltaF6, el pAAV2.1-CMV-EGFP, el constructo de empaquetamiento Rep2Cap2 y un plásmido irrelevante de control en una proporción de peso de 2:1:1,5:1,5;
2- Para evaluar la competencia de Rep2 con Rep5 en la producción de vectores AAV con ITR5, se transfectaron células HEK293 en cuádruple por fosfato de calcio con pDeltaF6, pZac5:5-CMV-EGFP, las construcciones Rep5Cap2 y Rep2Cap2 en una proporción de peso de 5:1,5 o, como control, la cuádruple transfección con pDeltaF6, pZac5:5-CMV-EGFP, el constructo Rep5 y un plásmido irrelevante de control en una proporción de peso de 2:1:1,5:1,5.
Para las preparaciones de vectores AAV a gran escala, los títulos físicos [copias del genoma (GC)/mL] se determinaron promediando el título obtenido mediante cuantificación por PCR utilizando TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) 48 con un alineamiento de sondas en la ITR2 y el obtenido mediante análisis de membrana transferencia puntual 50 con un alineamiento de sondas a 1 kb de la ITR2. Para las preparaciones de vectores AAV a gran escala producidas con diferente relación de peso Rep5:Rep2Cap2, se determinaron los títulos físicos [copias del genoma (GC)/mL] mediante la cuantificación por PCR utilizando TaqMan con un alineamiento de sondas en ITR2. En el caso de las preparaciones de vectores AAV utilizadas en los experimentos de competición, los títulos físicos [copias del genoma (GC)] se determinaron mediante cuantificación por PCR utilizando TaqMan con un alineamiento de sondas sobre la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH), incluida en el casete de expresión de EGFP empaquetado en los vectores AAV.
Infección AAV de células HEK293
La infección AAV de células HEK293 se llevó a cabo como se ha descrito previamente 14. Se utilizaron vectores AAV2 portadores de ITR2 e ITR5 heterólogas y producidos de acuerdo con el protocolo C para infectar células HEK293 con una multiplicidad de infección (m.o.i) de 1*104 GC/célula de cada vector (2*104 GC/célula totales cuando los inventores utilizaron vectores AAV duales en una proporción 1:1) calculada teniendo en cuenta el título más bajo alcanzado para cada preparación viral. Las infecciones con AAV2/2 con regiones recombinantes y señales de degradación se realizaron con un m.o.i de 5*104 GC/célula de cada vector (1*105 GC/célula total en el caso de vectores AAV duales en proporción 1:1) calculado considerando el título medio entre TaqMan y transferencia en mancha.
Para los experimentos en los que se utilizaron la mitad 5' de los vectores que contenían sitios objetivo de miR, las células se transfectaron utilizando fosfato de calcio 4 horas antes de la infección con los correspondientes imitadores de miR (50 nM; imitador de microARN hsa-let-7b-5p, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-124-3p y hsa-miR-26a-5p de miRIDIAN; Dharmacon, Lafayette, CO, EUA).
Inyección subretiniana de vectores AAV en ratones y cerdos
Los ratones fueron alojados en el animalario del instituto de genética y biofísica (Nápoles, Italia), mantenidos bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (exposición de 10-50 lux durante la fase de luz). Los ratones C57BL/6 se compraron a Harlan Italy SRL (Udine, Italia). Los ratones ABCA4-/- pigmentados se generaron a través de cruces sucesivos de ratones ABCA4-/- albinos 14 con ratones Sv129 y se mantuvieron endogámicos; la cría se realizó cruzando ratones heterocigotos con ratones homocigotos. Los ratones albinos ABCA4-/- se generaron a través de cruces sucesivos y retrocruzados con ratones BALB/c (homocigotos para Rpe65 Leu450) y se mantuvieron en consanguinidad; la cría se realizó cruzando ratones heterocigotos con ratones homocigotos. Los ratones C57BL/6 (de 5 semanas de edad), ABCA4-/- pigmentados (de 5,5 meses de edad) y ABCA4-/- albinos (de 2,5 a 3 meses de edad) fueron anestesiados como se ha descrito previamente 61, y después se administró 1 j l de PBS o de vectores AAV2/8 por vía subretiniana en el lado temporal de la retina mediante un abordaje transescleral transcoroidal como se ha descrito por Liang et al 62. La tirosinasa AAV2/5-VMD2 humana 63 (dosis: 2*108 GC/ojo) se añadió a la solución del vector AAV2/8 que se administró subretinalmente a ratones albinos ABCA4-/- (Fig. 8d). Esto permitió a los inventores marcar el RPE dentro de la parte transducida de la copa del ojo, que fue posteriormente disecada y analizada.
Los cerdos hembra Large White utilizadas en este estudio estaban registradas como de raza pura en el libro genealógico de la Asociación Nacional Italiana de Criadores de Cerdos. Los cerdos se alojaron en el establo del hospital Cardarelli (Nápoles, Italia) y se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (exposición de 10-50 lux durante la fase de luz). Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con la declaración de la asociación para la investigación de la visión y la oftalmología para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y con la regulación del Ministerio de Salud italiano para los procedimientos con animales. Todos los procedimientos se sometieron al Ministerio de Salud italiano; Departamento de Salud Pública, Sanidad Animal, Nutrición y Seguridad Alimentaria. La cirugía se realizó bajo anestesia y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los animales fueron sacrificados como se ha descrito previamente39. La administración subretiniana de vectores AAV a cerdos de 3 meses de edad se realizó como se ha descrito previamente39. Todos los ojos se trataron con 100 |jl de PBS o de solución de vector AAV2/8. La dosis del AAV2/8 fue de 1*1011GC de cada vector/ojo, por lo que la coinyección de vectores AAV duales en una proporción de 1:1 dio lugar a una dosis total de 2*1011 GC/ojo.
En los estudios con animales incluidos en las figuras 2c, 5b, 8, 9, 10, 11 y 12, los ojos derecho e izquierdo se asignaron aleatoriamente a los distintos grupos experimentales y los investigadores que realizaban y cuantificaban los experimentos no conocían el tratamiento recibido por los animales.
