KR102240180B1 - 다중 벡터 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효과적인 유전자 치료법을 가능하게 하는, 상세하게는 5 Kb 초과의 유전자로 된 구축물, 벡터, 관련 숙주 세포 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

다중 벡터 시스템 및 이의 용도
본 발명은 효과적인 유전자 치료법을 가능하게 하는, 상세하게는 5 Kb 초과의 유전자로 된 구축물, 벡터, 관련 숙주 세포 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.
많은 유전성 망막 변성(IRD; inherited retinal degeneration)에 대한 시력-회복 치료법(sight-restoring therapy)은 여전히, 충족되지 못한 주요 의료 요구이다. 아데노-연관 바이러스(AAV; adeno-associated viral) 벡터를 이용한 유전자 치료법은 현재까지, 많은 IRD의 치료를 위한 가장 유망한 접근법을 나타낸다. 사실상, 상이한 IRD들에 대한 수년간의 예비-임상 연구 및 다수의 임상 시험들은, 치료 유전자를 질병에 걸린 망막 층[광수용기(PR; photoreceptor) 및 망막 색소 상피(RPE; retinal pigment epithelium)]에 효율적으로 전달하는 AAV의 능력을 확인하였고1, 2, 인간에서 이들의 우수한 안전성 및 효능 프로파일을 분명히 보여주었다3 -7. 이러한 상항에도 불구하고, 이러한 성공을 다른 시력 상실 질환(blinding condition)까지 확장시키는 데 있어서 주요 장애들 중 하나는 AAV 벡터(~5 kb)의 패키징 용량(packaging capacity)이다. 이는 5 kb보다 더 큰 코딩 서열을 가진 유전자(본원에서는 큰 유전자로도 지칭됨)에서의 돌연변이로 인해, 보편적인 IRD에 대한 유전자 대체 치료법의 개발에 있어서 제한 인자가 되었다.
따라서, 최근 수년간 AAV의 운반 용량을 증가시키기 위한 전략의 규명에 상당한 관심이 있어 왔다. 분자간 재조합을 통해 콘카테머화(concatemerization)하는 AAV 게놈의 능력을 기반으로 한 이중 AAV 벡터는 이러한 문제를 해결하기 위해 성공적으로 이용되어 왔다14-16. 이중 AAV 벡터는 큰 이식유전자(transgene) 발현 카세트를 2개의 개별 절반들로 분할함으로써 생성되며, 이러한 절반은 각각 단일 정상 크기(NS; < 5 kb) AAV 벡터에 패키징된다. 전장(full-length) 발현 카세트의 재구축은, 동일한 세포를 이중 AAV 벡터 둘 다에 의해 공동-감염 시, i) 2개의 벡터 게놈의 반전 말단 반복부(ITR; inverted terminal repeat)-매개 꼬리-대-머리(tail-to-head) 콘카테머화, 및 후속해서 스플라이싱(이중 AAV 트랜스-스플라이싱, TS)15, ii) 2개의 벡터 게놈에 함유된 오버래핑 영역들 사이에서의 상동성 재조합(이중 AAV 오버래핑, OV)15, iii) 둘 다의 조합(이중 AAV 하이브리드)16에 의해 달성된다. 그 외 및 발명자들은 최근, 망막에서 이중 AAv 벡터의 잠재성을 보여주었다14 , 17-19. 이중 AAV 하이브리드 벡터의 맥락에서 사용되는 가장 많이 사용되는 재조합유전성(recombinogenic) 영역은, 높은 수준의 이중 AAV 하이브리드 벡터 재구축을 부여하는 것으로 나타난 인간 알칼리 포스파타제 cDNA의 중간 1/3의 872 bp 서열로부터 유래한다16. 발명자들은, AK 서열을 포함하는 이중 AAV 하이브리드 벡터가, 발명자들이 Ghosh 등22에서 제공된 설명을 기반으로 생성한 센스 알칼리 포스파타제 머리 영역 서열14을 포함하는 벡터를 능가함을 보여주었다. 부가적인 연구는, 이러한 알칼리 포스파타제 영역의 머리 또는 꼬리가, 알칼리 포스파타제 cDNA22의 전장 중간 1/3을 이용하여 달성된 것과 유사한 이식유전자 재구축 수준을 부여함을 보여주었다. 발명자들은, 이중 AAV 트랜스-스플라이싱 및 하이브리드 AK 벡터(F1 파지 유래의 짧은 AK 재조합유전성 서열을 함유함)가 마우스 및 돼지 망막에 효율적으로 형질도입되고, 스타르가르트 질병(STGD; Stargardt disease) 및 어셔 1B(USH1B; Usher 1B)의 마우스 모델을 구제함을 발견하였다14 ,19. 이중 AAV TS 및 하이브리드 AK 벡터를 이용하여 달성된 PR 형질도입의 수준은 IRD의 마우스 모델의 망막 표현형의 유의미한 개선을 가져왔고, 유전성 시력 상실 질환을 치료하는 데 효과적일 수 있다. 더욱이, 고도로 분기하는(divergent)(상동성 23의 58%) 혈청형 2 및 5 유래의 이종성 ITR(각각 ITR2 및 ITR5)을 가진 벡터는 상동성 ITR24을 가진 벡터보다 감소된 환형 단량체 형성 능력 및 증가된 방향성 꼬리-대-머리 콘카테머화를 보여준다. 이를 기반으로, Yan 등은, 이종성 ITR2 및 ITR5를 가진 이중 AAV 벡터가 상동성 ITR을 가진 이중 AAV 벡터보다 이식유전자 발현을 보다 효율적으로 재구축함을 보여주었다24, 25.
이들 연구가 망막과 같은 관심 조직에서의 큰 유전자 재구축을 위한 이중 AAV 벡터의 잠재성을 강조하긴 하였지만, 이들 연구는 또한, 이러한 전략의 추가적인 임상적 번역을 고려하기 전에 해결될 필요가 있는 중요한 문제점을 강조하고 있다.
프로모터 서열을 함유하는 5'-하프(half) 벡터로부터의 및/또는 3'-하프 벡터로부터의 절단된(truncated) 단백질 생성물의 생성은 ITR14 , 17, 20, 21의 낮은 프로모터 활성으로 인해, 이중 벡터의 사용과 연관된 주요 문제점이 여전히 남아 있다. 이들 절단된 생성물의 잠재적인 유해 효과를 생체내에서 평가하기 위한 형식적인 독성 연구가 지금까지도 수행된 적이 없으며, 따라서, 안전성 염려가 증가하고 있다. 따라서, 이들 절단된 생성물의 생성의 감소 또는 제거가 매우 바람직하다. 따라서, 본 발명은 이중 벡터 시스템의 사용과 연관된 이러한 주요 문제점을 해결하는 것을 목표로 한다.
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본 발명은 효과적인 유전자 치료법을 가능하게 하는, 상세하게는 5 Kb 초과의 유전자로 된 구축물, 벡터, 관련 숙주 세포 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.
큰 유전자들은 특히 하기의 유전자들을 포함한다:
Figure 112017095877839-pct00001
스타르가르트 질병(STGD1; MIM#248200)은 광수용기-특이적인 모든-트랜스 망막 전달체를 인코딩하는 ABCA4(CDS: 6822 bp)에서의 돌연변이에 의해 유발되는 유전성 황반 변성의 가장 흔한 형태이다8, 9. 추상체-간상체 이영양증(cone-rod dystrophy) 타입 3, 노란점 안저(fundus flavimaculatus), 연령-관련 황반 변성 타입 2, 조기 발병 중증 망막 이영양증(early-onset severe retinal dystrophy) 및 색소성 망막염(retinitis pigmentosa) 타입 19 또한, ABCA4 돌연변이(ABCA4-연관 질병)와 연관이 있다. 어셔 증후군 타입 IB(USH1B; MIM#276900)는 MYO7A(CDS: 6648 bp)에서의 돌연변이에 의해 유발되는 색소성 망막염과 난청의 가장 중증의 조합된 형태이며10, 이 MYO7A는 망막 내의 PR 및 RPE 둘 다에서 발현되는 액틴-기반 모터(actin-based motor)를 인코딩한다11-13.
더욱이, 망막 증상을 필연적으로 유발하지 않는 많은 다른 유전성 질병들은 큰 유전자에서의 돌연변이로 인한 것이다. 이들은 특히, DMD에서의 돌연변이로 인한 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), CFTR에서의 돌연변이로 인한 낭포성 섬유증, F8에서의 돌연변이로 인한 혈우병 A, 및 DYSF 유전자에서의 돌연변이로 인한 디스페린병증(dysferlinopathy)을 포함한다.
특히, 본 발명은 다중 벡터 시스템, 바람직하게는 다중 바이러스 벡터 시스템과 연관된 절단된 단백질 생성물의 발현을, 상기 단백질의 분해를 매개하거나 이의 번역을 방지하는 신호(이하, 분해 신호)를 사용함으로써 감소시키는 것을 목적으로 한다. 분해 신호는 다중 바이러스 벡터의 맥락에서는 전혀 사용된 적이 없다. 본 발명에서 놀랍게도, 분해 신호가 다중 벡터 시스템의 적어도 하나의 벡터에 존재하는 경우, 절단된 형태의 단백질의 발현이 상당히 감소하여, 전장 단백질의 수율이 더 높아짐을 발견하였다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 관심 유전자의 코딩 서열을 발현하는 벡터 시스템을 제공하며,
상기 코딩 서열은 제1 부분 및 제2 부분을 포함하고,
상기 벡터 시스템은
a) - 상기 코딩 서열의 상기 제1 부분(CDS1), 및
- 제1 재구축 서열(reconstitution sequence)
을 포함하는 제1 벡터; 및
b) - 상기 코딩 서열의 상기 제2 부분(CDS2), 및
- 제2 재구축 서열
을 포함하는 제2 벡터
를 포함하며,
상기 제1 재구축 서열 및 상기 제2 재구축 서열은
i] 제1 재구축 서열은 코딩 서열의 상기 제1 부분의 3' 말단으로 구성되고, 제2 재구축 서열은 코딩 서열의 상기 제2 부분의 5' 말단으로 구성되며, 상기 제1 재구축 서열 및 상기 제2 재구축 서열은 오버래핑 서열임; 또는
ii] 제1 재구축 서열은 스플라이싱 공여자 신호(SD; donor signal)를 포함하고, 제2 재구축 서열은 스플라이싱 수여자 신호(SA; acceptor signal)를 포함하며, 선택적으로 제1 재구축 서열 및 제2 재구축 서열 중 각각의 하나는 재조합유전성(recombinogenic) 서열을 더 포함함
으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
제1 벡터 및 제2 벡터 중 하나 또는 둘 다는 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 상기 서열은 i)의 경우, CDS1의 3' 말단 및/또는 CDS2의 5' 말단에 위치하고, ii)의 경우, SD에 대하여 3' 위치 및/또는 SA에 대하여 5' 위치에 위치한다는 사실을 특징으로 한다.
바람직하게는, 제1 벡터 및 제2 벡터는 둘 다 분해 신호의 상기 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 여기서, 제1 벡터 내 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열은 제2 벡터 내 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 상이하다.
바람직하게는, 제1 재구축 서열은 스플라이싱 공여자 신호(SD) 및 상기 SD에 대하여 3' 위치에 재조합유전성 영역을 포함하며, 제2 재구축 서열은 스플라이싱 수여자 신호(SA), 및 상기 SA에 대하여 5' 위치에 재조합유전성 서열을 포함하고; 분해 신호의 상기 뉴클레오타이드 서열은 제1 벡터 및 제2 벡터 중 하나 또는 둘 다의 재조합유전성 영역의 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치한다.
바람직하게는, 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 단백질 유비퀴틴화 신호, 하나 이상의 마이크로RNA 표적 서열 및/또는 하나 이상의 인공 정지 코돈으로부터 선택된다.
바람직하게는, 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열은 CL1 서열 번호 1, CL2 서열 번호 2, CL6 서열 번호 3, CL9 서열 번호 4, CL10 서열 번호 5, CL11 서열 번호 6, CL12 서열 번호 7, CL15 서열 번호 8, CL16 서열 번호 9, SL17 서열 번호 10 또는 PB29(서열 번호 14 또는 서열 번호 15)로부터 선택되는 서열을 인코딩하는 서열을 포함하거나 이로 구성되거나; 또는 여기서, 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열은 miR-204 서열 번호 11, miR-124 서열 번호 12 또는 miR-26a 서열 번호 13으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
바람직하게는, 제1 벡터의 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열은 CL1 서열 번호 1을 인코딩하는 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 또는 서열 번호 16을 포함하거나 이로 구성되거나, 또는 miR-204 서열 번호 11 및 miR-124 서열 번호 12를 포함하거나 이로 구성되며, 바람직하게는 miR 204 서열 번호 11의 3개 복사체 및 miR 124 서열 번호 12의 3개 복사체를 포함하거나, 또는 miR-26a 서열 번호 13을 포함하거나 이로 구성되며, 바람직하게는 miR-26a 서열 번호 13의 4개 복사체를 포함한다.
바람직하게는, 제2 벡터의 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열은 PB29를 인코딩하는 서열(서열 번호 14 또는 서열 번호 15)을 포함하거나 이로 구성되거나, 또는 서열 번호 19 또는 서열 번호 20을 포함하거나 이로 구성되며, 바람직하게는, 제2 벡터의 분해 신호는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 PB29의 3개 복사체를 인코딩하는 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
바람직하게는, 제1 벡터는 코딩 서열의 상기 제1 부분(CDS1)의 5' 말단 부분에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 더 포함한다.
바람직하게는 제1 벡터 및 제2 벡터는 둘 다 5'-말단 반복부(5'-TR) 뉴클레오타이드 서열 및 3'-말단 반복부(3'-TR) 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 바람직하게는 5'-TR은 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR) 뉴클레오타이드 서열이고 3'-TR은 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 뉴클레오타이드 서열이며, 바람직하게는 ITR은 동일한 바이러스 혈청형 또는 상이한 바이러스 혈청형으로부터 유래되며, 바람직하게는 바이러스는 AAV이다.
바람직하게는, 재조합유전성 서열은: AK GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(서열 번호 22) 또는 GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(서열 번호 23), AP1(서열 번호 24), AP2(서열 번호 25) 및 AP(서열 번호 26)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 코딩 서열은 천연 엑손-엑손 연접(junction)에서 제1 부분 및 제2 부분으로 분할된다.
바람직하게는, 스플라이싱 공여자 신호는 GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT(서열 번호 27)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 본질적으로 구성된다.
바람직하게는, 스플라이싱 수여자 신호는 GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG(서열 번호 28)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 본질적으로 구성된다.
바람직하게는, 제1 벡터는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 인핸서 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다.
바람직하게는, 코딩 서열은 망막 변성을 교정(correct)할 수 있는 단백질을 인코딩한다.
바람직하게는, 코딩 서열은 뒤시엔느 근이영양증, 낭포성 섬유증, 혈우병 A 및 디스페린병증을 교정할 수 있는 단백질을 인코딩한다.
망막 분해의 경우, 바람직하게는, 코딩 서열은 ABCA4, MYO7A, CEP290, CDH23, EYS, PCDH15, CACNA1, SNRNP200, RP1, PRPF8, RP1L1, ALMS1, USH2A, GPR98, HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 코딩 서열이다.
뒤시엔느 근이영양증, 낭포성 섬유증, 혈우병 A 및 디스페린병증의 경우, 바람직하게는, 코딩 서열은 DMD, CFTR, F8 및 DYSF로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 코딩 서열이다.
바람직하게는, 제1 벡터는 폴리아데닐화 신호 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다.
바람직하게는, 벡터 시스템은
a) 5'-3' 방향으로:
- 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR) 서열;
- 프로모터 서열;
- 관심 유전자의 코딩 서열의 5' 말단 부분(CDS1)으로서, 상기 5' 말단 부분은 상기 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고 이의 조절 하에 있음;
- 스플라이싱 공여자 신호의 뉴클레오타이드 서열;
- 재조합유전성 영역의 뉴클레오타이드 서열; 및
- 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 서열
을 포함하는 제1 벡터; 및
b) 5'-3' 방향으로:
- 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR) 서열;
- 재조합유전성 영역의 뉴클레오타이드 서열;
- 스플라이싱 수여자 신호의 뉴클레오타이드 서열;
- 코딩 서열의 3' 말단(CDS2);
- 폴리아데닐화 신호 뉴클레오타이드 서열; 및
- 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 서열
을 포함하는 제2 벡터
를 포함하고,
분해 신호의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 상기 서열은 제1 벡터 및 제2 벡터 중 하나 또는 둘 다의 재조합유전성 영역의 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 본 발명의 벡터에서, 상기 제1 벡터 및 제2 벡터는 독립적으로 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노 바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이며, 바람직하게는 상기 제1 및 제2 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 동일하거나 상이한 AAV 혈청형으로부터 선택되고, 바람직하게는 아데노-연관 바이러스는 혈청형 2, 혈청형 8, 혈청형 5, 혈청형 7 또는 혈청형 9로부터 선택된다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터 시스템은 상기 코딩 서열의 제3 부분(CDS3) 및 재구축 서열을 포함하는 제3 벡터를 더 포함하며, 여기서, 제2 벡터는 2개의 재구축 서열을 포함하고, 각각의 재구축 서열은 CDS2의 각각의 말단에 위치한다.
바람직하게는, 제1 벡터의 재구축 서열은 CDS1의 3' 말단으로 구성되며, 제2 벡터의 2개의 재구축 서열은 각각 CDS2의 5' 말단 및 3' 말단으로 제각기 구성되고, 제3 벡터의 재구축 서열은 CDS3의 5' 말단으로 구성되며;
제1 벡터의 상기 재구축 서열, 및 CDS2의 5' 말단으로 구성된 제2 벡터의 상기 재구축 서열은 오버래핑 서열이며;,
CDS2의 3' 말단으로 구성된 제2 벡터의 상기 재구축 서열 및 상기 제3 벡터의 상기 재구축 서열은 오버래핑 서열이고;
상기 제2 벡터는 분해 신호를 더 포함하며, 상기 분해 신호는 CDS2의 5' 말단 및/또는 CDS2의 3' 말단에 위치한다.
바람직하게는, 제3 벡터는 분해 신호의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다.
바람직하게는, 제2 벡터는 상기 코딩 서열(CDS2)의 3' 말단 부분에 연결된 폴리아데닐화 신호 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 벡터 시스템에 의해 형질변환된 숙주 세포를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터 시스템 또는 숙주 세포는 의료용이다. 바람직하게는 유전자 치료법에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 망막 변성을 특징으로 하는 병태 또는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하거나, 뒤시엔느 근이영양증, 낭포성 섬유증, 혈우병 A 및 디스페린병증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
바람직하게는, 망막 변성은 유전성이다.
바람직하게는, 병태 또는 질병은 색소성 망막염(RP), 레베르 선천성 흑암시(LCA; Leber congenital amaurosis), 스타르가르트 질병(STGD), 어셔 질병(USH), 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome), 선천성 비진행 야맹증(CSNB; congenital stationary night blindness), 황반 이영양증(macular dystrophy), 잠복 황반 이영양증(occult macular dystrophy), ABCA4 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 벡터 시스템 또는 숙주 세포 및 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 유효량의 상기 정의된 바와 같은 벡터 시스템, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 망막 변성을 특징으로 하는 병태 또는 질병의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 유효량의 상기 정의된 바와 같은 벡터 시스템, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 뒤시엔느 근이영양증, 낭포성 섬유증, 혈우병 A 또는 디스페린병증의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 절단된 형태의 단백질의 발현을 감소시키기 위한, 벡터 시스템에서의 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열의 용도를 제공한다.
본 발명은 벡터 시스템의 하나 이상의 벡터에 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열을 삽입하는 단계를 포함하는, 절단된 형태의 단백질의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 세포 내에서 관심 유전자의 코딩 서열을 발현하는 벡터 시스템은 2개의 벡터를 포함하고, 각각의 벡터는 상기 코딩 서열의 상이한 부분 및 재구축 서열을 포함하며; 바람직하게는, 제1 벡터의 재구축 서열은 스플라이싱 공여자를 포함하는 서열이며, 한편 제2 벡터의 재구축 서열은 스플라이싱 수여자를 포함하는 서열이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 세포 내에서 관심 유전자의 코딩 서열을 발현하는 벡터 시스템은 3개의 벡터를 포함하고, 각각의 벡터는 상기 코딩 서열의 상이한 부분 및 적어도 하나의 재구축 서열을 포함하며; 바람직하게는, 제1 벡터는 코딩 서열의 제1 부분에 대하여 3' 위치에 스플라이싱 공여자를 포함하는 재구축 서열을 포함하며, 제2 벡터는 제2 부분 코딩 서열에 대하여 5' 위치에 스플라이싱 수여자를 포함하는 재구축 서열 및 코딩 서열의 제2 부분에 대하여 3' 위치에 스플라이싱 수여자를 포함하는 재구축 서열을 포함하고, 제3 벡터는 제3 부분 코딩 서열에 대하여 5' 위치에 스플라이싱 수여자를 포함하는 재구축 서열을 포함한다.
바람직하게는, 제1 벡터 및 제2 벡터의 재구축 서열 또는 제1 벡터, 제2 벡터 및 제3 벡터의 재구축 서열은 재조합유전성 영역, 바람직하게는 스플라이싱 공여자에 대하여 3' 위치 및 스플라이싱 수여자에 대하여 5' 위치에 위치한 재조합유전성 영역을 더 포함한다.
본 발명의 벡터 시스템 중 어느 하나의 벡터, 2개의 벡터 또는 모든 벡터는 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다.
바람직하게는, 제1 벡터는 분해 신호를 포함한다. 바람직하게는, 제2 벡터는 분해 신호를 포함한다.
벡터가 재조합유전성 영역을 포함하는 재구축 서열을 포함하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 분해 신호는 상기 재조합유전성 영역의 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 세포 내에서 관심 유전자의 코딩 서열을 발현하는 벡터 시스템은 2개의 벡터를 포함하고; 벡터 시스템의 제1 벡터는 5'-3' 방향으로:
- 관심 유전자의 코딩 서열의 5' 말단 부분,
- 스플라이싱 공여자 신호의 핵산 서열,
- 재조합유전성 영역의 핵산 서열, 및
- 분해 신호의 핵산 서열
을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 세포 내에서 관심 유전자의 코딩 서열을 발현하는 벡터 시스템은 2개의 벡터를 포함하고; 벡터 시스템의 제2 벡터는 5'-3' 방향으로:
- 재조합유전성 영역의 핵산 서열,
- 분해 신호의 핵산 서열,
- 스플라이싱 수여자 신호의 핵산 서열, 및
- 관심 유전자의 코딩 서열의 3' 말단 부분
을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터 시스템의 제1 벡터는 프로모터 서열을 더 포함하며, 보다 바람직하게는 상기 프로모터 서열은 관심 유전자의 코딩 서열의 제1 부분의 5' 말단에 작동적으로 연결된다.
