ES2862164T3 - Genoterapia de la enfermedad de Wilson - Google Patents

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Abstract

Un vector para expresar la proteína ATP7B, comprendiendo el vector una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B funcional en donde la secuencia de nucleótidos tiene la secuencia de SEQ ID NO. 1, comprendiendo además el vector un promotor específico de hígado.

Description

DESCRIPCIÓN
Genoterapia de la enfermedad de Wilson
Campo de la invención
La invención se refiere a un nuevo enfoque de genoterapia para el tratamiento de la enfermedad de Wilson.
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Wilson es un trastorno autosómico recesivo poco frecuente con una incidencia global considerada de 1 por cada 30.000. Conduce a la acumulación de cobre en varios órganos tales como el hígado, los ganglios basales y la córnea. Normalmente, la proteína ATP7B libera el cobre de la dieta que entra en los hepatocitos. Sin embargo, en la enfermedad de Wilson, una mutación homocigota en el gen ATP7B conduce a una pérdida de secreción biliar de cobre y a una acumulación de este metal en el hígado y en la córnea y, en menor grado, en el cerebro, lo que conduce a daño celular y apoptosis. Los pacientes con enfermedad de Wilson suelen presentarse entre los 6 y los 20 años, pero al igual que ocurre con otras hepatopatías, la lesión hepática crónica no causa muchos síntomas y la única anomalía que suele observarse es un nivel elevado de aminotransferasas o hepatomegalia. La quelación prolongada con penicilamina es el tratamiento de elección inicial, pero un número considerable de pacientes padece efectos secundarios o complicaciones, tales como lupus o miastenia inducidos por fármacos. Por lo tanto, el cumplimiento con el fármaco es mediocre. Las alternativas a la penicilamina incluyen clorhidrato de trientina y, en menor grado, tetratiomolibdato. Los pacientes que responden a la terapia de quelación pueden tratarse con zinc para mantener niveles estables de cobre en el cuerpo. El zinc estimula la metalotioneína, una proteína en las células intestinales que se une al cobre e impide su absorción y transporte al hígado. Estos tratamientos se consideran no curativos ya que los defectos metabólicos de la enfermedad de Wilson no se corrigen con terapia de quelación o tratamiento con zinc. El trasplante de hígado ofrece la posibilidad de curación, pero se asocia a una morbilidad y mortalidad significativas.
Por lo tanto, se necesitan estrategias terapéuticas que puedan invertir los defectos metabólicos subyacentes. Se ha demostrado que el trasplante de hepatocitos normales en modelos animales de la enfermedad de Wilson es eficaz, pero solo de forma transitoria y se asocia a: (a) problemas de injertación y proliferación de células del donante que requieren un acondicionamiento previo con radiación, embolización de la vena porta o resección parcial del hígado; (b) la necesidad de modular la reacción inmunitaria y los cambios vasculares; y (c) la falta de suministro constante de hígados de donantes sanos nuevos para aislar los hepatocitos (Irani AN et al, Mol Ther 3: 302-309; Park SM et al, Cell Transplant 15:13-22; Hughes RD et al; Transplantation 93:342-347).
En cambio, la genoterapia de la enfermedad de Wilson ofrece la posibilidad de una cura a través de la producción endógena de ATP7B después de la transferencia de una copia normal del gen de ATP7B a un paciente afectado.
Anteriormente, se intentó la transferencia lentivírica de ATP7B en un modelo de rata (Merle U et al, Scand J Gastroenterol 41: 974-982) así como en animales prenatales en un modelo de ratón de la enfermedad (Roybal JL et al, Gene Ther 19: 1085-1094), pero se observó una mala transducción del tejido afectado y una corrección fenotípica limitada. Murillo et al., Journal of Hepatology, 2016 64(2): 419-426, describen la corrección metabólica a largo plazo de la enfermedad de Wilson en un modelo murino mediante genoterapia. En los documentos WO 2016/097219 y WO 2016/097218 se describen construcciones de ácido nucleico y vectores de genoterapia para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson.
Los inventores han desarrollado un enfoque de genoterapia utilizando vectores víricos adenoasociados (AAV, adenoassociated viral) para mediar en la transferencia y en la expresión del gen de ATP7B. Dado que la enfermedad de Wilson surge a partir de un defecto en un solo gen, niveles relativamente bajos de corrección enzimática ofrecerán un almacenamiento de cobre reducido. El enfoque del inventor implica la expresión de ATP7B mediada por el hígado después de la transferencia génica de hepatocitos mediada por AAV in vivo, que produce tolerancia a la proteína transgénica, reduciendo así el riesgo de desarrollar anticuerpos neutralizantes contra ATP7B.
Sumario de la invención
En un primer aspecto de la invención, se proporciona un vector para expresar la proteína ATP7B, comprendiendo el vector una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B funcional en donde la secuencia de nucleótidos tiene la secuencia de SEQ ID NO. 1, comprendiendo además el vector un promotor específico de hígado.