Análisis de transferencia Western
Para el análisis de transferencia Western, las células HEK293 y las retinas de ratón y cerdo se lisaron en amortiguador RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % NP40, 0,5 % Na-Deoxifinalto, 1 mM EDTA pH 8,0, 0,1 % SDS). Los amortiguadores de lisis se complementaron con inhibidores de la proteasa (tabletas de cóctel de inhibidores de la proteasa completos; Roche) y 1 mM de fenilmetilsulfonilo. Después de la lisis, las muestras de células que contenían MYO7A se desnaturalizaron a 99 °C durante 5 minutos en amortiguador de muestra 1X Laemli; las muestras que contenían ABCA4 se desnaturalizaron a 37 °C durante 15 minutos en amortiguador de muestra 1X Laemli complementado con 4 M de urea. Los lisados se separaron con un 6-7 % (muestras de ABCA4 y MYO7A, respectivamente) o un 8 % (WB en la Fig. 5b) electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, Los anticuerpos utilizados para la inmunotransferencia son los siguientes: anti-3*flag (1:1000, A8592; Sigma-Aldrich); anti-MYO7A (1:500, policlonal; Primm Srl, Milán, Italia) generado utilizando un péptido correspondiente a los aminoácidos 941-1070 de la proteína MYO7A humana; anti-filamina A (1:1000, catálogo #4762; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA); anti-disferlina (1:500, Disferlina, clon Ham1/7B6, MONX10795; Tebu-bio, Le Perray-en-Yveline, Francia). La cuantificación de las bandas de ABCA4 y MYO7A detectadas por transferencia Western se realizó mediante el software ImageJ (descarga gratuita disponible en http://rsbweb.nih.gov/ij/). Para los experimentos in vitro realizados con AAV portadores de la ITR2 e ITR5 heterólogas, la intensidad de las bandas de ABCA4 y MYO7A de longitud completa se normalizó con la del producto proteico truncado en el carril correspondiente 0 con la de las bandas de filamina A, mientras que la intensidad de las bandas de las proteínas ABCA4 y MYO7A más cortas se normalizó con la de las bandas de filamina A. La intensidad de las bandas de ABCA4 obtenidas con vectores AAV que llevan señales de degradación o regiones homológicas se normalizó a la de las bandas de filamina A para los experimentos in vitro o a la de las bandas de disferlina para los experimentos in vivo. La cuantificación de los experimentos de transferencia Western se ha realizado como sigue:
- Fig. 2a-b: la intensidad de la banda de ABCA4 se normalizó con la de la banda de filamina A en el carril correspondiente. La expresión normalizada de ABCA4 se expresó entonces como porcentaje relativo a los vectores AAV duales híbridos AK;
- Fig. 2c: la intensidad de la banda ABCA4 (a.u.) se calculó como pliegue de aumento en relación con la intensidad media medida al mismo nivel en los carriles de control negativo de cada gel (la medición de la muestra de control negativo en el carril 7 del panel inferior izquierdo se excluyó del análisis dada la señal de fondo excepcionalmente alta). Los valores de cada grupo se representan como media ± error estándar de la media (s.e.m.);
- Fig. 3b-d: las intensidades de las bandas de proteína ABCA4 de longitud completa y truncada se dividieron por las de las bandas de filamina A o la intensidad de las bandas de proteína ABCA4 de longitud completa se dividió por la de las bandas de proteína truncada en el carril correspondiente. Los valores se representan como media ± s.e.m.;
- Tabla 5: Se midieron las intensidades de las bandas de la proteína ABCA4 de longitud completa y truncada en las células coinfectadas con la mitad 5' y 3' de los vectores. Se calculó la proporción entre la intensidad de las bandas de ABCA4 de longitud completa y de la proteína truncada en presencia del imitador correspondiente o de un imitador aleatorio. Los valores representan la media ± s.e.m. de las proporciones de tres experimentos independientes;
- Tabla 6: Se midieron las intensidades de las bandas de ABCA4 de longitud completa y de la proteína truncada en células coinfectadas con la mitad 5' y 3' de los vectores. Se calculó la relación entre la intensidad de las bandas de ABCA4 de longitud completa y truncada de los vectores con o sin las señales de degradación. Los valores representan la media ± s.e.m. de las proporciones de tres experimentos independientes.
- Fig. 8a: la intensidad de la banda de ABCA4 (a.u.) se calculó como pliegue de aumento en relación con la intensidad media de fondo medida en los carriles de control negativo del gel correspondiente. Los valores se expresan como media ± s.e.m.
Análisis de transferencia Southern
Se extrajeron tres *1010 GC de ADN viral de las partículas del AAV. Para digerir los genomas no empaquetados, la solución del vector se resuspendió en 240 j l de PBS pH 7,4 19 (GIBCO; Invitrogen S.R.L., Milán, Italia) y luego se incubó con 1 U/|jl de DNasa I (Roche) en un volumen total de 300 j l que contenía 40 mM TRIS-HCl, 10 mM NaCl, 6 mM MgC12, 1 mM CaC12 pH 7,9 durante 2 h a 37 °C. Después, se inactivó la DNasa I con 50 mM de EDTA, seguido de una incubación con proteinasa K y una solución de N-lauroil-sarcosil al 2,5 % a 50 °C durante 45 minutos para lisar las cápsides. El ADN se extrajo dos veces con fenol-cloroformo y se precipitó con dos volúmenes de etanol 100 y acetato de sodio al 10 % (3 M, pH 7). La electroforesis en gel de agarosa alcalina y la transferencia por adsorción se realizaron como se ha descrito anteriormente (Sambrook & Russell, 2001 Molecular Cloning). Se cargaron diez microlitros de la escalera de ADN de 1 kb (N3232L; New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) como marcador de peso molecular. Se marcaron dos fragmentos diferentes de ADN de cadena doble con digoxigenina-dUTP utilizando el kit de inicio de etiquetado y detección de ADN de alta calidad DIG (Roche) y se utilizaron como sondas. La sonda 5' (768 pb) se generó por doble digestión del plásmido pZac2.1-CMV-ABCA4_5’ con SpeI y NotI; la sonda 3' (974 pb) se generó por doble digestión del plásmido pZac2.1-ABCA4_3'_3xflag_SV40 con Clal y Mfel. La prehibridación y la hibridación se realizaron a 65 °C en el amortiguador Church (Sambrook & Russel, 2001 Molecular cloning) durante 1 h y toda la noche, respectivamente. Después, la membrana (Whatman Nytran N, charged nylon membrane; Sigma-Aldrich, Milán, Italia) se lavó primero durante 30 minutos en SSC 29-0,1 % SDS, luego durante 30 minutos en SSC 0,59-0,1 % SDS a 65 °C, y después durante 30 minutos en SSC 0,19­ 0,1 % SDS a 37 °C. Posteriormente, se analizó la membrana mediante detección de quimioluminiscencia por inmunoensayo enzimático utilizando el kit de etiquetado y detección de ADN DIG (Roche).
Análisis histológico
Se practicó la eutanasia a los ratones y, después, se recogieron sus globos oculares y se fijaron durante la noche mediante la inmersión en paraformaldehído (PFA) al 4 %. Antes de recolectar los globos oculares, se marcó el aspecto temporal de las escleróticas mediante cauterización, con el fin de orientar los ojos con respecto al lugar de la inyección en el momento de la inclusión. Los globos oculares se cortaron para poder extraer el cristalino y el vitreo dejando la copa ocular intacta. Los globos oculares de los ratones se infiltraron con un 30 % de sacarosa para su criopreservación y se incrustaron en un medio de congelación de tejidos (matriz O.C.T.; Kaltek, Padua, Italia). Para cada ojo, se cortaron entre 150 y 200 secciones seriadas (de 10 |jm de grosor) a lo largo del plano horizontal y las secciones se distribuyeron progresivamente en 10 portaobjetos, de modo que cada portaobjetos contenía entre 15 y 20 secciones, cada una de ellas representativa de todo el ojo a diferentes niveles. Las secciones se tiñeron con 4',6'-diamidino-2-fenilindol (Vectashield; Vector Lab, Peterborough, Reino Unido) y se observaron con un axiocam de Zeiss (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) a diferentes aumentos.