바람직하게는, 2개의 벡터로 구성된 벡터 시스템의 제2 벡터는 폴리아데닐화 신호 핵산 서열을 더 포함하며, 보다 바람직하게는 상기 폴리아데닐화 신호 핵산 서열은 관심 유전자의 코딩 서열의 제2 부분의 3' 말단에 연결된다. 바람직하게는 본 발명에 따른 벡터 시스템의 제1 벡터는 폴리아데닐화 신호 핵산 서열을 포함하지 않는다.
바람직하게는, 3개의 벡터로 구성된 벡터 시스템의 제3 벡터는 폴리아데닐화 신호 핵산 서열을 더 포함하며, 보다 바람직하게는 상기 폴리아데닐화 신호 핵산 서열은 관심 유전자의 코딩 서열의 제3 부분의 3' 말단에 연결된다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터 시스템의 벡터 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 본 발명의 벡터 시스템의 제1 벡터는 CL1 서열 번호 1을 인코딩하는 서열을 포함하거나 이로 구성된 서열의 분해 신호를 포함하며; 바람직하게는, CL1 서열 번호 1을 인코딩하는 상기 서열은 서열 번호 16을 포함하거나 이로 구성된다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터 시스템의 벡터 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 본 발명의 벡터 시스템의 제1 벡터는 miR-204 서열 번호 11 및 miR-124 서열 번호 12, 보다 바람직하게는 miR 204 서열 번호 11의 3개의 복사체 및 miR 124 서열 번호 12의 3개의 복사체를 포함하는 서열의 분해 신호를 포함하며; 바람직하게는 miR 204 서열 및 miR 124 서열 및/또는 miR 204 서열의 복사체 및 miR 124 서열의 복사체 각각은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개의 뉴클레오타이드로 된 링커 서열에 의해 연결된다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터 시스템의 벡터 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 본 발명의 벡터 시스템의 제1 벡터는 miR-26a 서열 번호 13을 포함하거나 이로 구성된 서열, 보다 바람직하게는 miR-26a 서열 번호 13의 4개의 복사체를 포함하는 서열의 분해 신호를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터 시스템의 벡터 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 본 발명의 벡터 시스템의 제2 벡터는 PB29를 인코딩하는 서열(서열 번호 14 또는 서열 번호 15)을 포함하거나 이로 구성된 서열의 분해 신호를 포함하며; 바람직하게는 PB29를 인코딩하는 상기 서열은 서열 번호 19 또는 서열 번호 20을 포함하거나 이로 구성되고; 보다 바람직하게는, 서열의 상기 분해 신호는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 PB29의 3개의 복사체를 인코딩하는 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 벡터 시스템은
a) 5'-3' 방향으로:
- 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR) 서열;
- 프로모터 서열;
- 관심 유전자의 코딩 서열의 제1 부분으로서, 바람직하게는 상기 코딩 서열의 5' 말단 부분인 제1 부분이며, 바람직하게는 상기 제1 부분은 상기 프로모터에 작동적으로 연결되고 이의 조절 하에 있는, 제1 부분;
- 스플라이싱 공여자 신호의 핵산 서열;
- 재조합유전성 영역의 핵산 서열; 및
- 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 서열
을 포함하는 제1 벡터; 및
b) 5'-3' 방향으로:
- 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR) 서열;
- 재조합유전성 영역의 핵산 서열;
- 스플라이싱 수여자 신호의 핵산 서열;
- 관심 유전자의 코딩 서열의 제2 부분으로서, 바람직하게는 상기 코딩 서열의 3' 말단 부분인, 제2 부분;
- 폴리아데닐화 신호 핵산 서열; 및
- 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 서열
을 포함하는 제2 벡터
를 포함하고,
상기 제1 벡터 및/또는 제2 벡터는 분해 신호의 핵산 서열을 더 포함하며, 상기 서열은 재조합유전성 영역의 핵산 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 벡터 시스템은
a) 5'-3' 방향으로:
- 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR) 서열;
- 프로모터 서열;
- 관심 유전자의 코딩 서열의 제1 부분으로서, 바람직하게는 상기 프로모터에 작동적으로 연결되고 이의 조절 하에 있는 제1 부분;
- 스플라이싱 공여자 신호의 핵산 서열;
- 재조합유전성 영역의 핵산 서열; 및
- 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 서열
을 포함하는 제1 벡터;
b) 5'-3' 방향으로:
- 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR) 서열;
- 재조합유전성 영역의 핵산 서열;
- 스플라이싱 수여자 신호의 핵산 서열;
- 관심 유전자의 코딩 서열의 제2 부분;
- 스플라이싱 공여자 신호의 핵산 서열;
- 재조합유전성 영역의 핵산 서열; 및
- 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 서열
을 포함하는 제2 벡터; 및
c) 5'-3' 방향으로:
- 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR) 서열;
- 재조합유전성 영역의 핵산 서열;
- 스플라이싱 수여자 신호의 핵산 서열;
- 관심 유전자의 코딩 서열의 제3 부분;
- 폴리아데닐화 신호 핵산 서열; 및
- 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 서열
을 포함하는 제3 벡터
를 포함하고,
상기 제1 벡터 및/또는 제2 벡터 및/또는 제3 벡터는 분해 신호의 핵산 서열을 더 포함하며, 상기 서열은 재조합유전성 영역(들)의 핵산 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치한다.
바람직하게는, 병태 또는 질병은 어셔 타입 1F(USH1F), 선천성 비진행 야맹증(CSNB2), 상염색체 우성(ad; autosomal dominant) 및/또는 상염색체 열성(ar; autosomal recessive) 색소성 망막염(RP), USH1B, STGD1, 레베르 선천성 흑암시 타입 10(LCA10), RP, 어셔 타입 1D(USH1D), 어셔 타입 2A(USH2A), 상염색체 우성 황반 이영양증, 어셔 타입 2C(USH2C), 잠복 황반 이영양증, 알스트롬 증후군으로부터 선택된다.
본 발명에서, 벡터 시스템은 구축물 시스템, 플라스미드 시스템 및 또한 바이러스 입자를 의미한다.
본 발명에서, 구축물 또는 벡터 시스템은 2개 초과의 벡터를 포함할 수 있다.
특히, 구축물 시스템은 관심 서열의 제3 부분을 포함하는 제3 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 다양한(2개, 3개 또는 그 이상의) 벡터가 세포에 도입될 때, 전장 코딩 서열이 재구축되거나 수득된다.
코딩 서열은 2개로 분할될 수 있다. 부분들은 길이가 동일하거나 상이할 수 있다. 전장 코딩 서열은 벡터 시스템의 벡터가 세포 내에 도입될 때 수득된다. 제1 부분은 코딩 서열의 5' 말단 부분일 수 있다. 제2 부분은 코딩 서열의 3' 말단일 수 있다. 나아가, 코딩 서열은 3개의 부분으로 분할될 수 있다. 부분들은 길이가 동일하거나 상이할 수 있다. 전장 코딩 서열은 벡터 시스템의 벡터가 세포 내에 도입될 때 수득된다. 제1 부분은 코딩 서열의 5' 부분이며, 제2 부분은 코딩 서열의 중간 부분이고, 제3 부분은 코딩 서열의 3' 부분이다.
본 발명에서, 세포는 바람직하게는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포이다.
본 발명에서, 벡터들 중 임의의 벡터에 하나의 분해 신호가 존재하는 것으로도, 절단된 형태의 단백질의 생성을 감소시키기에 충분하다.
용어 분해 신호는 (뉴클레오타이드(nucleotidic) 또는 아미노산(amminoacidic)) 서열을 의미하며, 이러한 서열은 그것이 포함된 mRNA/단백질의 분해를 매개할 수 있다.
용어 "절단된 형태의 단백질" 또는 "절단된 단백질"은, 단일 아미노산 내지 많은 아미노산(예를 들어 1개 내지 10개, 1개 내지 20개, 1개 내지 50개, 100개, 200개 등) 범위의 결실을 제시하기 때문에, 이의 전장 형태에서는 생성되지 않는 단백질이다.
본 발명에서, "재구축 서열"은 교정 프레임(correct frame)을 이용한 전장 코딩 서열의 재구축을 가능하게 하여, 따라서 기능성 단백질의 발현을 가능하게 하는 서열이다.
용어 "스플라이싱 공여자/수여자 신호"는 mRNA의 스플라이싱에 관여하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명에서, 임의의 인트론으로부터의 임의의 스플라이싱 공여자 또는 수여자 신호 서열이 사용될 수 있다. 당업자는, 일상적인 실험에 의해 적절한 스플라이싱 공여자 또는 수여자 신호 서열을 인지하고 선택하는 방법을 알고 있다.
본 발명에서, 2개의 서열들은 상기 각각의 서열의 적어도 일부가 서로 상동성인 경우 오버래핑되고 있다. 서열은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 200개 뉴클레오타이드에 대해 오버래핑될 수 있다.
용어 "재조합유전성 영역 또는 서열"은 2개의 상이한 서열들 사이에서 재조합을 매개하는 서열을 의미한다. "재조합유전성 영역 또는 서열" 및 "상동성 영역"은 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
용어 "말단 반복부"는 뉴클레오타이드 서열의 양쪽 말단에서 반복되는 서열을 의미한다.
용어 "반전 말단 반복부"는 반대되는 배향에서(역 상보적인) 뉴클레오타이드 서열의 양쪽 말단에서 반복되는 서열을 의미한다.
단백질 유비퀴틴화 신호는 프로테아좀에 의한 단백질 분해를 매개하는 신호이다.
본 발명에서, 분해 신호가 반복된 서열을 포함하며 이러한 반복된 서열이 동일한 서열 또는 상이한 서열인 경우, 상기 반복된 서열들은 바람직하게는 적어도 1개의 뉴클레오타이드로 된 링커에 의해 연결된다.
인공 정지 코돈은 단백질 번역의 조기 종료를 유도하기 위해 전사체에 의도적으로 포함되는 뉴클레오타이드 서열이다.
인핸서 서열은 유전자 전사를 증가시키는 서열이다.
본 발명에 따르면, 적합한 분해 신호는: (i) 짧은 데그론(degron) CL1로서, 잘못 접혀진(misfolded) 단백질과 구조적 유사성을 공유하며 따라서 유비퀴틴화 시스템에 의해 인지되는 C-말단 불안정화 펩타이드인, 짧은 데그론 CL131, 32, (ii) 유비퀴틴으로서, 공여자 단백질의 N-말단에서의 이의 융합이 직접 단백질 분해 또는 N-말단 규칙 경로를 통한 분해를 둘 다 매개하는, 유비퀴틴33 , 34 및 (iii) N-말단 PB29 데그론으로서, 9개 아미노산 길이의 펩타이드이며, CL1 데그론과 유사하게 유비퀴틴화 경로의 효소에 의해 인지되는 구조로 접히는 것으로 예측되는, N-말단 PB29 데그론35을 포함한다. 본 발명자들은, 다중 벡터 시스템에 분해 서열 또는 신호를 포함시키면 절단된 단백질의 발현을 경감시킴을 발견하였다. 일 경우에서, 본 발명자들은, CL1 분해 신호의 포함이, 시험관내 및 큰 돼지 망막 둘 다에서 전장 단백질 생성에 영향을 미치지 않으면서도 절단된 단백질을 5'-하프로부터 선택적으로 분해시킴을 발견하였다.
부가적으로는, 인공 정지 코돈이 삽입되어, mRNA의 조기 종료를 유발할 수 있다.
마이크로RNA(miR) 표적 서열, 인공 정지 코돈 또는 단백질 유비퀴틴화 신호는 절단된 단백질 생성물의 분해를 매개하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명에서, 분해 신호 서열은 반복된 서열, 예컨대 1개 초과의 마이크로RNA(miR) 표적 서열, 인공 정지 코돈 또는 단백질 유비퀴틴화 신호를 포함할 수 있으며, 상기 반복된 서열은 동일한 서열 또는 상이한 서열로서 적어도 2회 반복되고; 바람직하게는, 반복된 서열들은 적어도 1개의 뉴클레오타이드로 된 링커에 의해 연결된다.
망막에서 발현되는 miR 중에서, miR-let7b 또는 miR-26a는 높은 수준으로 발현되는 한편26 -29, miR-204 및 miR-124는 AAV-매개 이식유전자 발현을 RPE 또는 광수용기로 제한하는 것으로 나타났다30. Karali 등30은, 특정 세포 타입에서 단일 AAV 벡터에 포함된 유전자의 발현을 조정하는 데 있어서 miR 표적 부위의 효능을 시험하였다. Karali 등에서, miR 표적 부위를 표준(canonical) 발현 카세트(전체 리포터 유전자를 코딩함)에서, 코딩 서열의 다운스트림 및 폴리아데닐화 신호(polyA) 앞에 포함시켰다. Karali 등은 miR-204 또는 miR-124에 대한 miR 표적 부위를 사용하였고, 각각의 miR의 4개의 탠덤(tandem) 복사체를 사용하였다.
본 발명에서, miR은 또한 miR 모방체일 수 있다(문헌[Xiao, et al. J Cell Physiol 212:285-292, 2007]; [Wang Z Methods Mol Biol 676:211-223, 2011]). 처음에, 발명자들은 이들 전략을 다중 벡터 구축물에 적용하였고, 이러한 벡터로부터 생성된 절단된 단백질의 발현을 침묵시킬 수 있었다.
지난 10년 동안, 유전자 치료법은 수백 가지의 임상 시험에서 질병의 치료에 적용되어 왔다. 유전자를 인간 세포 내에 전달하기 위해 다양한 툴들이 개발되어 왔다. 본 발명에서, 전달 비히클이 환자에게 투여될 수 있다. 당업자는 적절한 투여 범위를 결정할 수 있을 것이다. 용어 "투여되는"은 바이러스 또는 비-바이러스 기술에 의한 전달을 포함한다. 비-바이러스 전달 메커니즘으로는, 지질 매개 형질감염, 리포좀, 면역리포좀, 리포펙신, 양이온성 면상 양친매성 물질(CFA; cationic facial amphiphile) 및 이들의 조합 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 바이러스 전달 중에서, 아데노-연관 바이러스를 포함한 유전자 조작된 바이러스가 현재 유전자 전달에 있어서 가장 인기있는 툴 중의 하나이다. 바이러스-기반 유전자 전달의 개념은, 바이러스가 관심 유전자(들) 또는 프로모터 및 인트론과 같은 조절 서열을 발현시킬 수 있도록 이러한 바이러스를 조작하는 것이다. 바이러스의 특정 적용 및 타입에 따라, 대부분의 바이러스 벡터들은, 숙주에서 야생형 바이러스로서 자유롭게 복제하는 이들의 능력을 방해하는 돌연변이를 함유한다. 몇몇 상이한 과(family) 유래의 바이러스들은 유전자 전달용 바이러스 벡터를 생성하기 위해 변형되어 왔다. 이들 바이러스로는, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 바큘로바이러스, 피코르나바이러스 및 알파바이러스 등이 있다. 본 발명은 바람직하게는 아데노-연관 바이러스를 이용한다. 대부분의 시스템은, 관심 유전자를 수용할 수 있는 벡터, 및 벡터-함유 감염성 바이러스 입자의 생성을 허용하기 위해 바이러스 구조 단백질 및 효소를 제공할 수 있는 헬퍼 세포를 함유한다. 아데노-연관 바이러스는, 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열, 게놈 구조, 병원성(pathogenicity) 및 숙주 범위가 상이한 바이러스 과이다. 이러한 다양성은 상이한 치료적 적용을 개발하기 위해, 상이한 생물학적 특징을 가진 바이러스를 사용하는 기회를 제공한다. 임의의 전달 툴을 이용하는 데 있어서, 효율, 소정의 조직 또는 세포 타입을 표적화하는 능력, 관심 유전자의 발현, 및 아데노-연관 바이러스-기반 시스템의 안전성이 유전자 치료법의 성공적인 적용에 중요하다. 최근 수년간 이들 연구 영역에 상당한 노력이 쏟아져 왔다. 유전자 발현을 변경하며, 전달을 표적화하며, 바이러스 역가를 향상시키고, 안전성을 높이기 위해 아데노-연관 바이러스-기반 벡터 및 헬퍼 세포에 다양한 변형들이 이루어져 왔다. 본 발명은 관심 유전자를 이러한 바이러스 벡터 내에 효율적으로 전달하는 작용을 한다는 점에서 이러한 디자인 공정의 향상을 나타낸다.
유전자 전달에 이상적인 아데노-연관 바이러스-기반 벡터는 효율적이며, 세포-특이적이며, 조절되고, 안전해야 한다. 전달 효율은 치료법의 효능을 결정할 수 있기 때문에 중요하다. 현재의 노력은 아데노-연관 바이러스 벡터를 이용하여 세포-타입-특이적인 감염 및 유전자 발현을 달성하는 것을 목적으로 한다. 또한, 아데노-연관 바이러스 벡터는, 이러한 치료법이 장기-지속적인 발현 또는 조절된 발현을 필요로 할 수 있기 때문에, 관심 유전자의 발현을 조절하도록 개발되고 있다. 안전성은, 대부분의 바이러스가 병원체이거나 병원성 잠재성을 가지기 때문에, 바이러스 유전자 전달을 위한 주요 쟁점이다. 유전자 전달 동안, 완전한 복제 잠재성을 가진 병원성 바이러스가 또한 환자에게 부주의하게 수여되지 않도록 하는 것이 중요하다.
아데노 -연관 바이러스( AAV )는 인간 및 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 작은 바이러스이다. 현재로서는 AAV는 질병을 유발하는 것으로 알려져 있지 않고, 결과적으로 상기 바이러스는 매우 약한 면역 반응을 야기한다. AAV를 사용한 유전자 치료 벡터는 분열중인 세포 및 휴지기 세포를 둘 다 감염시키고, 숙주 세포의 게놈 내에 통합되지 않은 채 염색체외 상태로 지속될 수 있다. 이러한 특징 덕분에, AAV는 유전자 치료용 바이러스 벡터의 제작 및 동종동계(isogenic) 인간 질병 모델의 제작을 위한 매우 매력적인 후보물질이 된다.
야생형 AAV는 다수의 특징들로 인해 유전자 치료법 연구자들로부터 상당한 관심을 끌었다. 이들 중 주된 특징은 상기 바이러스가 명백하게 병원성을 갖지 않는다는 점이다. 상기 바이러스는 또한, 비-분열중인 세포를 감염시킬 수 있고, 인간 염색체 19 내의 특정 부위(AAVS1로 지정됨)에서 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합되는 능력을 가진다. 이러한 특징은 상기 바이러스를 레트로바이러스보다 다소 더 예측 가능하게 만들며, 상기 레트로바이러스는 무작위 삽입 및 돌연변이생성 위험을 나타내며 이로 인해 가끔은 암 발병이 후속된다. AAV 게놈은 언급된 부위 내로 가장 빈번하게 통합되며, 한편 게놈 내로의 무작위 혼입은 무시할 만한 빈도로 발생한다. 그러나, 유전자 치료 벡터로서의 AAV의 개발은 이 벡터의 DNA로부터 rep 및 cap를 제거함으로써 이러한 통합 능력을 없앴다. 단일-가닥 벡터 DNA를 숙주 세포 DNA 폴리머라제 복합체에 의해 이중-가닥 DNA로 전환한 후, 요망되는 유전자와 이러한 유전자의 전사를 유도하기 위한 프로모터가 함께, 핵에서 콘카타머(concatamer) 형성에 일조하는 ITR들 사이에 삽입된다. AAV-기반 유전자 치료 벡터는 숙주 세포 핵에서 에피솜(episomal) 콘카타머를 형성한다. 비-분열중인 세포에서, 이들 콘카타머는 숙주 세포의 일생 동안 온전한 채 유지된다. 분열중인 세포에서, AAV DNA는, 에피솜 DNA가 숙주 세포 DNA를 따라 복제되지 않기 때문에 세포 분열 동안 상실된다. 숙주 게놈 내로의 AAV DNA의 무작위 통합은 검출 가능하지만, 매우 낮은 빈도로 발생한다. AAV는 또한, 외견상 중화 항체의 생성으로 제한된 매우 낮은 면역원성을 나타내는 한편, 이들 AAV는 명확하게 정의된 세포독성 반응을 유도하지 않는다. 휴지기 세포를 감염시키는 능력과 함께 이러한 특징은 인간 유전자 치료용 벡터로서 아데노바이러스를 능가하는 우세를 보여준다.
AAV 게놈, 전사체 및 프로테옴( proteome )
AAV 게놈은 포지티브-센스 또는 네거티브-센스인 단일-가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)으로 제작되며, 길이가 약 4.7 킬로베이스이다. 상기 게놈은 DNA 가닥의 양쪽 말단에 반전 말단 반복부(ITR) 및 2개의 개방형 해독틀(ORF; open reading frame): rep 및 cap를 포함한다. rep는 AAV 생활 주기에 필요한 Rep 단백질을 인코딩하는 4개의 오버래핑 유전자로 구성되고, cap는 캡시드 단백질: VP1, VP2 및 VP3의 오버래핑 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 이러한 캡시드 단백질들은 함께 상호작용하여 정20면체 대칭의 캡시드를 형성한다.
ITR 서열
반전 말단 반복부(ITR) 서열들은 이들의 대칭성 때문에 이러한 명칭이 부여되었으며, 상기 서열은 AAV 게놈의 효율적인 증식에 필요한 것으로 나타났다. 이들 서열의 또 다른 특성은 헤어핀(hairpin)을 형성하는 능력으로서, 이러한 헤어핀은 제2 DNA 가닥의 프리마제(primase)-독립적인 합성을 허용하는 소위 자가-프라이밍에 기여한다. ITR은 또한, 숙주 세포 게놈(인간에서는 19번째 염색체) 내로의 AAV DNA의 통합 및 이로부터의 구출, 뿐만 아니라 완전히 어셈블리된 데옥시리보뉴클레아제-내성 AAV 입자의 생성과 조합된 AAV DNA의 효율적인 캡시드화(encapsidation) 둘 다에 필요한 것으로 나타났다.