En el presente documento también se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B funcional en donde la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 85 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica una proteína ATP7B. De manera sorprendente, los inventores han descubierto que la nueva secuencia de SEQ ID NO: 1 con codones optimizados, da como resultado niveles más altos de expresión del transcrito de ATP7B en hepatocitos transducidos con un vector AAV bajo el control de un promotor específico de hígado, en comparación con los niveles del transcrito de tipo silvestre.
La secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 85 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 86 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 87 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En aspectos particulares, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 88 % con la secuencia de s Eq ID NO: 1. En aspectos adicionales, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 89 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 91 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En aspectos particulares, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 92 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En aspectos adicionales, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 93 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 94 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En aspectos particulares, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 96 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En aspectos adicionales, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 97 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 98 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 99 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.
Una proteína ATP7B funcional es una ATPasa que transporta cobre dentro y fuera de las células. Los expertos en la técnica conocen bien métodos adecuados para analizar la actividad de ATP7b .
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un vector para expresar la proteína ATP7B.
El vector comprende la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. Esto significa que el vector contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B funcional de modo que cuando se expresa esta secuencia, la célula que contiene el vector, produce una proteína ATP7B funcional.
La secuencia de SEQ ID NO. 1 es una secuencia de nucleótidos de ATP7B con codones optimizados. De una manera normal, esta secuencia no tiene codones optimizados. En cambio, los codones se han seleccionado basándose en los codones utilizados para las proteínas que se expresan a un alto nivel en el hígado. La razón de esto es que el vector normalmente se expresa en el hígado. Se ha descubierto que este proceso especial de optimización de codones produce una secuencia de nucleótidos que da una expresión sorprendentemente alta.
La secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B tiene, preferentemente, una longitud entre 4373 y 4423 nucleótidos. En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B funcional tiene una longitud de entre 4378 y 4418 nucleótidos. En otros aspectos, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B funcional tiene una longitud entre 4383 y 4413 nucleótidos. En aspectos particulares, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B funcional tiene una longitud entre 4388 y 4408 nucleótidos.
El vector comprende además un promotor. El promotor provoca la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B funcional. Puede usarse cualquier promotor apropiado, tal como HLP (hybrid liver-specific promotor, promotor híbrido específico de hígado), LP1, HCR-hAAT, ApoE-hAAT y LSP. Estos promotores se describen con más detalle en las siguientes referencias: Hl P: McIntosh J. et al., Blood, 25 de abril de 2013, 121(17):3335-44; LP1: Nathwani et al., Blood. 1 de abril de 2006, 107(7): 2653-2661; HCR-hAAT: Miao et al., Mol Ther. 2000; 1: 522­ 532; ApoE-hAAT: Okuyama et al., Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996); y LSP: Wang et al., Proc Natl Acad Sci USA. 30 de marzo de 1999, 96(7): 3906-3910. En el documento WO 2011/005968, también se describe un promotor preferido. El promotor es un promotor específico de hígado. En realizaciones particulares, el promotor es un promotor HLP (siglas del inglés hybrid liver-specific promoter, promotor híbrido específico de hígado,).
El vector puede ser cualquier vector apropiado para expresar la proteína ATP7B, incluyendo vectores víricos y no víricos. Los vectores víricos incluyen un parvovirus, un adenovirus, un retrovirus, un lentivirus o un virus del herpes simple. El parvovirus puede ser un virus adenoasociado (AAV). El vector es, preferentemente, un vector vírico adenoasociado recombinante (rAAV, recombinant adeno-associated viral) o un vector lentivírico. Más preferentemente, el vector es un vector rAAV.
Un vector de acuerdo con la invención puede ser un vector de suministro de genes. Dicho vector de suministro de genes puede ser un vector de suministro de genes víricos o un vector de suministro de genes no víricos.
Por consiguiente, en el presente documento se describen vectores de suministro de genes basados en parvovirus animales, en particular, dependovirus, tales como AAV infecciosos de ser humano o simio, y los componentes de los mismos (por ejemplo, un genoma de parvovirus animal) para su uso como vectores para la introducción y/o expresión de una proteína ATP7B en una célula de mamífero. Por tanto, el término "parvovírico", como se usa en el presente documento, incluye dependovirus, tal como cualquier tipo de AAV.
Los virus de la familia Parvoviridae son virus pequeños de ADN de animales. La familia Parvoviridae puede dividirse en dos subfamilias: Parvovirinae, que infecta a vertebrados, y Densovirinae, que infecta a insectos. Los miembros de la subfamilia Parvovirinae se denominan en el presente documento parvovirus e incluyen el género Dependovirus. Como puede deducirse del nombre de su género, los miembros del género Dependovirus son únicos ya que normalmente necesitan la coinfección con un virus auxiliar, tal como un adenovirus o herpesvirus, para realizar una infección productiva en un cultivo celular. El género Dependovirus incluye AAV, que normalmente infecta a seres humanos (por ejemplo, serotipos 1,2, 3A, 3B, 4, 5 y 6) o a primates (por ejemplo, serotipos 1 y 4) y virus relacionados que infectan a otros animales de sangre caliente (por ejemplo, virus adenoasociados de bovinos, caninos, equinos y ovinos). Se describe más información sobre parvovirus y otros miembros de la familia Parvoviridae en Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", capítulo 69 en Fields Virology (3a ed. 1996). Por conveniencia, la presente invención se ilustra y describe adicionalmente en el presente documento haciendo referencia a AAV. Sin embargo, debe entenderse que la invención no se limita a AAV, sino que también puede aplicarse a otros parvovirus.