Los cerdos fueron sacrificados y sus globos oculares fueron recogidos y fijados durante la noche por inmersión en PFA al 4 %. Se cortaron los globos oculares para poder extraer el cristalino y el vitreo, dejando las copas oculares en su sitio. Las copas de los ojos se deshidrataron gradualmente infiltrándolas progresivamente con sacarosa al 10 %, 20 % y 30 %. Se realizó la incrustación en medio de congelación de tejidos (matriz O.C.T.; Kaltek). Antes de la incrustación, se analizaron las copas de los ojos de los cerdos con un estereomicroscopio de fluorescencia (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania) para localizar la región transducida siempre que se administrara un vector que codificara la EGFP. Para cada ojo, se cortaron 200-300 secciones seriadas (de 12 jm de grosor) a lo largo del meridiano horizontal y las secciones se distribuyeron progresivamente en portaobjetos de vidrio de forma que cada portaobjetos contuviera 6-10 secciones. La tinción de las secciones y la adquisición de imágenes se realizaron como se ha descrito para los ratones.
Tinción de inmunofluorescencia de conos
Las secciones de retina congeladas se lavaron una vez con PBS y luego se permeabilizaron durante 1 hora en PBS que contenía 0,1 % de Triton X-100. Se aplicó una solución de bloqueo con un 10 % de suero de cabra normal (Sigma-Aldrich) durante 1 hora. El anticuerpo primario [anti CAR humano6667, que también reconoce el CAR porcino (“Luminaire founders”-hCAR, 1:10.000; proporcionado amablemente por la Dra. Cheryl M. Craft, Doheny Eye Institute, Los Ángeles, CA)] se diluyó en PBS y se incubó durante la noche a 4 °C. El anticuerpo secundario (Alexa Fluor 594, anticonejo, 1:1.000; Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA) se incubó durante 45 minutos. Las secciones teñidas con los anticuerpos anti-CAR se analizaron con un aumento de 63x utilizando un sistema de microscopio confocal láser Leica (Leica Microsystems GmbH), como se ha descrito previamente64. Brevemente, para cada ojo se tomaron seis apilados z diferentes de seis regiones transducidas diferentes. Para cada apilado z, se utilizaron imágenes de planos individuales para contar las células CAR+ /EGFP . Para ello, los inventores se desplazaron cuidadosamente a lo largo del eje Z para distinguir una célula de otra y evitar así contar dos veces la misma célula. Para cada retina, los inventores contaron las células CAR positivas (CAR+)/EGFP-positivas (EGFP+) sobre el total de células CAR+. Después, los inventores calcularon el número promedio de células CAR+ /EGFP+ de los tres ojos de cada grupo experimental.
Cuantificación de EGFP
La intensidad de la fluorescencia en la RP se cuantificó de forma rigurosa y reproducible de manera no sesgada, como se ha descrito previamente64. Se tomaron imágenes individuales de los canales de color utilizando un microscopio Leica (Leica Microsystems GmbH). Las imágenes TIFF se escalaron en gris con el software de análisis de imágenes (LAS AF lite; Leica Microsystems GmbH). Un observador enmascarado analizó seis imágenes de cada ojo con 20x aumentos. El PR (capa nuclear externa OS) se delineó selectivamente en cada imagen, y la fluorescencia total para el área encerrada se calculó de manera imparcial utilizando el software de análisis de imágenes. Después, se promedió la fluorescencia en el PR a partir de seis imágenes recogidas de secciones retinianas separadas de cada ojo. Posteriormente, los inventores calcularon la fluorescencia media de los tres ojos de cada grupo experimental.
Cuantificación de la autofluorescencia de la lipofuscina
Para el análisis de la fluorescencia de la lipofuscina, se recogieron ojos de ratones ABCA4+/- y ABCA4-/- pigmentados a los 3 meses de la inyección del AAV. Los ratones fueron adaptados a la oscuridad durante la noche y sacrificados bajo luz roja tenue. Para cada ojo, se tomaron cuatro imágenes superpuestas del lado temporal de tres secciones de diferentes regiones del ojo utilizando un microscopio Leica DM5000B equipado con un filtro TX2 (excitación: 560±40 nm; emisión: 645±75) 71-75 y bajo un objetivo de 20X. Las cuatro imágenes de cada sección se combinaron en un único montaje utilizado para el posterior análisis de fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia de la lipofuscina (señal roja) en cada sección se calculó automáticamente utilizando el software ImageJ y luego se normalizó para la longitud del RPE subyacente al área de fluorescencia.
Microscopía electrónica de transmisión
Para los análisis de microscopía electrónica se recogieron ojos de ratones albinos ABCA4-/- y ABCA4+/- a los 3 meses de la inyección del AAV. Los ojos se fijaron en glutaraldehído al 0,2 % y paraformaldehído al 2 % en amortiguador PHEM 0,1 M de pH 6,9 (240 mM de PIPES, 100 mM de HEPES, 8 mM de MgC12, 40 mM de EGTA) durante la noche y luego se enjuagaron en amortiguador PHEM 0,1 M. Después, se diseccionaron los ojos bajo el microscopio de luz para seleccionar las porciones positivas a la tirosinasa de las copas de los ojos. La parte transducida de las copas de los ojos se incrustó posteriormente en gelatina al 12 %, se infundió con sacarosa 2,3 M y se congeló en nitrógeno líquido. Las criosecciones (50 nm) se cortaron con un ultramicrótomo Leica EM FC7 (Leica Microsystems) y se tuvo un cuidado extremo para alinear los cilios de conexión PR longitudinalmente. Para evitar el sesgo en la atribución de los datos morfológicos a los distintos grupos experimentales, los recuentos de gránulos de lipofuscina fueron realizados por un operador enmascarado (Dr. Roman Polishchuk) utilizando el software iTEM (Olympus SYS, Hamburgo, Alemania). Se utilizó el módulo “Touch count” del software iTEM para contar el número de gránulos de lipofuscina en áreas de 25 |jm2 (al menos 40) distribuidas aleatoriamente por la capa del RPE. La densidad de gránulos se expresó como número de gránulos por 25 jm 2.
Registros de electrorretinogramas
Los registros electrofisiológicos en ratones y cerdos se realizaron como se detalla en (68) y en (69), respectivamente.
Análisis estadístico
Los valores p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Se utilizó el ANOVA de una vía (software estadístico R) con el procedimiento de comparación múltiple post-hoc para comparar los datos representados en las figuras 2b (pANOVA=1,2 x 10-6), 2c (pANOVA= 0,326), 8c (pANOVA=1,5 * 10-10), 8d (pANOVA= 0,034) y 9a (pANOVA onda a: 0,5; pANOVA onda b: 0,8) y la tabla 6 (pANOVA= 0,0135). Como los recuentos de gránulos de lipofuscina (Fig. 8d) se expresan como números discretos, éstos fueron analizados por desviación de un modelo lineal generalizado binomial negativo65. Las diferencias estadísticamente significativas entre grupos determinadas con el procedimiento de comparación múltiple post-hoc son las siguientes: Figura 2b: AP frente a AK: 1,08 * 10-5; AP1 frente a AK: 0,05; AP2 frente a AK: 0,17; AP1 frente a AP: 1,8 * 10-6; AP2 frente a AP: 2,8 * 10-6; AP2 frente a AP1: 0,82. Figura 8c: ABCA4+/- no iny. frente a ABCA4-/- no iny.: 0,00; ABCA4-/- no iny. frente a ABCA4-/- AAV5'+3': 9,3 * 10-5; ABCA4+/- no iny. frente a ABCA4-/- AAV5'+3': 4 * 10-6 Figura 8d: ABCA4-/- PBS frente a ABCA4-/- AAV5'+3': 0,01; ABCA4+/+ PBS frente a ABCA4-/- AAV5'+3': 0,37; ABCA4+/+ no iny. frente a ABCA4-/- AAV5'+3': 0,53; ABCA4+/+ PBS frente a ABCA4-/- PBS: 0,05; ABCA4+/+ no iny. frente a ABCA4-/- PBS: 0,03; ABCA4+/+ no iny. frente a ABCA4+/+ PBS: 0,76. Tabla 6: 3xFINALIZADOR frente a ninguna señal de degradación: 0,97; 3xFINALIZADOR frente a PB29: 1,0; 3xFINALIZADOR frente a 3xPB29: 0,15; 3xSTOP frente a ubiquitina: 0,10; PB29 frente a ninguna señal de degradación: 1,0; PB29 frente a 3xPB29: 0,1; PB29 frente a ubiquitina: 0,07; 3xPB29 frente a ninguna señal de degradación: 0,06; 3xPB29 frente a ubiquitina: 1,0; ubiquitina frente a ninguna señal de degradación: 0,04.