유전자 치료법과 관련하여, ITR은 치료 유전자의 옆에서 인 시스(in cis)로 필요한 유일한 서열인 것으로 보이며: 구조 유전자(cap) 및 패키징 유전자(rep)는 인 트랜스(in trans)로 전달될 수 있다. 이러한 가정 하에, 리포터 또는 치료 유전자를 함유하는 재조합 AAV(rAAV) 벡터의 효율적인 생성을 위해 많은 방법들이 구축되었다. 그러나, ITR이 효과적인 복제 및 캡시드화를 위해 인 시스로 필요한 유일한 요소가 아니라는 것 또한 공개되었다. 몇몇 연구 그룹들은, rep 유전자의 코딩 서열 내에서 시스-작용 Rep-의존적 요소(CARE; cis-acting Rep-dependent element)로 지정된 서열을 동정하였다. CARE는 인 시스로 존재 시, 복제 및 캡시드화를 증가시키는 것으로 나타났다.
2006년에, 11개의 AAV 혈청형이 보고된 바 있으며, 11번째는 2004년에 보고되었다. 공지된 혈청형들은 모두 다수의 다양한 조직 타입들 유래의 세포를 감염시킬 수 있다. 조직 특이성은 캡시드 혈청형에 의해 결정되고, 향성(tropism) 범위를 변경하기 위한 AAV 벡터의 슈도타이핑(pseudotyping)은 치료법에서 이러한 벡터를 사용하는 데 있어서 중요할 것으로 예상된다.
본 발명의 AAV 벡터 시스템에 사용되는 반전 말단 반복부(ITR) 서열은 임의의 AAV ITR일 수 있다. AAV 벡터에 사용되는 ITR은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 AAV 혈청형 2의 ITR 및 AAV 혈청형 5의 ITR을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터의 일 실시형태에서, ITR은 AAV 혈청형 2, 4, 5 또는 8로부터 유래한다. 본 발명에서, AVV 혈청형 2 및 AVV 혈청형 5의 ITR이 바람직하다. AAV ITR 서열은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, ITR2에 대해서는, GenBank 수탁 번호 AF043303.1; NC_001401.2; J01901.1; JN898962.1을 참조하고; ITR5에 대해서는, GenBank 수탁 번호 NC_006152.1을 참조함).
혈청형 2
혈청형 2(AAV2)는 현재까지 가장 광범위하게 연구되어 왔다. AAV2는 골격근, 뉴런, 혈관의 평활근 세포 및 간세포에 대한 자연적인 향성을 제시한다.
AAV2에 대해 3개의 세포 수용체: 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG), aVβ5 인테그린 및 섬유아세포 성장 인자 수용체 1(FGFR-1)이 보고되어 있다. HSPG는 1차 수용체로서 작용을 하는 한편, 후자의 2개는 공동-수용체 활성을 가지고 수용체-매개 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 AAV가 세포 안으로 들어가게 할 수 있다. 이들 연구 결과에 대해 Qiu, Handa 등이 반박을 하였다. HSPG가 1차 수용체로서 작용을 하지만, 세포외 기질에서의 이의 풍부도(abundance)는 AAV 입자를 스캐빈지(scavenge)하고 감염 효율을 약화시킬 수 있다.
혈청형 2 및 암
연구들에서, 혈청형 2 바이러스(AAV-2)가 건강한 세포에 해를 주지 않으면서 암세포를 명백하게 살해한다고 나타났다. 펜실베니아 펜 스테이트(Penn State) 의과 대학의 면역학 및 미생물학 교수인 크레이그 마이어(Craig Meyers)는 "우리의 연구 결과는, 대부분의 집단을 감염시키지만 공지된 유해 효과(ill effect)는 없는 아데노-연관 바이러스 타입 2가 다수의 타입의 암세포를 살해하지만 건강한 세포에는 아무런 영향이 없음을 제시한다"고 언급하였다.
다른 혈청형들
AAV2가 다양한 AAV-기반 연구에서 가장 인기있는 혈청형이긴 하지만, 다른 혈청형이 유전자 전달 벡터로서 더 효과적일 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, AAV6은 기도 상피 세포를 감염시키는 데 있어 훨씬 더 양호한 것으로 보이며, AAV7은 (AAV1 및 AAV5와 유사하게) 뮤린 골격근 세포의 매우 높은 형질도입 속도를 제시하며, AAV8은 간세포 및 광수용기에 형질도입하는 데 우수하고, AAV1 및 AAV5는 혈관 내피 세포로의 유전자 전달에 매우 효율적인 것으로 나타났다. 뇌에서, 대부분의 AAV 혈청형이 뉴런 향성을 보이는 한편, AAV5는 성상세포에도 형질도입된다. AAV1과 AAV2의 하이브리드인 AAV6은 또한, AAV2보다 더 낮은 면역원성을 나타낸다.
혈청형은 이들이 결합하는 수용체에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어 AAV4 및 AAV5 형질도입은 (이들 각각의 혈청형에 대한 상이한 형태의) 용해성 시알산에 의해 저해될 수 있고, AAV5는 혈소판-유래 성장 인자 수용체를 통해 세포 안으로 들어가는 것으로 나타났다.
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 구축물 또는 벡터 구축물을 포함하는 바이러스 벡터 시스템에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 바이러스 벡터 시스템은 AAV 시스템이다. 이종성 폴리뉴클레오타이드 또는 구축물을 포함하는 바이러스 및 비리온의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. AAV의 경우, 세포는 AAV 헬퍼 기능에 적합한 아데노바이러스, 또는 아데노바이러스 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 구축물을 이용하여 공동감염되거나 형질감염될 수 있다. 물질 및 방법의 예는 예를 들어, 미국 특허 8,137,962 및 6,967,018에 기재되어 있다. 본 발명의 AAV 바이러스 또는 AAV 벡터는 비제한적으로 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11을 포함한 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 구체적인 실시형태에서, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8 또는 AAV9 혈청형이 이용된다. 일 실시형태에서, AAV 혈청형은 캡시드 표면 상에서 하나 이상의 티로신에서 페닐알라닌(Y-F) 돌연변이를 제공한다. 구체적인 실시형태에서, AAV는 위치 733에서 티로신에서 페닐알라닌 돌연변이(Y733F)를 가진 AAV8 혈청형이다.
본 발명에 따른 벡터 시스템에 의한 하나 이상의 치료 유전자 또는 조절 서열, 예컨대 프로모터 또는 인트론의 전달은 단독으로 사용되거나, 다른 치료 또는 치료의 구성성분과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 구축물 시스템 또는 바이러스 벡터 시스템을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 배양된 세포 또는 원발성 세포, 즉 유기체, 예를 들어 인간으로부터 직접 단리된 세포일 수 있다. 숙주 세포는 부착성 세포 또는 현탁성 세포, 즉 현탁액 내에서 성장하는 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당업계에 알려져 있으며, 그 예로는 DH5α, 이. 콜라이(E. coli) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포, 원숭이 VERO 세포, COS 세포, HEK293 세포 등이 있다. 세포는 인간 세포 또는 또 다른 동물 유래일 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 광수용기 세포 또는 RPE 세포이다. 구체적인 실시형태에서, 세포는 추상 세포이다. 세포는 또한, 근육 세포, 특히 골격근 세포, 폐 세포, 췌장 세포, 간 세포, 신장 세포, 장 세포, 혈액 세포일 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 세포는 인간 추상 세포 또는 간상 세포이다. 적절한 숙주의 선택은 본원 교시로부터 당업자의 재량 내에 있는 것으로 생각된다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다. 세포는 본 발명의 바이러스 벡터 시스템에 제공된 뉴클레오타이드 서열을 발현할 수 있다.
당업자는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 숙주 세포 내에 혼입시키는 표준 방법, 예를 들어 형질감염, 리포펙션, 전기천공, 현미주사, 바이러스 감염, 열 충격, 막의 화학적 투과 후 형질변환, 또는 세포 융합에 대해 잘 알고 있다. 본 발명의 구축물 또는 벡터 시스템은 또한, 생체내에서 당업계에 알려진 방법, 예컨대 형질감염, 현미주사, 전기천공, 칼슘 포스페이트 석출의 사용 및 볼리스틱 방법(biolistic method)에 의해 네이키드(naked) DNA로서 도입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포 또는 유전자 조작된 숙주 세포"는, 본 발명의 구축물 시스템 또는 바이러스 벡터 시스템을 이용하여 형질도입, 형질변환 또는 형질감염된 숙주 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드 서열" 및 "구축물"은 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 중합체 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 지칭하고, 다르게 제한되지 않는 한, 천연-발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 작용할 수 있는 공지된 천연 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 것이다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 전장 서열뿐만 아니라 해당 전장 서열 유래의 더 짧은 서열을 둘 다 포함한다. 특정 폴리뉴클레오타이드 서열은 본래의 서열, 또는 특정 숙주 세포에서 코돈 선호도(codon preference)를 제공하기 위해 도입될 수 있는 서열의 축퇴 코돈(degenerate codon)을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 범위 내에 속하는 폴리뉴클레오타이드 서열은, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 서열과 특이적으로 혼성화하는 서열을 더 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 개별 가닥으로서 또는 듀플렉스 내에서 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 둘 다 포함한다.
본 발명은 또한, 표준의 엄격한 조건 및 표준 방법 하에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열과의 혼성화를 허용하기 위해 해당 폴리뉴클레오타이드 서열과 충분히 상동성인 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드 분자를 고려한다(문헌[Maniatis, T. et al, 1982]).
본 발명은 또한, 구축물이 발현되는 것으로 의도된 숙주 세포 내에서 기능성 조절 요소를 포함할 수 있는 구축물 시스템에 관한 것이다. 당해 기술분야의 당업자는 적절한 숙주 세포, 예를 들어 포유류 또는 인간 숙주 세포에 사용하기 위한 조절 요소를 선택할 수 있다. 조절 요소로는 예를 들어, 프로모터, 전사 종결 서열, 번역 종결 서열, 인핸서, 신호 펩타이드, 분해 신호 및 폴리아데닐화 요소 등이 있다. 본 발명의 구축물은 요망되는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용하는 것으로 고려되는 프로모터로는, 본래의(native) 유전자 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(KF853603.1, bp 149-735), 키메라 CMV/닭 베타-액틴 프로모터(CBA) 및 절단된 형태의 CBA(smCBA) 프로모터(US8298818, 및 AAVGC1로 처리된 생후 구아닐레이트 사이클라제-1 녹아웃 마우스 망막의 추상체에서 광-구동 추상체 어레스틴 전좌(Light-Driven Cone Arrestin Translocation in Cones of Postnatal Guanylate Cyclase-1 Knockout Mouse Retina Treated with AAVGC1)), 로돕신 프로모터(NG_009115, bp 4205-5010), 광수용기간 레티노이드 결합 단백질 프로모터(interphotorecetpor retinoid binding protein promoter; NG_029718.1, bp 4777-5011), 난황상(vitelliform) 황반 이영양증 2 프로모터(NG_009033.1, bp 4870-5470), PR-특이적인 인간 G 단백질-커플링된 수용체 키나제 1(hGRK1; PR-specific human G protein-coupled receptor kinase 1; AY327580.1 bp1793-2087 또는 bp 1793-1991)(문헌[Haire et al. 2006]; 미국 특허 8,298,818) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 그렇지만, 당업계에 알려진 임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 프로모터는 CMV 프로모터 또는 hGRK1 프로모터이다. 일 실시형태에서 프로모터는, 하나의 조직 또는 한 그룹의 조직에서는 선택적인 활성을 보이지만 다른 조직에서는 활성이 더 낮거나 활성이지 않은, 조직-특이적인 프로모터이다. 일 실시형태에서, 프로모터는 수용기-특이적인 프로모터이다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 추상 세포-특이적인 및/또는 간상 세포-특이적인 프로모터이다.
바람직한 프로모터는 CMV, GRK1, CBA 및 IRBP 프로모터이다. 보다 바람직한 프로모터는 하이브리드 프로모터로서, 이는 다양한 프로모터들 유래의 조절 요소들을 조합한 것이다(예로서, CMV 프로모터 유래의 인핸서, CBA 프로모터 및 Sv40 키메라 인트론을 조합한 키메라 CBA 프로모터로서, 본원에서 CBA 하이브리드 프로모터로 지칭됨).
프로모터는 당업계에 알려진 표준 기술을 사용하여 구축물 내에 혼입될 수 있다. 프로모터의 다중 복사체 또는 다중 프로모터가 본 발명의 벡터에 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 프로모터는, 이의 천연 유전적 환경에서 전사 시작 부위로부터 유래한 것이므로, 전사 시작 부위로부터 대략 동일한 거리에 위치할 수 있다. 이러한 거리에 대한 약간의 변화는 프로모터 활성의 실질적인 감소가 없을 시 허용된다. 본 발명의 시스템에서, 전사 시작 부위는 전형적으로, 3' 구축물이 아닌 5' 구축물에 포함된다. 다른 실시형태에서, 전사 시작 부위는 분해 신호의 업스트림에 있는 3' 구축물에 포함될 수 있다.
본 발명의 구축물은 선택적으로, 전사 종결 서열, 번역 종결 서열, 신호 펩타이드 서열, 내부 리보솜 도입 부위(IRES; internal ribosome entry site), 인핸서 요소 및/또는 전사-후 조절 요소, 예컨대 마멋 간염 바이러스(WHV; Woodchuck hepatitis virus) 전사후 조절 요소(WPRE)를 함유할 수 있다. 전사 종결 영역은 전형적으로, 진핵 또는 바이러스 유전자 서열의 3' 비번역된 영역으로부터 수득될 수 있다. 전사 종결 서열은 효율적인 종결을 제공하기 위해 코딩 서열의 다운스트림에 위치할 수 있다. 본 발명의 시스템에서, 전사 종결 부위는 전형적으로, 5' 구축물이 아닌 3' 구축물에 포함된다.
신호 펩타이드 서열은, 작동적으로 연결된 폴리펩타이드를 특정 세포소기관 구획으로부터 단백질 작용 부위 및 세포외 환경에 이르기까지 광범위한 번역-후 세포 도착지로 재배치시키는 책임이 있는 정보를 인코딩하는 아미노 말단 서열이다. 인핸서는 유전자 전사를 증가시키는 시스-작용 요소로서, 이 또한 벡터 내에 포함될 수 있다. 인핸서 요소는 당업계에 알려져 있으며, 이러한 요소로는 CaMV 35S 인핸서 요소, 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 프로모터 인핸서 요소 및 SV40 인핸서 요소 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 구조 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA의 폴리아데닐화를 지시하는(direct) DNA 서열 또한, 벡터에 포함될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에서, 코딩 서열은 천연 엑손-엑손 연접에서 제1 및 제2 단편 또는 부분(5' 말단 부분 및 3' 말단 부분)으로 분할된다. 바람직하게는 코딩 서열의 각각의 단편 또는 부분은 그 크기가 60 kb를 초과하지 않아야 하며, 바람직하게는 코딩 서열의 각각의 단편 또는 부분은 그 크기가 50 Kb, 40 Kb, 30 Kb, 20 Kb, 10 Kb를 초과하지 않아야 한다. 바람직하게는, 코딩 서열의 각각의 단편 또는 부분은 그 크기가 약 2 Kb, 2.5 Kb, 3 Kb, 3.5 Kb, 4 Kb, 4.5 Kb, 5 Kb, 5.5 Kb, 6 Kb, 6.5 Kb, 7 kb, 7.5 Kb, 8 Kb, 8.5 Kb, 9 Kb, 9.5 Kb일 수 있거나 그보다 더 작은 크기일 수 있다.
스플라이스오솜(spliceosomal) 인트론은 종종 진핵 단백질-코딩 유전자의 서열 내에 체류한다. 상기 인트론 내에서, 공여자 부위(인트론의 5' 말단), 분지(branch) 부위(인트론의 3' 말단 부근) 및 수여자 부위(인트론의 3' 말단)가 스플라이싱에 필요하다. 스플라이스 공여자 부위는, 크기가 더 크며 더 적게 고도로 보존된 영역 내에서 인트론의 5' 말단에 대체로 변하지 않는(invariant) 서열 GU를 포함한다. 인트론의 3' 말단에서 스플라이스 수여자 부위는 대체로 변하지 않는 AG 서열을 가진 인트론으로 종결된다. AG로부터 업스트림(5'-방향)에, 피리미딘(C 및 U)이 풍부한 영역, 또는 폴리피리미딘 트랙이 존재한다. 폴리피리미딘 트랙으로부터 업스트림에 분지점이 존재하고, 이러한 분지점은 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 스플라이싱 수여자 신호 및 스플라이싱 공여자 신호는 또한 당업자에 의해, 당업계에 알려진 서열들 중에서 선택될 수 있다.
단백질의 분해를 매개하며, 다중 바이러스 시스템의 맥락에서 이전에는 전혀 사용된 적이 없는 신호로는, 잘못 접혀진 단백질과 구조적 유사성을 공유하며 따라서 유비퀴틴화 시스템에 의해 인지되는 C-말단 불안정화 펩타이드인 CL1, CL2, CL6, CL9, CL10, CL11, CL12, CL15, CL16, SL17과 같은 짧은 데그론, 공여자 단백질의 N-말단에서의 융합이 직접 단백질 분해 또는 N-말단 규칙 경로를 통한 분해를 둘 다 매개하는 유비퀴틴, 9개 아미노산 길이의 펩타이드이며 CL1 데그론과 유사하게 유비퀴틴화 경로의 효소에 의해 인지되는 구조로 접히는 것으로 예측되는 N-말단 PB29 데그론, mRNA의 조기 종결을 유발하는 인공 정지 코돈, 마이크로RNA(miR) 표적 서열 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 실험실에서 당업자에 의해 인공적으로 제작될 수 있는 변이체 서열들 외에도 자연적으로 발견되는 단백질의 다수의 변이체 서열들이 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 본원에서 구체적으로 예시된 것들, 뿐만 아니라 변이체들이 요망되는 기능적 활성을 보유하는 한 이들의 임의의 천연 변이체뿐만 아니라 인공적으로 제작될 수 있는 임의의 변이체를 포함한다. 또한, 폴리펩타이드 서열 내에서의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 제외하고는 본원에 예시된 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드는, 이들 변이체 폴리펩타이드가 본원에서 구체적으로 예시된 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 관련된 기능적 활성을 보유하는 한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 기능에 영향을 미치지 않는, 폴리펩타이드 내에서의 보존적 아미노산 치환이 본 발명의 범위 내에 포함될 것이다. 따라서, 본원에 개시된 폴리펩타이드는 상기 고찰된 바와 같이 구체적으로 예시된 서열의 변이체 및 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다. 이들 뉴클레오타이드 서열은 본원에 제시된 단백질 및 아미노산 서열에 대한 지식을 갖고 있는 당업자에 의해 쉽게 구축될 수 있다. 당업자가 이해하게 될 바와 같이, 유전자 코드의 축퇴성은 당업자로 하여금, 특정 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 여러 가지 뉴클레오타이드 서열들을 구축할 수 있게 한다. 특정 뉴클레오타이드 서열에 대한 선택은 예를 들어, 특정 발현 시스템 또는 숙주 세포의 코돈 사용빈도(codon usage)에 따라 다를 수 있었다. 구체적으로 예시된 것 이외의 아미노산 치환을 본 발명의 폴리펩타이드에 가진 폴리펩타이드 또한, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산은, 치환된 아미노산을 가진 폴리펩타이드가 아미노산이 치환되지 않은 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 한, 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 비-천연 아미노산의 예로는, 오르니틴, 시트룰린, 하이드록시프롤린, 호모세린, 페닐글리신, 타우린, 요오도티로신, 2,4-다이아미노부티르산, a-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 2-아미노 부티르산, γ-아미노 부티르산, ε-아미노 헥산산, 6-아미노 헥산산, 2-아미노 이소부티르산(isobutyiic acid), 3-아미노 프로피온산, 노르류신(norleucine), 노르발린(norvaline), 사르코신(sarcosine), 호모시트룰린, 시스테산(cysteic acid), τ-부틸글리신, τ-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예컨대 β-메틸 아미노산, C-메틸 아미노산, N-메틸 아미노산, 및 일반적인 아미노산 유사체 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 비-천연 아미노산은 또한, 유도체화된 측기(derivatized side group)를 가진 아미노산을 포함한다. 더욱이, 단백질 내 임의의 아미노산은 D(우선성(dextrorotary)) 형태 또는 L(좌선성(levorotary)) 형태일 수 있다. 아미노산은 일반적으로 하기 부류들: 비극성, 비전하성 극성, 염기성 및 산성으로 분류될 수 있다. 하나의 부류의 아미노산을 가진 폴리펩타이드가 동일한 부류의 또 다른 아미노산으로 대체되는 보존적 치환은, 상기 치환을 가진 폴리펩타이드가 상기 치환을 갖지 않은 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 활성을 여전히 실질적으로 보유하는 한, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 표 1은 각각의 부류에 속하는 아미노산의 예들의 목록을 제공한다.
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또한, 폴리뉴클레오타이드 서열 내에서의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 제외하고는 본원에 예시된 폴리뉴클레오타이드와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드는, 이들 변이체 폴리뉴클레오타이드가 본원에 구체적으로 예시된 폴리뉴클레오타이드와 실질적으로 동일한 관련된 기능적 활성을 보유하는 한, 본 발명의 범위 내에 포함된다(예를 들어, 이들은 예시된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 것과 동일한 아미노산 서열 또는 동일한 기능적 활성을 가진 단백질을 인코딩함). 따라서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 상기 고찰된 바와 같이 구체적으로 예시된 서열의 변이체 및 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 또한, 표준의 엄격한 조건 및 표준 방법 하에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열과의 혼성화를 허용하기 위해 해당 서열과 충분히 상동성인 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드 분자를 고려한다(문헌[Maniatis, T. et al, 1982]). 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 또한, 본원에 예시된 폴리뉴클레오타이드와 보다 특정한 동일성 및/또는 유사성 범위 측면에서 정의될 수 있다. 서열 동일성은 전형적으로 60% 초과, 바람직하게는 75% 초과, 보다 바람직하게는 80% 초과, 보다 더 바람직하게는 90% 초과일 수 있고, 95% 초과일 수 있다. 서열의 동일성 및/또는 유사성은 본원에 예시된 서열과 비교하여 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그보다 클 수 있다. 다르게 명시되지 않는 한 본원에 사용된 바와 같이, 2개의 서열들의 서열 동일성% 및/또는 유사성%는 Karlin 및 Altschul(1993)에서 변형된 Karlin 및 Altschul(1990)의 알고리즘을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 알고리즘은 Altschul 등(1990)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내로 통합된다. 요망되는 서열 동일성%를 가진 서열을 수득하기 위해 BLAST 검색은 NBLAST 프로그램을 이용하여 수행될 수 있으며, 여기서 점수 = 100, 단어길이 = 12이다. 비교용의 갭핑된 정렬(gapped alignment)을 수득하기 위해, 갭핑된 BLAST가 Altschul 등(1997)에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. BLAST 및 갭핑된 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(NBLAST 및 XBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. NCBI/NIH 웹사이트를 참조한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 벡터 시스템, 바이러스 벡터 시스템 또는 숙주 세포를 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제와 선택적으로 조합하여 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 실시의 측면에서 선택될 수 있다. 약제학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 - 또는 이것들 외에도 - 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들), 및 표적 부위 내로의 바이러스 도입을 돕거나 증가시킬 수 있는 다른 담체 제제(예를 들어, 지질 전달 시스템)를 포함할 수 있다. 구축물 또는 벡터는 생체내 또는 생체외로 투여될 수 있다.