La organización genómica de todos los serotipos de AAV conocidos es muy similar. El genoma de AAV es una molécula de ADN monocatenario, lineal con una longitud de aproximadamente 5.000 nucleótidos (nt). Las repeticiones terminales invertidas (ITR, siglas del inglés inverted terminal repeats) flanquean las secuencias de nucleótidos codificantes únicas de las proteínas de replicación (Rep) no estructurales y de las proteínas (VP) estructurales. Las proteínas VP (VP1,2 y 3) forman la cápside. Los 145 nt terminales son autocomplementarios y se organizan de forma que pueda formarse un dúplex intramolecular energéticamente estable que forma una horquilla con forma de T. Estas estructuras en horquilla funcionan como un origen para la replicación de ADN vírico, actuando como cebadores para el complejo de la ADN polimerasa celular. Después de la infección con AAV de tipo silvestre (ts) en células de mamífero, los genes Rep (es decir, los que codifican las proteínas Rep78 y Rep52) se expresan a partir del promotor P5 y el promotor P19, respectivamente, y las dos proteínas Rep intervienen en la replicación del genoma vírico. Un acontecimiento de corte y empalme en el ORF (open reading frame, marco abierto de lectura) de Rep, da lugar a la expresión de exactamente cuatro proteínas Rep (es decir, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40). Sin embargo, se ha demostrado que el ARNm no sometido a corte y empalme, que codifica las proteínas Rep78 y Rep52, en las células de mamífero, es suficiente para la producción del vector de a Av . También son suficientes las proteínas Rep78 y Rep52 para la producción del vector de AAV en las células de insecto.
En un AAV adecuado para uso como vector de genoterapia, el genoma del vector normalmente comprende un ácido nucleico que se empaqueta para su suministro a una célula diana. De acuerdo con esta realización particular, la secuencia de nucleótidos heteróloga se localiza entre las ITR víricas en cualquier extremo del genoma del vector. En otras realizaciones preferidas, los genes cap del parvovirus (por ejemplo, a Av ) y los genes rep del parvovirus (por ejemplo, AAV) se delecionan del genoma molde (y, por tanto, del ADN del virión producido a partir del mismo). Esta configuración maximiza el tamaño de la secuencia o secuencias de ácido nucleico que puede llevar la cápside del parvovirus.
De acuerdo con esta realización particular, el ácido nucleico de la invención se localiza entre las ITR víricas en cualquier extremo del sustrato. Es posible que un genoma parvovírico funcione solo con una ITR. Por tanto, en un vector de genoterapia de la invención basado en un parvovirus, el genoma del vector está flanqueado por al menos una ITR, pero, más normalmente, por dos ITR de a Av (generalmente una en cada lado del genoma del vector, es decir, una en el extremo 5' y la otra en el extremo 3'). Puede haber secuencias intermedias entre el ácido nucleico en el genoma del vector y una o más de las ITR.
Preferentemente, el ácido nucleico que codifica una proteína ATP7B funcional (para la expresión en las células de mamífero) se incorporará en un genoma parvovírico localizado entre dos ITR regulares o localizado en cualquier lado de una ITR obtenida por ingeniería genética con dos regiones D.
Las secuencias de AAV que pueden usarse en la presente invención para la producción de vectores de genoterapia de AAV, pueden proceder del genoma de cualquier serotipo de a Av . En general, los serotipos de AAV tienen secuencias genómicas de homología significativa a nivel de aminoácidos y de ácidos nucleicos, proporcionan un conjunto idéntico de funciones genéticas, producen viriones que son esencialmente equivalentes desde el punto de vista físico y funcional, y se replican y ensamblan mediante mecanismos prácticamente idénticos. Si se desea más información sobre la secuencia genómica de los diversos serotipos de a Av y una visión general de las similitudes genómicas, véase, por ejemplo, el número de registro U89790 del GenBank; el número de registro J01901 del GenBank; el número de registro AF043303 del GenBank; el número de registro AF085716 del GenBank; Chiorini et al, 1997; Srivastava et al, 1983; Chiorini et al, 1999; Rutledge et al, 1998; y Wu et al, 2000. En la presente invención puede usarse AAV de serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9. Sin embargo, los serotipos 1, 5 u 8 de AAV son fuentes preferidas de secuencias de AAV para su uso en el contexto de la presente invención. Las secuencias de los serotipos de AAV pueden mutarse o modificarse por ingeniería genética cuando se van a usar en la producción de vectores de genoterapia.