Se utilizó la prueba t de Student para comparar los datos representados en la figura 3c, d y f.
Resultados
Los vectores AAV duales híbridos que incluyen las regiones recombinantes AP1, AP2 o AK muestran una transducción eficiente
Los inventores evaluaron varias estrategias de vectores múltiples, como se muestra en las Fig. 1 y 13.
En particular, evaluaron en paralelo la eficacia de transducción de vectores AAV duales híbridos con diferentes regiones de homología. Para ello, los inventores generaron vectores AAV2/2 duales híbridos que incluyen la secuencia de codificación ABCA4-3xflag, bajo el control del promotor CMV ubicuo, y las regiones de homología a K 14, AP 14, AP1 o AP2 20 (Fig. 7). Los inventores utilizaron estos vectores para infectar células HEK293 [multiplicidad de infección, m.o.i: 5*104 copias del genoma (GC)/célula de cada vector]. Los lisados celulares se analizaron por transferencia Western con anticuerpos anti-3xflag para detectar ABCA4-3xflag (Fig. 2). Cada uno de los conjuntos de vectores híbridos AAV duales dio lugar a la expresión de proteínas de longitud completa del tamaño esperado que no se detectaron en los carriles cargados con controles negativos (Fig. 2a). La cuantificación de la expresión de ABCA4 (Fig. 2b) mostró que la infección con los vectores AAV duales híbridos AP1 y AP2 dio lugar a niveles ligeramente más altos de expresión de transgenes que con los vectores AAV duales híbridos AK y todos superaron significativamente a los vectores a Av duales híbridos AP 14. Los inventores descubrieron previamente que la eficacia de los vectores AAV duales que dependen de la recombinación homóloga es menor en células diferenciadas terminalmente como el PR que en cultivo celular 14. Por lo tanto, los inventores evaluaron los niveles de transducción específicos del PR en ratones C57BL/6 tras la administración subretiniana de los vectores AAV duales AK, AP1 y AP2 que incluyen el promotor de la quinasa del receptor acoplado a la proteína G humana 1 (GRK1) específico del PR (dosis de cada vector/ojo: 1,9x109 GC; Fig. 2c). Un mes después de la administración del vector, los inventores detectaron la expresión de la proteína ABCA4 de forma más consistente en las retinas tratadas con el AAV dual híbrido AK que con los vectores AP1 o AP2 (Fig. 2c).
La inclusión de la ITR heteróloga en los vectores AAV afecta a su rendimiento de producción y no reduce los niveles de productos proteicos truncados
Para comprobar si el uso de las ITR heterólogas mejora la concatemerización direccional productiva de los vectores AAV duales, los inventores generaron vectores AK híbridos AAV2/2 que incluían secuencias codificadoras ABCA4-3xflag o MYO7A-HA con ITR2 e ITR5 heterólogas en la configuración 5:2 (ITR izquierda del AAV5 e ITR derecha del AAV2) o 2:5 (ITR izquierda del AAV2 e ITR derecha del AAV5) (Fig. 1). La producción de vectores AAV duales con ITR2 e ITR5 heterólogas requiere la expresión simultánea de las proteínas Rep de los serotipos 2 y 5 del AAV, que no pueden complementar la replicación del virus 23. De hecho, se ha demostrado que Rep2 y Rep5 pueden unirse indistintamente a ITR2 o ITR5, aunque de forma menos eficiente que a la ITR homóloga, pero no pueden escindir los sitios de resolución terminal de la ITR del otro serotipo 36 Por lo tanto, antes de generar vectores AAV duales híbridos AK con ITR2 e ITR5 heterólogas, los inventores evaluaron la competencia potencial de (i) Rep5 con Rep2 en la producción de vectores AAV2/2-CMV-EGFP (es decir vectores con ITR2 homóloga) y (ii) Rep2 con Rep5 en la producción de vectores AAV5/2-CMV-EGFP (es decir, vectores con ITR5 homóloga), utilizando la misma cantidad de construcciones de empaquetamiento Rep5Cap2 y Rep2Cap2 (proporción 1:1). De hecho, cuando se proporciona el constructo de empaquetamiento Rep5Cap2 además de Rep2Cap2, los rendimientos totales de los vectores AAV2/2-CMV-EGFP se reducen al 42 % de los de las preparaciones de control obtenidas cuando sólo se proporciona Rep2Cap2 como constructo de empaquetamiento (promedio de 4 preparaciones independientes de cada tipo, p prueba t de Student <0,05). Por el contrario, no se encontraron diferencias significativas en los rendimientos totales de las preparaciones del AAV5/2-CMV-EGFP obtenidas cuando se añadió Rep2Cap2 a Rep5Cap2, que fueron el 83 % de las obtenidas cuando Rep5Cap2 era el único constructo de empaquetamiento transfectado (media de 4 preparaciones independientes de cada tipo, no se encontraron diferencias significativas mediante la prueba t de Student). Dada la competencia de Rep5 con Rep2 en la producción de vectores con ITR2, los inventores probaron tres proporciones diferentes entre Rep5 y los constructos de empaquetamiento Rep2Cap2 en la producción del AAV con ITR2 e ITR5 heterólogas (Protocolo A con 1:1, Protocolo B con 1:3 y Protocolo C con proporción 1:10 Rep5/Rep2Cap2). Como se muestra en la Tabla 3, los títulos virales determinados por la cuantificación de la PCR utilizando una alineamiento de sondas para la ITR2 aumentaron progresivamente al disminuir la cantidad de Rep5, obteniéndose el mejor título con el protocolo C.
Tabla 3: Rendimiento de los vectores AVV5:2/2 en la presencia de varias proporciones de constructos de empaquetamiento Rep5 y Rep2
Figure imgf000030_0001
ID: número de identificación de los vectores AAV5:2/2; GC: copias del genoma.
Estos resultados confirmaron la competencia de Rep5 con Rep2 durante la producción de vectores con la ITR2 y llevaron a seguir el protocolo C para la producción de vectores AAV con ITR2 e ITR5 heterólogas. Sin embargo, varias preparaciones del AAV obtenidas con esta estrategia revelaron: (i) títulos hasta 6 veces más bajos determinados en la ITR2 que los títulos determinados en una secuencia transgénica entre la ITR (Tabla 4), lo que podría sugerir que la integridad de la ITR2 está comprometida y (ii) una reducción media de aproximadamente 6 veces en los rendimientos totales de los vectores AAV con ITR2 e ITR5 heterólogas en comparación con los que contienen ITR2 homóloga (Tabla 4).