소정량의 화합물을 포함하며 국소 또는 비경구 투여용으로 맞춰진 약제학적 조성물은 본 발명의 바람직한 실시형태를 구성한다. 비경구 투여에 있어서, 조성물은 멸균 수용액 형태에서 최상으로 사용될 수 있으며, 이러한 수용액은 다른 성분들, 예를 들어 용액을 혈액과 등장성으로 만들기에 충분한 염 또는 단당류를 함유할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 선호할만하게는 망막하 주사를 통해 망막에 전달될 수 있거나, 또는 상기 조성물은 또한, 비-침습적인 절차를 통해 망막에 전달될 수 있는 주사용 현탁액, 안약(eye lotion) 또는 안 연고 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 환자, 특히 인간에게 투여되는 용량은 치사 독성 없이, 바람직하게는 부작용 또는 사망률(morbidity)을 허용 가능한 수준 이하로 유발하면서, 환자에서 합리적인 시간 프레임에 걸쳐 치료 반응을 달성하기에 충분해야 한다. 당업자는, 투여량이 대상의 (건강) 상태, 대상의 체중, 동시 수행되는(concurrent) 치료가 있다면 그 종류, 치료 빈도, 치료비(therapeutic ratio), 뿐만 아니라 병리학적 질환의 중증도 및 단계를 포함한 여러 가지 인자들에 따라 다를 것임을 인지할 것이다.
본 발명의 방법은 인간 및 다른 동물에게 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자" 및 "대상"는 상호호환적으로 사용되고, 이러한 인간 및 비-인간 종을 포함하고자 한다. 마찬가지로, 본 발명의 시험관내 방법은 이러한 인간 및 비-인간 종의 세포 상에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 구축물 시스템, 바이러스 벡터 시스템 또는 숙주 세포를 하나 이상의 용기에 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 선택적으로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 다른 구성성분, 부가물 또는 보조제를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 상기 키트의 벡터 시스템을 투여하는 방법을 기재하고 있는 지침서 또는 패키징 물질을 포함한다. 키트의 용기는 임의의 적합한 물질, 예를 들어 유리, 플라스틱, 금속 등으로 제작된 것이며 임의의 적합한 크기, 모양 또는 배치로 제작된 것일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 구축물 시스템, 바이러스 벡터 시스템 또는 숙주 세포는 키트에서 고형으로서 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 구축물 시스템, 바이러스 벡터 시스템 또는 숙주 세포는 키트에서 액체 또는 용액으로서 제공된다. 일 실시형태에서, 키트는 본 발명의 구축물 시스템, 바이러스 벡터 시스템 또는 숙주 세포를 액체 또는 용액 형태로 함유하는 앰플 또는 주사기를 포함한다.
본 발명은 또한, 유전자 치료법에 의해 개체를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서, 본 조성물은 본 발명의 벡터 시스템, 바이러스 벡터 시스템 또는 숙주 세포에 의해 생성되거나 이로부터 수득되는 하나 이상의 전달 가능한 치료적 및/또는 진단적 이식유전자(들) 또는 바이러스 입자를 포함하는 상기 벡터 시스템, 바이러스 벡터 시스템 또는 숙주 세포를 치료적 유효량으로 포함한다. 약제학적 조성물은 인간 또는 동물에게 사용하기 위한 것일 수 있다. 전형적으로, 일반적으로 숙련된 임상의는, 개별 대상에게 가장 적합할 뿐만 아니라 특정 개체의 연령, 체중 및 반응성 및 투여 경로에 따라 달라질 실제 투여량을 결정할 것이다. 투약 범위는 각각의 벡터의 1x10e10개 내지 1x10e15개 게놈 복사체/kg이며, 선호할만하게는 각각의 벡터의 1x10e11개 내지 1x10e13개 게놈 복사체/kg가 인간에서 효과적인 것으로 예상된다. 투약 범위는 각각의 벡터의 1x10e10개 내지 1x10e15개 게놈 복사체/눈(eye)이며, 선호할만하게는 1x10e10개 내지 1x10e13개가 안내(ocular) 투여에 효과적인 것으로 예상된다.
투여량 섭생 및 투여되어야 하는 유효량은 일반적으로 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 투여는 단일 투약 또는 다중 투약 형태일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드, 발현 구축물 및 벡터를 사용하여 유전자 치료법을 수행하는 일반적인 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어 문헌[Gene Therapy: Principles and Applications, Springer Verlag 1999]; 및 미국 특허 6,461,606, 6,204,251 및 6,106,826 참조). 본 발명은 또한, 선택된 폴리펩타이드를 세포에서 발현시키는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 방법은 선택된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본 발명의 벡터 시스템을 세포에 혼입시키는 단계, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 상기 세포에서 발현시키는 단계를 포함한다. 선택된 폴리펩타이드는 세포에 대해 이종성인 폴리펩타이드일 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 포유류 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 광수용기 세포 또는 RPE 세포이다. 세포는 또한, 근육 세포, 특히 골격근 세포, 폐 세포, 췌장 세포, 간 세포, 신장 세포, 장(intestine) 세포, 혈액 세포일 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 세포는 추상 세포 또는 간상 세포이다. 구체적인 실시형태에서, 세포는 인간 추상 세포 또는 간상 세포이다.
서열
AP1 (서열 번호 24)
AP2 (서열 번호 25)
AK seqA (서열 번호 22)
AK seqB (서열 번호 23)
AP(서열 번호 26)
좌측 ITR2 (서열 번호 29)
우측 ITR2 (서열 번호 30)
좌측 ITR5 (서열 번호 31)
우측 ITR5 (서열 번호 32)
CMV
CMV 인핸서 (서열 번호 33)
CMV 프로모터 (서열 번호 34)
키메라 인트론 (SV40 인트론 ) (서열 번호 35)
hGRK1 프로모터 (서열 번호 36)
CBA 하이브리드 프로모터
CMV 인핸서 (서열 번호 37)
CBA 프로모터 (서열 번호 38)
IRBP (서열 번호 39)
스플라이싱 공여자 신호 (서열 번호 27)
miR-let 7b 분해 신호 (서열 번호 40)
4xmiR-let 7b 분해 신호 (서열 번호 41)
miR-26a 분해 신호 (서열 번호 13)
4xmiR-26a 분해 신호 (서열 번호 18)
miR-204 분해 신호 (서열 번호 11)
miR-124 분해 신호 (서열 번호 12)
3xmiR-204+3xmiR-124 분해 신호 (서열 번호 17)
CL1 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 16)
아미노산 서열: (서열 번호 1)
CL2 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 42)
아미노산 서열: (서열 번호 2)
CL6 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 43)
아미노산 서열: (서열 번호 3)
CL9 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 44)
아미노산 서열: (서열 번호 4)
CL10 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 45)
아미노산 서열: (서열 번호 5)
CL11 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 46)
아미노산 서열: (서열 번호 6)
CL12 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 47)
아미노산 서열: (서열 번호 7)
CL15 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 48)
아미노산 서열: (서열 번호 8)
CL16 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 49)
아미노산 서열: (서열 번호 9)
SL17 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 50)
아미노산 서열: (서열 번호 10)
PB29 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 19)
아미노산 서열: (서열 번호 15)
짧은 PB29 분해 신호 (데그론)
뉴클레오타이드 서열: (서열 번호 20)
아미노산 서열: (서열 번호 14)
3x PB29 분해 신호 (데그론) (서열 번호 21)
인공 정지 코돈 (서열 번호 51)
스플라이싱 수여자 신호 (서열 번호 28)
SV40 폴리 A (서열 번호 52)
ABCA4 5' (서열 번호 53)
hGRK1-5' ABCA4+AK+CL1 전장 서열 (서열 번호 54)
Figure 112017095877839-pct00003
Figure 112017095877839-pct00004
Figure 112017095877839-pct00005
범례:
ITR: 대문자 볼드체
hGRK 프로모터: 소문자 볼드 이탤릭체
ABCA4 5': 소문자 밑줄
SDS: 소문자 볼드체
AK: 대문자
CL1: 소문자 이탤릭체 밑줄
Figure 112017095877839-pct00006
Figure 112017095877839-pct00007
범례:
ITR: 대문자 볼드체 밑줄
AK: 대문자
SAS: 소문자 볼드체
ABCA4 3': 소문자 밑줄
SV40 polyA: 소문자 볼드 이탤릭체
CMV 5' ABCA4 -SD-AK 전장 서열 (서열 번호 57)
AK-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 전장 서열 (서열 번호 58).
CMV 5' ABCA4-SD-AP1 전장 서열 (서열 번호 59)
AP1-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 전장 서열 (서열 번호 60)
CMV 5' ABCA4-SD-AP2 전장 서열 (서열 번호 61)
AP2-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 전장 서열 (서열 번호 62)
CMV 5' ABCA4-SD-AP 전장 서열 (서열 번호 63)
AP-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 전장 서열 (서열 번호 64)
hGRK1 5' ABCA4-SD-AP1 전장 서열 (서열 번호 65)
GRK1 5' ABCA4-SD-AP2 전장 서열 (서열 번호 66)
ITR5-CMV 5' ABCA4-SD-AK-ITR2 전장 서열 (서열 번호 67)
ITR2-AK-SA-3' ABCA4-SV40-ITR5 전장 서열 (서열 번호 68)
ITR5-CBA 5' MYO7A-SD-AK-ITR2 전장 서열 (서열 번호 69)
ITR2-AK-SA-3' MYO7A-HA-BGH-ITR5 전장 서열 (서열 번호 70)
CMV 5' ABCA4-3XFLAG-SD-AK-4xmiR26a 전장 서열 (서열 번호 71)
CMV 5' ABCA4-3XFLAG-SD-AK-3xmiR204+3xmir124 전장 서열 (서열 번호72)
CMV 5' ABCA4-3XFLAG-SD-AK-CL1 전장 서열 (서열 번호 73)
AK-STOP-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 전장 서열 (서열 번호 74)
AK-PB29-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 전장 서열 (서열 번호 75)
AK-3XPB29-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 전장 서열 (서열 번호 76)
AK-유비퀴틴-SA-3' ABCA4-3XFLAG-SV40 전장 서열 (서열 번호 77).
본 발명은 이제 하기 도면을 참조로 하여 비제한적인 실시예에 의해 예시될 것이다.
도 1. 본 발명의 실시예의 다중-벡터 전략의 모식도이다.　ITR: 반전 말단 반복부; Prom: 프로모터; CDS, 코딩 서열; SD, 스플라이싱 공여자 신호; RR: 재조합유전성 영역, AK 또는 알칼리 포스파타제(AP1, AP2 및 AP); Deg Sig; 분해 신호(표 2 참조); SA, 스플라이싱 수여자 신호; pA, 폴리아데닐화 신호. 도 1A 및 도 1C: 트랜스스플라이싱 및 재조합유전성 영역을 포함하는 (이중 또는 삼중) 하이브리드 벡터 전략이며, 본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면 도 1B 및 도 1D: (이중 또는 삼중) 벡터 오버래핑 벡터 전략이다. 부가적인 예들에 대해서는, 도 12 내지 도 14를 참조한다.
도 2. 상동성의 AK, AP1 및 AP2 영역을 사용한 효율적인 ABCA4 단백질 발현
(도 2a, 도 2c)는 ABCA4를 인코딩하는 (도 2a) 이중 AAV2/2(AAV 혈청형 2로서, AAV2 유래의 상동성 ITR을 가짐) 벡터로 감염된 HEK293 세포(50 ㎍/레인), 또는 (도 2c) 이중 AAV2/8(AAV 혈청형 8로서, AAV2 유래의 상동성 ITR을 가짐) 벡터로 주사된 C57BL/6 망막(전체 망막 용해물)의 대표적인 웨스턴 블롯 분석이다. 화살표는 전장 단백질을 가리키며, 분자량 사다리는 좌측에 도시되어 있다. (도 2b)는 (도 2a)의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 ABCA4 단백질 밴드의 정량화이다. (도 2a)에서의 ABCA4 밴드의 강도를 필라민(Filamin) A 밴드의 강도로 나누었다. 막대 그래프는 단백질의 발현을 이중 AAV 하이브리드 AK 벡터에 대한 퍼센트로서 보여주며, 평균값은 상응하는 막대의 상부에 표시되어 있다. 값은 평균 ± s.e.m.(평균의 표준 오차)으로 나타낸다. *pANOVA < 0.05; 별표는 AK, AP1 및 AP2의 유의한 차이를 가리킨다. (도 2a 내지 도 2c) AK: 이중 AAV 하이브리드 AK 벡터에 의해 감염된 세포 또는 주사된 눈; AP1: 이중 AAV 하이브리드 AP1 벡터에 의해 감염된 세포 또는 주사된 눈; AP2: 이중 AAV 하이브리드 AP2 벡터에 의해 감염된 세포 또는 주사된 눈; AP: 이중 AAV 하이브리드 AP 벡터에 의해 감염된 세포; neg: 음성 대조군으로서, 3'-하프 벡터 또는 EGFP 발현 벡터에 의해 감염된 세포 또는 주사된 눈. α-3xflag: 항-3xflag 항체를 이용한 웨스턴 블롯; α-필라민 A, 로딩 대조군으로서 사용되는 항-필라민 A 항체를 이용한 웨스턴 블롯; α-디스페린(α-Dysferlin), 로딩 대조군으로서 사용되는 항-디스페린 항체를 이용한 웨스턴 블롯.
도 3. 이종성 ITR2 및 ITR5를 가진 벡터의 게놈 및 형질도입 효율
(도 3a)는 상동성(2:2) 또는 이종성(5:2 또는 2:5) ITR을 가진 3 x 1010 GC의 5'-ABCA4-하프 벡터 및 3'-ABCA4-하프 벡터 둘 다로부터 추출한 DNA, 및 상동성 ITR2를 가진 대조군 AAV 조제물(CTRL)의 알칼리 서던 블롯 분석이다. 각각의 게놈의 예상된 크기는 각각의 레인 아래에 표시되어 있다. 분자량 마커(kb)는 좌측 5': 5'-하프 벡터; 3': 3'-하프 벡터 상에 표시되어 있다. (도 3b 내지 도 3d)는 ITR2 역가(도 3b 및 도 3c) 또는 이식유전자 역가(도 3b 및 도 3d)를 기반으로 한 m.o.i.에서 이종성 ITR2 및 ITR5, 또는 상동성 ITR2를 가진 이중 AAV2/2 하이브리드 ABCA4 벡터에 의해 감염된 HEK293 세포의 대표적인 웨스턴 블롯 분석 및 정량화이다. 웨스턴 블롯 이미지(도 3b)는 n = 3개의 독립적인 실험을 대표하며; 정량화(도 3c 및 도 3d)는 n = 3개의 독립적인 실험으로부터 유래된 것이다. (도 3b)에서, 상부 화살표는 전장 ABCA4 단백질을 가리키고, 하부 화살표는 절단된 단백질을 가리키며; 분자량 사다리는 좌측 상에 표시되어 있다. 로딩된 단백질의 ㎍은 이미지 아래에 표시되어 있다. α-3xflag: 항-3xflag 항체를 이용한 웨스턴 블롯이며; α-필라민 A: 로딩 대조군으로서 사용된 항-필라민 A 항체를 이용한 웨스턴 블롯이다. (도 3c 및 도 3d)는 ITR2 역가(도 3c) 또는 이식유전자 역가(도 3d)를 기반으로 한 용량의 벡터에 의해 감염된 세포의 웨스턴 블롯으로부터, 전장 ABCA4 단백질 및 절단된 ABCA4 단백질의 밴드를 정량화한 것이다. 막대 그래프는, 필라민 A 밴드의 강도로 나눈 전장 단백질 및 절단된 단백질 밴드의 강도, 또는 절단된 단백질 밴드의 강도로 나눈 전장 단백질 밴드의 강도를 상응하는 레인에 보여준다. MYO7A를 인코딩하는 이종성 ITR2 및 ITR5, 또는 상동성 ITR2를 가진 이중 AAV2(AAV 혈청형 2) 하이브리드 벡터에 의해 감염된 HEK293 세포의 대표적인 웨스턴 블롯 분석 및 정량화가 도시되어 있다(도 3e, 도 3f). 웨스턴 블롯 이미지(도 3e)는 대표적인 것이고, 정량화(도 3f)는 n = 3개의 독립적인 실험으로부터 유래된 것이다. (도 3e)에서, 상부 화살표는 전장 단백질을 가리키며, 하부 화살표는 절단된 단백질을 가리키고, 분자량 사다리는 좌측 상에 표시되어 있다. 로딩된 단백질의 ㎍은 이미지의 아래에 표시되어 있다. (도 3f)는 웨스턴 블롯 분석으로부터의 MYO7A 단백질 밴드의 정량화이다.
평균값은 상응하는 막대 위에 표시되어 있다. 값은 평균 ± s.e.m.으로서 나타나 있다. *p 스튜던츠 t 테스트 ≤ 0.05.
2:2 2:2: AAV2 유래의 상동성 ITR을 가진 이중 AAV 하이브리드 벡터에 의해 감염된 세포; 5:2 2:5: AAV2 및 AAV5 유래의 이종성 ITR을 가진 이중 AAV 하이브리드 벡터에 의해 감염된 세포; neg: 음성 대조군으로서, EGFP-발현 벡터에 의해 감염된 세포이다.
도 4. 5'-하프 벡터에 miR 표적 부위를 포함시키는 것은 절단된 단백질 생성물을 유의하게 감소시키지 않는다
miR-let7b(좌측 패널), miR-204+124(중앙 패널) 또는 miR-26a(우측 패널)에 대한 miR 표적 부위를 함유하는, ABCA4를 인코딩하는 이중 AAV2/2(AAV 혈청형 2) 하이브리드 벡터에 의해 감염된 HEK293 세포의 대표적인 웨스턴 블롯 분석이 도시되어 있다. 상부 화살표는 전장 ABCA4 단백질을 가리키며, 하부 화살표는 절단된 단백질을 가리키고; 분자량 사다리는 좌측 상에 표시되어 있다. 로딩된 단백질의 ㎍은 이미지의 아래에 표시되어 있다. 5'+3': miR 표적 부위가 없는 5'-하프 벡터, 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포; 5'+3'+스크램블: 스크램블(scramble) miR 모방체의 존재 하에, miR 표적 부위가 없는 5'-하프 벡터, 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포; 5'mir+3': miR 표적 부위를 함유하는 5'-하프 벡터, 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포; 5'mir+3'+스크램블: 스크램블 miR 모방체의 존재 하에, miR 표적 부위를 함유하는 5'-하프 벡터, 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포; 5'mir+3'+모방체 let7b: mir-let7b 모방체의 존재 하에, miR 표적 부위를 함유하는 5'-하프 벡터, 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포; 5': miR 표적 부위가 없는 5'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; 5'mir: 스크램블 miR 모방체의 존재 하에, miR 표적 부위를 함유하는 5'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; 5'mir+모방체 let7b: mir-let7b 모방체의 존재 하에, miR 표적 부위를 함유하는 5'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; neg: 3'-하프 벡터 또는 EGFP-발현 벡터에 의해 감염된 대조군 세포; 5'mir+3'+모방체 204+124: mir-204 및 124 모방체의 존재 하에, miR 표적 부위를 함유하는 5'-하프 벡터, 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포; 5'mir+모방체 204+124: mir-204 및 124 모방체의 존재 하에, miR 표적 부위를 함유하는 5'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; 5'mir+3'+모방체 26a: mir-26a 모방체의 존재 하에, miR 표적 부위를 함유하는 5'-하프 벡터, 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포; 5'mir+모방체 26a: mir-26a 모방체의 존재 하에, miR 표적 부위를 함유하는 5'-하프 벡터에 의해 감염된 세포이다. α-3xflag: 항-3xflag 항체를 이용한 웨스턴 블롯이며; α-필라민 A는 로딩 대조군으로서 항-필라민 A 항체를 이용한 웨스턴 블롯이다.
스크램블 서열은 상이한 miRNA의 서열에 상응하며, 예를 들어 mir-let7b 모방체를 이용한 실험에서 스크램블 서열은 miR26a의 서열이었다.
도 5. 5'-하프 벡터에 CL1 분해 신호를 포함시키는 것은 절단된 단백질 생성물을 유의하게 감소시킨다
ABCA4를 인코딩하고 CL1 분해 신호를 함유하거나 또는 함유하지 않는 (도 5a) 이중 AAV2/2(AAV 혈청형 2로서, AAV2 유래의 상동성 ITR을 가짐) 하이브리드 벡터에 의해 감염된 HEK293 세포, 또는 (도 5b) 이중 AAV2/8(AAV 혈청형 8로서, AAV2 유래의 상동성 ITR을 가짐) 하이브리드 벡터를 주사한 후 1개월째의 돼지 눈(RPE+망막)에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 분석이 도시되어 있다. 상부 화살표는 전장 ABCA4 단백질을 가리키며, 하부 화살표는 5'-하프 벡터로부터 절단된 단백질을 가리키고; 분자량 사다리는 좌측 상에 표시되어 있다. 로딩된 단백질의 ㎍은 각각의 이미지 아래에 표시되어 있다. 5'+3': CL1이 없는 5'-하프 벡터 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포 또는 공동-주사된 눈; 5'-CL1+3': CL1을 함유하는 5'-하프 벡터, 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포 또는 공동-주사된 눈; 5': CL1이 없는 5'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; 5'-CL1: CL1을 함유하는 5'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; neg: 음성 대조군으로서, 3'-하프 벡터 또는 EGFP-발현 벡터에 의해 감염된 대조군 세포 또는 주사된 대조군 눈; α-3xflag: 항-3xflag 항체를 이용한 웨스턴 블롯이며; α-필라민 A: 로딩 대조군으로서 사용된 항-필라민 A 항체를 이용한 웨스턴 블롯이고; α-디스페린: 로딩 대조군으로서 사용된 항-디스페린 항체를 이용한 웨스턴 블롯이다. (도 5a)에서, 웨스턴 블롯 이미지는 n = 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (도 5b)에서, 웨스턴 블롯 이미지는 5'+3' 벡터가 주사된 n = 5개의 눈, 5'-CL1+3' 벡터가 주사된 n = 2개의 눈, 및 음성 대조군으로서 3'-하프 벡터 또는 EGFP-발현 벡터가 주사된 n = 5개의 눈을 대표한다.