Preferentemente, las secuencias de ITR de AAV para su uso en el contexto de la presente invención proceden de AAV1, AAV2, AAV4 y/o AAV6. Análogamente, las secuencias codificantes de Rep (Rep78 y Rep52) proceden preferentemente de AAV1, AAV2, AAV4 y/o AAV6. Sin embargo, las secuencias que codifican las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 para su uso en el contexto de la presente invención, pueden tomarse de cualquiera de los 42 serotipos conocidos, más preferentemente de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9 o de partículas de tipo AAV recientemente desarrolladas obtenidas, por ejemplo, mediante técnicas de barajado de cápsides y bibliotecas de cápsides de AAV.
Las secuencias de ITR y Rep de AAV están particularmente conservadas entre la mayoría de los serotipos. Las proteínas Rep78 de diversos serotipos de AAV tienen, por ejemplo, una identidad mayor del 89 % y la identidad total de la secuencia de nucleótidos a nivel del genoma entre AAV2, AAV3A, AAV3B y AAV6 es de aproximadamente 82 % (Bantel-Schaal et al, 1999). Además, se sabe que las secuencias de Rep y las ITR de muchos serotipos de AAV se complementan eficazmente de forma cruzada (es decir, sustituyen funcionalmente) con las secuencias correspondientes de otros serotipos en la producción de partículas de a Av en células de mamífero. En el documento US 2003148506 se informa acerca de que las secuencias de Rep e ITR de AAV también se complementan eficazmente de forma cruzada con otras secuencias de Rep e ITR de AAV en células de insecto.
Se sabe que las proteínas VP de AAV determinan el tropismo celular del virión de AAV. Las secuencias que codifican la proteína VP están significativamente menos conservadas que los genes y las proteínas Rep entre diferentes serotipos de AAV. La capacidad de las secuencias de Rep e ITR de complementarse de forma cruzada con secuencias correspondientes de otros serotipos, permite la producción de partículas de AAV seudotipificadas que comprenden las proteínas de la cápside de un serotipo (por ejemplo, AAV1, 5 u 8) y las secuencias de Rep y/o ITR de otros serotipos de AAV (por ejemplo, AAV2). Estas partículas de rAAV seudotipificadas forman parte de la presente invención.
En el contexto de la presente invención también pueden usarse secuencias de "AAV" modificadas, por ejemplo, para la producción de vectores de genoterapia de AAV. Dichas secuencias modificadas que incluyen, por ejemplo, secuencias que tienen una identidad de secuencia de nucleótidos y/o de aminoácidos (por ejemplo, una secuencia que tiene una identidad de secuencia de nucleótidos de aproximadamente 75-99 %) de al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95% o mayor, con una ITR, Rep o Vp de AAV1, AAV2, AAV3, a Av 4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9, pueden utilizarse en lugar de las secuencias de ITR, Rep o VP de AAV de tipo silvestre.
Aunque en muchos aspectos es similar a otros serotipos de AAV, el serotipo AAV5 difiere de otros serotipos de AAV de simio y humanos más que otros serotipos de simio y humanos conocidos. En vista de esto, la producción de rAAV5 puede diferir de la producción de otros serotipos en células de insecto. Cuando se emplean métodos para producir rAAV5, se prefiere que una o más construcciones comprendan, en conjunto en el caso de más de una construcción, una secuencia de nucleótidos que comprenda una ITR de AAV5, una secuencia de nucleótidos que comprenda una secuencia codificante de Rep de AAV5 (es decir, una secuencia de nucleótidos que comprenda una Rep78 de AAV5). Dichas secuencias de ITR y Rep pueden modificarse como se desee para obtener una producción eficaz de vectores de AAV5 o AAV5 seudotipificados. Por ejemplo, para mejorar la producción de los vectores de AAV5, puede modificarse el codón de iniciación de las secuencias de Rep, pueden modificarse o eliminarse sitios de corte y empalme de VP y/o puede modificarse el codón de iniciación de VP1 y nucleótidos cercanos.
Por tanto, la cápside vírica usada en la invención puede ser de cualquier parvovirus, ya sea de un parvovirus autónomo o de un dependovirus, como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, la cápside vírica es una cápside de AAV (por ejemplo, una cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 o AAV6). En general, se prefiere la cápside de AAV1 o la de AAV6. La elección de la cápside del parvovirus puede basarse en diversas consideraciones conocidas en la técnica, por ejemplo, el tipo de célula diana, el nivel de expresión deseado, la naturaleza de la secuencia de nucleótidos heteróloga a expresar, cuestiones relacionadas con la producción vírica, y similares. Por ejemplo, la cápside de AAV1 y la de AAV6 puede emplearse ventajosamente en el músculo esquelético; la de AAV1, AAV5 y AAV8 en el hígado y en células del sistema nervioso central (por ejemplo, cerebro); la de AAV5 en células de las vías respiratorias y pulmón o cerebro; la de AAV3 en células de médula ósea; y la de AAV4 en células particulares en el cerebro (por ejemplo, células anexables).