Figure imgf000031_0001
ID: número de identificación de los vectores AAV; GC: copias del genoma.a Los valores representan la media ± SEM.
Sin embargo, el análisis de transferencia Southern de la preparación del AAV con ITR heteróloga no reveló ninguna alteración evidente de la integridad del genoma (Fig. 3a).
Para comprobar si la inclusión de la ITR heteróloga en los vectores AAV duales híbridos mejoraba la formación de concatémeros productivos de la sección final a principal y la transducción de proteínas de longitud completa, reduciendo al mismo tiempo la producción de proteínas truncadas, los inventores infectaron células HEK293 con vectores AAV duales híbridos que codificaban para ABCA4 o MYO7A con la ITR2 e ITR5 heterólogas (en la configuración 5:2/2:5) o ITR2 homóloga (Fig. 3b, 3e).
Dada la diferencia entre los títulos de la ITR2 y de transgenes para los vectores con la ITR heteróloga pero no homóloga (Tabla 4), los inventores infectaron las células con 104 copias del genoma (GC)/célula de cada vector basándose en los títulos de la ITR2 o de transgenes. El análisis de transferencia Western de las células HEK293 infectadas con vectores AAV duales basados en los títulos de ITR2, utilizando anticuerpos anti-3*flag (para detectar ABCA4-3xflag, Fig. 3b) o anti-Myo7a (Fig. 3e), mostró que la inclusión de la ITR2 e ITR5 heterólogas dio lugar a niveles más altos de proteína de longitud completa y truncada que la ITR2 homóloga (Fig. 3b, c, d, f). Sin embargo, esto no se observó cuando las células HEK293 se infectaron con las mismas preparaciones de vectores AAV duales en función del título del transgén (Fig. 3b, d). En conclusión, la relación entre la expresión de la proteína de longitud completa y la truncada fue similar independientemente de la ITR incluida en los vectores (Fig. 3 c, d, f) y del título del vector utilizado para dosificar las células (Fig. 3b, c, d).
El degron de CL1 en la mitad 5' del vector disminuye la producción de productos proteicos truncados
Para reducir selectivamente los niveles de productos proteicos truncados producidos por cada mitad 5' y 3' de los vectores AAV duales híbridos 14, los inventores colocaron secuencias de degradación putativas en la mitad 5' del vector después de la señal donante de corte y empalme entre AK y la ITR derecha, y en la mitad 3' del vector entre AK y la señal aceptora de corte y empalme (Fig. 1). Por lo tanto, la señal de degradación se incluirá en la proteína truncada pero no en la de longitud completa que resulta de un ARNm cortado y empalmado. Como señales de degradación en la mitad 5' de los vectores los inventores han incluido: (i) el degron de CL1 (CL1), (ii) 4 copias del sitio objetivo de miR-let7b (4xLet7b), (iii) 4 copias del sitio objetivo de miR-26a (4x26a) o (iv) la combinación de 3 copias de cada uno de los sitios objetivo de miR-204 y miR-124 (3x204+3x124) (Tabla 2). Como señales de degradación en la mitad 3' de los vectores los inventores han incluido: (i) 3 codones finalizadores (FiNa LIZADOR), (ii) PB29 en una sola (PB29) o en tres copias en tándem (3xPB29) o (iii) ubiquitina (Tabla 2). Los inventores generaron vectores AAV2/2 duales híbridos AK que codifican para ABCA4 incluyendo las diversas señales de degradación y evaluaron su eficacia tras la infección de células HEK293 [m.o.i: 5*104 copias del genoma (GC)/célula de cada vector]. Dado que miRlet7b, miR-26a, miR-204 y miR-124 se expresan poco o están completamente ausentes en las células HEK293 (Guía de investigación de miRNA de Ambion y 37), para probar el silenciamiento del constructo que contiene sitios objetivo para estos miR, los inventores transfectaron las células con imitador miR (es decir, pequeños ARN de doble cadena modificados químicamente que imitan a los miR endógenos 38) antes de la infección con los vectores AAV2/2 que contienen los correspondientes sitios objetivo. Para definir la concentración de imitadores miR necesaria para lograr el silenciamiento de un gen que contenga los correspondientes sitios objetivo de miR, los inventores utilizaron un plásmido que codificaba la proteína EGFP reportera y que contenía los sitios objetivo de miR antes de la señal de poliadenilación (datos no mostrados). Se utilizaron los mismos ajustes experimentales para la evaluación adicional de los sitios objetivo de miR en el contexto de los vectores AAV duales híbridos AK. Los inventores descubrieron que la inclusión de secuencias objetivo de miR-204+124 y 26a en la mitad 5' de los vectores AAV duales híbridos AK reducía, aunque no suprimía, la expresión de los productos proteicos truncados sin afectar a la expresión de la proteína de longitud completa (Fig. 4). De forma diferente, la inclusión de sitios objetivo de miR-let7b no fue eficaz para reducir la expresión de la proteína truncada (Fig. 4).
En particular, como se muestra en la figura 5a, los inventores descubrieron que la inclusión de la señal de degradación de CL1 en la mitad 5' del vector redujo la expresión de la proteína truncada a niveles indetectables sin afectar la expresión de la proteína de longitud completa (Fig. 5a). Dado que las diferencias en la expresión específica de tejido de las enzimas de la vía de ubiquitinación que median en la degradación de CL1 31 pueden explicar los cambios en la eficacia de CL1, los inventores evaluaron además la eficacia del degron de CL1 en la retina del cerdo, que tiene un tamaño y una estructura similares a los de los humanos 19, 30, 39, 40 y es, por lo tanto, un excelente modelo preclínico de animal grande para evaluar la seguridad y la eficacia del vector.
Con este fin, los inventores inyectaron subretinamente en cerdos Large White vectores AAV2/8 duales híbridos AK (de los cuales la mitad 5' del vector incluía o no la secuencia CL1) que codificaban para ABCA4 (dosis de cada vector/ojo: 1 x 1011 GC). En particular, los inventores descubrieron que la inclusión de la señal de degradación de CL1 en la mitad 5' del vector daba lugar a una reducción significativa de la expresión de la proteína truncada por debajo del límite de detección del análisis de transferencia Western sin afectar a la expresión de la proteína de longitud completa (Fig. 5b). Entre las señales de degradación probadas en la mitad 3' del vector, los inventores encontraron que los codones FINALIZADORES no afectaban a la producción de la proteína truncada. De manera diferente, PB29 (ya sea en una sola copia o en tres copias en tándem) y ubiquitina fueron eficaces para reducir la expresión de la proteína truncada. Sin embargo, mientras que la ubiquitina suprimió también la expresión de la proteína de longitud completa, PB29 afectó a la producción de la proteína de longitud completa en menor medida (Fig. 6).
Entre las señales de degradación probadas en la mitad 3' del vector, los inventores identificaron tres (PB29, 3xPB29 y ubiquitina) que redujeron tanto los niveles de productos proteicos truncados como de proteínas de longitud completa (Fig. 6 y Tablas 5 y 6).