도 6. 3'-하프 벡터에 분해 신호를 포함시키는 것은 절단된 단백질 생성물을 약간 감소시킨다
ABCA4를 인코딩하고 상이한 분해 신호를 함유하는 이중 AAV2/2 하이브리드 벡터에 의해 감염된 HEK293 세포에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 분석이 도시되어 있다. 상부 화살표는 전장 ABCA4 단백질을 가리키며, 하부 화살표는 절단된 단백질 생성물을 가리키고; 분자량 사다리는 좌측 상에 표시되어 있다. 로딩된 단백질의 ㎍은 각각의 이미지 아래에 표시되어 있다. 5'+3': 분해 신호 없이, 5'-하프 벡터 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포; 5': 5'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; 3'(표지 없음): 분해 신호 없이 3'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; 정지(STOP): 정지 코돈을 함유하는 3'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; PB29: PB29 분해 신호를 함유하는 3'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; 3xPB29: PB29 분해 신호의 3개의 탠덤 복사체를 함유하는 3'-하프 벡터에 의해 감염된 세포; 유비퀴틴: 유비퀴틴 분해 신호를 함유하는 3'-하프 벡터에 의해 감염된 세포이다. α-3xflag: 항-3xflag 항체를 이용한 웨스턴 블롯이며; α-필라민 A: 로딩 대조군으로서 항-필라민 A 항체를 이용한 웨스턴 블롯이다.
도 7: 본 발명의 바람직한 실시형태에 사용된 ALPP(태반 알칼리 포스파타제) 유래의 상동성의 AP, AP1 및 AP2 영역의 모식도이다. CDS: 코딩 서열이다.
도 8: 개선된 이중 AAV 벡터의 망막하 전달은 마우스 광수용기에서 ABCA4 발현, 및 Abca4 -/- 마우스 망막에서 리포푸신 ( lipofuscin ) 축적의 유의한 감소를 초래한다. (도a)는 이중 AAV2/8 하이브리드 ABCA4 벡터(5' + 3') 또는 음성 대조군(neg)이 주사된 C57BL/6 망막(전체 망막 용해물)의 대표적인 웨스턴 블롯 분석이다. 화살표는 전장 단백질을 가리키고, 분자량 사다리는 좌측 상에 표시되어 있다. α-3xflag: 항-3xflag 항체를 이용한 웨스턴 블롯이며; α-디스페린: 로딩 대조군으로서 사용된 항-디스페린 항체를 이용한 웨스턴 블롯이다. (도 8b 및 도 8c)는, 대조군으로서 주사되지 않거나 또는 AAV가 주사된 유색(pigmented) Abca4+/- 마우스(Abca4+/-), 또는 주사되지 않거나(Abca4-/-) 또는 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터가 주사된 유색 Abca4-/- 마우스(Abca4-/- AAV5'+3')의 망막(RPE 또는 RPE + OS)에서 리포푸신 자가형광(적색 신호)에 대한 대표적인 도면(도 8b) 및 정량화(도 8c)이다. (도 8b)에서, 축척 막대(75 ㎛)가 도면에 표시되어 있다. RPE: 망막 색소 상피; ONL: 외과립층(outer nuclear layer); INL: 내과립층(inner nuclear layer); GCL: 신경절 세포층. 화살표는 리포푸신 신호를 가리킨다. (도 8c)는 각각의 시료에 대한 3개의 박편들의 측두측(temporal side)에서의 평균 리포푸신 자가형광이다. 각각의 박편에서의 평균 자가형광을 기저 RPE의 길이에 대하여 정규화하였다. 평균값은 상응하는 막대 위에 표시되어 있다. 값은 평균 ± s.e.m.으로서 나타나 있다. ***p ANOVA < 0.0001. 각각의 그룹에 대해 n = 4개의 눈. (도 8d)는, 주사되지 않거나(Abca4+/+ not inj) 또는 PBS가 주사된 알비노 Abca4+/+ 마우스(Abca4+/+ PBS), 및 PBS가 주사되거나(Abca4-/- PBS) 또는 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터가 주사된 알비노 Abca4-/- 마우스(Abca4-/- AAV5'+3')의 1개 망막 당 적어도 40개의 필드(25 ㎛2)에서 계수된 RPE 리포푸신 과립의 평균 수이다. 평균값은 상응하는 막대 위에 표시되어 있다. 값은 평균 ± s.e.m.으로서 나타나 있다. *pANOVA ≤ 0.05; **pANOVA ≤0.01. Abca4+/+ not inj로부터 n = 4개의 눈; Abca4+/+ PBS로부터 n = 4개의 눈; Abca4-/- PBS로부터 n = 3개의 눈; Abca4-/- AAV5'+ 3'로부터 n = 3개의 눈.
도 9: 마우스 및 돼지의 음성 대조군 또는 개선된 이중 AAV -처리된 눈 사이의 유사한 전기적 활성이다. (도 9a)는 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터(AAV5'+ 3') 또는 음성 대조군(즉, 음성 대조군 AAV 벡터 또는 PBS; neg)을 주사한 후 1개월째에, C57BL/6 마우스의 평균 a-파(좌측 패널) 및 b-파(우측 패널)의 진폭이다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 제시되어 있으며; n은 분석된 눈의 갯수를 가리킨다.
(도 9b)는 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터(AAV5'+ 3') 또는 PBS를 주사한 후 1개월째에, 돼지에서 암순응(scotopic), 최대 반응, 명순응(photopic) 및 깜박거림 ERG 시험에서의 평균 b-파 진폭(μV)이다. 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터가 주사된 n = 5개의 눈; PBS가 주사된 n = 4개의 눈; *: n = 2.
도 10: 돼지의 간상체 광수용기 및 추상체 광수용기에서 IRBP 프로모터 및 GRK1 프로모터로부터의 EGFP 단백질 발현이다. 3월령의 라지 화이트종(Large White) 돼지 마우스에, AAV2/8-IRBP-EGFP 벡터 또는 AAV2/8-GRK1-EGFP 벡터를 각각 1x1011 GC/눈(eye)으로 망막하 주사하였다. 주사 후 4주째에 망막 냉동박편(cryosection)을 수득하고, 형광 현미경을 사용하여 EGFP를 분석하였다. (도 10a 내지 도 10b)는 PR 층에서의 형광 강도의 대표적인 이미지(도 10a) 및 정량화(도 10b)이다. 각각의 동물 그룹에 대해, 냉동박편 상에서의 형광 강도를 정량화하였다(6개의 상이한 필드/눈; 20x 배율). (도 10c 내지 도 10d)는 추상체 형질도입 효율에 대한 대표적인 이미지(도 10c) 및 정량화(도 10d)이다. 추상체 형질도입 효율을, 항-LUMIf-hCAR 항체를 이용하여 면역염색한 냉동박편(6개의 상이한 필드/눈; 63x 배율) 상에서 평가하였으며, 각각의 필드에서 추상체(CAR+)의 총 수를 기준으로 하여 EGFP를 발현하는 추상체(EGFP+/CAR+)의 수로서 표현한다. (도 10a, 도 10c)에서, 축척 막대가 도면에 표시되어 있다. (도 10b 내지 도 10d)에서, AAV2/8-IRBP-EGFP 벡터가 주사된 n = 3개의 눈; AAV2/8-GRK1-EGFP 벡터가 주사된 n = 3개의 눈이 있다. 값은 평균 ± s.e.m.으로서 나타나 있다. 스튜던츠 t-테스트를 사용하여 확인 시, 유의한 차이가 발견되지 않았다. OS: 외부 분절(outer segment); ONL: 외과립층; EGFP: 본래의(native) EGFP 형광; CAR: 항-추상체 어레스틴 염색(anti-cone arrestin staining); DAPI: 4',6'-다이아미디노-2-페닐인돌 염색. 화살표는 형질도입된 추상체를 가리킨다.
도 11: 개선된 이중 AAV 벡터의 망막하 전달은 Abca4 -/- 마우스 망막에서 리포푸신 축적을 유의하게 감소시킨다. 대조군으로서 주사되지 않거나 또는 AAV가 주사된 유색 Abca4+/- 마우스(Abca4+/-), 또는 주사되지 않거나(Abca4-/-) 또는 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터가 주사된 유색 Abca4-/- 마우스(Abca4-/- AAV5'+3')의 망막(RPE 또는 RPE+OS)에서 리포푸신 자가형광(적색 신호)을 보여주는 망막 단면의 측두측(주사된 면)의 이미지에 대한 몽타주가 도시되어 있다. 각각의 그룹에 대해 n = 4개의 눈. T: 측두측; N: 비측(nasal side)이다.
도 12: 마우스 및 돼지의 음성 대조군 또는 개선된 이중 AAV -처리된 눈 사이의 유사한 전기적 활성이다. (도 12a)는 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터(AAV5'+ 3') 또는 음성 대조군(즉, 음성 대조군 AAV 벡터 또는 PBS; neg)을 주사한 후 1개월째에, C57BL/6 마우스로부터의 대표적인 EFG 트레이스(trace)이다. (도 12b)는 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터(AAV5'+ 3') 또는 PBS를 주사한 후 1개월째에, 돼지에서의 암순응, 최대 반응, 명순응 및 깜박거림 ERG 시험 시, 대표적인 트레이스이다.
도 13. 본 발명의 실시예에 따른 벡터 시스템 전략의 모식도이다. (도 13a)는 본 발명의 바람직한 실시형태에 따라 2개의 벡터로 구성된 벡터 시스템의 모식도이다: 제1 벡터는 코딩 서열의 제1 부분(CDS1 부분)을 포함하며, 제2 벡터는 코딩 서열의 제2 부분(CDS2 부분)을 포함한다. (도 13A1)에서, 벡터 시스템의 재구축 서열은 코딩 서열 부분의 오버래핑 말단으로 구성된다. (도 13A2)에서, 제1 벡터 및 제2 벡터의 재구축 서열들은 각각 스플라이싱 공여자 및 스플라이싱 수여자 서열로 구성된다. (도 13A3)에서, 각각의 재구축 서열은 도 13A2에서와 같이 배열된 스플라이싱 공여자/수여자를 포함하고, 이는 재조합유전성 영역을 더 포함한다. 분해 신호가 적어도 하나의 벡터에 포함된다. 도면은 본 발명의 바람직한 비제한적인 실시형태에 따라 벡터 시스템의 하나 이상의 분해 신호의 모든 잠재적인 위치를 각각의 벡터에 대해 나타낸다.
(도 13b)는 본 발명의 바람직한 실시형태에 따라 3개의 벡터로 구성된 벡터 시스템의 모식도이다: 제1 벡터는 코딩 서열의 제1 부분(CDS1 부분)을 포함하며, 제2 벡터는 코딩 서열의 제2 부분(CDS2 부분)을 포함하고, 제3 벡터는 코딩 서열의 제3 부분(CDS3 부분)을 포함한다. (도 13B1)에서, 벡터 시스템의 재구축 서열은 코딩 서열 부분의 오버래핑 말단(CDS1의 3' 말단은 CDS2의 5' 말단과 오버래핑되고; CDS2의 3' 말단 오버래핑은 CDS3의 5' 말단과 오버래핑됨)으로 구성된다. (도 13B2)에서, 제1 벡터의 재구축 서열은 스플라이싱 공여자로 구성되며, 제1 벡터의 재구축 서열은 스플라이싱 공여자로 구성되며; 제2 벡터는 CDS2의 5' 말단에 제1 재구축 서열 및 CDS2의 3' 말단에 제2 재구축 서열을 포함하고, 제1 재구축 서열은 스플라이싱 수여자이고 제2 재구축 서열은 스플라이싱 공여자이며; 제3 벡터의 재구축 서열은 스플라이싱 수여자로 구성된다. (도 13B3)에서, 각각의 재구축 서열은 도 13B2에서와 같이 배열된 스플라이싱 공여자/수여자를 포함하고, 재조합유전성 영역을 더 포함한다. 분해 신호가 적어도 하나의 벡터에 포함된다. 도면은 본 발명의 바람직한 비제한적인 실시형태에 따라 벡터 시스템의 하나 이상의 분해 신호의 모든 잠재적인 위치를 각각의 벡터에 대해 나타낸다.
CDS, 코딩 서열; SD, 스플라이싱 공여자 신호; RR: 재조합유전성 영역; Deg Sig; 분해 신호 (표 2 참조); SA, 스플라이싱 수여자 신호.
도 14. 큰 유전자 형질도입을 위한 선행 기술의 다중 벡터-기반 전략의 모식도이다. CDS: 코딩 서열; pA: 폴리아데닐화 신호; SD: 스플라이싱 공여자 신호; SA: 스플라이싱 수여자 신호; AP: 알칼리 포스파타제 재조합유전성 영역; AK: F1 파지 재조합유전성 영역이다. 점선은 SD와 SA 사이에서 발생하는 스플라이싱을 보여주며, 포인트선(pointed line)은 상동성 재조합에 이용 가능한 오버래핑 영역들을 보여준다. 정상 크기 및 오버사이즈 AAV 벡터 플라스미드는 프로모터, 전장 이식유전자 CDS 및 폴리아데닐화 신호(pA)를 포함하는 전장 발현 카세트를 함유하였다. 이중 AAV 벡터를 생성하는 데 필요한 2개의 개별 AAV 벡터 플라스미드(5' 및 3')는 이식유전자 CDS의 N-말단 부분 앞에 프로모터(5' 플라스미드), 또는 이식유전자 CDS의 C-말단 부분 다음에 pA 신호(3' 플라스미드)를 함유하였다.
재료 및 방법
플라스미드의 생성
AAV 벡터 생성에 사용된 플라스미드는 모두, AAV 혈청형 214의 반전 말단 반복부(ITR)를 함유하는 인간 ABCA4 , 인간 MYO7A 또는 EGFP 리포터 단백질을 인코딩하는 이중 하이브리드 AK 벡터 플라스미드로부터 유래되었다.
ABCA4를 인코딩하는 벡터 플라스미드에 함유된 AK 재조합유전성 서열14을 알칼리 포스파타제 유전자로부터 유래된 3개의 상이한 재조합유전성 서열: AP(NM_001632, bp 823-110014); AP1(XM_005246439.2, bp1802-151620); AP2(XM_005246439.2, bp 1225-93820)로 대체하였다.
AAV 혈청형 2 유래의 이종성 ITR(ITR2) 및 AAV 혈청형 5 유래의 ITR(ITR5)을 5:2-2:5 배치로 갖는 이중 AAV 벡터 플라스미드는, 5'-하프 벡터 플라스미드 내의 좌측 ITR2 및 3'-하프 벡터 플라스미드 내의 우측 ITR2를 각각 ITR5(NC_006152.1, bp 1-175)로 대체함으로써 생성하였다. 이종성 ITR2 및 ITR5를 2:5 또는 5:2 배치로 갖는 이중 AAV 벡터 플라스미드는, 우측 또는 좌측 ITR2를 각각 ITR5로 대체함으로써 생성하였다. Rep5(NC_006152.1, bp 171-2206) 및 AAV2 Cap(AF043303 bp2203-2208) 유전자를 함유하는 pAAV5/2 패키징 플라스미드(Rep5Cap2)는, AAV2 유래의 Rep(AF043303 bp321-1993) 및 Cap(AF043303 bp2203-2208) 유전자를 함유하는 pAAV2/2 패키징 플라스미드(Rep2Cap2)로부터 상기 Rep2 유전자를 AAV5 유래의 Rep5 개방형 해독틀(NC_006152.1, bp 171-2206)로 대체함으로써 수득하였다.
ITR5를 가진 EGFP 발현 카세트를 함유하는 pZac5:5-CMV-EGFP 플라스미드는, EGFP 발현 카세트45 측면에 ITR2를 함유하는 pAAV2.1-CMV-EGFP 플라스미드로부터 생성하였다.
분해 신호를, ABCA4를 인코딩하는 이중 AAV 하이브리드 AK 벡터에서 하기와 같이 클로닝하였다: AK 서열과 우측 ITR2 사이에 5'-하프 벡터 플라스미드; AK 서열과 스플라이스 수여자 신호 사이에 3'-하프 벡터 플라스미드. 분해 신호 서열에 대한 상세한 사항은 표 2에서 확인할 수 있다.
표 2. 본 연구에서 사용된 분해 신호
Figure 112017095877839-pct00008
밑줄 표시된 서열은 분해 신호에 상응하며; 반복된 서열을 포함하는 분해 신호의 경우, 클로닝을 목적으로 반복된 서열들 사이에 포함된 뉴클레오타이드는 밑줄 표시가 되어 있지 않다.
이중 AAV 벡터로부터 발현된 ABCA4 단백질에, 도 3, 도 4 및 도 6에 나타낸 실험의 경우 N-말단(아미노산 위치 590) 및 C-말단 모두에서 3xflag를 태깅(tagging)하고, 도 2 및 도 8a의 실험의 경우 C-말단에서만 태깅한다.
본 연구에서 사용된 ABCA4를 인코딩하는 이중 AAV 하이브리드 벡터 세트는 유비쿼터스(ubiquitous) CMV46 프로모터 또는 PR-특이적인 인간 G 단백질-커플링된 수용체 키나제 1(GRK1)47 프로모터를 포함하였으며, 한편 MYO7A를 인코딩하는 이중 AAV 하이브리드 벡터는 유비쿼터스 CBA 프로모터39를 포함하였다.
AAV 벡터 생성 및 특성 확인
AAV 벡터 대용량 조제물을, HEK293 세포의 삼중 형질감염 및 후속해서 2회의 CsCl2 정제에 의해 TIGEM AAV 벡터 코어에 의해 제조하였다. 상동성 ITR2를 갖는 AAV 벡터를 이전에 보고된 바와 같이 수득하였다48.
이종성 ITR2 및 ITR5를 갖는 AAV 벡터를 수득하기 위해, 1.1x109개의 저-계대배양(low-passage) HEK293 세포의 현탁액을, Ad 헬퍼 유전자49를 함유하는 500 ㎍의 pDeltaF6 헬퍼 플라스미드, 260 ㎍의 pAAV cis-플라스미드 및 상이한 양의 Rep2Cap2 및 Rep5 패키징 구축물을 이용하여 칼슘 포스페이트에 의해 사중-형질감염시켰다. Rep2Cap2 및 Rep5 패키징 구축물의 양은 하기와 같았다:
(i) 프로토콜 A: 130 ㎍의 Rep5 및 130 ㎍의 Rep2Cap2 (비율 1:1)
(ii) 프로토콜 B: 90 ㎍의 Rep5 및 260 ㎍의 Rep2Cap2 (비율 1:3)
(iii) 프로토콜 C: 26 ㎍의 Rep5 및 260 ㎍의 Rep2Cap2 (비율 1:10)
그런 다음, 각각의 AAV 조제물을 공개된 프로토콜48에 따라 정제하였다.
하기 기재된 프로토콜을 Rep 경쟁 실험에 사용하였다:
1- ITR2를 가진 AAV 벡터의 제조에 있어서 Rep2와의 Rep5의 경쟁을 평가하기 위해, HEK293 세포를, pDeltaF6, pAAV2.1-CMV-EGFP cis, Rep2Cap2 및 Rep5Cap2 구축물을 2:1:1.5:1.5의 중량비로 이용하여 칼슘 포스페이트에 의해 사중-형질감염시키거나, 또는 대조군으로서 pDeltaF6, pAAV2.1-CMV-EGFP, Rep2Cap2 패키징 구축물 및 대조군 무관련(irrelevant) 플라스미드를 2:1:1.5:1.5의 중량비로 이용하여 사중-형질감염시켰으며;
2- ITR5를 가진 AAV 벡터의 제조에 있어서 Rep5와의 Rep2의 경쟁을 평가하기 위해, HEK293 세포를, pDeltaF6, pZac5:5-CMV-EGFP, Rep5Cap2 및 Rep2Cap2 구축물을 2:1:1.5:1.5의 중량비로 이용하여 칼슘 포스페이트에 의해 사중-형질감염시키거나, 또는 대조군으로서 pDeltaF6, pZac5:5-CMV-EGFP, Rep5 구축물 및 대조군 무관련 플라스미드를 2:1:1.5:1.5의 중량비로 이용하여 사중-형질감염시켰다.
대규모 AAV 벡터 조제물에 있어서, ITR2 상에 어닐링하고 있는 프로브와 함께 TaqMan(Applied Biosystem, Carlsbad, CA, USA)48을 사용한 PCR 정량화에 의해 달성된 역가, 및 ITR2로부터 1 kb 내에서 어닐링하고 있는 프로브를 이용한 도트-블롯 분석50에 의해 수득된 역가의 평균을 냄으로써, 물리적 역가[게놈 복사체(GC)/mL]를 확인하였다. 상이한 Rep5:Rep2Cap2 중량비로 제조된 대규모 AAV 벡터 조제물에 있어서, ITR2 상에 어닐링하고 있는 프로브와 함께 TaqMan을 사용한 PCR 정량화에 의해 물리적 역가[게놈 복사체(GC)/mL]를 확인하였다. 경쟁 실험에 사용된 AAV 벡터 조제물에 있어서, AAV 벡터에 패키징된 EGFP-발현 카세트에 포함된 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호 상에 어닐링하고 있는 프로브와 함께 TaqMan을 사용한 PCR 정량화에 의해 물리적 역가[게놈 복사체(GC)/mL]를 확인하였다.