El experto posee las habilidades técnicas para seleccionar el virus, el subtipo de virus o el serotipo de virus más apropiado. Algunos subtipos o serotipos pueden ser más apropiados que otros para un tipo de tejido determinado.
Por ejemplo, la expresión específica de hígado de un ácido nucleico de la invención, puede inducirse ventajosamente mediante transducción mediada por AAV de células hepáticas. El hígado es susceptible de transducción mediada por AAV y pueden usarse diferentes serotipos (por ejemplo, AAV1, AAV5 o AAV8). La transducción del músculo puede realizarse mediante la administración, a través del torrente circulatorio, de un AAV que codifique un ácido nucleico. Por tanto, es aplicable la administración intravenosa o intraarterial.
Un vector de genoterapia de parvovirus preparado de acuerdo con la invención, puede ser una partícula "híbrida" en la que las TR víricas y la cápside vírica son de parvovirus diferentes. Preferentemente, las TR víricas y la cápside vírica son de diferentes serotipos de AAV. Análogamente, el parvovirus puede tener una cápside "quimérica" (por ejemplo, que contenga secuencias de diferentes parvovirus, preferentemente diferentes serotipos de AAV) o una cápside "dirigida" (por ejemplo, un tropismo dirigido).
En el contexto de la invención, se entiende que "al menos una secuencia de nucleótidos de ITR parvovírico" significa una secuencia palindrómica, que comprende, en su mayor parte, secuencias complementarias, ordenadas de forma simétrica, también denominadas regiones "A", "B" y "C". La ITR funciona como un origen de replicación, un sitio que tiene un papel "cis" en la replicación, es decir, que es un sitio de reconocimiento para las proteínas de replicación que actúan en trans tales como, por ejemplo, Rep 78 (o Rep68), que reconocen el palíndromo y las secuencias específicas internas al palíndromo. Una excepción a la simetría de la secuencia de ITR es la región "D" de la ITR. Esta es única (al no tener un complemento dentro de una ITR). El mellado de ADN monocatenario se produce en la zona de unión entre las regiones A y D. Es la región en la que se inicia la síntesis de ADN. La región D normalmente se sitúa en un lado del palíndromo y proporciona direccionalidad a la etapa de replicación del ácido nucleico. Normalmente, un parvovirus que se replica en una célula de mamífero tiene dos secuencias de ITR. Sin embargo, es posible modificar por ingeniería genética una ITR de manera que los sitios de unión estén en las dos cadenas de las regiones A y las regiones D estén localizadas simétricamente, una a cada lado del palíndromo. En un molde de ADN bicatenario, circular (por ejemplo, un plásmido), la replicación del ácido nucleico asistida por Rep78 o Rep68 avanza en ambas direcciones y para la replicación parvovírica de un vector circular basta con una sola ITR. Por tanto, en el contexto de la presente invención puede usarse una secuencia de nucleótidos de ITR. Sin embargo, preferentemente, se usan dos, u otro número par, de ITR regulares. Lo más preferentemente, se usan dos secuencias de ITR. Una ITR parvovírica preferida es una ITR de AAV. Por razones de seguridad, puede ser deseable construir un vector (AAV) parvovírico que no pueda propagarse adicionalmente después de la introducción inicial en una célula. Dicho mecanismo de seguridad para limitar la propagación no deseable de un vector en un receptor, puede proporcionarse usando AAV con una ITR quimérica como se describe en el documento US 2003148506.
Los expertos en la materia apreciarán que la proteína o proteínas Rep víricas usadas para producir un vector de AAV de la invención pueden seleccionarse teniendo en cuenta la fuente de las ITR víricas. Por ejemplo, normalmente, la ITR de AAV5 interacciona más eficazmente con la proteína Rep de AAV5, aunque no es necesario que coincida el serotipo de la ITR y de la proteína o proteínas Rep.
Normalmente, la una o más ITR usadas en la invención son funcionales, es decir, pueden resolverse completamente y preferentemente son secuencias de AAV, prefiriéndose los serotipos 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Las ITR de AAV resolubles de acuerdo con la presente invención, no necesitan tener una secuencia de ITR de tipo silvestre (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre puede alterarse por mutaciones de inserción, deleción, truncamiento o de sentido erróneo), siempre que la ITR medie en las funciones deseadas, por ejemplo, el empaquetamiento vírico, la integración y/o el rescate de provirus, y similares.
Ventajosamente, al utilizar un vector de genoterapia, en comparación con enfoques anteriores, el restablecimiento de la síntesis de proteínas, es decir, de la síntesis de ATP7B, es una característica que las células transducidas adquieren de forma permanente o durante un periodo de tiempo prolongado, evitando así la necesidad de una administración continua para conseguir un efecto terapéutico.
Por consiguiente, los vectores de la invención representan una herramienta para el desarrollo de estrategias para el suministro in vivo de una secuencia de nucleótidos de ATP7B, mediante la modificación por ingeniería genética del ácido nucleico dentro de un vector de genoterapia que transduce de manera eficaz un tipo de célula apropiada, tal como una célula hepática.