Tabla 5. Cuantificación de la expresión de la proteína ABCA4 de longitud completa en relación con la truncada a partir del análisis de transferencia Western de células HEK293 infectadas con vectores AA V duales híbridos que incluyen sitios objetivo de miR en la mitad 5 ’ del vector.
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Tabla 6: Cuantificación de la expresión de la proteína ABCA4 de longitud completa y truncada a partir del análisis de transferencia Western de células HEK293 infectadas con vectores AAV duales híbridos, incluyendo las señales de degradación en la mitad 3 ’ del vector.
Figure imgf000032_0002
La administración subretiniana de vectores AAV duales mejorados reduce la acumulación de lipofuscina en la retina ABCA4-/-
Basándose en los hallazgos de los presentes inventores, los vectores AAV duales híbridos ABCA4 mejorados deben incluir la ITR2 homóloga, la región de homología AK y el CL1. Como ABCA4 se expresa tanto en los fotorreceptores de bastones como en los de conos en los seres humanos70, los inventores identificaron un promotor adecuado para la administración de ABCA4 comparando las propiedades de transducción de PR de vectores AAV2/8 simples que codifican EGFP a partir de los promotores humanos GRK1 (receptor quinasa 1 acoplado a proteína G) o IRBP (proteína de unión a retinoides interfotorreceptores), que se han descrito para impulsar altos niveles de transducción combinada de PR de bastones y conos en varias especies53-55. Aprovechando la arquitectura de la retina porcina, que incluye una región estriada con una relación cono/bastón = 1:356 similar a la de la mácula humana, los inventores inyectaron subretinamente 1*1011GC/ojo de vectores AAV2/8-GRK1- o IRBP-EGFP en cerdos Large White de 3 meses. Cuatro semanas después de la inyección, los inventores analizaron las correspondientes criosecciones de retina con un microscopio de fluorescencia. La cuantificación de la fluorescencia de EGFP en la capa de células PR (Fig. 10a-b) mostró que ambos promotores dan niveles comparables de transducción de PR (predominantemente bastones en esta región). Sin embargo, cuando los inventores contaron el número de conos marcados con un anticuerpo contra la arrestina de conos (CAR)57 que también eran positivos a la EGFP, encontraron niveles más altos, aunque no estadísticamente significativos, de transducción de PR de conos con el promotor GRK1 (Material, Fig. 10c-d). Basándose en esto, los inventores incluyeron el promotor GRK1 en los presentes vectores AAV duales híbridos ABCA4 mejorados, e investigaron su capacidad tanto para expresar ABCA4 como para disminuir el contenido anormal de material de lipofuscina autofluorescente que contiene A2E en el RPE de ratones ABCA4-/-. Los inventores inyectaron inicialmente por vía subretiniana a ratones C57/BL6 de un mes de edad con vectores AAV duales mejorados (dosis de cada vector/ojo: 2*109 GC) y encontraron que 12 de los 24 (50 %) ojos inyectados tenían niveles detectables, aunque variables, de la proteína ABCA4 de longitud completa por transferencia Western [Fig. 8a; niveles de proteína ABCA4 en los ojos positivos a ABCA4: 2,8 ± 0,7 a.u. (media ± error estándar de la media)].
Esto es similar al hallazgo de los inventores anterior de que una versión diferente de la plataforma AAV dual dio como resultado un 50 % de ojos que expresan ABCA414. A continuación, los inventores inyectaron a ratones ABCA4-/-pigmentados de 5,5 meses de edad por vía subretiniana en la región temporal del ojo con los vectores AAV duales mejorados (dosis de cada vector/ojo: 1,8*109 GC). Tres meses después, los inventores recolectaron los ojos y midieron los niveles de fluorescencia de la lipofuscina (excitación: 560±40 nm; emisión: 645±75) en criosecciones de la retina [en el RPE solo o en el RPE segmentos externos (SO)] en la región temporal del ojo (Fig. 8b-c y Fig. 11). Los inventores descubrieron que la intensidad de la fluorescencia de la lipofuscina en esta región del ojo era significativamente mayor en los ratones ABCA4-/- no tratados que en los ratones ABCA4+/- y -/- inyectados con los vectores AAV duales híbridos ABCA4 terapéuticos (Fig. 8b, c y Fig. 11). Después, mediante microscopía electrónica de transmisión, los inventores contaron el número de gránulos de lipofuscina del RPE. Éstos aumentaron en los ratones albinos ABCA4-/- de 5,5-6 meses de edad inyectados con PBS en comparación con los controles ABCA4+/+ de la misma edad (Fig. 8d), a niveles similares a los que los inventores han medido independientemente en los ratones ABCA4-/- no inyectados o inyectados con un vector AAV de control (datos no mostrados). El número de gránulos de lipofuscina en el RPE ABCA4-/- se normalizó 3 meses después de la inyección subretiniana de vectores AAV duales híbridos ABCA4 mejorados (dosis de cada vector/ojo: 1*109 GC, Fig. 8d).
Los vectores AAV duales mejorados son seguros tras su administración subretiniana en la retina de ratones y cerdos
Para investigar la seguridad de los vectores AAV2/8 duales híbridos ABCA4 mejorados, los inventores los inyectaron por vía subretiniana tanto en ratones C57BL/6 de tipo salvaje como en cerdos Large White (dosis de cada vector/ojo: 3*109 y 1^1011GC, respectivamente). Un mes después de la inyección, los inventores midieron la actividad eléctrica de la retina mediante un electrorretinograma (ERG) de Ganzfeld y descubrieron que las amplitudes de las ondas a y b no eran significativamente diferentes entre los ojos de los ratones inyectados con vectores AAV duales híbridos ABCA4 y los ojos inyectados con vectores AAV de control negativo o PBS (Fig. 9a y Material, Fig. 12a). Del mismo modo, la amplitud de la onda b en las pruebas ERG escotópica, fotópica, de respuesta máxima y de parpadeo fue comparable en los ojos de cerdo que fueron inyectados con vectores AAV duales híbridos ABCA4 a los de los ojos de control inyectados con PBS (Fig. 9b y Material, Fig. 12b).
Discusión
La capacidad restringida de empaquetamiento del AAV representa uno de los principales obstáculos para la aplicación generalizada del AAV para la terapia génica de las IRD. Sin embargo, recientemente, varios grupos han informado de forma independiente de que los vectores AAV duales amplían eficazmente la capacidad de carga del AAV tanto en la retina de ratón como en la de cerdo14, 17, 19, 41, ampliando así la aplicabilidad del AAV a las IRD debido a mutaciones en los genes que no cabrían en un único vector AAV canónico. En este caso, los inventores se propusieron superar algunas limitaciones asociadas al uso de vectores AAV duales, a saber, su eficacia relativamente baja en comparación con un vector único, y la producción de proteínas truncadas que pueden plantear problemas de seguridad.