HEK293 세포의 AAV 감염
HEK293 세포의 AAV 감염을 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다14. 이종성 ITR2 및 ITR5를 가지며 프로토콜 C에 따라 제조된 AAV2 벡터를 사용하여 HEK293 세포를 감염시키되, 각각의 바이러스 조제물에 대해 달성된 최저 역가를 고려하여 계산된, 각각의 벡터 당 1x104 GC/세포의 감염 다중도(m.o.i; multiplicity of infection)(발명자들이 1:1 비율의 이중 AAV 벡터를 사용한 경우, 총 2x104 GC/세포)로 상기 세포를 감염시켰다. 재조합유전성 영역 및 분해 신호를 갖는 AAV2/2에 의한 감염을, TaqMan과 도트-블롯 사이의 평균 역가를 고려하여 계산된, 각각의 벡터 당 5x104 GC/세포의 m.o.i(1:1 비율의 이중 AAV 벡터의 경우 총 1x105 GC/세포)로 수행하였다.
miR 표적 부위를 함유하는 5'-하프 벡터를 사용한 실험의 경우, 세포를 칼슘 포스페이트를 사용하여 4시간 동안 형질감염시킨 후, 상응하는 miR 모방체(50 nM; miRIDIAN 마이크로RNA 모방체 hsa-let-7b-5p, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-124-3p 및 hsa-miR-26a-5p; Dharmacon, Lafayette, CO, USA)를 사용하여 감염시켰다.
마우스 및 돼지에서 AAV 벡터의 망막하 주사
마우스를, 유전학 및 생물리학 동물 하우스 기관(Naples, Italy)에서 12시간 명/암 사이클(광기(light phase) 동안 10 lux 내지 50 lux에 노출됨) 하에 유지시키면서 사육하였다. C57BL/6 마우스를 Harlan Italy SRL(Udine, Italy)사로부터 구입하였다. 유색 Abca4 -/- 마우스를 알비노 Abca4-/- 마우스14와 Sv129 마우스의 연속 이종 교배를 통해 발생시키고, 동종 번식시켜 유지시켰으며; 이종성 마우스와 동종성 마우스를 이종 교배시켜 번식시켰다. 알비노 Abca4 -/- 마우스를 BALB/c 마우스(Rpe65 Leu450에 대해 동종성임)와 연속적인 이종 교배 및 역교배를 통해 발생시켰으며, 동종 번식시켜 유지시켰고; 이종성 마우스와 동종성 마우스를 이종 교배시켜 번식시켰다. C57BL/6(5주령), 유색 Abca4 -/-(5.5월령) 및 알비노 Abca4 -/-(2.5월령 내지 3월령) 마우스를 이전에 보고된 바와 같이 마취시킨 다음61, 1 ㎕의 PBS 또는 AAV2/8 벡터를 Liang 등62에 의해 보고된 바와 같이 경공막 경맥락막(trans-scleral trans-choroidal) 접근법을 통해 망막의 측두측에 망막하로 전달하였다. AAV2/5-VMD2-인간 티로시나제63(용량: 2x108 GC/눈)를, 알비노 Abca4 -/- 마우스에 망막하로 전달되는 AAV2/8 벡터 용액에 첨가하였다(도 8d). 이로써, 본 발명자들은 아이컵(eyecup)의 형질도입된 부분 내에서 RPE를 마킹할 수 있었으며, 후속해서 상기 아이컵을 해부 및 분석하였다.
이 연구에 사용된 라지 화이트종 암컷 돼지를 이탈리아 돼지 사육 협회의 LW 허드 북(LW Herd Book)에 순혈종으로서 등록시켰다. 돼지를 카르다렐리(Cardarelli) 병원 동물 하우스(Naples, Italy)에서 12시간 명/암 사이클(광기 동안 10 lux 내지 50 lux에 노출됨) 하에 유지시키면서 사육하였다. 이 연구를 안과 및 시력 연구에서의 동물의 사용에 대한 시력 및 안과학 성명에서의 연구 협회(Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research), 및 동물 시술에 대한 이탈리아 보건성(Italian Ministry of Health) 법규에 따라 수행하였다. 모든 시술들을 이탈리아 보건성; 공공보건국, 동물 건강, 영양 및 식품 안전성(Italian Ministry of Health; Department of Public Health, Animal Health, Nutrition and Food Safety)에 제출하였다. 수술은 마취 하에 수행하였고, 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 다하였다. 동물을 이전에 보고된 바와 같이 안락사시켰다39. 3월령 돼지에 대한 AAV 벡터의 망막하 전달을 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다39. 모든 눈에 100 ㎕의 PBS 또는 AAV2/8 벡터 용액을 처리하였다. AAV2/8 용량은 각각의 벡터 당 1x1011 GC/눈이었으며, 따라서 1:1 비율의 이중 AAV 벡터의 공동-주사에는 총 2x1011 GC/눈의 용량이 필요하였다.
도 2c, 도 5b, 도 8, 도 9, 도 10, 도 11 및 도 12에 포함된 동물 연구의 경우, 우측 눈 및 좌측 눈을 다양한 실험군들에 무작위로 할당하였으며, 이 실험을 수행하고 정량화하는 연구원들은 동물이 받는 치료에 대해 맹검이었다.
웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석을 위해, HEK293 세포, 마우스 및 돼지 망막을 RIPA 완충제(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% Na-데옥시콜레이트, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS)에서 용해시켰다. 용해 완충제에 프로테아제 저해제(완전 프로테아제 저해제 칵테일 정제; Roche) 및 1 mM 페닐메틸설포닐을 보충하였다. 용해 후, MYO7A를 함유하는 세포의 시료를 1X Laemli 시료 완충제 내에서 99℃에서 5분 동안 변성시켰으며; ABCA4를 함유하는 시료를 4 M 우레아가 보충된 1X Laemli 시료 완충제 내에서 37℃에서 15분 동안 변성시켰다. 용해물을 6% 내지 7%(각각 ABCA4 시료 및 MYO7A 시료) 또는 8%(도 5b에서 WB) SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분리하였으며, 면역-블로팅에 사용한 항체는 하기와 같다: 항-3xflag(1:1000, A8592; Sigma-Aldrich); 인간 MYO7A 단백질의 아미노산 941-1070에 상응하는 펩타이드를 사용하여 생성된 항-MYO7A(1:500, 폴리클로날; Primm Srl, Milan, Italy); 항-필라민 A(1:1000, 카탈로그 #4762; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); 항-디스페린(1:500, 디스페린, 클론 Ham1/7B6, MONX10795; Tebu-bio, Le Perray-en-Yveline, France). 웨스턴 블롯에 의해 검출된 ABCA4 밴드 및 MYO7A 밴드의 정량화를 ImageJ 소프트웨어(http://rsbweb.nih.gov/ij/에서 이용 가능한 프리 다운로드)를 사용하여 수행하였다. 이종성 ITR2 및 ITR5를 가진 AAV를 이용하여 수행된 시험관내 실험의 경우, 전장 ABCA4 및 MYO7A 밴드의 강도를, 상응하는 레인의 절단된 단백질 생성물의 강도 또는 필라민 A 밴드의 강도에 대해 정규화하였으며, 한편 더 짧은 ABCA4 및 MYO7A 단백질 밴드의 강도를 필라민 A 밴드의 강도에 대해 정규화하였다. 분해 신호 또는 상동성 영역을 갖는 AAV 벡터를 이용하여 달성된 ABCA4 밴드의 강도를 시험관내 실험의 경우 필라민 A 밴드의 강도 또는 생체내 실험의 경우 디스페린 밴드의 강도에 대해 정규화하였다.
웨스턴 블롯 실험의 정량화를 하기와 같이 수행하였다:
- 도 2a 내지 도 2b: ABCA4 밴드의 강도를 상응하는 레인에서 필라민 A 밴드의 강도에 대해 정규화하였다. 그런 다음, 정규화된 ABCA4 발현을 이중 AAV 하이브리드 AK 벡터에 대한 퍼센트로서 표현하였다;
- 도 2c: ABCA4 밴드의 강도(a.u.)를 각각의 겔의 음성 대조군 레인에서 동일한 수준에서 측정된 평균 강도에 대한 증가의 배수로서 계산하였다(하부 좌측 패널의 레인 7에서의 음성 대조군 시료의 측정은 이례적으로 높은 백그라운드 신호로 인해 분석으로부터 배제하였음). 각각의 그룹에 대한 값을 평균 ± 평균의 표준 오차(s.e.m.)로서 나타낸다;
- 도 3b 내지 도 3d: 전장 ABCA4 및 절단된 단백질 밴드 강도를 필라민 A 밴드의 강도로 나누거나, 또는 전장 ABCA4 단백질 밴드의 강도를 상응하는 레인에서의 절단된 단백질 밴드의 강도로 나누었다. 값은 평균 ± s.e.m.으로서 나타나 있다;
- 표 5: 전장 ABCA4 및 절단된 단백질 밴드 강도를 5'-하프 벡터 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포에서 측정하였다. 전장 ABCA4 및 절단된 단백질 밴드의 강도들 사이의 비율을 상응하는 모방체 또는 스크램블 모방체의 존재 하에 계산하였다. 값은 3개의 독립적인 실험들로부터의 비율의 평균 ± s.e.m.을 나타낸다;
- 표 6: 전장 ABCA4 및 절단된 단백질 밴드 강도를 5'-하프 벡터 및 3'-하프 벡터에 의해 공동-감염된 세포에서 측정하였다. 분해 신호를 갖거나 또는 갖지 않는 벡터로부터의 전장 ABCA4 및 절단된 밴드의 강도들 사이의 비율을 계산하였다. 값은 3개의 독립적인 실험들로부터의 비율의 평균 ± s.e.m.을 나타낸다.
- 도 8a: ABCA4 밴드의 강도(a.u.)를 상응하는 겔의 음성 대조군 레인에서 측정된 평균 백그라운드 강도에 대한 증가 배수로서 계산하였다. 값은 평균 ± s.e.m.으로서 표현된다.
서던 블롯 분석
3 x 1010 GC의 바이러스 DNA를 AAV 입자로부터 추출하였다. 패키징되지 않은 게놈을 분해하기 위해, 벡터 용액을 240 ㎕의 PBS pH 7.4 19(GIBCO; Invitrogen S.R.L., Milan, Italy)에 재현탁시킨 다음, 40 mM TRIS-HCl, 10 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 pH 7.9를 함유하는 총 300 ㎕ 부피 중 1 U/㎕의 DNase I (Roche)와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, DNase I을 50 mM EDTA를 이용하여 불활성화시키고, 후속해서 프로테이나제 K 및 2.5% N-라우로일-사르코실 용액과 함께 50℃에서 45분 동안 인큐베이션하여, 캡시드를 용해시켰다. DNA를 페놀-클로로포름을 이용하여 2회 추출하고, 2 부피의 에탄올 100 및 10% 소듐 아세테이트(3 M, pH 7)를 이용하여 침전시켰다. 알칼리 아가로스 겔 전기영동 및 블로팅을 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다(문헌[Sambrook & Russell, 2001 Molecular Cloning]). 10 ㎕의 1 kb DNA 사다리(N3232L; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 분자량 마커로서 로딩하였다. 2개의 상이한 이중 가닥 DNA 단편을 DIG 하이 프라임 DNA 표지화 및 검출 스타터 키트(Roche)를 사용하여 다이곡시게닌-dUTP를 이용하여 표지하였으며, 프로브로서 사용하였다. 5' 프로브(768 bp)는, pZac2.1-CMV-ABCA4_5' 플라스미드를 SpeI 및 NotI를 이용하여 이중 분해시켜 제조하였으며; 3' 프로브(974 bp)는, pZac2.1-ABCA4_3'_3xflag_SV40 플라스미드를 ClaI 및 MfeI를 이용하여 이중 분해시켜 제조하였다. 예비혼성화 및 혼성화를 65℃에서 Church 완충제(문헌[Sambrook & Russel, 2001 Molecular cloning])에서 각각 1시간 및 밤새 수행하였다. 그런 다음, 막(Whatman Nytran N, 하전된 나일론 막; Sigma-Aldrich, Milan, Italy)을 우선 SSC 29-0.1% SDS에서 30분 동안 세척하고, 그런 다음 65℃에서 SSC 0.59-0.1% SDS에서 30분 동안 세척한 다음, 37℃에서 SSC 0.19-0.1% SDS에서 30분 동안 세척하였다. 그런 다음, 상기 막을 DIG DNA 표지화 및 검출 키트(Roche)를 사용한 효소 면역검정법에 의한 화학발광 검출에 의해 분석하였다.
조직학적 분석
마우스를 안락사시키고, 이의 안구를 수집한 다음, 4% 파라포름알데하이드(PFA)에 침지시켜 밤새 고정시켰다. 안구를 수집하기 전에, 공막의 측두측(temporal aspect)을 소작술에 의해 마킹하여, 포함시키는 순간, 주사 부위에 대하여 눈을 배향시켰다. 아이컵을 온전하게 유지시키면서 수정체 및 유리체를 제거할 수 있도록 안구를 절단하였다. 냉동보존을 위해 마우스 아이컵에 30% 수크로스를 침윤시키고, 조직-동결 배지(O.C.T. 매트릭스; Kaltek, Padua, Italy)에서 포매시켰다. 각각의 눈에 대해, 150개 내지 200개의 연속 박편(10 ㎛ 두께)들을 수평면을 따라 절단하였고, 상기 박편들을 10개의 슬라이드 상에 점진적으로 분포시킴으로써, 각각의 슬라이드는, 상이한 수준에서 전체 눈을 각각 대표하는 15개 내지 20개의 박편들을 함유하게 되었다. 박편을 4',6'-다이아미디노-2-페닐인돌(Vectashield; Vector Lab, Peterborough, United Kingdom)을 사용하여 염색시키고, 상이한 배율에서 Zeiss Axiocam(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 모니터링하였다.
돼지를 안락사시키고, 이의 안구를 수집한 다음, 4% PFA에 침지시켜 밤새 고정시켰다. 아이컵을 온전하게 유지시키면서 수정체 및 유리체를 제거할 수 있도록 안구를 절단하였다. 아이컵에 10%, 20% 및 30% 수크로스를 점진적으로 침윤시킴으로써 상기 아이컵을 점차 탈수시켰다. 조직-동결 배지(O.C.T. 매트릭스; Kaltek) 포매를 수행하였다. 포매 전에, 돼지의 아이컵을 형광 입체현미경(Leica Microsystem GmbH, Wetzlar, Germany)을 이용하여 분석하여, EGFP-인코딩 벡터를 투여할 때마다 형질도입된 영역을 위치화시켰다. 각각의 눈에 대해, 200개 내지 300개의 연속 박편(12 ㎛ 두께)들을 수평선을 따라 절단하였고, 상기 박편들을 유리 슬라이드 상에 점진적으로 분포시킴으로써, 각각의 슬라이드는 6개 내지 10개의 박편들을 함유하게 되었다. 박편 염색 및 이미지 획득을 마우스에 대해 보고된 바와 같이 수행하였다.
추상체 면역형광 염색
동결된 망막 박편을 PBS로 1회 세척한 다음, 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS에서 1시간 동안 침투시켰다. 10% 정상 염소 혈청(Sigma-Aldrich)을 함유하는 블록킹 용액을 1시간 동안 적용시켰다. 1차 항체[항-인간 CAR66 ,67로서, 돼지 CAR을 인지하기도 함("Luminaire founders"―hCAR, 1:10,000; Dr. Cheryl M. Craft가 친절하게 제공함, Doheny Eye Institute, Los Angeles, CA)]를 PBS로 희석하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 2차 항체(Alexa Fluor 594, 항-토끼, 1:1,000; 분자 프로브, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 45분 동안 인큐베이션하였다. 항-CAR 항체를 이용하여 염색된 박편을 이전에 보고된 바와 같이64 레이카 레이저 공촛점 현미경 시스템(Leica Microsystem GmbH)을 사용하여 63x 배율에서 분석하였다. 간략하게는, 각각의 눈에 대해, 6개의 상이한 형질도입된 영역으로부터의 6개의 상이한 z-스택을 취하였다. 각각의 z-스택에 대해, 단일 플랜으로부터의 이미지를 사용하여, CAR+ /EGFP+ 세포를 계수하였다. 이를 수행할 때, 발명자들은 하나의 세포를 또 다른 세포와 구별하고 따라서 동일한 세포를 중복 계수하는 것을 피하기 위해, Z-축을 따라 조심스럽게 이동시켰다. 각각의 망막에 대해, 발명자들은 총 CAR+ 세포를 기준으로 CAR-양성(CAR+)/EGFP-양성(EGFP+) 세포를 계수하였다. 그런 다음, 발명자들은 각각의 실험군의 3개의 눈의 CAR+/EGFP+ 세포의 평균 수를 계산하였다.
EGFP 정량화
PR에서 형광 강도를 이전에 보고된 바와 같이64 비편향된 방식으로 철저하고 재현 가능하게 정량화하였다. 개별 색상 채널 이미지를 레이카 현미경(Leica Microsystem GmbH)을 사용하여 취하였다. TIFF 이미지를 이미지 분석 소프트웨어(LAS AF lite; Leica Microsystem GmbH)에 의해 그레이-스케일링(gray-scale)하였다. 각각의 눈의 6개 이미지를 맹검 관찰자에 의해 20x 배율에서 분석하였다. PR(외과립층 + OS)을 모든 이미지에서 선택적으로 도시하였으며, 밀폐된 영역에 대한 총 형광을 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 비편향된 방식으로 계산하였다. 그런 다음, PR에서의 형광을, 각각의 눈 유래의 개별 망막 박편으로부터 수집된 6개의 이미지로부터 평균을 내었다. 그런 다음, 발명자들은 각각의 실험군 당 3개의 눈에서의 평균 형광을 계산하였다.
리포푸신 자가형광의 정량화
리포푸신 형광 분석을 위해, AAV 주사 후 3개월째에 유색 Abca4 +/- 및 Abca4-/- 마우스로부터 눈을 수집하였다. 마우스를 밤새 암순응시켰으며, 희미한 적색광 하에 안락사시켰다. 각각의 눈에 대해, 눈의 상이한 영역으로부터 유래한 3개의 박편의 측두측으로부터 4개의 오버래핑 사진을, TX2 필터(여기: 560±40 nm; 방출: 645±75)71 -75가 장착된 레이카 DM5000B 현미경을 사용하여 20X 대물렌즈 하에 촬영하였다. 그런 다음, 각각의 박편에 대한 4개의 이미지를 추가의 형광 분석에 사용된 단일 몽타주에서 조합하였다. 각각의 박편에서의 리포푸신 형광(적색 신호)의 강도를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 자동적으로 계산하였으며, 그런 다음 형광 영역의 기저를 이루는 RPE의 길이에 대해 정규화하였다.
투과 전자 현미경
전자 현미경 분석을 위해, AAV 주사 후 3개월째에 알비노 Abca4 -/- 및 Abca4+/+ 마우스로부터 눈을 수집하였다. 눈을 0.1 M PHEM 완충제 pH 6.9(240 mM PIPES, 100 mM HEPES, 8 mM MgCl2, 40 mM EGTA) 중 0.2% 글루타르알데하이드-2% 파라포름알데하이드에서 밤새 고정한 다음, 0.1 M PHEM 완충제에서 헹구었다. 그런 다음, 눈을 광학 현미경 하에 해부하여, 아이컵의 티로시나제-양성 부분을 선택하였다. 후속해서, 아이컵의 형질도입된 부분을 12% 젤라틴에 포매시키고, 2.3 M 수크로스를 주입한 다음, 액체 질소에서 동결시켰다. 냉동박편(50 nm)을 레이카 울트라마이크로톰 EM FC7(Leica Microsystem)을 사용하여 절단하고, 섬모(cilia)를 연결하는 PR을 세로방향으로 정렬하는 데 있어서 극도의 주의를 기울였다. 형태학적 데이터를 다양한 실험군들에 귀속시키는 것과 관련하여 편견을 피하기 위해, 리포푸신 과립의 계수를 맹검 작업자(Dr. Roman Polishchuk)가 iTEM 소프트웨어(Olympus SYS, Hamburg, Germany)를 사용하여 수행하였다. iTEM 소프트웨어의 '터치 카운트' 모듈을 사용하여, RPE 층을 가로질러 무작위로 분포된 25 ㎛2 영역 내 리포푸신 과립의 수(적어도 40)를 계수하였다. 과립 밀도를 25 ㎛2 당 과립의 수로서 표현하였다.
망막 전위도 기록
마우스 및 돼지에서 전기생리학적 기록을 각각 (68) 및 (69)에서 보고된 바와 같이 수행하였다.
통계학적 분석
0.05 이하의 p-값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다. 사후 다중 비교 절차를 이용하는 원-웨이 ANOVA(R 통계학적 소프트웨어)를 사용하여, 도 2b(pANOVA= 1.2 x 10-6), 도 2c(pANOVA= 0.326), 도 8c(pANOVA= 1.5 x 10-10), 도 8d(pANOVA= 0.034) 및 도 9a(pANOVA a-파: 0.5; pANOVA b-파: 0.8) 및 표 6(pANOVA= 0.0135)에 도시된 데이터를 비교하였다. 리포푸신 과립(도 8d)의 계수가 이산형 수(discrete number)로서 표현되기 때문에, 이들을 음수 이항 일반화된 선형 모델(Negative Binomial generalized linear model)65로부터의 편차값에 의해 분석하였다. 사후 다중 비교 절차(post-hoc Multiple Comparison Procedure)를 이용하여 확인된 그룹들 사이에서의 통계학적으로 유의한 차이는 하기와 같다: 도 2b: AP vs AK: 1.08 x 10-5; AP1 vs AK: 0.05; AP2 vs AK: 0.17; AP1 vs AP: 1.8 x 10-6; AP2 vs AP: 2.8 x 10-6; AP2 vs AP1: 0.82. 도 8c: Abca4 +/- not inj vs Abca4 -/- not inj: 0.00; Abca4 -/- not inj vs Abca4 -/- AAV5'+3': 9.3 x 10-5; Abca4 +/- not inj vs Abca4 -/- AAV5'+3': 4 x 10-6. 도 8d: Abca4-/- PBS vs Abca4 -/- AAV5'+3': 0.01; Abca4 +/+ PBS vs Abca4 -/- AAV5'+3': 0.37; Abca4 +/+ not inj vs Abca4 -/- AAV5'+3': 0.53; Abca4 +/+ PBS vs Abca4 -/- PBS: 0.05; Abca4 +/+ not inj vs Abca4 -/- PBS: 0.03; Abca4 +/+ not inj vs Abca4+/+ PBS: 0.76. 표 6: 3xSTOP vs 분해 신호 없음: 0.97; 3xSTOP vs PB29: 1.0; 3xSTOP vs 3xPB29: 0.15; 3xSTOP vs 유비퀴틴: 0.10; PB29 vs 분해 신호 없음: 1.0; PB29 vs 3xPB29: 0.1; PB29 vs 유비퀴틴: 0.07; 3xPB29 vs 분해 신호 없음: 0.06; 3xPB29 vs 유비퀴틴: 1.0; 유비퀴틴 vs 분해 신호 없음: 0.04.