Preferentemente, el vector es un vector monocatenario en lugar de un vector autocomplementario. Sorprendentemente, se ha demostrado que esto proporciona una mejor expresión de proteínas.
El vector puede comprender además una cola poli A. Preferentemente, esta cola se coloca secuencia abajo de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B funcional. Preferentemente, la cola de poli A es una pequeña Poli A sintética, idéntica a la utilizada en McIntosh J. etal., Blood (2013): 121(17): 3335-44 en la construcción que expresa FVIII V3.
El vector puede comprender otros elementos para permitir que se exprese la proteína ATP7B funcional. El experto en la materia conoce bien dichos elementos.
Preferentemente, se aíslan los ácidos nucleicos descritos anteriormente.
Con las capacidades de un experto se podrían producir bien las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. Esto podría hacerse, por ejemplo, usando síntesis química de una secuencia dada.
Además, un experto podría determinar fácilmente si un ácido nucleico expresa una proteína funcional. Para los expertos en la materia serán obvios métodos adecuados. Por ejemplo, un método in vitro adecuado implica insertar el ácido nucleico en un vector, tal como un vector lentivírico o un vector de AAV, transducir células hospedadoras, tales como células 293T o HeLa, con el vector, y evaluar la actividad de la proteína ATP7B. Como alternativa, un método adecuado in vivo consiste en transducir un vector que contenga el ácido nucleico en un modelo animal para la enfermedad de Wilson y evaluar la ATP7B funcional en el plasma de los ratones. Los modelos animales para la enfermedad de Wilson son: 1) la rata Long Evans Cinnamon (de color canela), que tiene una deleción grande en el gen de ATP7B (Terada K, Sugiyama T. Pediatr Int. Agosto de 1999; 41(4):414-8); 2) el ratón de leche tóxica de Jackson, que tiene una mutación puntual en la secuencia que codifica la ATP7B (Roberts EA, Robinson BH, Yang S. Mol Genet Metab. Enero de 2008;93(1):54-65); y 3) un ratón ATP7B -/-(Huster D, Finegold MJ, Morgan CT, Burkhead JL, Nixon R, Vanderwerf SM, Gilliam CT, Lutsenko S. Am J Pathol. Febrero de 2006; 168(2):423-34). Adicionalmente, más adelante se describen con más detalle métodos adecuados.
El ácido nucleico puede ser cualquier tipo de ácido nucleico compuesto por nucleótidos. El ácido nucleico debe poder expresarse de manera que se produzca una proteína. Preferentemente, el ácido nucleico es ADN o ARN.
La invención también proporciona una célula hospedadora que comprende el vector de la invención. En el presente documento también se describe una célula hospedadora que comprende una cualquiera de las moléculas o vectores de ácido nucleico descritos anteriormente. Preferentemente, el vector es capaz de expresar la secuencia de nucleótidos de ATP7B en el hospedador. El hospedador puede ser cualquier hospedador adecuado.
Como se usa en el presente documento, el término "hospedador" se refiere a organismos y/o a células que son portadores de una molécula de ácido nucleico o de un vector de la invención, así como organismos y/o células que son adecuados para su uso en la expresión de un gen o una proteína recombinante. No se pretende limitar la presente invención a ningún tipo de célula u organismo particular. De hecho, se contempla que como hospedador cualquier organismo y/o célula adecuados encontrarán uso en la presente invención. Una célula hospedadora puede estar en forma de una sola célula, de una población de células similares o diferentes, por ejemplo, en forma de un cultivo (tal como un cultivo líquido o un cultivo en un sustrato sólido), un organismo o parte del mismo.
Una célula hospedadora de acuerdo con la invención puede permitir la expresión de una molécula de ácido nucleico de la invención. Por tanto, la célula hospedadora puede ser, por ejemplo, una bacteria, una levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero.
Además, en el presente documento se describe un animal transgénico que comprende células que comprenden la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ATP7B funcional descrita anteriormente o un vector descrito anteriormente. Preferentemente, el animal es un mamífero no humano, especialmente un primate. Como alternativa, el animal puede ser un roedor, especialmente un ratón; o puede ser un animal canino, felino, ovino o porcino.
En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector de la invención y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El uno o más excipientes incluyen transportadores, diluyentes y/u otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos o adyuvantes, etc.
En el presente documento se describe un método para tratar la enfermedad de Wilson, que comprende administrar, a un paciente que padece la enfermedad de Wilson, una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, el paciente es un ser humano.
Cuando la enfermedad de Wilson se "trata" con el método anterior, esto significa que se mejoran uno o más síntomas de la enfermedad de Wilson. No significa que los síntomas de la enfermedad de Wilson se remedien por completo, de modo que ya no estén presentes en el paciente, aunque en algunos métodos, puede ser el caso. El método de tratamiento hace que uno o más de los síntomas de la enfermedad de Wilson sean menos graves que antes del tratamiento.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado, tal como elevar el nivel de ATP7B funcional en un sujeto (para conducir a la producción de ATP7B funcional a un nivel suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad de Wilson).