Las estrategias destinadas a aumentar la concatemerización de la sección final a principal del genoma del AAV dual deberían, en teoría, aumentar los niveles de proteínas de longitud completa y reducir los de proteínas truncadas de las mitades de los vectores únicos libres. Los inventores se propusieron mejorar la concatemerización del genoma del AAV dual de la sección final a principal incluyendo regiones óptimas de homología o ITR heterólogas. En una evaluación paralela de las regiones de homología previamente descritas, los inventores han encontrado que las secuencias AP1 y AP2 recientemente publicadas por Lostal et al. 20 y la secuencia AK del fago Fl 14 conducen a niveles generales similares de expresión de la proteína in vitro, con vectores AAV duales híbridos AK que conducen a una expresión más consistente de ABCA4 en la retina del ratón. Independientemente, la disponibilidad de diferentes regiones de homología es útil para dirigir la concatenación adecuada de vectores AAV triples para ampliar aún más la capacidad de carga de los AAV 2042 Se han incluido con éxito ITR2 e ITR5 heterólogas en vectores AAV duales 2425 y triples42. Los inventores descubrieron que los rendimientos de los vectores AAV con ITR2 e ITR5 heterólogas son menores que los de la ITR2 homóloga. Los inventores también detectaron menos genomas de vectores con ITR heteróloga cuando los inventores sondean su ITR2 que cuando los inventores sondean una región diferente de su genoma. Como los inventores muestran que Rep5 interfiere con la producción de vectores con ITR2, esto sugiere anomalías a nivel de ITR2 incluidas en los vectores a Av con ITR heteróloga, que se producen en presencia de Rep5, pero no en los vectores AAV con ITR2 homóloga, que se producen sólo en presencia de Rep2 y que mostraron títulos similares tanto si los inventores sondean ITR2 como una región diferente del genoma. Estos resultados difieren en parte de los comunicados anteriormente, en los que los vectores AAV duales con ITR2 e ITR5 heterólogas presentaban una mayor eficacia de transducción que los vectores con ITR homólogas y aparentemente no presentaban problemas de producción2425. Además de las diferentes construcciones de empaquetamiento y protocolos de producción, en este estudio los inventores utilizaron vectores AAV duales híbridos que incluían regiones de homología entre las dos mitades de los vectores, a diferencia del sistema de transcorte y empalme utilizado en los informes anteriores, que simplemente se basa en la ITR para la concatemerización 24, 25. Como en los vectores AAV híbridos duales la reconstitución del gen de longitud completa está mediada principalmente por la región de homología incluida en los vectores16 que dirigen la formación del concatémero, esto puede explicar el menor aumento de la expresión del transgén que los inventores observaron con los vectores con la ITR heteróloga en comparación con los estudios anteriores que utilizaban vectores de transcorte y empalme24, 25 Además, los inventores pueden haber sobrestimado la eficacia de los vectores con ITR heteróloga, ya que los inventores los utilizaron basándose en un título calculado en la ITR2 que es de 3 a 6 veces menor que el calculado en la secuencia transgénica para los vectores que expresan MYO7A y ABCA4, respectivamente. Como ambos títulos calculados sobre la ITR2 y sobre la secuencia transgénica son similares entre los correspondientes vectores AAV duales con ITR2 homóloga, los inventores los han utilizado con un volumen 3-6 veces menor que los que tienen las ITR2 e ITR5 heterólogas. Esto puede explicar los niveles aparentemente más altos de productos proteicos tanto de longitud completa como truncados del vector a Av dual con ITR heteróloga que con la ITR homóloga.
En los estudios anteriores de los inventores, éstos no observaron signos de toxicidad local hasta 8 meses después de la administración subretiniana de los vectores AAV duales14, sin embargo, la producción de productos proteicos truncados a partir de mitades de vectores del AAV duales podría plantear problemas de seguridad.
La inclusión de sitios objetivo de miR en el transcrito de un gen ha demostrado ser una estrategia eficaz para restringir la expresión del transgén en varios tejidos, incluida la retina 30. Sin embargo, in vitro los inventores lograron una reducción parcial de la producción de proteínas truncadas sólo cuando los inventores incluyeron sitios objetivo para miR-204+124 y 26a. De hecho, las características del ARNm externas a los sitios objetivo de miR pueden afectar a la eficacia del silenciamiento43, 44 En esta línea, dado que los productos proteicos truncados que se derivan de la mitad 5' se producen a partir de un vector que no está dotado de una señal de poliadenilación canónica, es posible que el ARNm resultante no pueda someterse a un silenciamiento eficiente mediado por miR. Es importante destacar que los inventores lograron la degradación completa del producto proteico truncado de la mitad 5' del vector mediante la inclusión del degron CL1. Los inventores demostraron que esta señal es eficaz tanto in vitro como en la retina del cerdo, lo que indica que las enzimas de la vía de degradación necesarias para la actividad de CL1 se expresan en varios tipos de células. Dado que el producto proteico truncado de la mitad 3' del vector es menos abundante que el producido por la mitad 3' del vector (Fig. 6), su presencia debería plantear menos problemas de seguridad. Los datos proporcionados en la presente en la retina del ratón y del cerdo apoyan la seguridad de los vectores AAV duales mejorados.
En particular, los inventores descubrieron que la administración subretiniana de los vectores AAV duales mejorados, bajo el control del promotor GRK1, que proporciona altos niveles de transducción combinada de bastones y conos, da lugar a una entrega efectiva de ABCA4 en ratones, aunque a niveles variables. Esto podría deberse tanto a la variabilidad inherente de la inyección subretiniana en el pequeño ojo murino como a la menor eficacia general del sistema AAV dual en comparación con un único vector AAV14.
A pesar de esta variabilidad, los inventores descubrieron que la administración de ABCA4 mediada por el AAV dual da lugar a una reducción significativa de la lipofuscina en la retina de ABCA4-/-, lo que sugiere que una amplia gama de niveles de expresión del transgén puede contribuir de forma similar a la eficacia terapéutica. Esto se observó utilizando dos técnicas independientes, sin embargo, se observó una mejora más pronunciada del fenotipo cuando los inventores diseccionaron y analizaron la zona transducida por el AAV de la retina que, efectivamente, mostraba una normalización del número de gránulos de lipofuscina. En conclusión, la invención proporciona múltiples vectores con características mejoradas adecuadas para la aplicación clínica, en particular para la terapia de enfermedades de la retina. Además, la invención mejora la seguridad y la eficacia de los vectores múltiples que amplían aún más la capacidad de carga20, 42.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema de vectores AAV múltiples para expresar la secuencia de codificación de un gen de interés en una célula, dicha secuencia de codificación comprende una primera porción y una segunda porción, dicho sistema de vectores comprende:
a) un primer vector que comprende:
- dicha primera porción de dicha secuencia de codificación (CDS1),
- una primera secuencia de reconstitución; y
b) un segundo vector que comprende:
- dicha segunda porción de dicha secuencia de codificación (CDS2),
- una segunda secuencia de reconstitución,
en donde dichas primera y segunda secuencias de reconstitución se seleccionan del grupo de:
i) la primera secuencia de reconstitución consiste en el extremo 3' de dicha primera porción de la secuencia de codificación y la segunda secuencia de reconstitución consiste en el extremo 5' de dicha segunda porción de la secuencia de codificación, dichas primera y segunda secuencias de reconstitución siendo secuencias superpuestas; o
ii) la primera secuencia de reconstitución comprende una señal donante del corte y empalme (SD) y la segunda secuencia de reconstitución comprende una señal aceptora del corte y empalme (SA), opcionalmente cada una de la primera y segunda secuencia de reconstitución comprende además una secuencia recombinogénica, caracterizada por el hecho de que uno o ambos del primero y el segundo vectores comprenden además una secuencia de nucleótidos de una señal de degradación, estando dicha secuencia situada en caso de i) en el extremo 3' de la CDS1 y/o en el extremo 5' de la CDS2 y en caso de ii) en la posición 3' respecto a SD y/o en la posición 5' respecto a SA, en donde:
- la secuencia recombinogénica se selecciona del grupo que consiste en:
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID No. 22, AK) o GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID NO. 23, AK), SEQ ID NO. 24 (AP1), SEQ ID NO. 25 (AP2), y SEQ ID NO. 26 (AP) y
- la secuencia de nucleótidos de la señal de degradación comprende o consiste en una secuencia que codifica la SEQ ID No. 1 (CL1), SEQ ID No. 2 (CL2), SEQ ID No. 3 (CL6), SEQ ID No. 4 (CL9), SEQ ID No. 5 (CL10), SEQ ID No. 6 (CL11), SEQ ID No. 7 (CL12), SEQ ID No. 8 (CL15), s Eq iD No. 9 (CL16), o la secuencia de nucleótidos de una señal de degradación comprende o consiste en la SEQ ID No. 16.