스튜던츠 t-테스트를 사용하여, 도 3c, 도 3d 및 도 3f에 도시된 데이터를 비교하였다.
결과
AP1, AP2 또는 AK 재조합유전성 영역을 포함하는 이중 AAV 하이브리드 벡터는 효율적인 형질도입을 보여준다
본 발명자들은 몇몇 다중 벡터 전략들을 도 1 및 도 13에 도시된 바와 같이 평가하였다.
특히, 발명자들은 상이한 상동성 영역들을 가진 이중 AAV 하이브리드 벡터의 형질도입 효능을 동시에 평가하였다. 이를 위해, 본 발명자들은, 유비쿼터스 CMV 프로모터 및 상동성의 AK14, AP14, AP1 또는 AP220 영역의 조절 하에 ABCA4-3xflag 코딩 서열을 포함하는 이중 AAV2/2 하이브리드 벡터를 생성하였다(도 7). 본 발명자들은 HEK293 세포를 감염시키는 데 이들 벡터를 사용하였다[감염 다중도, m.o.i.: 각각의 벡터 당 5x104 게놈 복사체(GC)/세포]. 세포 용해물을 항-3xflag 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하여, ABCA4-3xflag를 검출하였다(도 2). 각각의 이중 AAV 하이브리드 벡터 세트는 음성 대조군이 로딩된 레인에서는 검출되지 않은 예상된 크기의 전장 단백질을 발현시켰다(도 2a). ABCA4 발현의 정량화(도 2b)는, 이중 AAV 하이브리드 AP1 및 AP2 벡터에 의한 감염이 이중 AAV 하이브리드 AK 벡터를 이용할 때보다 이식유전자 발현의 수준을 약간 더 높였으며, 모두 이중 AAV 하이브리드 AP 벡터14를 상당히 능가하였음을 보여주었다. 본 발명자들은 이전에, 상동성 재조합에 의존하는 이중 AAV 벡터의 효율이 세포 배양물에서보다 PR로서 종결-분화된 세포에서 더 낮음을 발견하였다14. 따라서, 본 발명자들은, PR-특이적인 인간 G 단백질-커플링된 수용체 키나제 1(GRK1) 프로모터를 포함하는 이중 AAV AK, AP1 및 AP2 벡터(각각의 벡터의 용량/눈: 1.9x109 GC; 도 2c)의 망막하 투여 후, C57BL/6 마우스에서 PR-특이적인 형질도입 수준을 평가하였다. 벡터 투여 후 1개월째에, 본 발명자들은 AP1 또는 AP2 벡터보다 이중 AAV 하이브리드 AK로 처리한 망막에서 ABCA4 단백질 발현을 보다 일관되게 검출하였다(도 2c).
AAV 벡터에 이종성 ITR을 포함시키는 것은 이의 생성 수율에 영향을 미치고, 절단된 단백질 생성물의 수준을 감소시키지 않는다.
이종성 ITR의 사용이 이중 AAV 벡터의 생산성 방향성 콘카테머화를 향상시키는지 시험하기 위해, 본 발명자들은 이종성 ITR2 및 ITR5를 5:2(AAV5로부터 좌측 ITR 및 AAV2로부터 우측 ITR) 또는 2:5(AAV2로부터 좌측 ITR 및 AAV5로부터 우측 ITR) 배치로 갖는 ABCA4-3xflag 또는 MYO7A-HA 코딩 서열을 포함하는 이중 AAV2/2 하이브리드 AK 벡터를 생성하였다(도 1). 이종성 ITR2 및 ITR5를 갖는 이중 AAV 벡터의 생성은, 바이러스 복제23를 교차-보완(cross-complement)할 수 없는 AAV 혈청형 2 및 AAV 혈청형 5로부터의 Rep 단백질의 동시적인 발현을 필요로 한다. 사실상, Rep2 및 Rep5는 상동성 ITR에 결합하는 것보다는 덜 효율적이긴 하지만 ITR2 또는 ITR5에 상호호환적으로 결합할 수 있으며, 그러나 이들은 다른 혈청형36 유래의 ITR의 말단 분해 부위(resolution site)를 절단할 수 없는 것으로 나타났다. 따라서, 이종성 ITR2 및 ITR5를 가진 이중 AAV 하이브리드 AK 벡터를 생성하기 전에, 본 발명자들은 (i) AAV2/2-CMV-EGFP 벡터(즉 상동성 ITR2를 가진 벡터)의 생성에 있어서 Rep2와의 Rep5의 잠재적인 경쟁, 및 (ii) AAV5/2-CMV-EGFP 벡터(즉 상동성 ITR5를 가진 벡터)의 생성에 있어서 Rep5와의 Rep2의 잠재적인 경쟁을, 동일한 양의 Rep5Cap2 및 Rep2Cap2 패키징 구축물(비율 1:1)을 사용하여 평가하였다. 사실상, Rep2Cap2 외에도 Rep5Cap2 패키징 구축물이 제공되는 경우, AAV2/2-CMV-EGFP 벡터의 총 수율은, Rep2Cap2만이 패키징 구축물로서 제공되는 경우 수득되는 대조군 조제물의 총 수율의 42%까지 감소된다(각각의 타입의 4개의 독립적인 조제물의 평균, p 스튜던츠 t-테스트 < 0.05). 역으로, Rep2Cap2가 Rep5Cap2에 첨가되었을 때 수득된 AAV5/2-CMV-EGFP 조제물의 총 수율에 있어서는 유의한 차이가 발견되지 않았으며, 이때의 수율은 Rep5Cap2가 형질감염된 유일한 패키징 구축물이었을 때 수득된 수율의 83%이었다(각각의 타입의 4개의 독립적인 조제물의 평균, 스튜던츠 t-테스트를 사용하여 확인 시 유의한 차이가 발견되지 않았음). ITR2를 가진 벡터의 생성에 있어서 Rep5가 Rep2와 경쟁한다면, 본 발명자들은 이종성 ITR2 및 ITR5를 가진 AAV의 생성에 있어서 Rep5 및 Rep2Cap2 패키징 구축물 사이에서 3개의 상이한 비율(프로토콜 A에서는 1:1, 프로토콜 B에서는 1:3 및 프로토콜 C에서는 1:10의 Rep5/Rep2Cap2 비율)을 시험하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, ITR2에 어닐링하는 프로브를 사용한 PCR 정량화에 의해 확인된 바이러스 역가는 Rep5의 양이 감소되었을 때 점진적으로 증가하였으며, 프로토콜 C에서 최상의 역가가 수득되었다.
표 3. 다양한 비율의 Rep5 및 Rep2 패키징 구축물의 존재 시 AAV5:2/2 벡터의 수율
Figure 112017095877839-pct00009
ID: AAV5:2/2 벡터의 식별 번호; GC: 게놈 복사체.
이들 결과는, ITR2를 가진 벡터의 생성 동안 Rep2와의 Rep5의 경쟁을 확인시켜 주었으며, 본 발명자들이 이종성 ITR2 및 ITR5를 가진 AAV 벡터의 생성을 위해 프로토콜 C를 따르도록 하였다. 그러나, 이 전략으로 수득된 몇몇 AAV 조제물은: (i) ITR들 사이에서의 이식유전자 서열 상에서 확인된 역가보다 ITR2 상에서 확인된 역가가 최대 6배 더 낮으며(표 4), 이는 ITR2의 온전성이 손상됨(compromise)을 제시할 수 있었다는 점, 및 (ii) 상동성 ITR2를 함유하는 것과 비교하여 이종성 ITR2 및 ITR5를 갖는 AAV 벡터의 총 수율이 평균 약 6배 감소한다는 점(표 4)을 드러내었다.
표 4. ITR2와 이종성 ITR2 및 ITR5를 가진 AAV2의 이식유전자 역가의 낮은 수율 및 차이
Figure 112017095877839-pct00010
ID: AAV 벡터의 식별 번호; GC: 게놈 복사체. a 값은 평균±SEM을 나타낸다.
그러나, 이종성 ITR을 가진 AAV 조제물의 서던 블롯 분석은 게놈 온전성의 명백한 변경을 드러내지 않았다(도 3a).
이중 AAV 하이브리드 AK 벡터에 이종성 ITR을 포함시키는 것이, 절단된 단백질의 생성을 감소시키면서도 꼬리-대-머리 생산성 콘카테머의 형성 및 전장 단백질 형질도입을 증강시켰는지 시험하기 위해, 본 발명자들은 이종성 ITR2 및 ITR5 (in the 5:2/2:5 배치) 또는 상동성 ITR2를 가진, ABCA4 또는 MYO7A를 인코딩하는 이중 AAV 하이브리드 벡터를 이용하여 HEK293 세포를 감염시켰다(도 3b, 3e).
상동성 ITR에서가 아니라 이종성 ITR을 가진 벡터에 대해 ITR2와 이식유전자 역가 사이에 차이가 있으면(표 4), 본 발명자들은 ITR2 또는 이식유전자 역가를 기반으로 하여 각각의 벡터 당 104 게놈 복사체 (GC)/세포로 세포를 감염시켰다. ITR2 역가를 기반으로 이중 AAV 벡터에 의해 감염된 HEK293 세포의, 항-3xflag(ABCA4-3xflag를 검출하기 위함, 도 3b) 또는 항-Myo7a(도 3e) 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석은, 이종성 ITR2 및 ITR5를 포함시키는 것이 상동성 ITR2보다 전장 및 절단된 단백질 둘 다의 수준을 더 높였음을 보여주었다(도 3b, 도 3c, 도 3d, 도 3f). 그러나, 이는 HEK293 세포를, 이식유전자 역가를 기반으로 한 동일한 이중 AAV 벡터 조제물에 의해 감염시켰을 때는 관찰되지 않았다(도 3b, 도 3d). 결론적으로, 전장 및 절단된 단백질 발현 사이의 비율은 벡터에 포함된 ITR(도 3 c, 도 3d, 도 3f) 및 세포의 투약에 사용된 벡터 역가(도 3b, 도 3c, 도 3d)와는 상관없이 유사하였다.
5'-하프 벡터 내의 CL1 데그론은 절단된 단백질 생성물의 생성을 감소시킨다
이중 AAV 하이브리드 벡터14의 각각의 5'-하프 및 3'-하프에 의해 제조된 절단된 단백질 생성물의 수준을 선택적으로 감소시키기 위해, 본 발명자들은 추정상 분해 서열을, 5'-하프 벡터에서 AK와 우측 ITR 사이에서 스플라이싱 공여자 신호 다음에 두고, 3'-하프 벡터에서는 AK와 스플라이싱 수여자 신호 사이에 두었다(도 1). 따라서, 분해 신호는 스플라이싱된 mRNA로부터 비롯되는 전장 단백질에서가 아니라 절단된 단백질에 포함될 것이다. 5'-하프 벡터에 분해 신호로서, 본 발명자들은: (i) CL1 데그론(CL1), (ii) miR-let7b 표적 부위의 4개의 복사체(4xLet7b), (iii) miR-26a 표적 부위의 4개의 복사체(4x26a) 또는 (iv) miR-204 표적 부위와 miR-124 표적 부위 각각의 3개의 복사체들의 조합(3x204+3x124)(표 2)을 포함시켰다. 3'-하프 벡터에 분해 신호로서, 본 발명자들은: (i) 3 정지 코돈(정지), (ii) 단일(PB29) 또는 3개의 탠덤 복사체(3xPB29)에 PB29, 또는 (iii) 유비퀴틴(표 2)을 포함시켰다. 본 발명자들은 다양한 분해 신호를 포함하는 ABCA4를 인코딩하는 이중 AAV2/2 하이브리드 AK 벡터를 생성하였으며, HEK293 세포를 감염시킨 후[m.o.i.: 각각의 벡터 당 5 x 104 게놈 복사체(GC)/세포] 이들 벡터의 효능을 평가하였다. miR-let7b, miR-26a, miR-204 및 miR-124가 HEK293 세포(Ambion miRNA Research Guide37)에서 불량하게 발현되거나 완전히 부재하기 때문에, 이들 miR의 표적 부위를 함유하는 구축물의 침묵화를 시험하기 위해, 본 발명자들은 상기 세포를 miR 모방체(즉, 내인성 miR38을 모방하는 작고 화학적으로 변형된 이중 가닥 RNA)로 형질감염시킨 후, 상응하는 표적 부위를 함유하는 AAV2/2 벡터로 감염시켰다. 상응하는 miR 표적 부위를 함유하는 유전자의 침묵화를 달성하는 데 필요한 miR 모방체의 농도를 확인하기 위해, 본 발명자들은 리포터 EGFP 단백질을 인코딩하고 폴리아데닐화 신호 앞에 miR 표적 부위를 함유하는 플라스미드를 사용하였다(데이터는 도시되지 않음). 동일한 실험 설정을 이중 AAV 하이브리드 AK 벡터의 맥락에서의 miR 표적 부위에 대한 추가적인 평가에 사용하였다. 본 발명자들은, 이중 AAV 하이브리드 AK 벡터의 5'-하프에 miR-204+124 및 26a 표적 서열을 포함시키는 것이 전장 단백질 발현에 영향을 미치지 않으면서도 절단된 단백질 생성물의 발현을 완전히 없애지는 못하더라도 감소시켰음을 발견하였다(도 4). 상이하게는, miR-let7b 표적 부위를 포함시키는 것은 절단된 단백질 발현을 감소시키는 데 효과적이지 않았다(도 4).
주목할만하게는, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은, 5'-하프 벡터에 CL1 분해 신호를 포함시키는 것이 전장 단백질 발현에 영향을 미치지 않으면서도 검출할 수 없는 수준으로 절단된 단백질 생성물의 발현을 감소시켰음을 발견하였다(도 5a). CL1 분해31를 매개하는 유비퀴틴화 경로의 효소의 조직-특이적인 발현에서의 차이가 CL1 효능의 변화를 설명할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 돼지 망막에서 CL1 데그론의 효능을 평가하였으며, 돼지는 인간19 , 30, 39, 40과 유사한 크기 및 구조를 갖고 있어서 벡터의 안전성 및 효율을 평가하기 위한 우수한 예비-임상 대형 동물 모델이다. 이를 위해, 본 발명자들은 라지 화이트종 돼지에서, ABCA4를 인코딩하는 AAV2/8 이중 AAV 하이브리드 AK 벡터(이 중에서 5'-하프 벡터는 CL1 서열을 포함하거나 포함하지 않았음)를 망막하로 주사하였다(각각의 벡터의 용량/눈: 1 x 1011 GC). 주목할만하게는, 본 발명자들은, 5'-하프 벡터에 CL1 분해 신호를 포함시키는 것이 전장 단백질 발현에 영향을 미치지 않으면서도 절단된 단백질의 발현을 웨스턴 블롯 분석의 검출 한계 미만까지 상당히 감소시켰음을 발견하였다(도 5b). 3'-하프 벡터에서 시험된 분해 신호 중에서, 본 발명자들은 정지 코돈이 절단된 단백질 생성에 영향을 미치지 않았음을 발견하였다. 상이하게는, PB29(단일 또는 3개의 탠덤 복사체에서) 및 유비퀴틴 모두, 절단된 단백질 발현을 감소시키는 데 효과적이었다. 그러나, 유비퀴틴은 전장 단백질의 발현도 없앤 반면, PB29는 전장 단백질 생성에 대해 더 적은 범위로 영향을 미쳤다(도 6).
3'-하프 벡터에서 시험된 분해 신호 중에서, 본 발명자들은 절단된 단백질 생성물 및 전장 단백질의 수준을 둘 다 감소시킨 3가지(PB29, 3xPB29 및 유비퀴틴)를 동정하였다(도 6 및 표 5 및 표 6).
표 5. 5'-하프 벡터에 miR 표적 부위를 포함하는 이중 AAV 하이브리드 벡터에 의해 감염된 HEK293 세포의 웨스턴 블롯 분석으로부터의, 절단된 단백질 발현에 대한 전장 ABCA4의 정량화
Figure 112017095877839-pct00011
값은 상응하는 모방체 또는 스크램블 모방체의 존재 하에 전장 ABCA4 및 절단된 단백질 밴드의 강도 사이의 비율의 (3개의 독립적인 실험으로부터) 평균 ± s.e.m.을 나타낸다. 스크램블 또는 상응하는 모방체의 존재 하에 각각의 쌍의 벡터에 대한 비율을 스튜던츠 t-테스트를 사용하여 비교하였으며, 유의한 차이가 발견되지 않았다.
표 6: 3 '-하프 벡터에 분해 신호를 포함하는 이중 AAV 하이브리드 벡터에 의해 감염된 HEK293 세포의 웨스턴 블롯 분석으로부터의, 절단된 단백질 발현에 대한 전장 ABCA4의 정량화.
Figure 112017095877839-pct00012
값은 분해 신호를 가진 벡터 또는 갖지 않은 벡터로부터 전장 ABCA4 및 절단된 단백질 밴드의 강도 사이의 비율의 (3개의 독립적인 실험으로부터) 평균 ± s.e.m.을 나타낸다. 특정 통계학적 값을 포함한 통계학적 분석에 대한 보다 상세한 사항은 재료 및 방법 섹션의 통계학적 분석 단락에서 확인할 수 있다.
개선된 이중 AAV 벡터의 망막하 투여는 Abca4 -/- 망막에서의 리포푸신 축적을 감소시킨다
본 발명자들의 발견을 기반으로, 개선된 이중 AAV 하이브리드-ABCA4 벡터는 상동성 ITR2, 상동성 AK 영역 및 CL1을 포함해야 한다. ABCA4가 인간에서 간상체 및 추상체 광수용기 둘 다에서 발현되기 때문에70, 본 발명자들은 인간 GRK1(G 단백질-커플링된 수용체 키나제 1) 프로모터 또는 IRBP(광수용기간 레티노이드 결합 단백질) 프로모터 유래의 EGFP를 인코딩하는 단일 AAV2/8 벡터의 PR 형질도입 특성을 비교함으로써 ABCA4 전달에 적합한 프로모터를 동정하였으며, 상기 프로모터들은 둘 다 다양한 종들에서 조합된 간상체 및 추상체 PR 형질도입을 높은 수준으로 유도하는 것으로 보고되어 있다53 -55. 인간의 망막 황반(macula)과 유사한 추상체:간상체 = 1:356을 가진 스트리크(streak)-유사 영역을 포함하는 돼지 망막 구조물을 이용하여, 본 발명자들은 3월령 라지 화이트종 돼지에서 AAV2/8-GRK1- 또는 IRBP-EGFP 벡터를 1x1011 GC/눈으로 망막하로 주사하였다. 주사 후 4주째에, 본 발명자들은 형광 현미경 하에 상응하는 망막 냉동박편을 분석하였다. PR 세포 층에서의 EGFP 형광 정량화(도 10a 내지 도 10b)는, 2개 프로모터 모두 유사한 수준의 PR 형질도입(이 영역에서는 주로 간상체)을 제공함을 보여주었다. 그러나, 본 발명자들이 마찬가지로 EGFP 양성인 추상체 어레스틴(CAR)57에 대한 항체로 표지된 추상체의 수를 계수하였을 때, 이들은 GRK1 프로모터를 이용한 추상체 PR 형질도입을 통계학적으로 유의한 수준은 아니지만 더 높은 것을 발견하였다(물질, 도 10c 내지 도 10d). 이를 기반으로, 본 발명자들은 이들의 개선된 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터에 GRK1 프로모터를 포함시켰으며, ABCA4를 발현하고, Abca4 -/- 마우스의 RPE에서 A2E-함유 자가형광 리포푸신 물질의 비정상적인 함량을 감소시키는 능력에 대해 조사하였다. 본 발명자들은 처음에, 1월령의 C57/BL6 마우스에게 개선된 이중 AAV 벡터(각각의 벡터의 용량/눈: 2x109 GC)를 망막하 주사하였으며, 주사한 24개의 눈 중 12개(50%)가 웨스턴 블롯에 의해 확인 시 전장 ABCA4 단백질을 다양한 수준이긴 하지만 검출 가능한 수준으로 가졌음을 발견하였다[도 8a; ABCA4-양성 눈에서 ABCA4 단백질 수준: 2.8 ± 0.7 a.u.(평균 ± 평균의 표준 오차)]. 이는, 상이한 버전의 이중 AAV 플랫폼이 50% ABCA4-발현 눈14에서 초래되었다는 본 발명자들의 이전의 발견과 유사하다. 그런 다음, 본 발명자들은 5.5월령 유색 Abca4 -/- 마우스에게, 개선된 이중 AAV 벡터를 눈의 측두측 영역에 망막하 주사하였다(각각의 벡터의 용량/눈: 1.8x109 GC). 3개월 후, 본 발명자들은 눈을 수집하고, 상기 눈의 측두측 영역에서 망막 냉동박편[RPE 단독 또는 RPE +외부 분절(OS)] 상에서의 리포푸신 형광 (여기: 560±40 nm; 방출: 645±75)의 수준을 측정하였다(도 8b 내지 도 8c 및 도 11). 본 발명자들은, 눈의 이 영역에서의 리포푸신 형광 강도가 치료용 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터를 주사한 Abca4 +/- 마우스 및 Abca4 -/- 마우스 둘 다에서보다 비처리된 Abca4-/- 마우스에서 상당히 더 높았음을 발견하였다(도 8b, 도 8c 및 도 11). 그런 다음, 투과 전자 현미경을 사용하여, 본 발명자들은 RPE 리포푸신 과립의 수를 계수하였다. 이들은 연령-매칭된 Abca4 +/+ 대조군과 비교하여 PBS를 주사한 5.5월령 내지 6-월령의 알비노 Abca4 -/- 마우스에서 증가하였으며(도 8d), 이와 유사한 수준에서 본 발명자들은 주사하지 않거나 또는 대조군 AAV 벡터를 주사한 Abca4-/- 마우스에서 독립적으로 측정하였다(데이터는 도시되지 않음). Abca4-/- RPE에서의 리포푸신 과립의 수를, 개선된 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터의 망막하 주사 후 3개월째에 정규화하였다(각각의 벡터의 용량/눈: 1x109 GC, 도 8d).