El suministro de un ácido nucleico o de un vector descrito en el presente documento a una célula hospedadora in vivo, puede dar como resultado un aumento de ATP7B funcional en el hospedador, por ejemplo, a un nivel que mejore uno o más síntomas de la enfermedad de Wilson.
Se ha descubierto que, cuando se usa el método de tratamiento descrito en el presente documento, puede provocar un aumento en el nivel de ATP7B funcional en el sujeto. En algunos aspectos, el método de tratamiento provoca un aumento en el nivel de ATP7B funcional hasta aproximadamente un nivel normal (es decir, el nivel encontrado en un sujeto sano normal). En un aspecto, el método de tratamiento provoca un aumento en el nivel de ATP7B de factor funcional hasta, como máximo, niveles normales.
Adicionalmente, la invención proporciona un vector de la presente invención para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad de Wilson.
Además, en el presente documento se describe el uso de la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ATP7B funcional, como se ha descrito anteriormente, o de un vector, como se ha descrito anteriormente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Wilson.
En el presente documento también se describe un método para suministrar a un sujeto una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína ATP7B funcional, cuyo método comprende administrar a dicho sujeto una molécula de ácido nucleico que codifique una proteína ATP7B funcional, como se ha descrito anteriormente, o un vector, como se ha descrito anteriormente.
En la descripción anterior, el término "identidad" se usa para hacer referencia a la similitud de dos secuencias. A los efectos de esta invención, en el presente documento se define que, para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de nucleótidos, las secuencias se alinean para realizar una comparación óptima (por ejemplo, en la secuencia de un primer ácido nucleico pueden introducirse huecos para un realizar una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos). Después, se comparan los restos de nucleótido en las posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones solapantes) x 100). Preferentemente, las dos secuencias tienen la misma longitud. Normalmente, se lleva a cabo una comparación de secuencias en toda la longitud de las dos secuencias comparadas.
El experto sabrá que existen varios programas informáticos para determinar la homología o identidad entre dos secuencias. Por ejemplo, la comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede llevarse a cabo mediante un algoritmo matemático. En un aspecto preferido, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico se determina usando el programa informático de alineación de secuencias Clone Manager 9 (programa informático Sci-Ed - www.scied.com) usando alineación global de ADN; parámetros: ambas cadenas; matriz de puntuación: lineal (emparejamiento incorrecto 2, apertura de hueco 4, extensión de hueco 1).
Como alternativa, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico (o dos secuencias de aminoácidos) se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete del programa informático Accelrys GCG (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), usando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Las secuencias de ácidos nucleicos descritas en el presente documento pueden usarse además como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Estas búsquedas pueden realizarse usando los programas BLASTN (versión 2.0) de Altschul, et al, 1990. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al, 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN). Véase la página web del National Center for Biotechnology Information en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Un experto apreciará que todos los aspectos de la divulgación, tanto si se refieren, por ejemplo, al ácido nucleico, al vector, a la célula hospedadora o al uso, son igualmente aplicables a todos los demás aspectos de la divulgación. En particular, los aspectos del método de tratamiento, por ejemplo, la administración del ácido nucleico o del vector, pueden haberse descrito con mayor detalle que en algunos de los otros aspectos de la divulgación, por ejemplo, en relación con el uso del ácido nucleico o del vector para el tratamiento de la enfermedad de Wilson. Sin embargo, el experto apreciará que cuando se ha dado información más detallada para un aspecto particular de la divulgación, esta información es, en general, igualmente aplicable a otros aspectos de la divulgación. Además, el experto apreciará también que la descripción relativa al método de tratamiento es igualmente aplicable al uso del ácido nucleico o vector en el tratamiento de la enfermedad de Wilson.
Descripción detallada de la invención
La invención se describirá ahora en detalle a modo de ejemplo solo con referencia a las figuras en las que:
La Figura 1 muestra una versión de ATP7B con codones optimizados, expresada por el promotor HLP, para empaquetarse en un vector AAV.
La Figura 2 muestra un análisis en gel alcalino de un vector AAV8-HLP-ATP7B monocatenario a diferentes títulos (carriles 2-4) e ilustra que está bien empaquetado, con un prominente genoma de longitud completa y algunos genomas parciales. Como control se utiliza un vector FIX pequeño y bien empaquetado (carril 1) y el carril 5 es un marcador de tamaño de ADN.
La Figura 3 ilustra que cuando las células hepáticas Huh7 se transdujeron con un vector ssAAV8-HLP-codophATP7B, expresaron niveles similares de transcritos de ATP7B endógena (panel superior izquierdo), pero altos niveles de codop-hATP7B en comparación con las células no transducidas (panel superior derecho). Se encontró que la expresión del transcrito de codop-hATP7B aumentaba de una manera dependiente de la dosis (panel inferior).
La Figura 4 muestra que tanto por transferencia Western (panel superior) como por inmunofluorescencia (panel inferior), después de la administración del vector, se detecta una proteína transgénica hATP7B en el hígado de un modelo de rata (LEC, Long-Evans Cinnamon) de la enfermedad de Wilson. Las ratas LEA sirven como control. La ATP7B de rata no reacciona de forma cruzada con el anti-hATP7B.