2. El sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con la reivindicación 1, en donde tanto el primer como el segundo vector comprenden además dicha secuencia de nucleótidos de una señal de degradación, en donde la secuencia de nucleótidos de la señal de degradación en el primer vector es idéntica o difiere de la del segundo vector, o en donde la primera secuencia de reconstitución comprende una señal donante de corte y empalme (SD) y una región recombinogénica en posición 3' con respecto a dicha SD, la segunda secuencia de reconstitución comprende una señal aceptora de corte y empalme (SA) y una secuencia recombinogénica en posición 5' con respecto a la SA; en donde dicha secuencia de nucleótidos de una señal de degradación se localiza en el extremo 5' y/o en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos de la región recombinogénica de uno o ambos del primer y segundo vector.
3. El sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer vector comprende además una secuencia promotora unida de forma operativa a la porción del extremo 5' de dicha primera porción de la secuencia de codificación (CDS1).
4. El sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde tanto el primer como el segundo vector comprenden además una secuencia de nucleótidos de repetición 5' terminal (5'-TR) y una secuencia de nucleótidos de repetición 3' terminal (3'-TR), preferiblemente la 5'-TR es una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida (5'-ITR) y la 3'-TR es una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida (3'-ITR), preferiblemente las ITR derivan del mismo serotipo del virus o de diferentes serotipos de virus.
5. El sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la señal donante de corte y empalme comprende o consiste esencialmente en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a:
GT AAGT AT CAAGGTT ACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACT GGGCTT GTCGAGACAGAGAAGACT CTT GCG TTTCT (SEQ ID No. 27), o en donde la señal aceptora de corte y empalme comprende o consiste esencialmente en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ ID No. 28)
6. El sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de codificación es la secuencia de codificación de un gen seleccionado del grupo que consiste en: ABCA4, MYO7A, CEP290, CDH23, EYS, PCDH15, CACNA1, SNRNP200, RP1, PRPF8, RP1L1, ALMS1, USH2A, GPR98, HMCN1, preferiblemente la secuencia de codificación es la secuencia de codificación de un gen seleccionado del grupo que consiste en: DMD, CFTR, F8 y DYSF.
7. El sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer vector no comprende una secuencia de nucleótidos de señal de poliadenilación.
8. El sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:
a) un primer vector que comprende en una dirección 5'-3':
- una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR);
- una secuencia promotora;
- una porción del extremo 5' de una secuencia de codificación de un gen de interés (CDS1), estando dicha porción del extremo 5' unida de forma operativa a dicho promotor y bajo su control;
- una secuencia de nucleótidos de una señal donante de corte y empalme;
- una secuencia de nucleótidos de una región recombinogénica; y
- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR); y
b) un segundo vector que comprende en una dirección 5'-3':
- una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR);
- una secuencia de nucleótidos de una región recombinogénica; y
- una secuencia de nucleótidos de una señal aceptora de corte y empalme;
- el extremo 3' de la secuencia de codificación (CDS2);
- una secuencia de nucleótidos de la señal de poliadenilación; y
- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR),
caracterizado por comprender además una secuencia de nucleótidos de una señal de degradación, estando dicha secuencia situada en el extremo 5' o en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos de la región recombinante de uno de los dos vectores o de ambos, en donde:
- la secuencia recombinogénica se selecciona del grupo que consiste en:
GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID No. 22, AK) o GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT
(SEQ ID NO. 23, AK), SEQ ID NO. 24 (AP1), SEQ ID NO. 25 (AP2) y SEQ ID NO. 26 (AP) y
- la secuencia de nucleótidos de la señal de degradación comprende o consiste en una secuencia que codifica la SEQ ID No. 1 (CL1), SEQ ID No. 2 (CL2), SEQ ID No. 3 (CL6), SEQ ID No. 4 (CL9), SEQ ID No. 5 (CL10), SEQ ID No. 6 (CL11), SEQ ID No. 7 (CL12), SEQ ID No. 8 (CL15), s Eq iD No. 9 (CL16), o la secuencia de nucleótidos de una señal de degradación comprende o consiste en la SEQ ID No. 16.
9. El sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además un tercer vector que comprende una tercera porción de dicha secuencia de codificación (CDS3) y una secuencia de reconstitución, en donde el segundo vector comprende dos secuencias de reconstitución, cada secuencia de reconstitución situada en cada extremo de la CDS2, preferiblemente el tercer vector comprende además al menos una secuencia de nucleótidos de una señal de degradación, preferiblemente el segundo vector comprende además una secuencia de nucleótidos de señal de poliadenilación unida a la porción del extremo 3' de dicha secuencia de codificación (CDS2).
10. Una célula huésped que comprende el sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
11. El sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10 para uso médico, preferiblemente para uso en terapia génica, preferiblemente para uso en el tratamiento y/o prevención de una patología o enfermedad caracterizada por una degeneración de la retina, preferiblemente la degeneración de la retina es hereditaria, preferiblemente la patología o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en: retinosis pigmentaria (RP), amaurosis congénita de Leber (LCA), enfermedad de Stargardt (STGD), enfermedad de Usher (USH), síndrome de Alstrom, ceguera nocturna estacionaria congénita (CSNB), distrofia macular, distrofia macular oculta, una enfermedad causada por una mutación en el gen ABCA4, preferiblemente para su uso en la prevención y/o tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne, fibrosis quística, hemofilia A y disferlinopatías.
12. Una composición farmacéutica que comprende el sistema de vectores AAV múltiples de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Una secuencia de nucleótidos de una señal de degradación que comprende o consiste en una secuencia que codifica la SEQ ID No. 1 (CL1), SEQ ID No. 2 (CL2), SEQ ID No. 3 (CL6), SEQ ID No. 4 (CL9), SEQ ID No. 5 (CL10), SEQ ID No.
6 (CL11), SEQ ID No. 7 (CL12), SEQ ID No. 8 (CL15), SEQ ID No. 9 (CL16), o que comprenda o consista en la SEQ lD No.16 en un sistema de vectores AAV múltiples para su uso en un método para disminuir la expresión de una proteína en forma truncada o para su uso en un método para disminuir la expresión de una proteína en forma truncada que comprende insertar dicha secuencia de nucleótidos de una señal de degradación en uno o más vectores de un sistema de vectores AAV múltiples.
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