개선된 이중 AAV 벡터는 마우스 및 돼지 망막에의 망막하 투여 시 안전하다
개선된 이중 AAV2/8 하이브리드 ABCA4 벡터의 안전성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 상기 벡터를 야생형 C57BL/6 마우스 및 라지 화이트종 돼지 둘 다에게 망막하 주사하였다(각각의 벡터의 용량/눈: 각각 3x109 및 1x1011 GC). 주사 후 1개월째에, 본 발명자들은 망막 전기적 활성을 간츠펠트(Ganzfeld) 망막 전위도(ERG)에 의해 측정하였으며, 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터를 주사한 마우스 눈과, 음성 대조군 AAV 벡터 또는 PBS를 주사한 눈 사이에서 a-파 및 b-파 진폭이 둘 다 유의하게 상이하지 않았음을 발견하였다(도 9a 및 재료, 도 12a). 유사하게는, 암순응, 명순응, 최대 반응 및 깜박거림 ERG 시험 둘 다에서 b-파 진폭은, PBS를 주사한 대조군 눈에 이중 AAV 하이브리드 ABCA4 벡터를 주사한 돼지 눈에서와 유사하였다(도 9b 및 재료, 도 12b).
고찰
AAV 제한된 패키징 용량은 IRD의 유전자 치료법에 대한 AAV의 광범위한 적용에 있어 주요 걸림돌들 중 하나를 나타낸다. 그러나, 최근 몇몇 그룹들이 독립적으로, 이중 AAV 벡터가 마우스 및 돼지 망막 둘 다에서 AAV 카고 용량(cargo capacity)을 효과적으로 확장시키며14 , 17, 19, 41, 따라서 단일 표준(canonical) AAV 벡터에서는 맞춰지지 않을 유전자에서의 돌연변이로 인해 IRD에의 AAV 이용 가능성을 확장시킨다고 보고하였다. 따라서, 본 발명자들은 이중 AAV 벡터의 사용과 연관된 일부 한계들, 즉 단일 벡터와 비교 시 상기 이중 AAV 벡터의 상대적으로 낮은 효율, 및 안전성 문제를 유발할 수 있는 절단된 단백질의 생성을 극복하기 위해 설정한다.
이중 AAV 게놈 꼬리-대-머리 콘카테머화를 증가시키기 위한 전략은 이론적으로, 자유 단일 하프-벡터로부터 전장 단백질의 수준을 증가시키고 절단된 단백질의 수준을 감소시켜야 한다. 본 발명자들은 상동성 또는 이종성 ITR의 최적 영역을 포함시킴으로써 꼬리-대-머리 이중 AAV 하이브리드 게놈 콘카테머화를 향상시키려고 설정한다. 이전에 보고된 상동성 영역에 대한 나란한(side-by-side) 평가에서, 본 발명자들은, Lostal 등20에 의해 최근 공개된 AP1 및 AP2 서열 및 F1 파지 14 유래의 AK 서열이 마우스 망막에서 보다 일관적인 ABCA4 발현을 유도하는 이중 AAV 하이브리드 AK 벡터를 이용하여 시험관내에서 단백질 발현을 전반적으로 유사한 수준으로 유도함을 발견하였다. 독립적으로, 상이한 상동성 영역의 이용 가능성은 AAV 카고 용량20, 42을 더 확장시키기 위해 삼중 AAV 벡터의 적절한 콘카테머화를 지시하는 데 유용하다. 이종성 ITR2 및 ITR5는 이중24 , 25 및 삼중42 AAV 벡터에 성공적으로 포함되었다. 본 발명자들은, 이종성 ITR2 및 ITR5를 가진 AAV 벡터의 수율이 상동성 ITR2를 가진 벡터의 수율보다 더 낮음을 발견하였다. 본 발명자들은 또한, 본 발명자들이 이들의 게놈의 상이한 영역들을 프로브할 때보다 본 발명자들이 이들의 ITR2를 프로브할 때, 이종성 ITR을 가진 벡터 게놈을 더 적게 검출하였다. 본 발명자들이, Rep5가 ITR2를 갖는 벡터의 생성을 방해한다고 보여주기 때문에, 이는 Rep2의 존재 시에만 생성되는 상동성 ITR2를 가진 AAV 벡터에서가 아니라 Rep5의 존재 시 생성되는 이종성 ITR을 가진 AAV 벡터에 포함된 ITR2의 수준의 비정상을 제시하고, 본 발명자들이 게놈의 ITR2 또는 상이한 영역을 프로브하는지 여부에 관계없이 유사한 역가를 보였다. 이들 결과는 부분적으로는, 이종성 ITR2 및 ITR5를 가진 이중 AAV 벡터가 상동성 ITR을 가진 벡터보다 더 높은 형질도입 효율을 가졌으며 생성 문제를 명확하게 갖지 않았다는 이전의 보고들과는 상이하다24 , 25. 상이한 패키징 구축물 및 생성 프로토콜 외에도, 이 연구에서 본 발명자들은, 콘카테머화24 , 25를 위해 단순히 ITR에 의존하는 이전의 보고들에서 사용된 트랜스-스플라이싱 시스템과는 대조적으로, 2개의 하프-벡터들 사이에 상동성 영역을 포함시킨 이중 AAV 하이브리드 벡터를 사용하였다. 이중 AAV 하이브리드 벡터에서는 전장 유전자의 재구축이 콘카테머 형성을 지시하는 상기 벡터16에 포함된 상동성 영역에 의해 주로 매개되므로, 이는 트랜스-스플라이싱 벡터24 , 25를 사용한 이전의 연구들과 비교하여 이종성 ITR을 가진 벡터를 이용하여 본 발명자들이 관찰한 이식유전자 발현에서의 더 작은 감소를 설명할 수 있다. 또한, 본 발명자들이 각각 MYO7A-발현 벡터 및 ABCA4-발현 벡터에 대한 이식유전자 서열을 기반으로 계산된 것보다 3배 내지 6배 더 낮은 ITR을 기반으로 계산된 역가를 기준으로 사용하였기 때문에, 본 발명자들은 이종성 ITR을 가진 벡터의 효율을 과대평가했을 수 있다. ITR2 및 이식유전자 서열을 기반으로 계산된 역가들 둘 다 상동성 ITR2를 가진 상응하는 이중 AAV 벡터들 사이에서 유사하기 때문에, 본 발명자들은 상기 벡터들을 이종성 ITR2 및 ITR5를 가진 벡터들보다 3배 내지 6배 더 낮은 부피로 사용하였다. 이는, 상동성 ITR을 가진 이중 AAV 벡터보다 이종성 ITR을 가진 이중 AAV 벡터로부터의 전장 및 절단된 단백질 생성물의 명확하게 더 높은 수준을 설명할 수 있다.
본 발명자들의 이전의 연구에서, 본 발명자들은 이중 AAV 벡터14의 망막하 투여 후 8개월째까지 국소 독성의 징후를 관찰하지 않았으나, 이중 AAV의 단일 하프-벡터로부터의 절단된 단백질 생성물의 생성은 안전성 문제를 유발할 것이다. 유전자 전사체에 miR 표적 부위를 포함시키는 것은 망막30을 포함한 다양한 조직에서 이식유전자 발현을 제한하기 위한 효과적인 전략인 것으로 나타났다. 그러나, 시험관내에서, 본 발명자들이 miR-204+124 및 26a에 대한 표적 부위를 포함시켰을 때에만 본 발명자들은 절단된 단백질 생성의 부분적인 감소를 달성하였다. 사실상, miR 표적 부위에 대해 외부에 놓인 mRNA의 특징은 침묵화의 효율에 영향을 미칠 수 있다43, 44. 이와 더불어, 5'-하프로부터 유래되는 절단된 단백질 생성물이 표준 폴리아데닐화 신호가 부여되지 않은 벡터로부터 생성되기 때문에, 생성되는 mRNA가 효율적인 miR-매개 침묵화를 수행할 수 없는 것이 가능할 수 있다. 중요하게는, 본 발명자들은 CL1 데그론을 포함시킴으로써, 5'-하프 벡터로부터 절단된 단백질 생성물을 완전히 분해시켰다. 본 발명자들은, 이러한 신호가 시험관내 및 돼지 망막 둘 다에서 효과적임을 보여주었으며, 이는 CL1 활성에 필요한 분해 경로의 효소가 다양한 세포 타입들에서 발현됨을 가리킨다. 3'-하프 벡터로부터의 절단된 단백질 생성물의 풍부도가 5'-하프 벡터에 의해 생성된 것보다 더 낮기 때문에(도 6), 이의 존재는 안전성 문제를 더 적게 유발해야 한다. 본원에서 마우스 및 돼지 망막에서 제시된 데이터는 개선된 이중 AAV 벡터의 안전성을 뒷받침한다.
주목할만하게는, 본 발명자들은, 조합된 간상체 및 추상체 형질도입을 높은 수준으로 제공하는 GRK1 프로모터의 조절 하에 개선된 이중 AAV 벡터를 망막하 투여하면, 마우스에서 변동적인 수준이긴 하지만 효과적인 ABCA4 전달을 초래함을 발견하였다. 이는, 작은 뮤린 눈에서 망막하 주사의 타고난 가변성, 및 단일 AAV 벡터14와 비교하여 이중 AAV 시스템의 전반적으로 더 낮은 효능 때문일 수 있었다. 이러한 가변성에도 불구하고, 본 발명자들은, 이중 AAV에 의해 매개된 ABCA4 전달이 Abca4-/- 망막에서 상당한 리포푸신 감소를 초래하며, 이는 광범위한 이식유전자 발현 수준이 치료 효능에 유사하게 기여할 수 있음을 발견하였다. 이는 2개의 독립적인 기술을 사용하여 관찰되었으나, 본 발명자들이, 사실상 리포푸신 과립의 수의 정규화를 보여준 망막의 AAV 형질도입된 영역을 해부하고 분석하였을 때 표현형의 보다 두드러진 향상이 관찰되었다. 결론적으로, 본 발명은 임상 적용, 특히 망막 질병의 치료에 적합한 개선된 특징을 가진 다중 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 다중 벡터의 안전성 및 효능을 개선하며 이는 카고 용량20 , 42을 더 확장시킨다.
SEQUENCE LISTING <110> Fondazione Telethon <120> Multiple vector system and uses thereof <130> PCT 129062 <150> US62/127,463 <151> 2015-03-03 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Ala Cys Lys Asn Trp Phe Ser Ser Leu Ser His Phe Val Ile His Leu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Ser Leu Ile Ser Leu Pro Leu Pro Thr Arg Val Lys Phe Ser Ser Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ile Arg Ile Met Lys Ile Ile Thr Met Thr Phe Pro Lys Lys 20 25 30 Leu Arg Ser 35 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Phe Tyr Tyr Pro Ile Trp Phe Ala Arg Val Leu Leu Val His Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 Ser Asn Pro Phe Ser Ser Leu Phe Gly Ala Ser Leu Leu Ile Asp Ser 1 5 10 15 Val Ser Leu Lys Ser Asn Trp Asp Thr Ser Ser Ser Ser Cys Leu Ile 20 25 30 Ser Phe Phe Ser Ser Val Met Phe 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cgactacaag gatgacgatg 4500 acaagtgagc ggccgcttcg agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 4560 acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 4620 tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg 4680 tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt 4740 ggtaaaatcg ataaggatct tcctagagca tggctacgta gataagtagc atggcgggtt 4800 aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg 4860 ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc 4920 ctcagtgagc gagcgagcgc gcag 4944 <210> 78 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 78 atgcagatct tcgtgaagac tctgactggt aagaccatca ccctcgaggt ggagcccagt 60 gacaccatcg agaatgtcaa ggcaaagatc caagataagg aaggcattcc tcctgatcag 120 cagaggttga tctttgccgg aaaacagctg gaagatggtc gtaccctgtc tgactacaac 180 atccagaaag agtccacctt gcacctggta ctccgtctca gaggtggg 228

Claims (39)

  1. 세포 내에서 관심 유전자의 코딩 서열을 발현하는 AAV 다중 벡터 시스템으로서,
    상기 코딩 서열은 제1 부분 및 제2 부분을 포함하고,
    상기 벡터 시스템은
    a) - 상기 코딩 서열의 상기 제1 부분(CDS1),
    - 제1 재구축 서열(reconstitution sequence)
    을 포함하는 제1 벡터; 및
    b) - 상기 코딩 서열의 상기 제2 부분(CDS2),
    - 제2 재구축 서열
    을 포함하는 제2 벡터
    를 포함하며,
    상기 제1 재구축 서열 및 상기 제2 재구축 서열은
    i] 상기 제1 재구축 서열은 코딩 서열의 상기 제1 부분의 3' 말단으로 구성되고, 상기 제2 재구축 서열은 코딩 서열의 상기 제2 부분의 5' 말단으로 구성되며, 상기 제1 재구축 서열 및 상기 제2 재구축 서열은 오버래핑 서열임; 또는
    ii] 상기 제1 재구축 서열은 스플라이싱 공여자 신호(SD; donor signal)를 포함하고, 상기 제2 재구축 서열은 스플라이싱 수여자 신호(SA; acceptor signal)를 포함하는 서열임
    으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 제1 벡터 및 제2 벡터 중 하나 또는 둘 다는 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하며, 상기 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열은 i)의 경우, CDS1의 3' 말단 및/또는 CDS2의 5' 말단에 위치하고, ii)의 경우, SD에 대하여 3' 위치 및/또는 SA에 대하여 5' 위치에 위치한다는 사실을 특징으로 하며,
    상기 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열은 CL1 서열 번호 1을 인코딩하는 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 또는 서열 번호 16을 포함하거나 이로 구성되는, AAV 다중 벡터 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 벡터 및 제2 벡터가 둘 다 분해 신호의 상기 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하고,
    상기 제1 벡터 내 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열이 상기 제2 벡터 내 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 상이한, AAV 다중 벡터 시스템.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 재구축 서열 및 제2 재구축 서열은 각각 재조합유전성(recombinogenic) 서열을 더 포함하며,
    상기 재조합유전성 서열은 AK GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(서열 번호 22) 또는 GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(서열 번호 23), AP1(서열 번호 24), AP2(서열 번호 25) 및 AP(서열 번호 26)로 이루어진 군으로부터 선택되는, AAV 다중 벡터 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 재구축 서열이 스플라이싱 공여자 신호(SD), 및 상기 SD에 대하여 3' 위치에 재조합유전성 서열을 포함하며,
    상기 제2 재구축 서열이 스플라이싱 수여자 신호(SA), 및 상기 SA에 대하여 5' 위치에 재조합유전성 서열을 포함하고,
    상기 분해 신호의 상기 뉴클레오타이드 서열이 상기 제1 벡터 및 제2 벡터 중 하나 또는 둘 다의 재조합유전성 영역의 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치하고,
    상기 재조합유전성 서열은 AK GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(서열 번호 22) 또는 GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(서열 번호 23), AP1(서열 번호 24), AP2(서열 번호 25) 및 AP(서열 번호 26)로 이루어진 군으로부터 선택되는, AAV 다중 벡터 시스템.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 벡터가 코딩 서열의 상기 제1 부분(CDS1)의 5' 말단 부분에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 더 포함하는, AAV 다중 벡터 시스템.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 벡터 및 제2 벡터가 둘 다 5'-말단 반복부(5'-TR) 뉴클레오타이드 서열 및 3'-말단 반복부(3'-TR) 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, AAV 다중 벡터 시스템.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 5'-TR이 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR; 5'-inverted terminal repeat) 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 3'-TR이 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 뉴클레오타이드 서열이며,
    상기 ITR이 동일한 바이러스 혈청형 또는 상이한 바이러스 혈청형으로부터 유래되는, AAV 다중 벡터 시스템.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코딩 서열이 천연 엑손-엑손 연접(junction)에서 상기 제1 부분 및 제2 부분으로 분할되는, AAV 다중 벡터 시스템.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스플라이싱 공여자 신호가 GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT(서열 번호 27)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된, AAV 다중 벡터 시스템.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스플라이싱 수여자 신호가 GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG(서열 번호 28)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된, AAV 다중 벡터 시스템.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 벡터가, 상기 코딩 서열에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 인핸서 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, AAV 다중 벡터 시스템.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코딩 서열이 ABCA4, MYO7A, CEP290, CDH23, EYS, PCDH15, CACNA1, SNRNP200, RP1, PRPF8, RP1L1, ALMS1, USH2A, GPR98 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 코딩 서열인, AAV 다중 벡터 시스템.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코딩 서열이 DMD, CFTR, F8 및 DYSF로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 코딩 서열인, AAV 다중 벡터 시스템.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 벡터가 폴리아데닐화 신호 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는, AAV 다중 벡터 시스템.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 5'-3' 방향으로:
    - 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR) 서열;
    - 프로모터 서열;
    - 관심 유전자의 코딩 서열의 5' 말단 부분(CDS1)으로서, 상기 5' 말단 부분이 상기 프로모터에 작동적으로 연결되고 이의 조절하에 있는 부분;
    - 스플라이싱 공여자 신호의 뉴클레오타이드 서열;
    - 재조합유전성 영역의 뉴클레오타이드 서열; 및
    - 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 서열
    을 포함하는 제1 벡터; 및
    b) 5'-3' 방향으로:
    - 5'-반전 말단 반복부(5'-ITR) 서열;
    - 재조합유전성 영역의 뉴클레오타이드 서열;
    - 스플라이싱 수여자 신호의 뉴클레오타이드 서열;
    - 코딩 서열의 3' 말단(CDS2);
    - 폴리아데닐화 신호 뉴클레오타이드 서열; 및
    - 3'-반전 말단 반복부(3'-ITR) 서열
    을 포함하는 제2 벡터
    를 포함하고,
    분해 신호의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하고, 상기 서열이 상기 제1 벡터 및 제2 벡터 중 하나 또는 둘 다의 재조합유전성 영역의 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치하며,
    상기 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열은 CL1 서열 번호 1을 인코딩하는 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 또는 서열 번호 16을 포함하거나 이로 구성되고,
    상기 재조합유전성 영역의 뉴클레오타이드 서열은 AK GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(서열 번호 22) 또는 GGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT(서열 번호 23), AP1(서열 번호 24), AP2(서열 번호 25) 및 AP(서열 번호 26)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, AAV 다중 벡터 시스템.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노-연관 바이러스(AAV)가 혈청형 2, 혈청형 8, 혈청형 5, 혈청형 7 또는 혈청형 9로부터 선택되는, AAV 다중 벡터 시스템.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코딩 서열의 제3 부분(CDS3) 및 재구축 서열을 포함하는 제3 벡터를 더 포함하고,
    상기 제2 벡터가 2개의 재구축 서열을 포함하며, 각각의 재구축 서열이 CDS2의 각각의 말단에 위치하는, AAV 다중 벡터 시스템.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 제3 벡터가 분해 신호의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하고,
    상기 뉴클레오타이드 서열은 CL1 서열 번호 1을 인코딩하는 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 또는 서열 번호 16을 포함하거나 또는 이로 구성되는, AAV 다중 벡터 시스템.
  22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 벡터가 상기 코딩 서열의 3' 말단 부분(CDS2)에 연결된 폴리아데닐화 신호 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, AAV 다중 벡터 시스템.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 다중 벡터 시스템을 이용하여 형질변환된 숙주 세포.
  24. 의료용의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 다중 벡터 시스템.
  25. 의료용의 제23항에 따른 숙주 세포.
  26. 유전자 치료법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 다중 벡터 시스템.
  27. 유전자 치료법에 사용하기 위한, 제23항에 따른 숙주 세포.
  28. 망막 변성을 특징으로 하는 병태 또는 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 다중 벡터 시스템.
  29. 망막 변성을 특징으로 하는 병태 또는 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제23항에 따른 숙주 세포.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 망막 변성이 유전성인, AAV 다중 벡터 시스템.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 망막 변성이 유전성인, 숙주 세포.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 병태 또는 질병이 색소성 망막염(RP; retinitis pigmentosa), 레베르 선천성 흑암시(LCA; Leber congenital amaurosis), 스타르가르트 질병(STGD; Stargardt disease), 어셔 질병(USH; Usher disease), 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome), 선천성 비진행 야맹증(CSNB; congenital stationary night blindness), 황반 이영양증(macular dystrophy), 잠복 황반 이영양증(occult macular dystrophy), ABCA4 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된 질병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, AAV 다중 벡터 시스템.
  33. 제29항에 있어서,
    상기 병태 또는 질병이 색소성 망막염(RP; retinitis pigmentosa), 레베르 선천성 흑암시(LCA; Leber congenital amaurosis), 스타르가르트 질병(STGD; Stargardt disease), 어셔 질병(USH; Usher disease), 알스트롬 증후군(Alstrom syndrome), 선천성 비진행 야맹증(CSNB; congenital stationary night blindness), 황반 이영양증(macular dystrophy), 잠복 황반 이영양증(occult macular dystrophy), ABCA4 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된 질병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 숙주 세포.
  34. 뒤시엔느 근이영양증, 낭포성 섬유증, 혈우병 A 및 디스페린병증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 다중 벡터 시스템.
  35. 뒤시엔느 근이영양증, 낭포성 섬유증, 혈우병 A 및 디스페린병증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제23항에 따른 숙주 세포.
  36. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 다중 벡터 시스템 또는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 다중 벡터 시스템을 이용하여 형질변환된 숙주 세포; 및 약제학적으로 허용가능한 비히클;을 포함하는 망막 변성을 특징으로 하는 병태 또는 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  37. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 다중 벡터 시스템 또는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 다중 벡터 시스템을 이용하여 형질변환된 숙주 세포; 및 약제학적으로 허용가능한 비히클;을 포함하는 뒤시엔느 근이영양증, 낭포 성 섬유증, 혈우병 A 및 디스페린병증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  38. 제1항의 AAV 다중 벡터 시스템의 하나 이상의 벡터에 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열을 삽입하는 단계를 포함하고,
    상기 분해 신호의 뉴클레오타이드 서열이 CL1 서열 번호 1을 인코딩하는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되거나, 또는 서열 번호 16을 포함하거나 또는 이로 구성되는, 절단된 형태의 단백질의 발현을 감소시키는 방법.
  39. 삭제
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