La Figura 5 muestra el análisis detallado de tejidos hepáticos e ilustra que se detecta un solo producto de proteína transgénica ATP7B de longitud completa (panel izquierdo). Se muestra un control de carga de beta-tubulina (panel derecho).
La Figura 6 ilustra que la ATP7B (rojo) se expresa específicamente en hepatocitos de hígado de rata después de la administración del vector, y no en otros tipos de células tales como las del epitelio de los canalículos biliares (verde).
La Figura 7 muestra la corrección fenotípica de los niveles de cobre biliar que se observa en 2/6 animales tratados con vector (R10 y R7). Como controles, están los animales no tratados (simulación) y los animales normales (LEA normales).
El objetivo principal del programa de investigación de los inventores es establecer una cura para la enfermedad de Wilson que sea segura, eficaz y ampliamente disponible. En la búsqueda de este objetivo, los inventores han desarrollado un enfoque de transferencia génica a Av dirigida al hígado con una secuencia única de ATP7B con codones optimizados.
El casete de expresión rAAV-Atp7b de gran tamaño de 5,1 kb (esquema mostrado en la Figura 1) que contiene el ADNc de Atp7b con codones optimizados, se empaquetó con la cápside del serotipo 8 utilizando un método convencional de transfección transitoria en células h Ek293T, con una eficiencia de producción de ~ 1x104 partículas de AAV-Atp7b/293T. La evaluación del ADN vírico extraído de rAAV-Atp7b mostró una sola banda de ~ 5 kb en un gel de agarosa alcalino, que es el tamaño esperado (Figura 2). El análisis del transgén de Atp7b con codones optimizados después de la transfección transitoria de las líneas celulares de hepatoma de hígado HuH7 mostró (Figura 3) un aumento significativo pero dependiente de la dosis en el transcrito de Atp7b transgénico.
La inyección en la vena de la cola del vector ssAAV-HLP-Atp7b en ratas Long Evans Cinnamon de 7-9 semanas de vida, condujo a la expresión de la proteína Atp7b en los hígados de estos animales (Figura 4: panel superior). La expresión de Atp7b fue más alta 1 mes después de la administración y se observó en aproximadamente el 10 % de los hepatocitos (Figura 4: panel inferior). El análisis por transferencia Western de tejidos hepáticos de ratas LEC, mostró una expresión específica de Atp7b en animales a los que se les administró el vector, y no en animales tratados de forma simulada o no tratados. La proteína Atp7b tiene la longitud correcta, sin pruebas de que se expresen productos proteicos más pequeños (Figura 5, panel izquierdo). La transferencia de beta tubulina se utiliza como control (Figura 5, panel derecho). La expresión de Atp7b en células hepáticas de animales a los que se administró vector, se localizó en hepatocitos; no se encontró expresión de Atp7b en el endotelio de la vena porta ni en el epitelio de los canalículos biliares DPPIV+ (Figura 6). Cabe destacar que, la expresión de cobre biliar después de un solo bolo de administración de histidina de cobre, se normalizó en 2/6 ratas LEC a las que se administró el vector (Figura 7), lo que demuestra que el vector ssAAV-HLP-Atp7b puede actuar como mediador en la corrección fenotípica.
Las ventajas de la presente invención son que:
1. Una sola infusión en vena periférica de AAV que codifica la Atp7b, puede dar como resultado la expresión prolongada de Atp7b en pacientes con enfermedad de Wilson. La expresión estable prolongada de Atp7b después de la transferencia génica mediada por AAV, ejercerá un beneficio clínico más pronunciado que el posible con la terapia actual, mejorando así las perspectivas de evitar el trasplante de órganos y mejorando la esperanza de vida de los pacientes con enfermedad de Wilson;
2. Expresión más fuerte del casete de expresión con codones optimizados que da como resultado un beneficio terapéutico al usar dosis más bajas de vector AAV; y
3. La expresión de Atp7b en el hígado reducirá el riesgo de desarrollar anticuerpos neutralizantes contra esta proteína.
Una evaluación inicial ha demostrado que la transducción de hepatocitos con un vector AAV que contiene Atp7b con codones optimizados bajo el control de un promotor específico de hígado, dio lugar a la expresión de Atp7b transgénica en ratas Atp7b - /homocigotas a un nivel que era un 5 % superior al observado en ratas de control LEA, lo cual era inesperado según la técnica anterior.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un vector para expresar la proteína ATP7B, comprendiendo el vector una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ATP7B funcional en donde la secuencia de nucleótidos tiene la secuencia de SEQ ID NO. 1, comprendiendo además el vector un promotor específico de hígado.
2. El vector de la reivindicación 1, en donde el promotor específico de hígado es un promotor HLP.
3. El uso de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde el vector es un vector AAV.
4. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el vector es un vector monocatenario.
5. Una célula hospedadora que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Una composición farmacéutica que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
7. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en terapia.
8. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson.
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